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Neuroscience

टेम्पोरैली और स्थानिक रूप से अलग सेल आबादी को लक्षित करने के लिए यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में डबल

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/61046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

Summary

गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में डबल सेल आबादी को लक्षित करने की अनुमति देता है जो स्थानिक और अस्थायी रूप से अलग होते हैं। यह तकनीक सामान्य परिस्थितियों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके उन कोशिका आबादी के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए उपयोगी है, लेकिन रुचि के जीन को परेशान करने के लिए कार्यात्मक प्रयोगों के बाद भी।

Abstract

गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में वीवो डीएनए ट्रांसफर तकनीक है जो बड़े पैमाने पर स्तनधारी कोर्टिकोजेनेसिस में अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। यह प्रक्रिया मस्तिष्क वेंट्रिकल का लाभ उठाती है ताकि ब्याज के डीएनए की शुरूआत की अनुमति दी जा सके और आनुवंशिक सामग्री के प्रवेश द्वार को वेंट्रिकल, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अस्तर वाली कोशिकाओं में प्रत्यक्ष करने के लिए इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का उपयोग किया जाता है। यह विधि शोधकर्ताओं को वांछित कोशिकाओं को लेबल करने और/या उन कोशिकाओं में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की अनुमति देता है । इसमें न्यूरोनल माइग्रेशन, वंश ट्रेसिंग और अक्षीय पथवित्तीकरण को लक्षित करने वाले परख सहित कई अनुप्रयोग हैं। इस विधि की एक महत्वपूर्ण विशेषता इसका लौकिक और क्षेत्रीय नियंत्रण है, जो भ्रूणीय घातकता या विशिष्ट सीआरई चालक चूहों की कमी से संबंधित संभावित समस्याओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है। इस तकनीक का एक और प्रासंगिक पहलू यह है कि यह आर्थिक और लौकिक सीमाओं को काफी कम करने में मदद करता है जिसमें नई माउस लाइनों की पीढ़ी शामिल है, जो विभिन्न विकासात्मक युगों में मस्तिष्क के दूर के क्षेत्रों में उत्पन्न होने वाले सेल प्रकारों के बीच बातचीत के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाती है। यहां हम एक डबल इलेक्ट्रोपॉलिपेशन रणनीति का वर्णन करते हैं जो सेल आबादी को लक्षित करने में सक्षम बनाता है जो स्थानिक और अस्थायी रूप से अलग होते हैं। इस दृष्टिकोण के साथ हम चयनित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ विभिन्न स्थानों में कोशिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों को लेबल कर सकते हैं ताकि उन्हें कल्पना की जा सके, और/या हम उचित समय पर इन विभिन्न कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए ब्याज के जीन में हेरफेर कर सकते हैं । यह रणनीति गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन की क्षमता को बढ़ाती है और अस्थायी और स्थानिक रूप से अलग कोशिका आबादी के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है जो घनिष्ठ संपर्क स्थापित करने के साथ-साथ अक्षीय अनुमानों के माध्यम से लंबी दूरी की बातचीत, लौकिक और आर्थिक लागत को कम करती है।

