Summary
Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).
Abstract
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer u osteoartritis (OA). La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una herramienta fuerte para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo fuerzas en un rango tan pequeño como el piconewton hasta el micronewton. Las propiedades biomecánicas son de especial importancia en los tejidos musculoesqueléticos, que están sometidos a altos niveles de tensión. OA como una enfermedad degenerativa del cartílago resulta en la interrupción de la matriz pericelular (PCM) y la reorganización espacial de los condrocitos incrustados en su matriz extracelular (ECM). La interrupción en PCM y ECM se ha asociado con cambios en las propiedades biomecánicas del cartílago. En el presente estudio utilizamos AFM para cuantificar estos cambios en relación con los cambios específicos del patrón espacial de los condrocitos. Con cada cambio de patrón, se observaron cambios significativos en la elasticidad para el PCM y el ECM. La medición de la elasticidad local permite sacar conclusiones directas sobre el grado de degeneración del tejido local en OA.
Introduction
El cartílago articular es un tejido avascular y aneural. Los condrocitos escasamente dispersos producen, organizan y mantienen una matriz extracelular expansiva (ECM) en la que están incrustados. Como parte distinta y especializada del ECM, los condrocitos están rodeados por una fina capa de matriz especializada conocida como matriz pericelular (PCM). El PCM actúa como una interfaz de matriz celular sensible al mecanosensible 1 que protege los condrocitos2 y modula su respuesta biosintética3. Como se describió anteriormente4, en cartílago sano, los condrocitos están dispuestos en patrones espaciales específicos y distintos que son específicos para cada capa de tejido y articulación4,5 y dependen de los mecanismos de carga mecánica específicos de la articulación6. Estos patrones cambian de pares y cuerdas en cartílago sano a cuerdas dobles con la aparición de osteoartritis (OA). Con una mayor progresión de la enfermedad, los condrocitos forman pequeños racimos, aumentando gradualmente en tamaño a grandes racimos en OA avanzado. Una pérdida completa de cualquier estructura organizativa e inducción de la apoptosis se observa en la etapa final OA. Por lo tanto, la disposición celular de condrocitos se puede utilizar como un biomarcador basado en imágenes para la progresión de OA4.
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer o la OA. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una poderosa herramienta para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo una amplia gama de fuerza, desde piconewton hasta la micronewton. La principal aplicación de AFM es medir la topografía superficial y las propiedades mecánicas de las muestras a la resolución del subnómetro7. El dispositivo de medición consta de tres componentes principales: 1) Una sonda AFM, que es una punta afilada montada en un voladizo y se utiliza para la interacción directa con la superficie de la muestra. Cuando se aplica la fuerza al voladizo, la deformación de este último se produce de acuerdo con las propiedades del tejido medido. 2) Un sistema óptico que proyecta un rayo láser en el voladizo, que luego se refleja en una unidad detectora. 3) Un detector de fotodiodo que capta la luz desviada del voladizo. Convierte la información recibida sobre la desviación láser por el voladizo en una curva de fuerza que se puede analizar.
Por lo tanto, el principio principal de AFM es la detección de la fuerza que actúa entre la sonda AFM y la estructura objetivo de la muestra. Las curvas de fuerza obtenidas describen las propiedades mecánicas de las estructuras objetivo en la superficie de la muestra como elasticidad, distribución de carga, magnetización, tensión de rendimiento y dinámica de deformación plástica elástica8. Una ventaja importante de La AFM sobre otras técnicas de diagnóstico por imágenes es que el AFM se puede utilizar para medir las propiedades mecánicas de las células vivas en medios o tejidos en un estado nativo sin dañar el tejido. AFM puede funcionar tanto en condiciones líquidas como secas. No hay ningún requisito para la preparación de la muestra. AFM ofrece la posibilidad de tomar imágenes de una muestra y medir sus propiedades mecánicas simultáneamente en especímenes que están cerca de condiciones fisiológicas. En el presente estudio describimos un enfoque novedoso para evaluar la progresión de la OA midiendo la elasticidad del PCM y el ECM en el cartílago articular nativo. La correlación de la organización espacial de los condrocitos con el grado de degeneración del tejido local proporciona una perspectiva completamente nueva para la detección temprana de OA. Sin embargo, la relevancia funcional de estos patrones no se ha evaluado hasta ahora. Debido a que la función principal del cartílago articular es la carga que tiene una fricción baja, el tejido debe poseer propiedades elásticas. AFM permite medir no sólo la elasticidad del ECM, sino también de los patrones celulares espaciales incrustados en su PCM. La correlación observada de elasticidad con el cambio de patrón espacial de los condrocitos es tan fuerte que la medición de la elasticidad por sí sola puede permitir la estratificación de la degeneración del tejido local.
