Summary
O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.
Abstract
No útero a eletroporação é uma técnica de transferência de DNA in vivo amplamente usada para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à corticogênese dos mamíferos. Este procedimento aproveita os ventrículos cerebrais para permitir a introdução do DNA de interesse e usa um par de eletrodos para direcionar a entrada do material genético para as células que revestem o ventrículo, as células-tronco neurais. Este método permite que os pesquisadores rotulem as células desejadas e/ou manipulem a expressão de genes de interesse nessas células. Possui várias aplicações, incluindo ensaios direcionados à migração neuronal, rastreamento de linhagem e localização axonal. Uma característica importante deste método é o seu controle temporal e regional, permitindo a evasão de potenciais problemas relacionados com a letalidade embrionária ou a falta de ratos condutores de CRE específicos. Outro aspecto relevante dessa técnica é que ela ajuda a reduzir consideravelmente as limitações econômicas e temporais que envolvem a geração de novas linhas de camundongos, que se tornam particularmente importantes no estudo de interações entre tipos celulares que se originam em áreas distantes do cérebro em diferentes idades de desenvolvimento. Aqui descrevemos uma estratégia de eletroporação dupla que permite o direcionamento de populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Com essa abordagem podemos rotular diferentes subtipos de células em diferentes locais com proteínas fluorescentes selecionadas para visualizá-las, e/ou podemos manipular genes de interesse expressos por essas diferentes células nos momentos apropriados. Essa estratégia aumenta o potencial da eletroporação uteral e fornece uma poderosa ferramenta para estudar o comportamento de populações celulares temporais e espacialmente separadas que migram para estabelecer contatos próximos, bem como interações de longo alcance através de projeções axonais, reduzindo custos temporais e econômicos.
Introduction
O córtex cerebral é uma estrutura muito complexa e intrincadamente organizada. Para alcançar tal grau de organização, os neurônios de projeção cortical passam por processos complexos de desenvolvimento que requerem sua geração temporal, migração para seu destino final na placa cortical e o estabelecimento de conexões de curto e longo alcance1,,2. Por muito tempo, a maneira clássica de estudar corticogênese foi baseada no uso de modelos murinos de nocaute ou knock-in de genes de interesse. No entanto, essa estratégia, e particularmente o uso de camundongos eliminatórios condicionais, é demorada e cara, e às vezes apresenta problemas adicionais quanto à existência de redundância genética ou à falta de drivers específicos de CRE, entre outras questões. Uma das abordagens que surgiram para tentar resolver esses problemas e que hoje é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cortical está na eletroporaçãoutero 3,4. No útero a eletroporação é uma técnica usada para transgênese somática, permitindo o direcionamento in vivo de células-tronco neurais e sua prole. Este método pode ser usado para rotular células pela expressão de proteínas fluorescentes5,6, para manipulação genética in vivo (ou seja, ganho ou perda de ensaios de função)7,8,9, para isolar cortices eletroporados in vitro e cultura de células8,,10. Além disso, no útero a eletroporação permite o controle temporal e regional da área alvo. Esta técnica possui inúmeras aplicações e tem sido amplamente utilizada para estudar migração neuronal, divisão de células-tronco, conectividade neuronal e outros sujeitos8,,9,,11,12.
O manuscrito atual descreve o uso de uma variante de eletroporação uteral, denominada dupla em eletroporação uteral, para analisar as interações das células no córtex cerebral com diferentes origens temporais e espaciais. Esses estudos são extremamente complexos de serem concluídos ao empregar modelos murinos porque requerem o uso combinado de várias linhas transgênicas. Algumas das aplicações do protocolo descrito neste artigo incluem o estudo de interações próximas entre células vizinhas, bem como interações entre células distantes através de projeções de longo alcance. O método requer a realização de duas cirurgias de eletroporação uteral, separadas temporal e espacialmente, nos mesmos embriões para atingir diferentes populações celulares de interesse. A vantagem dessa abordagem é a possibilidade de manipular a função genética em um ou ambos os tipos de neurônios usando animais do tipo selvagem. Além disso, esses experimentos funcionais podem ser combinados com a expressão de proteínas fluorescentes citoplasmáticas ou marcadas por membrana para visualizar a morfologia fina das células-alvo, incluindo dendritos e axônios, e analisar possíveis diferenças nas interações celulares em comparação com um controle (ou seja, células apenas rotuladas com a proteína fluorescente).
