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Neuroscience

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/61046

Summary

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Abstract

In utero l'elettroporazione è una tecnica di trasferimento del DNA in vivo ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base della corticogenesi dei mammiferi. Questa procedura sfrutta i ventricoli cerebrali per consentire l'introduzione del DNA di interesse e utilizza una coppia di elettrodi per dirigere l'ingresso del materiale genetico nelle cellule che rivestono il ventricolo, le cellule staminali neurali. Questo metodo consente ai ricercatori di etichettare le cellule desiderate e/o di manipolare l'espressione dei geni di interesse in tali cellule. Ha più applicazioni, tra cui saggi mirati migrazione neuronale, tracciamento del lignaggio, e pathfinding assonale. Una caratteristica importante di questo metodo è il suo controllo temporale e regionale, che consente l'elusione di potenziali problemi legati alla letalità embrionale o alla mancanza di topi driver CRE specifici. Un altro aspetto rilevante di questa tecnica è che aiuta a ridurre considerevolmente i limiti economici e temporali che coinvolgono la generazione di nuove linee del mouse, che diventano particolarmente importanti nello studio delle interazioni tra i tipi di cellule che hanno origine in aree lontane del cervello in diverse età dello sviluppo. Qui descriviamo una doppia strategia di elettroporrazione che consente il targeting di popolazioni cellulari separate spazialmente e temporalmente. Con questo approccio possiamo etichettare diversi sottotipi di cellule in luoghi diversi con proteine fluorescenti selezionate per visualizzarle e/o possiamo manipolare i geni di interesse espressi da queste cellule diverse nei momenti appropriati. Questa strategia aumenta il potenziale dell'elettroporazione in utero e fornisce un potente strumento per studiare il comportamento delle popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente che migrano per stabilire contatti stretti, così come le interazioni a lungo raggio attraverso proiezioni assonali, riducendo i costi temporali ed economici.

Introduction

La corteccia cerebrale è una struttura molto complessa e finemente organizzata. Per raggiungere un tale grado di organizzazione, i neuroni di proiezione corticale passano attraverso processi di sviluppo complessi che richiedono la loro generazione temporale, la migrazione alla loro destinazione finale nella piastra corticale e la creazione di connessioni a breve e lungo raggio1,2. Per molto tempo, il modo classico per studiare la corticogenesi si basava sull'uso di modelli murini knockout o knock-in di geni di interesse. Tuttavia, questa strategia, e in particolare l'uso di topi knockout condizionali, richiede tempo e denaro, e talvolta presenta ulteriori problemi per quanto riguarda l'esistenza di ridondanza genetica o la mancanza di driver CRE specifici, tra le altre questioni. Uno degli approcci che è sorto per cercare di affrontare questi problemi e che è oggi ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo corticale è in elettroporazione utero3,4. In utero l'elettroporazione è una tecnica utilizzata per la transgenesi somatica, che consente il targeting in vivo delle cellule staminali neurali e della loro progenie. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule con l'espressione di proteine fluorescenti5,6, per la manipolazione genica in vivo (cioè, guadagno o perdita di test funzione)7,8,9, per isolare cortice elettropotizzate in vitro e colture8,10. Inoltre, l'elettroporazione in utero consente il controllo temporale e regionale dell'area mirata. Questa tecnica ha numerose applicazioni ed è stata ampiamente utilizzata per studiare la migrazione neuronale, divisione delle cellule staminali, connettività neuronale, e altri soggetti8,9,11,12.

Il manoscritto attuale descrive l'uso di una variante di elettroporazione in utero, definita doppia elettroporazione in utero, per analizzare le interazioni delle cellule nella corteccia cerebrale con diverse origini temporali e spaziali. Questi studi sono estremamente complessi da completare quando si impiegano modelli murini perché richiedono l'uso combinato di diverse linee transgeniche. Alcune delle applicazioni del protocollo descritto in questo documento includono lo studio delle interazioni ravvicinate tra le cellule vicine, così come le interazioni tra cellule distanti attraverso proiezioni a lungo raggio. Il metodo richiede l'esecuzione di due interventi chirurgici di elettroporazione indipendenti, separati temporaneamente e spazialmente, sugli stessi embrioni per indirizzare diverse popolazioni cellulari di interesse. Il vantaggio di questo approccio è la possibilità di manipolare la funzione genica in uno o entrambi i tipi di neuroni utilizzando animali di tipo selvaggio. Inoltre, questi esperimenti funzionali possono essere combinati con l'espressione di proteine citoplasmiche o fluorescenti marcate a membrana per visualizzare la morfologia fine delle cellule mirate, compresi dendriti e assoni, e analizzare le possibili differenze nelle interazioni cellulari rispetto a un controllo (cioè cellule etichettate solo con la proteina fluorescente).

Il protocollo qui delineato è focalizzato sullo studio delle interazioni cellulari all'interno della neocorteccia, ma questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per esaminare le interazioni con aree extracorticali che possono essere prese di mira utilizzando in uteropozione, come il subpio o il talamo13,14, o interazioni cellula-cellula in altre strutture, come il cervelletto15. Il targeting di aree diverse si basa sull'orientamento degli elettrodi e sul ventricolo in cui viene iniettato il DNA (laterale, terzo o quarto). Con la strategia qui descritta, possiamo etichettare un numero considerevole di cellule, che è utile per valutare i cambiamenti generali nella connettività / innervazione in esperimenti funzionali. Tuttavia, per studiare i cambiamenti fini nella connettività, si possono utilizzare versioni modificate dell'elettroporazione in utero per ottenere l'etichettatura più scarsa e identificare le singole cellule16. In sintesi, la doppia elettroporazione in utero è un metodo versatile che consente di indirizzare le popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente e di studiarne le interazioni in dettaglio, sia in condizioni di controllo che combinate con esperimenti funzionali, riducendo considerevolmente i costi temporali ed economici.