Los módulos elásticos del PCM y el ECM se evaluaron en secciones de 35 m de grosor utilizando un sistema AFM integrado en un microscopio de contraste de fase invertido que permitía la visualización simultánea de la muestra de cartílago. Este protocolo se basa en un estudio ya publicado en nuestro laboratorio9 y describe específicamente cómo caracterizar la disposición espacial de los condrocitos y cómo medir la elasticidad de su PCM y ECM asociados. Con cada cambio de patrón de los condrocitos, también se pueden observar cambios significativos en la elasticidad tanto para el PCM como para el ECM, permitiendo que esta técnica se utilice para medir directamente la etapa de degeneración del cartílago.
Este enfoque validado abre una nueva manera de evaluar la progresión de la OA y los efectos terapéuticos en las primeras etapas antes de que la degradación del tejido macroscópico realmente comience a aparecer. Realizar mediciones de AFM consistentemente es un proceso arduo. En el siguiente protocolo describimos cómo preparar la muestra a medir por AFM, cómo realizar las mediciones reales de AFM comenzando con la preparación del voladizo, cómo calibrar el AFM, y luego cómo realizar las mediciones. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque claro y conciso para obtener datos confiables y proporcionar estrategias básicas para procesarlos e interpretarlos. La sección de discusión también describe los escollos más comunes de este método riguroso y proporciona consejos útiles para la solución de problemas.
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Protocol
Las muestras de cartílago humano se obtuvieron de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tuebingen, Alemania, y del Winghofer-hospital, Rottenburg a.N., Alemania, para la etapa final de la OA de la rodilla. Se obtuvo la aprobación completa del comité ético local, institucional y local antes del inicio del estudio (número de proyecto 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la participación. Los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices aprobadas.
1. Preparación de la muestra
- Preparación del cartílago para la sección del criotome
- Para evaluar los cambios degenerativos en la articulación de la rodilla, tomar muestras de cartílago articular obtenidas de la zona de carga de los cóndilos femorales después de la resección tisular de los pacientes.
NOTA: Las muestras que se investigan deben contener al menos una capa delgada de hueso subcondral para permitir una identificación clara de la orientación del tejido con respecto a la superficie interna y externa, permitiendo así también una cosecha de tejido estandarizada de la capa de cartílago superior. El cartílago se puede utilizar para mediciones de AFM hasta 24 horas después de la cirugía. El tejido se puede almacenar en el medio de águila modificado de Dulbecco sin suero (DMEM) con un 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina y 1,2% (v/v) de anfotericina B antes de su uso. Sin embargo, almacenar las muestras durante más de 24 horas puede causar artefactos en las mediciones de AFM debido a la hinchazón del tejido. - Cortar el cartílago articular en su conjunto del hueso subcondral con la ayuda de un bisturí y luego incrustar la muestra de cartílago en medio de incrustación soluble en agua en la perilla criotoma que se congela a baja temperatura en el dispositivo de criotoma.
NOTA: El medio congelado estabiliza el tejido que envuelve. También resulta en la congelación de la muestra de cartílago junto con el medio de incrustación. Al cortar el cartílago del hueso, realice un seguimiento de la orientación del tejido. El tejido incrustado para las criosecciones debe colocarse de tal manera que la capa superior (es decir, la superficie articular) del cartílago se dirija a la hoja. Tenga en cuenta que el tejido debe estar completamente cubierto por el medio de incrustación.
- Para evaluar los cambios degenerativos en la articulación de la rodilla, tomar muestras de cartílago articular obtenidas de la zona de carga de los cóndilos femorales después de la resección tisular de los pacientes.
- Seccionamiento del criotome del cartílago
- Usando un criotomo estándar, seccione el tejido a un espesor de 35 m de la capa superior (es decir, la superficie articular) del cartílago articular que está incrustado en el medio de incrustación soluble en agua congelado.