O protocolo delineado aqui é focado no estudo das interações celulares dentro do neocórtex, mas essa estratégia também poderia ser usada para examinar interações com áreas extracorticais que podem ser direcionadas usando na eletroporação utero, como o subpallium ou o tálamo13,14, ou interações célula-células em outras estruturas, como o cerebelo15. O direcionamento de diferentes áreas baseia-se na orientação dos eletrodos e no ventrículo onde o DNA é injetado (lateral, terceiro ou quarto). Com a estratégia descrita aqui, podemos rotular um número substancial de células, o que é útil para avaliar mudanças gerais na conectividade/inervação em experimentos funcionais. No entanto, para estudar mudanças finas na conectividade, pode-se usar versões modificadas de eletroporação uteróptero para obter rotulagem mais esparsa e identificar células únicas16. Em resumo, o dobro da eletroporação uteral é um método versátil que permite direcionar populações celulares temporais e espacialmente separadas e estudar suas interações em detalhes, seja em condições de controle ou combinadas com experimentos funcionais, reduzindo consideravelmente os custos temporais e econômicos.
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Protocol
O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação, pelo bem-estar animal da Universidad de Valência e da Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica da Comunidad Valenciana, e adere às diretrizes do Conselho Internacional de Ciência Animal Laboratorial (ICLAS) revisado no Real Decreto 53/2013 da legislação espanhola, bem como na Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho.
NOTA: Este protocolo envolve dois propósitos diferentes: 1) o primeiro estudo, chamado de "estratégia A", permite a análise das interações entre as células de Cajal-Retzius (células CR) e os neurônios de projeção cortical de nascimento precoce dentro do mesmo hemisfério cerebral; 2) o segundo estudo, "estratégia B", é realizado a fim de examinar a inervação dos neurônios de projeção calosal da camada superior para o lado contralateral do neocórtex.
1. Preparação pré-cirurgia
- Preparação de DNA
- Transforme as células E. coli DH5α quimicamente ou eletrocompetente com os plasmídeos de interesse, emplaque-as em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado e incuba-as durante a noite a 37 °C.
NOTA: Todos os plasmídeos utilizados aqui contêm o promotor geral para frango β-actin (CAG) conduzindo a expressão de uma proteína fluorescente-repórter (CAG-mCherry e CAG-EGFP para a estratégia A e CAG-BFP e CAG-nEGFP-2A-mtdTomato para a estratégia B). Todos eles contêm resistência à ampicilina (AMP). - Escolha colônias individuais de cada transformação plasmida e inicie uma cultura líquida inicial em 2 mL de caldo de Luria + ampicilina (LB+AMP) em tubos de cultura bacteriana durante 3-4 h a 37 °C com agitação vigorosa (200 rpm). Depois, defina uma cultura bacteriana maior em um frasco de 500 mL Erlenmeyer adicionando 200 mL de LB+AMP e 1 mL da cultura inicial. Incubar durante a noite a 37 °C no agitador orbital a 200 rpm.
- Use um kit maxi-prep livre de endotoxinas(Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante para obter DNA plasmídeo puro e concentrado das culturas líquidas. Resuspenque o DNA em ~50-100 μL de tampão Tris-EDTA (TE) livre de endotoxina para obter concentrações de pelo menos 5 μg/μL.
- Para cada cirurgia, prepare uma solução com um volume final de 10 μL contendo 1 μL de corante verde rápido, solução de DNA plasmida de interesse para uma concentração final de 1 μg/μL para cada plasmídeo e tampão de TE livre de endotoxina. Por exemplo, misture 1 μL de corante verde rápido, 2 μL de uma solução de DNA plasmídeo de 5 μg/μL e 7 μL de tampão de TE.
- Transforme as células E. coli DH5α quimicamente ou eletrocompetente com os plasmídeos de interesse, emplaque-as em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado e incuba-as durante a noite a 37 °C.
- Pipeta puxando
- Puxe capilares de vidro borossilicato (1/0,58 mm de diâmetro externo/interno) em um puxador de micropipette vertical até que a ponta atinja um comprimento de 1-1,5 cm e corte-o usando fórceps dissecando em um ângulo de aproximadamente 30° sob um escopo dissecando.
- Configuração da sala de cirurgia
- Coloque todo o equipamento na mesa de operação (ou seja, pinças, tesouras, fórceps, micropipettos, agulha e porta-agulhas). Ligue a almofada de aquecimento e cubra-a com uma almofada absorvente cirúrgica estéril. Certifique-se de que o reservatório na máquina para anestesia de inalação esteja cheio de isoflurane, o tanque de oxigênio contém oxigênio suficiente, e o sistema funciona corretamente.
NOTA: A sala de cirurgia e o material resistente devem ser mantidos o mais estéril possível (ou seja, todo o material deve ser autoclavado antes da cirurgia e as superfícies devem ser higienizadas com 70% de etanol). Os eletrodos de platina precisam ser cuidadosamente desinfetados primeiro com sabão germicidal e segundo com 70% de etanol antes da cirurgia. - Prepare 100 mL de solução salina estéril de 0,9% (p/v) contendo penicilina-estreptomicina 1:100 e encha uma placa de Petri de 10 cm. Coloque a placa em cima da almofada aquecida para aquecer a solução.