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Protocol

La procedura qui descritta è stata approvata dal comitato etico incaricato della sperimentazione, il benessere degli animali dell'Università di Valencia e la Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rurale, Emergencia Climàtica y Transiciàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolàn Ecolànegica della Comunidad Valenciana, e aderisce alle linee guida del Consiglio internazionale per la scienza animale di laboratorio (ICLAS) riesaminate nel decreto reale 53/2013 della legislazione spagnola e della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio.

NOTA: Questo protocollo prevede due scopi diversi: 1) il primo studio, denominato "strategia A", consente l'analisi delle interazioni tra le cellule di Cajal-Retzius (cellule CR) e i neuroni di proiezione corticale nati precocemente all'interno dello stesso emisfero cerebrale; 2) il secondo studio, "strategia B", viene effettuato al fine di esaminare l'innervazione dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore sul lato contralaterale della neocorteccia.

1. Preparazione pre-chirurgia

  1. Preparazione del DNA
    1. Trasformare le cellule E. coli DH5, chimicamente o elettrocompetenti con i plasmidi di interesse, arlatarle su piastre di agar LB con l'antibiotico appropriato e incubarle durante la notte a 37 gradi centigradi.
      NOTA: Tutti i plasmidi utilizzati qui contengono il promotore generale per il pollo ,a-actin (CAG) che guida l'espressione di una proteina fluorescente-reporter (CAG-mCherry e CAG-EGFP per la strategia A e CAG-BFP e CAG-nEGFP-2A-mtdTomato per la strategia B). Tutti contengono resistenza all'ampicillina (AMP).
    2. Scegli le singole colonie da ogni trasformazione plasmide e inizia una coltura liquida di avviamento in 2 mL di brodo di Luria, l'ampicillina (LB-AMP) nei tubi di coltura batterica durante 3-4 h a 37 h con agitazione vigorosa (200 rpm). Dopo, impostare una coltura batterica più grande in un pallone Erlenmeyer da 500 mL aggiungendo 200 mL di LB-AMP e 1 mL della coltura di avviamento. Incubare peruna una notte a 37 gradi centigradi nello shaker orbitale a 200 giri/min.
    3. Utilizzare un kit di maxipreparazione senza endotossina (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore per ottenere DNA plasmid puro e concentrato dalle colture liquide. Risospendere il DNA in un buffer Tris-EDTA (TE) privo di endotossine per ottenere concentrazioni di almeno 5 g/l.
    4. Per ogni intervento chirurgico, preparate una soluzione con un volume finale di 10,L contenente 1 Lega di colorante verde veloce, una soluzione di DNA plasmide interessante per una concentrazione finale di 1 g/l per ogni plasmide e un buffer TE privo di endotossine. Ad esempio, mescolare 1 l l di colorante verde veloce, 2 ll di una soluzione di DNA plasmid di 5 g/l e 7 L di tampone DI TE.
  2. Pipette tirando
    1. Tirare i capillari di vetro borosilicati (1/0,58 mm di diametro esterno/interno) in un'espirazione verticale a micropipette fino a quando la punta non raggiunge una lunghezza di 1-1,5 cm e tagliarla utilizzando pinze dissetanti con un angolo di circa 30 gradi sotto un mirino di sedzione.
  3. Configurazione della sala chirurgica
    1. Mettere tutte le attrezzature sul tavolo operatorio (ad esempio, pinzette, forbici, pinze, micropipette, ago e portaa aghi). Accendere la piastra di riscaldamento e coprirla con un assorbente chirurgico sterile. Assicurarsi che il serbatoio nella macchina per l'anestesia per inalazione sia riempito con isoflurane, che il serbatoio dell'ossigeno contenga abbastanza ossigeno e che il sistema funzioni correttamente.
      NOTA: La sala operatoria e il materiale resistente devono essere mantenuti il più sterili possibile (cioè tutto il materiale deve essere autoclaed prima dell'intervento chirurgico e le superfici devono essere sanificati con il 70% di etanolo). Gli elettrodi di platino devono essere accuratamente disinfettati prima con sapone germicida e secondo con 70% di etanolo prima dell'intervento chirurgico.
    2. Preparare 100 mL di 0,9% (w/v) soluzione salina sterile contenente penicillina-streptomicina 1:100 e riempire un piatto Petri 10 cm. Posizionare la piastra sulla parte superiore del pad riscaldato per riscaldare la soluzione.
    3. Riempire una siringa da 1 mL con 150 l di una soluzione analgesica (ad esempio, una buprenorfine da 0,1 mg/kg).
    4. Caricare la pipetta tirata con 5 -L della soluzione finale del DNA plasmid e preparata al punto 1.1.4. Collegare il capillare a un tubo aspirante a clabo- controllato dalla bocca.