NOTA: En total, se pueden seccionar y utilizar hasta 300 m (que corresponden a unas nueve secciones) para los análisis. El límite propuesto de 300 m corresponde a la profundidad de penetración visual que generalmente se puede obtener con microscopía de fluorescencia en cartílago hialino como cartílago articular. Por lo tanto, es posible clasificar el cartílago de acuerdo con el patrón espacial local predominante y luego medir estos patrones en las secciones correspondientes. - Recoger las secciones en una diapositiva de vidrio y enjuagar las secciones 3x con solución salina con fosfato (PBS) para eliminar el medio de incrustación soluble en agua.
- Usando un criotomo estándar, seccione el tejido a un espesor de 35 m de la capa superior (es decir, la superficie articular) del cartílago articular que está incrustado en el medio de incrustación soluble en agua congelado.
- Pegado de secciones de cartílago en una placa Petri compatible con AFM
NOTA: Debido a que el AFM recopila datos por sangría mecánica en la muestra, las secciones deben fijarse en su lugar para permitir mediciones precisas.- Pegue suavemente las secciones de 35 m de espesor con pegamento de muestra biocompatible en platos de cultivo de tejidos que sean compatibles con el dispositivo AFM. Para ello, tome 2 x 3 gotas de pegamento y colóquelas en el plato de cultivo de tejido en el lugar donde terminará el borde de la sección. Ahora ponga la sección de cartílago en el pegamento y deje que se pegue firmemente a la superficie del plato de cultivo de tejido.
NOTA: Las secciones de 35 m de espesor del cartílago articular hialino no son muy propensas al rizado. Sin embargo, si el rizado se produce al extraer las muestras del medio tampón, asegúrese de que el menor líquido posible se pegue a las muestras. Tan pronto como el exceso de agua se haya secado, extienda directamente el tejido sobre las manchas dispersas de pegamento para que se fije a la superficie del plato de cultivo celular. El pegamento se aplica en una capa delgada sólo en los bordes de la muestra y no en toda la sección. Mida sólo la parte de la muestra que está lejos de la zona encolada para eliminar la posibilidad de que el pegamento interfiera con las mediciones. - Incubar las secciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 min para permitir que el pegamento y el tejido se adhieran correctamente. A continuación, cubra las secciones con el medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina y sin bicarbonato de sodio para que estén completamente sumergidos.
NOTA: Los movimientos repentinos de la muestra durante la fijación o la aplicación insuficiente de pegamento son errores comunes que dan lugar al desprendimiento del tejido del plato de cultivo. Además, la aplicación del medio Leibowitz debe hacerse de forma suave, para no separar la muestra de la superficie debido a las "ondas" creadas por el medio. - Coloque el plato Petri con las secciones pegadas en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 oC hasta que se realicen las mediciones.
NOTA: Asegúrese de que las secciones de tejido son estables y no se separan de la superficie del plato de cultivo de tejido realizando cada paso lentamente.
- Pegue suavemente las secciones de 35 m de espesor con pegamento de muestra biocompatible en platos de cultivo de tejidos que sean compatibles con el dispositivo AFM. Para ello, tome 2 x 3 gotas de pegamento y colóquelas en el plato de cultivo de tejido en el lugar donde terminará el borde de la sección. Ahora ponga la sección de cartílago en el pegamento y deje que se pegue firmemente a la superficie del plato de cultivo de tejido.
2. Preparación en voladizo (pegado de las microesferas)
- Preparación del dispositivo AFM y dilución de las microesferas
- Coloque el voladizo en el bloque de vidrio especificado para las mediciones de aire, fíjelo con el muelle y monte el bloque de vidrio en el cabezal AFM.
- Diluir las microesferas en etanol 100% (100 partículas/10 l) y ultrasonidos durante 10 s, de modo que las microesferas se separan y no se agrupan.
- Preparación de la configuración para el encolado
- Limpie un portaobjetos de vidrio con un 70% de etanol y móntelo en el soporte de la muestra en el dispositivo AFM.
NOTA: La limpieza de la corredera evita que las manchas de polvo que podrían interferir con el proceso de encolado se acumulen en la superficie de la diapositiva. - Coloque 2 s de la suspensión de la microesfera en el centro de la corredera y 2 s de pegamento cerca de la suspensión de la microesfera.
NOTA: Se recomienda colocar la suspensión de la microesfera y el pegamento cerca uno del otro para permitir una transición rápida del voladizo entre el pegamento y las microesferas. Si la transición entre sumergir el voladizo en el pegamento y hacer contacto con una microesfera es demasiado larga, el pegamento eventualmente se endurecerá, perdiendo así sus propiedades adhesivas. - Deje que el líquido de etanol en la microesfera suspensión se seque al aire, dejando las microesferas en su lugar.