- Encha uma seringa de 1 mL com 150 μL de solução analgésico (por exemplo, 0,1 mg/kg buprenorfina).
- Carregue a pipeta puxada com 5 μL da solução final de DNA plasmídeo preparada na etapa 1.1.4. Conecte o capilar a um tubo aspirador controlado pela boca.
- Coloque todo o equipamento na mesa de operação (ou seja, pinças, tesouras, fórceps, micropipettos, agulha e porta-agulhas). Ligue a almofada de aquecimento e cubra-a com uma almofada absorvente cirúrgica estéril. Certifique-se de que o reservatório na máquina para anestesia de inalação esteja cheio de isoflurane, o tanque de oxigênio contém oxigênio suficiente, e o sistema funciona corretamente.
2. Primeiro na cirurgia de eletroporação do útero
- Coloque um e11.5 (estratégia A) ou E13,5 (estratégia B) C57BL/6 mouse gestante dentro de uma câmara de indução fechada com isoflurane de 2,5% (v/v) a 0,8 L/min e espere até que seja anestesiado. Transfira o mouse para a almofada de aquecimento e coloque seu nariz em uma máscara para entrega constante de isoflurane. Verifique a ausência de um reflexo do pedal como um indicador de anestesia adequada.
NOTA: Aidade e mbryônica é determinada com base no dia em que o plugue vaginal é observado (E0.5). - Injete subcutânea a gestante com a solução analgésico (0,1 mg/kg buprenorfina). Para evitar que os olhos sequem durante o procedimento, aplique uma gota de pomada ocular em cada olho usando um cotonete.
- Raspe a área abdominal do rato com uma navalha elétrica e lave-a 2x com 70% (v/v) lenços de etanol, uma vez com lenços de iodo, e uma última vez com uma limpeza de etanol.
- Use uma tesoura para fazer uma incisão de 30 mm de comprimento através da pele no lado direito do animal e separar cuidadosamente a pele adjacente do músculo com uma espátula cega. Depois, faça uma segunda incisão na parede abdominal.
- Cubra o abdômen com um pedaço de papel de tecido dobrado anteriormente desinfetado com 70% de etanol contendo uma fenda de 40 mm de comprimento em seu centro. Puxe cuidadosamente o útero da cavidade abdominal com fórceps do anel.
NOTA: O útero deve ser mantido molhado com a solução salina quente preparada na etapa 1.3.2 durante todo o procedimento. - Précar as pipetas puxadas com a solução de DNA preparada na etapa 1.1.4. Injete ~0,5 μL da solução de DNA por embrião no ventrículo lateral do hemisfério selecionado usando o tubo aspirador controlado pela boca até que o corante verde rápido seja perceptível dentro do ventrículo.
- Coloque eletrodos de platina do tipo fórceps lateralmente ao redor da cabeça do embrião injetado (como mostrado na Figura 1A e Figura 2A). Oriente os eletrodos para atingir a região cerebral desejada. Direcione o polo positivo para a parede medial para eletroporar a baça cortical (estratégia A) ou para o córtex lateral (estratégia B) para rotular células geradas nessa área.
NOTA: Em todos os casos, o coração e a placenta devem ser evitados para garantir a sobrevivência embrionária. - Aplique a sequência específica de pulsos elétricos com um eletroporador de ondas quadradas seguindo as indicações mostradas na Tabela 1 (estratégia A E11.5 embriões: quatro pulsos de 25 V e 40 ms, separados por intervalos de 950 ms; estratégia B E13,5 embriões: cinco pulsos de 35 V e 60 ms, com intervalos de 950 ms).
- Coloque cuidadosamente o útero de volta na cavidade abdominal com fórceps, preencha-o com solução salina quente e feche a parede abdominal com uma agulha 6-0 sutura. Junte-se aos dois lados da incisão inicial feita na pele usando uma agulha 6-0 sutura ou clipes de sutura.
- Mantenha o animal na almofada de aquecimento e monitore-o até sua recuperação da anestesia. Forneça uma dose extra de analgesia (150 μL) em uma solução de hidrogel colocada em sua gaiola doméstica.
- 24 horas após a cirurgia, administre uma dose extra de analgesia (150 μL). Continue o monitoramento diário por inspeção visual para possíveis dores e angústias. Observe o comportamento do animal, teste seus reflexos normais do membro traseiro e inspecione a sutura em busca de possíveis sinais de dano devido à lambida ou arranhão da ferida.