2. Prima operazione di elettroporazione in utero

  1. Posizionare un topo incinta E11.5 (strategia A) o E13.5 (strategia B) C57BL/6 all'interno di una camera a induzione chiusa con 2,5% (v/v) isoflurane a 0,8 L/min e attendere che venga anestesizzato. Trasferire il mouse al pad di riscaldamento e mettere il naso in una maschera per la consegna costante di isoflurane. Controllare l'assenza di un riflesso del pedale come indicatore di un'anestesia adeguata.
    NOTA: L'etàmbrilionica E viene determinata in base al giorno in cui viene osservato il tappo vaginale (E0.5).
  2. Iniettare sottocutaneamente la femmina incinta con la soluzione analgesica (0,1 mg/kg di buprenorphine). Per evitare che gli occhi si asciughino durante la procedura, applicare una goccia di unguento per gli occhi in ogni occhio utilizzando un tampone di cotone.
  3. Rasare l'area addominale del topo con un rasoio elettrico e lavarlo 2x con 70% (v/v) salviette di etanolo, una volta con salviette di iodio, e un'ultima volta con una salvietta di etanolo.
  4. Utilizzare le forbici per fare un'incisione lunga 30 mm attraverso la pelle nella parte destra dell'animale e separare con cura la pelle adiacente dal muscolo con una spatola smussata. Successivamente, fare una seconda incisione nella parete addominale.
  5. Coprire l'addome con un pezzo di carta velina piegata precedentemente disinfettata con 70% di etanolo contenente una fessura lunga 40 mm al suo centro. Tirare con cura l'utero dalla cavità addominale con pinze ad anello.
    NOTA: l'utero deve essere mantenuto umido con la soluzione salina calda preparata al punto 1.3.2 durante l'intera procedura.
  6. Precaricare le pipette tirate con la soluzione DNA preparata al punto 1.1.4. Iniettare 0,5 DOLLARI della soluzione di DNA per embrione nel ventricolo laterale dell'emisfero selezionato utilizzando il tubo dell'aspiratore controllato dalla bocca fino a quando il colorante verde veloce non si manifesta all'interno del ventricolo.
  7. Posizionare gli elettrodi di platino di tipo pinps lateralmente intorno alla testa dell'embrione iniettato (come mostrato nella Figura 1A e nella Figura 2A). Orientare gli elettrodi per colpire la regione cerebrale desiderata. Dirigere il polo positivo verso la parete mediale per elettropolare l'orlo corticale (strategia A) o verso la corteccia laterale (strategia B) per etichettare le cellule generate in quell'area.
    NOTA: In tutti i casi, il cuore e la placenta devono essere evitati per garantire la sopravvivenza embrionale.
  8. Applicare la sequenza specifica di impulsi elettrici con un elettroporatore a onde quadrate seguendo le indicazioni indicate nella Tabella 1 (strategia A Embrioni E11.5: quattro impulsi di 25 V e 40 ms, separati da intervalli di 950 ms; strategia B E13.5 embrioni: cinque impulsi di 35 V e 60 ms, con intervalli di 950 ms).
  9. Riposizionare con attenzione l'utero nella cavità addominale con pinze, riempirlo con soluzione salina calda e chiudere la parete addominale con una sutura ago 6-0. Unire i due lati dell'incisione iniziale fatta nella pelle utilizzando una sutura aghi 6-0 o clip di sutura.
  10. Mantenere l'animale sul pad di riscaldamento e monitorarlo fino al suo recupero dall'anestesia. Fornire una dose extra di analgesia (150 oL)   in una soluzione idrogel collocata nella sua gabbia di casa.
  11. 24 ore dopo l'intervento chirurgico, somministrare una dose extra di analgesia (150 o L). Continuare il monitoraggio quotidiano con l'ispezione visiva per possibili dolori e disagi. Osservare il comportamento dell'animale, testare i riflessi normali dell'arto posteriore e ispezionare la sutura per individuare eventuali segni di danno dovuto all'leccare o graffiare la ferita.

3. Seconda elettroporazione in utero

  1. Due giorni dopo l'intervento iniziale, ripetere i passaggi 2.1.2.3. Anche se il recupero delle femmine incinte dopo l'intervento chirurgico è molto buono, controllare che essi mostrano un comportamento normale e non presentano segni di dolore o angoscia prima di eseguire il secondo intervento chirurgico (E13.5 embrioni per la strategia A ed E15.5 per la strategia B).
  2. Fare un'incisione lunga 30 mm attraverso la pelle come nel passaggio 2.4 e una seconda incisione alla parete addominale, questa volta nel lato sinistro dell'animale. Esporre con attenzione l'utero sopra un tessuto disinfettato come descritto al punto 2.5.
    NOTA: Fare attenzione a non interferire con l'incisione precedentemente effettuata nell'altro lato.
  3. Iniettare circa 0,5 l per embrione della soluzione del DNA nel ventricolo cerebrale laterale dell'emisfero precedentemente elettropostato nel caso della strategia A e nel ventricolo cerebrale laterale dell'emisfero contralaterale per la strategia B.
    NOTA: Utilizzare solo embrioni che mostrano un normale sviluppo e nessun segno di riassorbimento.
  4. Posizionare gli elettrodi intorno alla testa dell'embrione come descritto al punto 2.7, dirigendo l'elettrodo positivo verso la corteccia laterale e applicare gli impulsi appropriati seguendo le indicazioni riportate nella tabella 1 (strategia A embrioni E13.5: cinque impulsi di 35 V e 60 ms separati da intervalli di 950 ms; strategia B E15.5 embrioni: cinque impulsi di 50 V e 80 ms separati da intervalli di 950 ms).
  5. Continuare e terminare l'intervento come descritto nei passaggi 2.8.2.10.