Introduction

सेरेब्रल कॉर्टेक्स एक बहुत ही जटिल और जटिल रूप से संगठित संरचना है। संगठन की ऐसी डिग्री प्राप्त करने के लिए, कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स जटिल विकास प्रक्रियाओं से गुजरते हैं, जिन्हें उनकी अस्थायी पीढ़ी, कॉर्टिकल प्लेट में अपने अंतिम गंतव्य पर जाने और छोटी और लंबी दूरी के कनेक्शन1,,2की स्थापना की आवश्यकता होती है। लंबे समय तक कॉर्टिकोजेनेसिस का अध्ययन करने का शास्त्रीय तरीका ब्याज के जीन के नॉकआउट या नॉक-इन मुरीन मॉडल के उपयोग पर आधारित था। हालांकि, इस रणनीति, और विशेष रूप से सशर्त नॉकआउट चूहों का उपयोग, समय लेने वाली और महंगी है, और कभी-कभी अन्य मुद्दों के अलावा आनुवंशिक अतिरेक या विशिष्ट सीआरई ड्राइवरों की कमी के अस्तित्व के बारे में अतिरिक्त समस्याएं प्रस्तुत करती हैं। उन समस्याओं को दूर करने का प्रयास करने के लिए जो दृष्टिकोण पैदा हुआ है और आजकल कॉर्टिकल विकास का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है , वह गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन3,4में है । गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूशन में एक तकनीक है जो दैहिक ट्रांसजेनेसिस के लिए उपयोग की जाती है, जो तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतान के वीवो लक्ष्यीकरण में अनुमति देती है। इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन 5,6की अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, वीवो में जीन हेरफेर के लिए(अर्थात,लाभ या कार्य के रूप की हानि)7,8,,9,विट्रो और संस्कृति कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोटेड कोर्टिस को अलग करने के लिए8,,,10। इसके अलावा, गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में लक्षित क्षेत्र के लौकिक और क्षेत्रीय नियंत्रण की अनुमति देता है। इस तकनीक में कई अनुप्रयोग हैं और इसका व्यापक रूप से उपयोग न्यूरोनल माइग्रेशन, स्टेम सेल डिवीजन, न्यूरोनल कनेक्टिविटी और अन्य विषयों8,,9,11, 12,12का अध्ययन करने के लिए किया गया है।,

वर्तमान पांडुलिपि विभिन्न लौकिक और स्थानिक मूल के साथ सेरेब्रल कॉर्टेक्स में कोशिकाओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉक्राइशन में डबल कहा जाता है, गर्भाशय में एक utero इलेक्ट्रोपॉरेशन संस्करण के उपयोग का वर्णन करता है । ये अध्ययन मुरीन मॉडल को नियोजित करते समय पूरा करने के लिए बेहद जटिल हैं क्योंकि उन्हें कई ट्रांसजेनिक लाइनों के संयुक्त उपयोग की आवश्यकता होती है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल के कुछ अनुप्रयोगों में पड़ोसी कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ बातचीत का अध्ययन, साथ ही लंबी दूरी के अनुमानों के माध्यम से दूर की कोशिकाओं के बीच बातचीत शामिल है। विधि ब्याज की विभिन्न कोशिका आबादी को लक्षित करने के लिए एक ही भ्रूण पर, अलग अस्थायी और स्थानिक रूप से, utero इलेक्ट्रोप्यूटेशन सर्जरी में दो स्वतंत्र प्रदर्शन की आवश्यकता है। इस दृष्टिकोण का लाभ जंगली प्रकार के जानवरों का उपयोग करके एक या दोनों प्रकार के न्यूरॉन्स में जीन फ़ंक्शन में हेरफेर करने की संभावना है। इसके अलावा, इन कार्यात्मक प्रयोगों को साइटोप्लाज्मिक या झिल्ली-टैग किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि लक्षित कोशिकाओं की ठीक आकृति की कल्पना की जा सके, जिसमें डेंड्राइट्स और एक्सॉन शामिल हैं, और नियंत्रण की तुलना में सेलुलर इंटरैक्शन में संभावित अंतर का विश्लेषण करें (यानी, कोशिकाएं केवल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की जाती हैं)।

यहां चित्रित प्रोटोकॉल नियोकॉर्टेक्स के अंदर सेलुलर इंटरैक्शन के अध्ययन पर केंद्रित है, लेकिन इस रणनीति का उपयोग एक्सट्राकॉर्टिकल क्षेत्रों के साथ बातचीत की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसे गर्भाशयमीय या थैलेसीमिया13,14,या अन्य संरचनाओं में सेल-सेल इंटरैक्शन जैसे गर्भाशयम15जैसे गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में लक्षित किया जा सकता है।, विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करना इलेक्ट्रोड के अभिविन्यास और वेंट्रिकल पर आधारित है जहां डीएनए इंजेक्ट किया जाता है (पार्श्व, तीसरा, या चौथा)। यहां वर्णित रणनीति के साथ, हम पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को लेबल कर सकते हैं, जो कार्यात्मक प्रयोगों में कनेक्टिविटी/इनरवेशन में सामान्य परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है । फिर भी, कनेक्टिविटी में ठीक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, कोई भी गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में संशोधित संस्करणों का उपयोग करने के लिए विरल लेबलिंग प्राप्त कर सकता है और एकल कोशिकाओं की पहचान कर सकता है16। संक्षेप में, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में डबल एक बहुमुखी विधि है जो अस्थायी और स्थानिक रूप से अलग कोशिका आबादी को लक्षित करने और उनकी बातचीत का विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देती है, या तो नियंत्रण स्थितियों में या कार्यात्मक प्रयोगों के साथ संयुक्त, अस्थायी और आर्थिक लागत को काफी कम करती है।