3. Segundo em eletroporação uteróptero
- Dois dias após a cirurgia inicial, repita os passos 2.1-2.3. Embora a recuperação das gestantes após a cirurgia seja muito boa, verifique se elas apresentam comportamento normal e não apresentam sinais de dor ou angústia antes de realizar a segunda cirurgia (embriões E13,5 para a estratégia A e E15,5 para a estratégia B).
- Faça uma incisão de 30 mm de comprimento através da pele como na etapa 2.4 e uma segunda incisão na parede abdominal, desta vez no lado esquerdo do animal. Expor cuidadosamente o útero em cima de um tecido desinfetado como descrito na etapa 2.5.
NOTA: Tenha cuidado para não interferir com a incisão feita anteriormente no outro lado. - Injete cerca de 0,5 μL por embrião da solução de DNA no ventrículo cerebral lateral do hemisfério previamente eletroporado no caso da estratégia A e no ventrículo cerebral lateral do hemisfério contralateral para a estratégia B.
NOTA: Utilize apenas embriões que mostem desenvolvimento normal e sem sinais de reabsorção. - Coloque os eletrodos ao redor da cabeça do embrião conforme descrito na etapa 2.7, Direcionando o eletrodo positivo para o córtex lateral e aplique os pulsos apropriados seguindo as indicações apresentadas na Tabela 1 (estratégia A E13.5 embriões: cinco pulsos de 35 V e 60 ms separados por intervalos de 950 ms; estratégia B E15,5 embriões: cinco pulsos de 50 V e 80 ms separados por intervalos de 950 ms).
- Continue e termine a cirurgia conforme descrito nas etapas 2.8-2.10.
4. Colheita e secção de tecidos
- Estratégia A
- Quatro dias após a segunda eletroporação (E17.5), realizar deslocamento cervical da gestante e colocá-la em posição supina.
- Usando uma tesoura, faça uma incisão ventral para extrair os chifres uterinos e com fórceps coloque-os em uma placa de Petri cheia de 1x salina tamponada com fosfato (PBS) colocada no gelo.
NOTA: A baixa temperatura torna possível a anestesia dos embriões. - Usando pinças, extraia os embriões do saco amniótico e transfira-os com fórceps para uma nova placa de Petri cheia de PBS sob um escopo dissecando. Segure cuidadosamente a cabeça dos embriões usando fórceps e conduza a dissecção cerebral com pinças para primeiro remover a pele sobre a cabeça e, em seguida, o crânio. Use uma espátula para arrancar os cérebros expostos.
- Colete os cérebros com uma colher e deposite-os em uma placa de 48 poços preenchida com a solução fixa (4% [w/v] paraformaldeído [PFA] em 1x PBS). Teste imediatamente para o resultado bem sucedido de ambas as eletroporações examinando os cérebros usando um microscópio de epifluorescência invertida, por exemplo.
- Fixar os cérebros embrionários durante a noite a 4 °C em um agitador orbital. Lave com 1x PBS para eliminar traços de PFA. Em seguida, transfira-os para a PBS com conservantes antifúngicos (1x PBS-0,05% (w/v) azida de sódio).
ATENÇÃO: PFA e azida de sódio são compostos citotóxicos que requerem precaução especial durante sua utilização. - Incorpore os cérebros fixados em 4% (w/v) ponto de fusão baixo surgiu em 1x PBS e espere ~10 min até que se solidifique. Coloque-os no suporte do tecido vibratome usando cola cianoacrilato com as lâmpadas olfativas voltadas para cima para obter seções coronais.
- Inicie o vibratome e selecione os parâmetros desejados: 100 μm de largura, 0,60 μm/s de velocidade e 0,60 mm de amplitude.
- Fixar o cérebro dentro do recipiente de vibratome, preenchê-lo com solução pbs 1x e começar a coletar seções coronárias com a ajuda de um pincel em uma placa de 48 poços preenchido com 1x PBS-0,05% (w/v) azida de sódio para ter uma representação completa do cérebro (por exemplo, cerca de sete seções por poço e seis poços por embrião).
- Monte as seções desejadas em lâminas de vidro de microscópio usando uma escova fina. Cubra-os com tampas de vidro. Para o armazenamento de longo prazo adicione meio de montagem, o que evita fotobleaching e fotooxidação. Observe os slides sob um microscópio de epifluorescência vertical para avaliar a eficácia da eletroporação.
- Estratégia B
- Que os filhotes previamente eletroporados em E13.5 e E15.5 nasçam e esperem até P15 para realizar a perfusão transcárdia utilizando a mesma solução fixativa utilizada na etapa 4.1.4.
- Pouco antes da perfusão, administram intraperitonealmente uma dose de 75/1 mg/kg de cetamina/medetomidina. Quando o reflexo do pedal for perdido, fixe o mouse em uma posição supina e faça uma incisão ventral seguindo a linha média usando uma tesoura para expor tanto a caixa torácica quanto o diafragma.