4. Raccolta e sezionamento dei tessuti

  1. Strategia A
    1. Quattro giorni dopo la seconda elettroporazione (E17.5), eseguire lussazione cervicale della femmina incinta e posizionarla in una posizione supina.
    2. Utilizzando le forbici, fare un'incisione ventrale per estrarre le corna uterine e con pinze metterle in un piatto Petri riempito con 1x salina tampone di fosfato (PBS) posta sul ghiaccio.
      NOTA: La bassa temperatura rende possibile l'anestesizzazione degli embrioni.
    3. Utilizzando una pinzetta, estrarre gli embrioni dal sacco amniotico e trasferirli con pinze in un nuovo piatto Petri pieno di PBS sotto un mirino di sismiferazione. Tenere con attenzione la testa degli embrioni utilizzando le pinze e condurre la dissezione cerebrale con una pinzetta per rimuovere prima la pelle sopra la testa e poi il cranio. Utilizzare una spatola per tirare fuori il cervello esposto.
    4. Raccogliere i cervelli con un cucchiaio e depositarli in un 48 piastra ben riempito con la soluzione fissativa (4% [w/v] paraformaldeide [PFA] in 1x PBS). Testare immediatamente per il risultato positivo di entrambi gli elettroporari esaminando il cervello utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito, per esempio.
    5. Fissare i cervelli embrionali durante la notte a 4 gradi centigradi in uno shaker orbitale. Lavare con 1x PBS per eliminare le tracce di PFA. Trasferirli quindi in PBS con conservanti antifungini (1x PBS-0.05% (w/v) azide di sodio).
      SOPFA e azide di sodio sono composti citotossici che richiedono precauzioni speciali durante il loro utilizzo.
    6. Incorporare i cervelli fissati nel 4% (w/v) punto di fusione basso agarose in 1x PBS e attendere 10 min fino a quando non si solidifica. Attaccarli al supporto del tessuto vibratome utilizzando colla cianoacrita con i bulbi olfattivi rivolti verso l'alto per ottenere sezioni coronali.
    7. Avviare il vibratome e selezionare i parametri desiderati: larghezza di 100 m, 0,60 m/s di velocità e 0,60 mm di ampiezza.
    8. Fissare il cervello all'interno del contenitore del vibratome, riempirlo con soluzione 1x PBS, e iniziare a raccogliere sezioni seriali coronali con l'aiuto di un pennello in una piastra 48 bene riempito con 1x PBS-0.05% (w / v) azide di sodio per avere una rappresentazione completa del cervello (ad esempio, circa sette sezioni per pozzo e sei pozzi per embrione).
    9. Montare le sezioni desiderate in vetrini di vetro al microscopio utilizzando un pennello sottile. Coprirli con copricapi in vetro. Per lo stoccaggio a lungo termine aggiungere il supporto di montaggio, che impedisce la fotosbiancatura e la fotoossidazione. Osservare i vetrini al microscopio a epifluorescenza verticale per valutare l'efficacia dell'elettroporazione.
  2. Strategia B
    1. Lasciate che i cuccioli precedentemente elettrostati a E13.5 e E15.5 siano nati e attendere fino a P15 per eseguire la perfusione transcardiale utilizzando la stessa soluzione fissativa utilizzata nel passaggio 4.1.4.
    2. Poco prima della perfusione, somministrare intraperitonealmente una dose di 75/1 mg/kg di ketamina/medetomidina. Quando il riflesso del pedale viene perso, fissare il mouse in posizione supina e fare un'incisione ventrale seguendo la linea mediana utilizzando le forbici per esporre sia la gabbia toracica che il diaframma.
    3. Tagliare il diaframma e aprire la gabbia toracica per ottenere l'accesso al cuore. Tenere la gabbia toracica con un emotostato e fare un'incisione nell'atrio destro con le forbici fini.
    4. Penetrare il ventricolo sinistro con un ago collegato con un tubo flessibile a una pompa perfusione peristale. Iniziare la perfusione transcardiale, consegnando almeno 25 mL del 4% di PFA a un flusso costante di 5,5 mL/min (tempo totale di 5 min).
    5. Dissezionare il cervello degli animali perfusi. In primo luogo, rimuovere la pelle sopra la testa con forbici e pinze. Inizia a tagliare il cranio con le forbici e tira con attenzione le sezioni delle ossa del cranio fino a quando non vengono completamente rimosse. Infine, estrarre il cervello con l'aiuto di una spatola.
    6. Trasferire i cervelli su una piastra di 24 pozze e fissarli con 4% PFA durante la notte a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale. Interrompere la fissazione sostituendo PFA con 0.05% (w/v) azide di sodio in PBS.
      NOTA: come indicato al punto 4.1.5, si consiglia di effettuare un lavaggio intermedio con 1x PBS.
    7. Ripetere i passaggi di 4.1.6-4.1.9, modificando i parametri vibratomi per i cervelli postnatali (40 larghezza m, 1,20 velocità m/s e 0,5 mm di ampiezza).
      NOTA: L'immunohistochimica o l'immunofluorescenza possono essere effettuate per rilevare specifici marcatori cellulari o migliorare il segnale delle proteine fluorescenti utilizzate nell'elettroporazione.