- Limpie un portaobjetos de vidrio con un 70% de etanol y móntelo en el soporte de la muestra en el dispositivo AFM.
- Pegar las microesferas en la punta del voladizo
- Sumerja el voladizo manualmente en el pegamento con la ayuda del motor paso a paso en pasos de 10 m hasta que la punta esté cubierta por pegamento. Realice este paso rápidamente, ya que el pegamento se seca rápidamente.
- Retraiga el voladizo de nuevo en 100 m, muévalo hacia las microesferas y coloque la punta del voladizo directamente por encima de una sola microesfera.
- Ejecute una medición de espectroscopia de fuerza para sumergir la punta del voladizo en la microesfera seleccionada con los parámetros que se muestran en la Tabla 1.
NOTA: Al ejecutar este paso, se utiliza una medición de la superficie de la microesfera para establecer contacto entre la punta del voladizo y la microesfera. El tiempo de contacto relativamente largo que se muestra en la Tabla 1 permite un amplio tiempo de unión entre el pegamento y la microesfera. La curva de fuerza-distancia obtenida durante este paso se genera como un subproducto del encolado de la microesfera en la punta del voladizo y no se procesa para su posterior análisis. - Una vez que una microesfera está unida al voladizo, retraiga el bloque de vidrio con el voladizo montado en la parte superior y luego retire la cabeza del AFM del microscopio. Por último, desmonte el bloque de vidrio y el voladizo de la cabeza afm.
- Incubar el voladizo a 65oC durante 2 h y dejar secar durante la noche a RT antes de iniciar las mediciones.
NOTA: La incubación del voladizo mejora las propiedades adhesivas del pegamento, haciendo más estable el complejo de microesferas en voladizo.
3. Preparación del dispositivo AFM para mediciones
- Ajuste un bloque de vidrio especificado para medir en un entorno líquido en el soporte AFM de modo que la superficie superior sea recta y paralela al soporte AFM.
- Con la ayuda de pinzas, monte cuidadosamente el voladizo seleccionado en la superficie del bloque de vidrio, de modo que la punta AFM con la microesfera sobresalga sobre el plano óptico pulido.
NOTA: La punta del voladizo debe sobresalir sobre el plano pulido para poder reflejar el láser del AFM en el fotodetector. Tenga mucho cuidado al colocar el voladizo en el AFM para no rayar la superficie óptica pulida del bloque de vidrio. Rascar el bloque de vidrio puede resultar en dificultades en el ajuste de la alineación del láser y puede interferir con las mediciones posteriores. - Debido a que el voladizo estará sujeto a presión mecánica, debe fijarse en su lugar. Estabilice el voladizo en el bloque de vidrio deslizando el resorte metálico en la ranura del bloque y sujetando la parte superior del voladizo con el muelle con la ayuda de pinzas.
- Coloque cuidadosamente el bloque de vidrio con el voladizo en el cabezal AFM y fíjelo con el mecanismo de bloqueo integrado. Asegúrese de que el muelle esté orientado hacia el lado izquierdo para que el voladizo se coloque en la orientación correcta. A continuación, monte el cabezal AFM con el voladizo en el dispositivo AFM.
4. Carga de la muestra y calibración del voladizo
NOTA: Aquí, la calibración del dispositivo se realiza ejecutando una curva de fuerza en la superficie limpia de la placa Petri llena de medio de Leibovitz sin ningún tejido de muestra. La calibración también se puede realizar utilizando una placa AFM de control independiente llena solo con el medio AFM sin la muestra.
- Montaje de la muestra en el dispositivo AFM
- Coloque el plato Petri preparado en el paso 1.3.3 en el portamuestras AFM.
- Encienda el calentador de platos Petri y póntelo a 37 oC. Permita que el plato de cultivo de tejido alcance una temperatura óptima (es decir, 20 min).
- Coloque una lámina protectora en la base del conjunto del voladizo para evitar la condensación de medio en el cabezal AFM.
- Calibración del dispositivo
- Abra el software(Tabla de materiales), seguido de la ventana de alineación láser, y la ventana que representa la configuración del parámetro de aproximación. A continuación, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD.
- Utilice la cámara CCD del microscopio para visualizar e identificar el voladizo. Usando la función de motor paso a paso, baje el voladizo en pasos de 100 m hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el medio.