- Corte o diafragma e abra a caixa torácica para ter acesso ao coração. Segure a caixa torácica usando um hemosta e faça uma incisão no átrio direito com uma tesoura fina.
- Penetre o ventrículo esquerdo com uma agulha conectada com um tubo flexível a uma bomba de perfusão peristáltica. Inicie a perfusão transcárlica, entregando pelo menos 25 mL de 4% pfa a um fluxo constante de 5,5 mL/min (tempo total ~5 min).
- Dissecar o cérebro de animais perfumados. Primeiro, remova a pele sobre a cabeça com tesouras e fórceps. Comece a cortar o crânio usando uma tesoura e retire cuidadosamente seções dos ossos do crânio até que eles sejam completamente removidos. Finalmente, extrair o cérebro com a ajuda de uma espátula.
- Transfira os cérebros para uma placa de 24 poços e fixe-os com 4% de PFA durante a noite a 4 °C em um agitador orbital. Pare a fixação substituindo pfa por 0,05% (w/v) azida de sódio em PBS.
NOTA: Conforme indicado na etapa 4.1.5, é aconselhável realizar uma lavagem intermediária com 1x PBS. - Repetir passos 4.1.6−4.1.9, alterando os parâmetros vibratome para cérebros pós-natais (40 μm de largura, 1,20 μm/s de velocidade e 0,5 mm de amplitude).
NOTA: A imunohistoquímica ou a imunofluorescência podem ser realizadas para detectar marcadores celulares específicos ou melhorar o sinal de proteínas fluorescentes usadas na eletroporação.
5. Imagem e análise de fluorescência confocal
- Ligue o microscópio confocal, coloque os slides do microscópio contendo as seções cerebrais montadas no suporte de slides do microscópio e selecione os canais nos quais as imagens de fluorescência serão tiradas (ou seja, 420-460 nm para BFP, 490-540 nm para GFP e 570-620 nm para mCherry e tdTomato).
- Realize a varredura de amostras para obter imagens de mapa de cada seção cerebral em dois comprimentos de onda diferentes para uma visão geral da saída de eletroporação dupla. Uma vez concluída, selecione a lente 10x e o modo de observação timelapse multi-área-Z-stack-timelapse. Isso permitirá a programação da aquisição automática de imagens de fluorescência em diferentes localizações XYZ dentro de seções cerebrais.
- Em cada uma das regiões escolhidas (XY), defina parâmetros adequados de imagem (ou seja, intensidade do laser, sensibilidade fotomultiplier e resolução mínima de 1.024 x 1.024), bem como a profundidade da varredura (Z) de acordo com os planos da amostra onde a fluorescência é visível.
- Obtenha imagens de baixa ampliação (10x) de todas as regiões escolhidas e exporte-as do formato OIF para TIFF usando o software de visualizador de microscópio.
- Mude para a lente 60x, repita o passo 5.3 e capture imagens de alta ampliação para observar as interações célula-célula de forma mais detalhada. Exportá-los conforme indicado na etapa 5.4.
- Abra as imagens adquiridas com qualquer software de imagem (por exemplo, Fiji) para análise posterior.
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Representative Results
As interações entre as células vizinhas originaram-se em locais distais e em diferentes épocas: células de Cajal-Retzius (células CR) e neurônios de projeção cortical migratórios precoces (estratégia A)
A interação das células de CR e dos neurônios de projeção cortical precoce foi descrita anteriormente como necessária para regular a translocação somal via moléculas de adesão de néctina e cadherina usando uma estratégia de eletroporação dupla8. As células-CR originam-se do neuroepithelium nas bordas do pálio e migram tangencialmente para povoar a parte mais superficial do córtex, a zona marginal17,,18,,19, enquanto os neurônios de projeção cortical são gerados na zona proliferativa do córtex cerebral e migram radialmente para a nascente placa cortical20. Há uma diferença temporal na geração de ambos os tipos de células. As células-CR são geradas em estágios embrionários muito precoces a partir de E10.521,22 e os neurônios de projeção cortical que migram por translocação somal nascem de E12.5-E13.523. Utilizando o dobro na eletroporação uteral, a lacuna temporal entre as cirurgias permite que as células de CR, direcionadas ao E11,5 em um de seus locais de origem (a baça cortical), atinjam a zona marginal do neocórtex lateral, incluindo a área somatosensorial a tempo de estabelecer contatos com neurônios de projeção cortical rotulados em E13,5 (Figura 1A,B). Os principais processos de neurônios de projeção expressando GFP aprimorado (EGFP) profusamente arborizam na zona marginal do córtex e se misturam com os processos de células CR que expressam mCherry (Figura 1C). Experimentos funcionais mostraram que a perturbação de moléculas de adesão celular expressa por neurônios de projeção ou células CR afeta a arborização de seus processos como consequência de contatos alterados entre ambos os tipos de células8.