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Protocol

यहां वर्णित प्रक्रिया को प्रयोग के प्रभारी नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, यूनीवर्सिड डी वेलेंसिया और कॉन्सेलेरिया डी एग्रीकल्चर के पशु कल्याण, Desarrollo ग्रामीण, आपात Climática y कोमुनिदाद वालेंसियाना के ट्रांसिसिओन इकोलोजिका, और इंटरनेशनल काउंसिल फॉर लेबोरेटरी एनिमल साइंस (आईसीएलास) के दिशा-निर्देशों का पालन करता है, जो स्पेनिश कानून के रियल डेक्रेटो 53/2013 में समीक्षा की गई और साथ ही यूरोपीय संसद और परिषद के निर्देश 2010/63/EU में भी ।

नोट: इस प्रोटोकॉल में दो अलग-अलग उद्देश्य शामिल हैं: 1) पहला अध्ययन, जिसे "रणनीति ए" कहा जाता है, एक ही मस्तिष्क गोलार्द्ध के भीतर कैजल-रेटज़ियस कोशिकाओं (सीआर-कोशिकाओं) और प्रारंभिक-बोर्न कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स के बीच बातचीत के विश्लेषण की अनुमति देता है; 2) दूसरा अध्ययन, "रणनीति बी", ऊपरी परत कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स के इनरवेशन को नियोकॉर्टेक्स के कॉन्ट्रालेटरल साइड में जांचने के लिए किया जाता है।