5. Imaging e analisi della fluorescenza confocale

  1. Accendere il microscopio confocale, posizionare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni cerebrali montate sul supporto delle diapositive del microscopio e selezionare i canali in cui verranno scattate le immagini a fluorescenza (ad esempio, 420-460 nm per BFP, 490-540 nm per GFP e 570-620 nm per mCherry e tdTomato).
  2. Eseguire la scansione dei campioni per ottenere immagini mappa di ogni sezione del cervello a due lunghezze d'onda diverse per una visione generale dell'uscita a doppia elettroposizione. Una volta terminato, selezionare l'obiettivo 10x e la modalità di osservazione multi-area-z-stack-timelapse. Ciò consentirà di programmare l'acquisizione automatica di immagini a fluorescenza in diverse localizzazioni XY z all'interno delle sezioni cerebrali.
  3. In ciascuna delle regioni scelte (XY), impostare i parametri di imaging appropriati (ad esempio, l'intensità del laser, la sensibilità al fotomoltiplicatore e una risoluzione minima di 1.024 x 1.024), nonché la profondità della scansione (a) in base ai piani del campione in cui è visibile la fluorescenza.
  4. Ottenere immagini a basso ingrandimento (10x) di tutte le regioni scelte ed esportarle dal formato OIF al formato TIFF utilizzando il software del visualizzatore al microscopio.
  5. Passare all'obiettivo 60x, ripetere il passaggio 5.3 e acquisire immagini ad alto ingrandimento per osservare le interazioni cella-cellula in modo più dettagliato. Esportarli come indicato nel passaggio 5.4.
  6. Aprire le immagini acquisite con qualsiasi software di imaging (ad esempio, Fiji) per ulteriori analisi.

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Representative Results

Le interazioni tra le cellule vicine hanno avuto origine in luoghi diversi e in tempi diversi: cellule Dijal-Retzius (cellule CR) e neuroni di proiezione corticale della migrazione precoce (strategia A)

L'interazione delle cellule CR e dei neuroni di proiezione corticale precoce è stata descritta in precedenza come necessaria per regolare la traslocazione somice tramite molecole di nectina e aderenza alla cadherina utilizzando una doppia strategia di elettroporazione8. Le cellule CR hanno origine dal neuroepitelio ai bordi del pallio e migrano tangenzialmente per popolare la parte più superficiale della corteccia, la zona marginale17,18,19, mentre i neuroni di proiezione corticale vengono generati nella zona proliferare della corteccia cerebrale e migrano radialmente nella nascente piastra corticale20. C'è una differenza temporale nella generazione di entrambi i tipi di cellule. Le cellule CR sono generate in fase embrionale molto precoce da E10.521,22 e i neuroni di proiezione corticale che migrano per traslocazione somala sono nati da E12.5–E13.523. Utilizzando la doppia elettroporazione in utero, il divario temporale tra gli interventi chirurgici consente alle cellule CR, mirate a E11.5 in uno dei suoi luoghi di origine (l'orlo corticale), di raggiungere la zona marginale della neocorteccia laterale compresa l'area somatosensoriale in tempo per stabilire contatti con neuroni di proiezione corticale etichettati a E13.5(Figura 1A,B). I principali processi di neuroni di proiezione che esprimono GFP potenziato (EGFP) si arborizzano abbondantemente nella zona marginale della corteccia e si mescolano con i processi delle cellule CR che esprimono mCherry (Figura 1C). Gli esperimenti funzionali hanno dimostrato che la perturbazione delle molecole di adesione cellulare-cellula espressa dai neuroni di proiezione o dalle cellule CR influisce sull'arborizzazione dei loro processi come conseguenza di contatti alterati tra i due tipi di cellule8.

Interazioni a lungo raggio tra cellule distali generate in tempi diversi: innervazione dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore sul lato contralaterale della neocorteccia (strategia B)

I neuroni di proiezione corticale callosi sono presenti in tutta la corteccia cerebrale, essendo più abbondanti negli strati superiori24. Questi neuroni proiettano i loro assoni attraverso il corpo calloso e contattano le loro cellule bersaglio, neuroni di proiezione situati attraverso i diversi strati della corteccia contralaterale 25,26,27. I neuroni di proiezione dello strato superiore sono evolutivamente più recenti dei neuroni di livello inferiore e sono stati notevolmente espansi nei primati28. Queste cellule sono fondamentali per il pensiero complesso e compiti associativi più elevati, e le disfunzioni in gruppi di geni specificamente espressi da questa popolazione di cellule sono state recentemente correlate con l'autismo29.

Al fine di studiare in particolare le interazioni della sottopopolazione di neuroni di proiezione callosale situati negli strati superiori con le loro cellule bersaglio distribuite in tutto l'emisfero contralaterale, abbiamo sviluppato un protocollo di elettroporazione doppio in utero. Per etichettare le cellule bersaglio dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore abbiamo eseguito in elettroporazione in utero a E13.5 utilizzando un BFP che esprime plasmide (Figura 2A-C). Questa età è stata scelta strategicamente perché permette non solo di targeting di un'ampia popolazione di neuroni di proiezione corticale tra cui molti neuroni strato-V, ma anche un numero considerevole di neuroni situati negli strati superiori (Figura 2C), fondamentalmente coprendo tutte le aree target di neuroni di proiezione callososa dall'emisfero contralaterale. Una seconda elettroporazione nel lato contralaterale a E15.5 ha preso di mira la sottopopolazione di neuroni di proiezione callosale dello strato superiore (esprimendo nEGFP e mtdTomato) (Figura 2A,B,D) ma non i neuroni di proiezione strato inferiore nati in età precedenti. La necessità di doppia elettropozione eterocronica era quindi giustificata a causa dei diversi tempi nella generazione delle cellule spettitrici di interesse e delle cellule innervate da esse. Questi neuroni mirati strato superiore inviano i loro assoni all'emisfero contralaterale con un caratteristico modello di arborizzazione (Figura 2C). Le differenze in questo tipico modello di arborizzazione assonale potrebbero essere valutate al momento del guadagno o della perdita di esperimenti di funzione nelle cellule bersaglio utilizzando questo protocollo di doppia elettrorazione. L'analisi ad alto ingrandimento mostra in dettaglio gli assoni callosali che innervavano i neuroni di proiezione mirati nell'emisfero contralaterale (Figura 2E).