Interações de longo alcance entre células distais geradas em diferentes momentos: inervação de neurônios de projeção calosal de camada superior para o lado contralateral do neocórtex (estratégia B)
Os neurônios de projeção cortical calosal estão presentes em todo o córtex cerebral, sendo mais abundantes nas camadas superiores24. Esses neurônios projetam seus axônios através do corpo caloso e entram em contato com suas células-alvo, neurônios de projeção localizados nas diferentes camadas do córtex contralateral 25,,26,,27. Os neurônios de projeção da camada superior são evolutivamente mais novos que os neurônios de camada inferior e foram muito expandidos em primatas28. Essas células são críticas para o pensamento complexo e tarefas associativas mais elevadas, e disfunções em grupos de genes especificamente expressos por essa população de células foram recentemente relacionadas com o autismo29.
Para estudar especificamente as interações da subpopulação de neurônios de projeção calisais localizados nas camadas superiores com suas células-alvo distribuídas por todo o hemisfério contralateral, desenvolvemos um duplo no protocolo de eletroporação utero. Para rotular as células-alvo dos neurônios de projeção calosal de camada superior realizamos na eletroporação utericana em E13.5 utilizando um plasmídeo expresso BFP(Figura 2A−C). Esta idade foi estrategicamente escolhida porque permite não apenas atingir uma ampla população de neurônios de projeção cortical, incluindo muitos neurônios de camada V, mas também um número considerável de neurônios localizados em camadas superiores(Figura 2C),basicamente cobrindo todas as áreas alvo de neurônios de projeção calisais do hemisfério contralateral. Uma segunda eletroporação no lado contralateral em E15.5 teve como alvo a subpopulação do neurônio de projeção calosal da camada superior (expressando nEGFP e mtdTomato)(Figura 2A,B,D), mas não os neurônios de projeção de camada inferior nascidos em idades anteriores. A necessidade de eletroporação dupla heterocrônica foi, portanto, justificada devido aos diferentes tempos na geração das células de interesse projetadas e das células inervadas por elas. Esses neurônios alvos de camada superior enviam seus axônios para o hemisfério contralateral com um padrão de arborização característico(Figura 2C). Diferenças neste padrão típico de arborização axonal poderiam ser avaliadas após o ganho ou perda de experimentos de função em células-alvo usando este protocolo de eletroporação dupla. A análise de alta ampliação mostra em detalhes os axônios calosais que inervam neurônios de projeção direcionados no hemisfério contralateral(Figura 2E).
Figura 1: Estratégia A. Dupla na estratégia de eletroporação uteral para estudar interações próximas entre células com diferentes origens espaciais e temporais. (A) Esquemas do protocolo utilizado para atingir células cr expressando mCherry e neurônios de projeção cortical expressando EGFP. (B) Imagem representativa de uma seção coronal de um cérebro após eletroporação dupla na córmã cortical e no córtex lateral. As células alvo da baça cortical (vermelha) migram tangencialmente, povoando a zona marginal do neocórtex. Células rotuladas na zona ventricular do córtex geram neurônios de projeção cortical (verde) que migram radialmente para entrar na placa cortical nascente. Barra de escala = 200 μm. (C) Ampliação da área encaixotada no painel B exibindo o córtex lateral e os dois tipos de células rotuladas após o protocolo de eletroporação dupla. As linhas tracejadas enquadram a zona marginal e a placa cortical. Barra de escala = 100 μm. Alta ampliação à direita mostra um detalhe da zona marginal contendo os processos de liderança arborizados dos neurônios de projeção misturados com corpos e processos de células CR. Barra de escala = 10 μm. Ctx = córtex; Hem = baça cortical; MZ = zona marginal; CP = placa cortical; IZ = zona intermediária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia B. Estratégia de eletroporação dupla para estudar interações de longo alcance entre células com diferentes origens espaciais e temporais. (A) Esquema exibindo a estratégia para atingir diferentes populações de neurônios de projeção cortical no neocórtex lateral, incluindo a área somatossensorial em diferentes hemisférios, em dobro na eletroporação utertica. Neurônios de projeção no córtex somatosensorial do hemisfério direito direcionados a E13,5 expressaram BFP. Neurônios de projeção direcionados no lado contralateral direcionados ao EGFP (nEGFP) e tdTomato (mtdTomato) expressos em EGFP (nEGFP) e tdTomato (mtdTomato). (B) Imagem representativa de uma seção coronal de um cérebro que foi submetida a cirurgia de eletroporação dupla com os plasmídeos mencionados no painel A. Observe as diferentes distribuições das células rotuladas por BFP ou nEGFP e a rotulagem intensa dos axônios dos neurônios de projeção calosal de camada superior (mtdTomato) rotulados em E15.5. Barra de escala = 500 μm. (C) Imagem do córtex somatosensorial localizado no hemisfério direito em um cérebro