NOTA: La sumergición del voladizo en el líquido es identificable visualmente a través de la cámara CCD. Cuando rompe la superficie del agua, la punta en voladizo crea reflejos circulares fácilmente perceptibles en el agua. - Dirija el láser en la parte superior del voladizo utilizando los tornillos de ajuste.
NOTA: No sobrefuerce los tornillos, ya que esto dañará el mecanismo de alineación láser. El voladizo se ve desde abajo y el rayo láser viene desde arriba. - Una vez que el láser se coloca en el voladizo, ajuste el rayo láser con la ayuda de tornillos en el dispositivo AFM para que el haz reflejado caiga sobre el centro del fotodetector. Mantenga monitoreando la posición del rayo láser utilizando la función de alineación láser.
NOTA: El detector capta la desviación del rayo láser reflejado por el voladizo y lo convierte en una señal eléctrica. - Después del ajuste láser-cantilever, la señal Sum tiene que ser de 1 V o superior, mientras que las desviaciones laterales y verticales tienen que estar cerca de 0. Si no se obtienen estos valores, ajuste el fotodetector.
- Obtención de la curva de fuerza de calibración
- Para llegar a la superficie de la antena AFM para iniciar las mediciones, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la Tabla 2. Una vez que se alcanza la parte inferior del plato de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 m.
NOTA: En este punto, la sonda está exactamente a 100 m por encima de la parte inferior de la placa de cultivo de tejido. - Configure los parámetros RUN y ajuste los parámetros mostrados en la Tabla 3. Haga clic en el botón RUN para iniciar una medición y obtener una curva de fuerza-distancia de calibración.
NOTA: La curva de fuerza obtenida aquí se muestra en la Figura 1. - En la curva de fuerza-distancia de calibración, seleccione la región para un ajuste lineal de la curva retraída en el software.
NOTA: El ajuste lineal se realiza para medir la sensibilidad del voladizo. Una vez que el ajuste lineal está en su lugar, los valores serán guardados por el software. La medición constante del resorte o el ruido térmico del voladizo es calculado por el software después. - Como las mediciones se realizan en medio a una temperatura de 37 oC, ajuste la variable de temperatura a 37 oC en el software para imitar las condiciones fisiológicas lo más cerca posible.
NOTA: Al final de la calibración, la desviación vertical se guarda y se muestra en la unidad de fuerza, la Newton (N), en lugar de voltios (V), que es la unidad del registro original por el detector de fotodiodo.
- Para llegar a la superficie de la antena AFM para iniciar las mediciones, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la Tabla 2. Una vez que se alcanza la parte inferior del plato de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 m.
5. Caracterización biomecánica del ECM y PCM mediante la realización de mediciones de elasticidad a través de AFM
- Identificación de los patrones de condrocitos en la sección del cartílago
- Observar la sección del cartílago bajo un microscopio de contraste de fase integrado en el sistema AFM e identificar los patrones celulares específicos10 del cartílago articular de la rodilla osteoartrítica: cuerdas simples (áreas de tejido sano), cuerdas dobles (degeneración del tejido inicial), racimos pequeños y grandes (ambos degeneración avanzada del tejido). Vea la Figura 2A–D.
- Una vez identificado el patrón deseado específico, mida dos sitios por patrón elegido por tipo de matriz (PCM o ECM) y realice nueve repeticiones de medición en cada sitio de medición(Figura 2E,F). Asegúrese de que un tamaño de muestra sea lo suficientemente grande como para tener en cuenta posibles imprecisiones.
NOTA: Para las mediciones de PCM, coloque el voladizo cerca de las celdas (como se muestra en los círculos rojos de la Figura 2E,F). Para realizar las mediciones del ECM, seleccione una región sin ninguna célula (mostrada por el área azul en el cuadro 2E,F)y realice la sangría como se describe en el paso 5.2.
- Sangría del sitio objetivo
- Realizar un enfoque seguido de una retracción para que el voladizo se coloque 100 m por encima del tejido, que será la posición inicial para las mediciones posteriores.
- Concéntrese en el PCM o ECM del patrón que se va a medir y fije el ratón del ordenador en ese punto.