Figure 2
Figura 1: Strategia A. Strategia doppia nell'utero strategia di elettroporazione per studiare le interazioni ravvicinate tra le cellule con diversa origine spaziale e temporale. (A) Gli schemi del protocollo utilizzati per indirizzare le cellule CR che esprimono i neuroni mCherry e di proiezione corticale che esprimono EGFP. (B) Immagine rappresentativa di una sezione coronale di un cervello dopo doppia elettroporazione nell'orlo corticale e nella corteccia laterale. Le cellule mirate all'orlo corticale (rosso) migrano tangenzialmente, popolando la zona marginale della neocorteccia. Le cellule etichettate nella zona ventricolare della corteccia generano neuroni di proiezione corticale (verde) che migrano radialmente per entrare nella nascente piastra corticale. Barra di scala (C) Ingrandimento dell'area in scatola nel pannello B che mostra la corteccia laterale e i due tipi di cellule etichettate dopo il protocollo di doppia elettrosazione. Linee tratteggiate incorniciano la zona marginale e la piastra corticale. Barra di scala - L'ingrandimento elevato a destra mostra un dettaglio della zona marginale contenente i processi iniziali arborizzati dei neuroni di proiezione mescolati a corpi e processi delle cellule CR. Barra di scala : 10 m. Ctx e corteccia; Orlo - orlo corticale; Mz - zona marginale; CP - piastra corticale; Iz - zona intermedia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Strategia B. Doppia strategia di elettroporazione per studiare le interazioni a lungo raggio tra cellule di diversa origine spaziale e temporale. (A) Schema che mostra la strategia per indirizzare diverse popolazioni di neuroni di proiezione corticale nella neocorteccia laterale, compresa l'area somatosensoriale in emisferi diversi per doppia elettropozione in utero. Neuroni di proiezione nella corteccia somatosensoriale dell'emisfero destro mirati a E13.5 espresso BFP. I neuroni di proiezione mirati nel lato contralaterale mirati a E15.5 hanno espresso EGFP nucleare (nEGFP) e tdTomato mirato alla membrana (mtdTomato). (B) Immagine rappresentativa di una sezione coronale di un cervello sottoposto a doppio intervento chirurgico di elettroporazione con i plasmidi menzionati nel pannello A. Si notino le diverse distribuzioni delle cellule etichettate da BFP o nEGFP e l'intensa etichettatura degli assoni dei neuroni di proiezione callosale dello strato superiore (mtdTomato) etichettati su E15.5. Barra di scala - 500 m. (C) Immagine della corteccia somatosensoriale situata nell'emisfero destro in un doppio cervello elettroporate. Si noti l'ampia distribuzione dei neuroni di proiezione (blu) tra gli strati e la abbondante arborizzazione degli assoni callosali (rosso) provenienti da neuroni di proiezione mirati nell'emisfero contralaterale. Barra di scala - 100 m. (D) Immagine della corteccia somatosensoriale nell'emisfero sinistro di un doppio cervello elettroporate. Si noti la localizzazione discreta dei neuroni di proiezione mirati nella parte superiore della piastra corticale, come mostrato dall'espressione di nEGFP (verde), così come l'etichettatura rossa abbondante corpi cellulari circostanti e tutte le proiezioni neuronali (rosso). Barra di scala (E) Immagini ad alto ingrandimento della corteccia somatosensoriale nell'emisfero destro che mostrano i dettagli dell'arborizzazione degli assoni callosali intorno ai neuroni di proiezione mirati. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Strategia Ordine di elettroporazione Celle di destinazione Regione mirata Ventricolo iniettato Posizione degli elettrodi Tensione e impulsi Plasmids usato Età dell'analisi
Un Prima CR-cell presso E11.5 Orlo Corticale A sinistra Positivo nell'emisfero sinistro (diretto verso la parete mediale) 25 V, 40 ms, 4p CAG-mCherry E17,5
Secondo Neuroni di Proiezione Corticale presso E13.5 Corteccia somatosensoriale A sinistra Positivo nell'emisfero sinistro 35 V, 60 ms, 5p CAG-EGFP
(diretto verso la corteccia)
B Prima Neuroni di Proiezione Corticale presso E13.5 Corteccia somatosensoriale A destra Positivo nell'emisfero destro 35 V, 60 ms, 5p CAG-BFP P15 (in via in edamazione
(diretto verso la corteccia)
Secondo Neuroni di Proiezione Corticale presso E15.5 Corteccia somatosensoriale A sinistra Positivo nell'emisfero sinistro 50 V, 80 ms, 5p CAG-nEGFP-2A-mTdTomato
(diretto verso la corteccia)

Tabella 1: Riepilogo delle condizioni di elettroporazione utilizzate nei diversi esperimenti.