eletroporado duplo. Note a ampla distribuição dos neurônios de projeção (azul) através das camadas e a arborização profusa dos axônios calisais (vermelho) provenientes de neurônios de projeção direcionados no hemisfério contralateral. Barra de escala = 100 μm. (D) Imagem do córtex somatosensorial no hemisfério esquerdo de um cérebro eletroporado duplo. Observe a localização discreta dos neurônios de projeção direcionados na parte superior da placa cortical, como mostra a expressão de nEGFP (verde), bem como a rotulagem vermelha profusa em torno de corpos celulares e todas as projeções neuronais (vermelho). Barra de escala = 100 μm. (E) Imagens de alta ampliação do córtex somatosensorial no hemisfério direito mostrando detalhes da arborização dos axônios calisais em torno de neurônios de projeção direcionados. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estratégia | Ordem de eletroporação | Células-alvo | Região-alvo | Ventrículo injetado | Localização dos eletrodos | Tensão e pulsos | Plasmídeos usados | Idade da análise |
| Um | Primeiro | CÉLULA DE CR em E11.5 | Cortical Hem | Deixou | Positivo no hemisfério esquerdo (direcionado para a parede medial) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | E17,5 |
| Segundo | Neurônios de projeção cortical em E13.5 | Córtex Somatosensorial | Deixou | Positivo no hemisfério esquerdo | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (direcionado para o córtex) | ||||||||
| B | Primeiro | Neurônios de projeção cortical em E13.5 | Córtex Somatosensorial | Certo | Positivo no hemisfério direito | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 |
| (direcionado para o córtex) | ||||||||
| Segundo | Neurônios de projeção cortical em E15.5 | Córtex Somatosensorial | Deixou | Positivo no hemisfério esquerdo | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (direcionado para o córtex) |
Tabela 1: Resumo das condições de eletroporação utilizadas nos diferentes experimentos.
| Sobrevivência de embriões após duplo na eletroporação uteria na Estratégia A | |||||||||
| Número de ninhadas | Número inicial de embriões | Número de embriões sobreviventes do primeiro EP | Número de embriões sobreviventes do segundo EP | % de sobrevivência após o primeiro EP | % de sobrevivência após o segundo EP* | % da taxa de sobrevivência global | |||
| 9 | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7,11 ± 2,08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4,44 ± 1,01 | ||||
| Número de embriões abortados após o primeiro EP | Número de embriões abortados após o segundo EP | Número total de embriões abortados | % do aborto após o primeiro EP | % do aborto após o segundo EP* | % da taxa global de aborto | ||||
| Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 ± 1,09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| *Sobrevivência e aborto calculados considerando os embriões que sobreviveram à primeira eletroporação | |||||||||
Tabela 2: Sobrevivência de embriões seguindo o dobro na eletroporação uteródica na Estratégia A.
| Sobrevivência de embriões e filhotes seguindo a Estratégia B (EP duplo E13.5 e E15.5) | |||||||||||
| Número de ninhadas | Número inicial de embriões | Número de embriões sobreviventes do primeiro EP | Número de filhotes nascidos após o DUPLO EP | Número de embriões sobreviventes em P15 | % de sobrevivência após o primeiro EP | % de sobrevivência após segundo EP | % de sobrevivência em P15 | ||||
| 8 | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3,63 ± 1,6 | ||||
| Sobrevivência de embriões e filhotes após um único EP no E13.5 | ||||||||
| Número de ninhadas | Número inicial de embriões | Número de filhotes nascidos após o PE | Número de embriões sobreviventes em P15 | % de sobrevivência após o PE | % de sobrevivência em P15 | |||
| 11 | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | Número total | (Avg. lixo ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 ± 1,64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4,09 ± 2,07 | |||
Tabela 3: Sobrevivência de filhotes seguindo o dobro na eletroporação uteródica na Estratégia B em comparação com a eletroporação simples.
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Discussion
O estudo das interações célula-células in vivo em regiões com alta densidade celular como o córtex cerebral é uma tarefa complexa. Abordagens tradicionais, incluindo o uso de anticorpos para rotular neurites, não são adequadas devido à falta de marcadores específicos para diferentes populações celulares. O uso de modelos transgênicos de murina, onde um determinado tipo de célula expressa uma proteína fluorescente, é útil para visualizar os processos neuronais, mas isso depende da disponibilidade de tais modelos. Essa tarefa é ainda mais complicada ao tentar visualizar possíveis diferenças nas interações entre dois tipos de células particulares após perturbação dos genes de interesse, pois envolve o uso de outros modelos animais, como ratos de nocaute. Todas essas questões complicaram esses estudos no passado devido aos custos econômicos e temporais.