NOTA: El ratón servirá como marcador visual para el sitio de destino de sangría. Una vez que el enfoque cambia a la punta del voladizo, las estructuras tisulares se volverán indistinguibles o borrosas. - Ahora concéntrese en la sonda y mueva la punta de la sonda al punto previamente fijado por la flecha del ordenador. A continuación, inicie las mediciones con RUN, utilizando el parámetro de punto de ajuste obtenido mediante la calibración del voladizo.
NOTA: En la Figura Suplementaria 1se muestra una curva de fuerza ejemplar obtenida al medir el PCM de una sola cadena.
6. Procesamiento de datos
NOTA: El análisis de datos o la determinación del módulo elástico se realiza utilizando un modelo Hertz como se describió anteriormente11,12. La forma del indentador era esférica debido al uso de microesferas en la punta y la proporción de Poisson se mantuvo en 0.5 basado en la literatura anterior13,14,15.
- Abra el software de procesamiento de datos(Tabla de materiales)compatible con los datos obtenidos del dispositivo AFM.
- Seleccione el modelo Hertz en el software para procesar las curvas de fuerza-distancia. Establezca la relación de Poisson en 0,5 y seleccione la forma de la punta como esférica y un radio de punta de 12,5 m.
- Una vez ajustados todos los parámetros, se ajustan los resultados y el software calcula y muestra el módulo del Joven.
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Representative Results
A lo largo del modelo fisiopatológico de cadenas a cuerdas dobles, a pequeños y finalmente a clústeres grandes, tanto ECM(Figura 3A)como módulos elásticos PCM(Figura 3B)disminuyeron significativamente entre cada cambio de patrón. La única excepción fue la diferencia en ECM entre cadenas y cadenas dobles (p - 0.072). Los resultados muestran que la relación ECM/PCM(Figura 4B) no cambió significativamente, mientras que se observó una marcada disminución de las diferencias absolutas de elasticidad entre ECM y PCM(Figura 4A). Además, los resultados no muestran ninguna asociación significativa con respecto a la relación ECM/PCM o los cambios espaciales celulares asociados (r -0,099, p a 0,281).
Figura 1: Representación esquemática de una curva de fuerza-distancia en el modo de contacto AFM. A medida que la sonda se acerca a la superficie, las fuerzas son demasiado pequeñas para dar una desviación medible de la punta al principio, dejando así la punta en su posición intacta (1). Luego, cuando el voladizo está muy cerca de la muestra, debido a las fuerzas adhesivas activas entre la punta y la sonda, el voladizo realmente se ajusta rápidamente hacia la muestra (2). Con la sonda acercándose más a la muestra, la desviación repulsiva se enfrenta al movimiento de la dirección, con una función casi lineal de altura y desviación hasta que la desviación vertical alcanza el valor de punto de ajuste relativo (3). Al retraer (4), además de las fuerzas de desviación de baja, las fuerzas de adhesión también están presentes mientras que el voladizo se retrae en el eje Z de la muestra. A medida que la sonda AFM se extrae del contacto con la muestra, primero se "atasca" antes de que sea capaz de aflojarse de la adhesión en la interfaz, incluso dando lugar a una breve desviación negativa del voladizo, antes de volver a alcanzar su posición neutra sin peste sin contacto con la sonda (5). El grado de desviación se expresa en la fuerza que trabaja en el voladizo expresado en nanonewtons. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización espacial representativa de los condrocitos y mediciones AFM de la matriz extracelular (ECM) y la matriz pericelular (PCM). (A-D) Caracterización de los patrones celulares: cadenas (A), cadenas dobles (B), pequeños clústeres (C) y clústeres grandes (D). Los módulos elásticos del PCM (círculos rojos) y ECM (área azul) (E/F) fueron evaluados para los diferentes patrones celulares en el cartílago osteoartrítico. Los sitios de medición para el ECM y el PCM fueron seleccionados por el experimentador y se indican gráficamente por cruces negras. La punta en voladizo utilizada para las mediciones está marcada por una estrella blanca. Las barras de escala representan 10 m (A-D) y 100 m (E/F). La figura está adaptada y modificada de Danalache et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de los módulos cuantificados de Young de la matriz extracelular (ECM) y la matriz pericelular (PCM) en función de la organización de condrocitos espaciales. Con la organización de condrocitos espaciales patológicos progresivos, se observó una disminución gradual de la elasticidad en las gráficas de caja tanto para el ECM (A) como para el PCM (B) (*p < 