Sopravvivenza degli embrioni in seguito alla doppia elettroporazione in utero nella strategia A
Numero di cucciolate Numero iniziale di embrioni Numero di embrioni sopravvissuti al primo EP Numero di embrioni sopravvissuti al secondo EP % di sopravvivenza dopo il primo EP % di sopravvivenza dopo il secondo EP % del tasso di sopravvivenza globale
9 Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) 75% 83.33% 62.50%
64 7.11 - 2,08 48 5,33 x 1,22 40 4.44 - 1,01
Numero di embrioni abortiti dopo il primo EP Numero di embrioni abortiti dopo il secondo EP Numero totale di embrioni abortiti % dell'aborto dopo il primo EP % dell'aborto dopo il secondo EP % del tasso globale di aborto
Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) 25% 16.66% 37.50%
16 1,8 - 1,09 8 0,88 x 0,78 24 2,67 x 1,32
La sopravvivenza e l'aborto hanno calcolato considerando gli embrioni sopravvissuti alla prima elettroporazione

Tabella 2: Sopravvivenza degli embrioni in seguito alla doppia elettroporazione in utero nella strategia A.

Sopravvivenza di embrioni e cuccioli seguendo la strategia B (doppio EP E13.5 e E15.5)
Numero di cucciolate Numero iniziale di embrioni Numero di embrioni sopravvissuti al primo EP Numero di cuccioli nati dopo il doppio EP Numero di embrioni sopravvissuti a P15 % di sopravvivenza dopo il primo EP % di sopravvivenza dopo il secondo EP % di sopravvivenza a P15
8 Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) 88.46% 82.69% 55.77%
52 6,5 x 2 46 5,75 x 2,05 43 5,38 x 1,77 29 3.63 - 1,6
Sopravvivenza di embrioni e cuccioli dopo un singolo EP all'E13.5
Numero di cucciolate Numero iniziale di embrioni Numero di cuccioli nati dopo il PE Numero di embrioni sopravvissuti a P15 % di sopravvivenza dopo il PE % di sopravvivenza a P15
11 Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) Numero totale (Media cucciolata - SD) 89.74% 57.69%
78 7.1 - 1,64 70 6,36 x 1,7 45 4,09 x 2,07

Tabella 3: Sopravvivenza dei cuccioli dopo la doppia elettroporazione in utero nella strategia B rispetto alla semplice elettroporazione.

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Discussion

Lo studio delle interazioni cellula-cellula in vivo in regioni ad alta densità cellulare come la corteccia cerebrale è un compito complesso. Gli approcci tradizionali, compreso l'uso di anticorpi per etichettare i neuriti non sono adatti a causa della mancanza di marcatori specifici per diverse popolazioni di cellule. L'uso di modelli murini transgenici, in cui un particolare tipo di cellula esprime una proteina fluorescente, è utile per visualizzare i processi neuronali, ma questo dipende dalla disponibilità di tali modelli. Questo compito è ancora più complicato quando si cerca di visualizzare possibili differenze nelle interazioni tra due tipi di cellule particolari dopo la perturbazione dei geni di interesse, perché comporta l'uso di altri modelli animali, come i topi knockout. Tutti questi problemi hanno reso questi studi complicati in passato a causa dei costi economici e temporali.

L'emergere di nuove tecniche che permettono la transgenesi somatica in vivo, come l'elettroporazione in utero, offre la possibilità di progettare strategie come quella descritta in questo protocollo, che eludono l'uso o la generazione di artisti combinati di reporter e knockout, rendendo questo tipo di esperimento più fattibile. I risultati mostrati in questa pubblicazione e gli studi8 pubblicati in precedenza dimostrano che questo protocollo 1) consente con successo il targeting di popolazioni cellulari con diversa origine temporale e spaziale; 2) rende possibile la visualizzazione dei contatti cellulare-cellula ad alta risoluzione; e 3) è utile per rilevare le differenze nei contatti cellulari dopo esperimenti funzionali.

Nonostante l'ampio uso dell'elettroporazione in utero, questa tecnica richiede un notevole addestramento per eseguire in modo sicuro l'intervento chirurgico, manipolare gli embrioni senza danneggiarli e assicurare il corretto targeting della regione desiderata. Tuttavia, dopo questo allenamento, la sopravvivenza delle femmine incinte è eccellente (circa il 100% nelle nostre mani) e non abbiamo trovato differenze tra elettroporazione singola e doppia in utero. Femmine incinte singole e doppie elettroporate si riprendono molto rapidamente dall'intervento chirurgico. Nella stragrande maggioranza dei casi, il loro comportamento il giorno dopo un intervento chirurgico singolo o doppio sembra normale e queste femmine incinte mangiano, bevono, camminano e persino si arrampicano senza difficoltà senza segni apparenti di dolore e angoscia.

Anche la sopravvivenza degli embrioni dopo il primo e il secondo elettroporazione è complessivamente buona e il tasso di aborto diminuisce con l'aumentare dell'età degli embrioni(tabella 2 e tabella 3). La difficoltà principale è il targeting di successo in entrambi gli elettroporari. Con gli embrioni più anziani da E13.5 in poi il grado di successo è molto alto. Le età precoci come E11.5 sono più impegnative perché le piccole dimensioni degli embrioni rendono più difficile la manipolazione e l'iniezione, il che influisce inoltre sulla loro sopravvivenza. Tuttavia, gli embrioni sopravvissuti al primo elettroporamento E11.5 presentano ottimi tassi di sopravvivenza dopo il secondo elettroporazione all'E13.5(tabella 2). Per migliorare la competenza con questa tecnica, si consiglia vivamente di praticare gli interventi chirurgici nei cuccioli a E14.5 e progressivamente cercando interventi chirurgici in età più giovane.