O surgimento de novas técnicas que permitem transgênese somática in vivo, como na eletroporação uteral, oferece a possibilidade de projetar estratégias como a descrita neste protocolo, que contornam o uso ou geração de animais combinados de repórter e nocaute, tornando esse tipo de experimento mais viável. Os resultados apresentados nesta publicação e estudos publicados anteriormente8 demonstram que este protocolo 1) permite com sucesso o direcionamento de populações celulares com diferentes origens temporais e espaciais; 2) possibilita a visualização de contatos célula-célula com alta resolução; e 3) é útil para detectar diferenças nos contatos celulares após experimentos funcionais.
Apesar do amplo uso da eletroporação utertica, esta técnica requer treinamento considerável para realizar a cirurgia com segurança, manipular os embriões sem danificá-los e garantir o direcionamento correto da região desejada. No entanto, após esse treinamento, a sobrevivência das fêmeas grávidas é excelente (cerca de 100% em nossas mãos) e não encontramos diferenças entre solteiro e duplo na eletroporação uterá.. Mulheres grávidas eletroporadas solteiras e duplas se recuperam muito rapidamente da cirurgia. Na grande maioria dos casos, seu comportamento no dia seguinte à cirurgia única ou dupla parece normal e essas fêmeas grávidas comem, bebem, caminham e até sobem sem dificuldades sem sinais aparentes de dor e angústia.
A sobrevivência dos embriões após a primeira e a segunda eletroporação também é boa no geral, e a taxa de aborto diminui à medida que a idade dos embriões aumenta(Tabela 2 e Tabela 3). A principal dificuldade é o sucesso de segmentação em ambas as eletroporações. Com embriões mais antigos do E13,5 em diante, o grau de sucesso é muito alto. Idades precoces como o E11.5 são mais desafiadoras porque o pequeno tamanho dos embriões dificulta o manuseio e a injeção, o que, além disso, afeta sua sobrevivência. No entanto, os embriões sobreviventes da primeira eletroporação E11.5 apresentam taxas muito boas de sobrevivência após a segunda eletroporação em E13.5 (Tabela 2). Para melhorar a proficiência com essa técnica, recomendamos fortemente a prática de cirurgias em filhotes em ~E14.5 e tentando progressivamente cirurgias em idades mais jovens.
Outro desafio é a sobrevivência pós-natal, pois as mães submetidas à cirurgia nem sempre cuidam de todos os filhotes, embora as fêmeas grávidas solteiras ou eletroporadas entreguem os filhotes sem problemas (Tabela 3) e seu comportamento e estado de condicionamento físico pareçam normais. Em nossas mãos, e com o tempo descrito aqui, não encontramos diferenças importantes na sobrevivência pós-natal após eletroporação simples e dupla(Tabela 3),mas para contornar possíveis problemas de sobrevivência os filhotes podem ser transferidos para mães adotivas no parto quando mães reais apresentam mau comportamento materno ao nascer. Fornecer material extra de aninhamento e alimentos ricos para fêmeas grávidas antes da data de parto também pode ajudar a aumentar as taxas de sobrevivência dos filhotes.
Uma das principais vantagens dessa estratégia é o uso de camundongos do tipo selvagem para estudos funcionais, mas também pode ser aplicado, por exemplo, a ratos repórteres cre ou camundongos floxed para genes de interesse, quando disponíveis. Nestes camundongos, a eletroporação de plasmídeos expressos de CRE-recombinase permitirá a expressão permanente do gene repórter ou a inativação do gene desejado, respectivamente, nas células-alvo. Para experimentos funcionais também podemos controlar a expressão do construto apenas no tipo celular de interesse. Por exemplo, um promotor neuronal pode ser usado para manipular um gene candidato apenas em neurônios e não em células-tronco neurais, evitando assim efeitos indesejados no nível progenitor. Todas essas considerações, juntamente com o controle do tempo e da região alvo, fazem do dobro da eletroporação uterótica uma técnica muito versátil para estudar interações célula-células não apenas dentro do córtex, mas também em outras estruturas que podem ser alvo usando essa tecnologia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Cristina Andrés Carbonell e aos membros da unidade de Cuidados com Animais da Universidad de Valência pela assistência técnica. Também queremos agradecer a Isabel Fariñas e Sacramento R. Ferrón pelos reagentes e pelo compartilhamento de seus equipamentos conosco. A I.M.W é financiada por um contrato da Garantía Juvenil da Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), a D.d.D é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detém um Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) do Ministério espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Este Trabalho foi financiado RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