0.05, ***p < 0.001). Abreviaturas: SS: cadenas simples, DS: cadenas dobles, SC: clústeres pequeños, BC: clústeres grandes. Las cifras están tomadas de Danalache et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Relación de los módulos de los Jóvenes de la matriz extracelular (ECM) y la matriz pericelular (PCM) en función de la organización espacial celular. Una organización de condrocitos espaciales cada vez más patológica se asoció con una disminución de los módulos de Young tanto para ECM como para PCM (A). Si bien estos cambios espaciales tuvieron lugar, la relación entre la elasticidad de ECM y PCM se mantuvo constante, sin mostrar cambios significativos (B). Los datos se presentan como un diagrama de líneas con el error medio (A) y las gráficas de caja (B). Abreviaturas: SS: cadenas simples, DS: cadenas dobles, SC: clústeres pequeños, BC: clústeres grandes. Las cifras están tomadas de Danalache et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Curva de fuerza representativa obtenida por sangría de la matriz pericelular (PCM) de un patrón de cadena única que muestra los resultados de ajuste (flecha naranja), así como el cuadrado medio de la raíz residual (RMS residual; flecha negra). Los resultados de ajuste incluyen el punto de contacto entre la muestra y la punta, el módulo de Young y la línea de base. El RMS residual que se muestra a continuación describe la diferencia entre los datos de ajuste y de fuerza, lo que representa la calidad de un ajuste de curva de fuerza. Haga clic aquí para descargar esta figura.
| Tabla 1. Parámetros para pegar una microesfera en la sonda AFM | |
| Parámetros | Valor |
| Ajuste | 5.0 V |
| Ajustar la línea de base | 1 |
| Longitud de tracción | 90,0 m |
| Movimiento Z | Velocidad constante |
| Extender la velocidad | 5,0 m/s |
| Extender el tiempo | 18.0 s |
| Tiempo de contacto | 90.0 s |
| Modo retardo | Fuerza constante |
| Frecuencia de muestreo | 2000 Hz |
Tabla 1. Parámetros para pegar una microesfera en la sonda AFM.
| Cuadro 2. Parámetros de aproximación | |
| Parámetros de aproximación | Valor |
| Enfoque IGain | 5.0 Hz |
| Enfoque PGain | 0.0002 |
| Enfoque la altura objetivo | 10,0 m |
| Punto de consigna de enfoque | 5.00 V |
| Línea de base de aproximación | 0.00 V |
Cuadro 2. Parámetros de aproximación.
| Cuadro 3. Ejecutar parámetros | |
| Parámetros | Valor |
| Ajuste | 1.0 V |
| Ajustar la línea de base | 1 |
| Longitud de tracción | 90,0 m |
| Movimiento Z | Velocidad constante |
| Extender la velocidad | 5,0 m/s |
| Extender el tiempo | 18.0 s |
| Tiempo de contacto | 0.0 s |
| Modo retardo | Fuerza constante |
| Frecuencia de muestreo | 2000 Hz |
Cuadro 3. Ejecute parámetros.
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Discussion
Utilizando AFM como una técnica novedosa y poderosa para medir las propiedades biomecánicas de los materiales biológicos a un nivel nanoescala, medimos las propiedades elásticas del ECM y pcM en el cartílago articular osteoartrítico humano. Las muestras de cartílago se seleccionaron de acuerdo con su patrón espacial predominante de organización de condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración del tejido local. Como era de esperar, se observó una fuerte disminución en los valores de elasticidad de ECM y PCM a lo largo de la reorganización de los condrocitos espaciales. Estas observaciones destacan claramente que las desviaciones en la disposición espacial de los condrocitos no sólo se asociaron con cambios en las propiedades elásticas del microambiente celular (PCM), sino también en todo el cartílago (ECM). Además, la relación ECM/PCM no mostró cambios significativos a pesar de los cambios robustos en los módulos elásticos de PCM y ECM durante oA. Estos hallazgos indican que los cambios en las propiedades mecánicas del ECM y del PCM ocurrieron unidireccionalmente y al mismo tiempo, lo que podría significar que la naturaleza de la destrucción progresiva es similar tanto para el PCM como para el ECM. Por lo tanto, la iniciación y progresión de la OA desencadena una degradación significativa de PCM y ECM y, en última instancia, la destrucción. Ambas pérdidas se asociaron con una pérdida significativa de propiedades biomecánicas del cartílago articular como su elasticidad, como se muestra en el presente estudio. Esto enfatiza la relevancia funcional de la organización espacial de los condrocitos como marcador de propiedades biomecánicas. Por el contrario, nos permite utilizar mediciones de elasticidad local para sacar conclusiones sobre los patrones espaciales predominantes localmente y por lo tanto la degeneración del tejido local del cartílago.