Un'altra sfida è la sopravvivenza postnatale, perché le madri sottoposte a chirurgia non sempre si prendono cura di tutti i loro cuccioli, anche se le femmine incinte singole o doppie elettrofarate forniscono i cuccioli senza problemi (Tabella 3) e il loro comportamento e il loro stato di fitness sembrano normali. Nelle nostre mani, e con i tempi qui descritti, non troviamo differenze importanti nella sopravvivenza postnatale dopo un'elettroporazione semplice e doppia (Tabella 3),ma per aggirare possibili problemi di sopravvivenza i cuccioli possono essere trasferiti alle madri affidatarie al momento della consegna quando le vere madri mostrano scarso comportamento materno alla nascita. Fornire materiale di nidificazione extra e cibo ricco alle femmine incinte prima della data di consegna può anche contribuire ad aumentare i tassi di sopravvivenza dei cuccioli.

Uno dei principali vantaggi di questa strategia è l'uso di topi di tipo selvatico per studi funzionali, ma può anche essere applicato, ad esempio, ai topi reporter CRE o ai topi dissiliper ai geni di interesse, quando disponibili. In questi topi, l'elettroporazione dei plasmidi espressi CRE-ricombinani consentirà rispettivamente l'espressione permanente del gene reporter o l'inattivazione del gene desiderato nelle cellule mirate. Per gli esperimenti funzionali possiamo anche controllare l'espressione del costrutto solo nel tipo di cellula di interesse. Ad esempio, un promotore neuronale può essere utilizzato per manipolare un gene candidato solo nei neuroni e non nelle cellule staminali neurali, prevenendo quindi effetti indesiderati a livello progenitore. Tutte queste considerazioni, insieme al controllo del tempo e alla regione bersaglio, rendono l'elettroporazione doppia mente in utero una tecnica molto versatile per studiare le interazioni cellula-cellula non solo all'interno della corteccia ma anche in altre strutture che possono essere mirate utilizzando questa tecnologia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Cristina Andrés Carbonell e i membri della struttura Animal Care dell'Universidad de Valencia per assistenza tecnica. Vogliamo anche ringraziare Isabel Farias e Sacramento R. Ferràn per i reagenti e la condivisione delle loro attrezzature con noi. I.M.W è finanziato da un contratto Garant'a Juvenil della Conselleria de Educaciàn de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D è finanziato dal Ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detiene un Ramàn y Cajal Grant (RYC-2015-19058) dal ministro spagnolo Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN). Quest'opera è stata finanziata RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-25G
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177-5EA
Baby-mixter hemostat (perfusion) Fine Science Tools (FST) 13013-14
Borosilicate glass capillary WPI 1B100-6
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) Rb Pharmaceuticals Limited 921425
CAG-BFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
Confocal microscope Olympus FV10i
Cotton Swabs BFHCVDF
Cyanoacrylate glue B. Braun Surgical 1050044
Dissecting scope Zeiss stemi 305
Dumont Forceps #5 Fine Forceps Fine Science Tools (FST) 11254-20
ECM830 Square Wave Electroporator BTX 45-0052
Electric Razor Oster 76998
Endotoxin-free TE buffer QIAGEN 1018499
Ethanol wipes BFHCVDF
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools (FST) 11150-10
Eye ointment Alcon 682542.6
Fast Green dye Sigma-Aldrich F7252-5G
Fine Scissors Fine Science Tools (FST) 14069-09
Fluorescence LEDs CoolLED pE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) Fine Science Tools (FST) 91308-12
Heating Pad UFESA AL5514
Inverted epifluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-S
Iodine wipes Lorsoul
Isofluorane vaporizer Flow-Meter A15B5001
Isoflurane Karizoo 586259
Ketamine (Anastemine) Fatro Ibérica SL 583889-2
Kimtech precision wipes Kimberly-Clark 7252
LB (Lennox) Agar GEN Labkem AGLB-00P-500
LB (Lennox) broth GEN Labkem LBBR-00P-500
Low-melting point agarose Fisher Scientific BP165-25
Medetomidine (Sedator) Dechra 573749.2
Microscope coverslips Menel-Gläser 15747592
Microscope Slides Labbox SLIB-F10-050
Mounting medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Mutiwell plates (24) SPL Life Sciences 32024
Mutiwell plates (48) SPL Life Sciences 32048
NaCl (for saline solution) Fisher Scientific 10112640
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Orbital incubator S150 Stuart Scientific 5133
P Selecta Incubator J. P. Selecta, s.a. 0485472
Paraformaldehyde PanReac AppliedChem A3813
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Peristaltic perfusion pump Cole-Parmer EW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter Btx 45-0489
Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 AgnThos 203-1000
Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm AgnThos 204-1000
Ring Forceps Fine Science Tools (FST) 11103-09
Sodium azide PanReac AppliedChem 122712-1608
Surgical absorbent pad (steryle) HK Surgical PD-M
Suture (Surgicryl PGA 6-0) SMI Suture Materials BYD11071512
Syringe 1ml (BD plastipak) Becton, Dickinson and Company 303172
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
Vertical Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-30
Vertical microscope Nikon Eclipse Ni
Vibratome Leica VT1200S

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Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente
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Mateos-White, I., Fabra-Beser, J.,More

Mateos-White, I., Fabra-Beser, J., de Agustín-Durán, D., Gil-Sanz, C. Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations. J. Vis. Exp. (160), e61046, doi:10.3791/61046 (2020).

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