La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una herramienta de alta resolución para estudiar los tejidos de una manera no destructiva. Funciona sondeando físicamente muestras con un voladizo delicado y flexible que refleja un láser sobre un fotodiodo. Cualquier cambio en esta reflexión se registra y se convierte en una señal eléctrica. Si bien AFM es una poderosa herramienta para realizar mediciones a nanoescala, no viene sin sus limitaciones y escollos. Especialmente crítica es la preparación en voladizo pegando las microesferas. En el contexto de este método, las microesferas se utilizan para modificar la profundidad de sangría y la presión local durante las mediciones. El uso de pequeñas microesferas unidas a la punta de la sonda permite medir las propiedades biomecánicas de una red de fibra en lugar de la elasticidad de una sola fibra cuando se utiliza la punta sola. También previene el daño tisular durante el proceso de medición. Debido a la delicada naturaleza de los sensores en voladizo, es necesario establecer un modo de preparación atento y cuidadoso para obtener mediciones consistentes y precisas. Para evitar que las microesferas se desprendan de la punta del sensor, recomendamos pegamento recién mezclado no más de una semana. Además, es vital para la funcionalidad del sensor colocar la microesfera en el centro de la punta, ya que la desviación lateral en el accesorio de la microesfera da como resultado fácilmente mediciones inconsistentes.
Colocar el voladizo en el bloque de vidrio y fijarlo con un muelle de ajuste es un proceso delicado y propenso a errores que necesita atención meticulosa y manos firmes. Debido a que es muy probable que los voladizos sean destruidos por operadores no entrenados, recomendamos realizar varias ejecuciones de prueba y práctica para manejar cómodamente los componentes fácilmente rompibles del AFM.
Un bloque de vidrio limpio es imprescindible para calibrar correctamente el dispositivo y obtener mediciones confiables. La suciedad o el polvo en la superficie óptica del bloque pueden impedir la alineación adecuada del láser en el fotodetector. Por lo tanto, si se encuentran problemas durante la alineación del láser, podría ser necesario lavar el bloque de vidrio con etanol una segunda vez.
El análisis o la determinación de datos del módulo elástico se pueden realizar utilizando el modelo Hertz como se describió anteriormente11,12. En resumen, los datos generados por la sangría son gráficas de fuerza sobre el movimiento de la punta en voladizo. Durante las mediciones, el voladizo se mueve en la dirección de la muestra. Esto lleva al voladizo a entrar en contacto con la muestra y posteriormente a su flexión en la dirección opuesta a la que se movió originalmente. Simultáneamente, se produce una sangría de la muestra por una cantidad determinada. Para utilizar el modelo de ajuste hertzátino, la sangría de la muestra debe calcularse y ajustarse para aislar el parámetro de flexión en voladizo. El parámetro que describe la muestra es la relación de Poisson, que depende del material investigado. Para muestras biológicas blandas, la relación de Poisson a menudo se establece en 0,515. Como se mencionó anteriormente, la forma del indentorés usado es relevante para el cálculo del módulo de Young, ya que dicta las extensiones que se tienen que hacer a la ecuación original de Hertz. En el caso del experimento descrito, se asume una forma de indentorés esférica debido al uso de microesferas.
Mientras que AFM puede ofrecer nuevas e interesantes posibilidades de recopilación de datos, la consistencia y fiabilidad de los datos producidos dependen en gran su fuerza de la experiencia del operador respectivo. Varios de los pasos descritos anteriormente son propensos a errores humanos y requieren paciencia y meticulosidad para ejecutarlos correctamente.
Debido a las muchas variables sensibles que pueden afectar a los resultados de la medición, los valores de fuerza absolutos reportados en este estudio no se pueden generalizar, sino que son bastante específicos para nuestra configuración experimental. Cuando se utiliza esta técnica para evaluar la degeneración tisular del cartílago, primero es necesario realizar algunas mediciones de normalización en diferentes patrones espaciales para escalar los resultados a los ajustes de medición experimentales específicos presentes. Sin embargo, la relación de los diferentes módulos de elasticidad y los patrones espaciales no se verá afectada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a nuestros coautores de la publicación original por su ayuda y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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