1. प्रीसर्जरी की तैयारी

  1. डीएनए की तैयारी
    1. ब्याज के प्लाज्मिड के साथ रासायनिक या इलेक्ट्रोकंप्यूटेंट ई कोलाई डीएच5α कोशिकाओं को बदलें, उन्हें उचित एंटीबायोटिक के साथ पौंड एगर प्लेटों पर प्लेट करें, और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यहां इस्तेमाल किए जाने वाले सभी प्लाज्मिड्स में चिकन के लिए सामान्य प्रमोटर होते हैं-ऐक्टिन (कैग) एक फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर प्रोटीन (कैग-रीचेरी और कैग-ईजीएफपी फॉर स्ट्रैटजी ए और कैग-बीएफपी और कैग-nEGFP-2A-mtdTomato के लिए रणनीति बी) की अभिव्यक्ति चलाते हैं । उन सभी में एम्पिसिलिन (एएमपी) का प्रतिरोध होता है।
    2. प्रत्येक प्लाज्मिड परिवर्तन से व्यक्तिगत उपनिवेशों को चुनें और जोरदार झटकों (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3−4 घंटे के दौरान बैक्टीरियल कल्चर ट्यूबों में लुरिया शोरबा + एम्पिसिलिन (एलबी + एएमपी) के 2 एमसीएल में स्टार्टर तरल संस्कृति शुरू करें। इसके बाद, 500 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एक बड़ा बैक्टीरियल कल्चर सेट करें जिसमें एलबी + एएमपी के 200 एमएल और स्टार्टर कल्चर के 1 एमएल को जोड़ा गया है। 200 आरपीएम पर कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    3. तरल संस्कृतियों से शुद्ध और केंद्रित प्लाज्मिड डीएनए प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एंडोटॉक्सिन-फ्री मैक्सी-प्रेप किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें। कम से कम 5 माइक्रोग्राम/माइक्रोन की सांद्रता प्राप्त करने के लिए एंडोटॉक्सिन-फ्री ट्रिस-ईडीटीए (टीई) बफर के ~ 50−100 माइक्रोन में डीएनए को फिर से रीसस्ट करें।
    4. प्रत्येक सर्जरी के लिए, 10 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के साथ एक समाधान तैयार करें जिसमें 1 माइक्रोन फास्ट ग्रीन डाई, प्लाज्मिड डीएनए समाधान ब्याज का 1 μg/μL की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए, और एंडोटॉक्सिन-मुक्त टीई बफर है। उदाहरण के लिए, फास्ट ग्रीन डाई के 1 माइक्रोन, 5 μg/μL प्लाज्मिड डीएनए समाधान के 2 माइक्रोन, और 7 माइक्रोन ते बफर का मिश्रण करें।
  2. पिपेट खींच
    1. एक ऊर्ध्वाधर माइक्रोपिपेट पुलर में बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (1/0.58 मिमी बाहरी/आंतरिक व्यास) को खींचें जब तक कि टिप 1−1.5 सेमी की लंबाई तक न पहुंच जाए और विच्छेदन दायरे के तहत लगभग 30 डिग्री के कोण पर विच्छेदन संदंश का उपयोग करके इसे ट्रिम करें।
  3. सर्जरी कक्ष सेटअप
    1. ऑपरेटिंग टेबल (यानी चिमटी, कैंची, संदंश, माइक्रोपिपेट, सुई, और सुई धारक) पर सभी उपकरण रखो। हीटिंग पैड चालू करें और इसे बाँझ सर्जिकल शोषक पैड से ढक दें। सुनिश्चित करें कि साँस लेना संज्ञाहरण के लिए मशीन में जलाशय आइसोफ्लाणे से भर जाता है, ऑक्सीजन टैंक में पर्याप्त ऑक्सीजन होती है, और सिस्टम ठीक से कार्य करता है।
      नोट: सर्जरी कक्ष और प्रतिरोधी सामग्री को यथासंभव बाँझ रखा जाना चाहिए (यानी, सर्जरी से पहले सभी सामग्री को ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए और सतहों को 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए)। प्लैटिनम इलेक्ट्रोड को ध्यान से पहले जर्मिसिडल साबुन के साथ कीटाणुरहित और सर्जरी से पहले 70% इथेनॉल के साथ दूसरा कीटाणुरहित करने की आवश्यकता होती है।
    2. 0.9% (w/v) बाँझ खारा समाधान जिसमें पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1:100 का 100 मिलियन का 100 मिलियन का एलएल तैयार करें और 10 सेमी पेट्री डिश भरें। समाधान को गर्म करने के लिए प्लेट को गर्म पैड के ऊपर रखें।
    3. एक एनाल्जेसिक समाधान (जैसे, 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) के 150 माइक्रोन के साथ एक 1 मिलीएल सिरिंज भरें।
    4. चरण 1.1.4 में तैयार अंतिम प्लाज्मिड डीएनए समाधान के 5 माइक्रोन के साथ खींचा गया पिपेट लोड करें। केशिका को मुंह से नियंत्रित एस्पिरेटर ट्यूब से कनेक्ट करें।

2. गर्भाशय इलेक्ट्रोपेशन सर्जरी में पहले

  1. 0.8 एल/मिनट पर 2.5% (v/v) आइसोफल्य्रेन के साथ एक बंद प्रेरण कक्ष के अंदर एक E11.5 (रणनीति ए) या E13.5 (रणनीति B) C57BL/6 गर्भवती माउस रखें और इंतजार करें जब तक कि यह एनेस्थेटाइज्ड न हो जाए। माउस को हीटिंग पैड पर स्थानांतरित करें और आइसोफ्लाणे के निरंतर वितरण के लिए अपनी नाक को मास्क में डाल दें। उचित संज्ञाहरण के संकेतक के रूप में एक पेडल पलटा की अनुपस्थिति के लिए जांच करें।
    नोट: ईmbryonic युग दिन के आधार पर निर्धारित किया जाता है जब योनि प्लग मनाया जाता है (E0.5) ।
  2. गर्भवती महिला को एनाल्जेसिक समाधान (0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) के साथ सुकुटा रूप से इंजेक्ट करें। प्रक्रिया के दौरान आंखों को सूखने से रोकने के लिए, कपास झाड़ू का उपयोग करके प्रत्येक आंख में आंखों के मरहम की एक बूंद लगाएं।
  3. एक इलेक्ट्रिक रेजर के साथ माउस पेट क्षेत्र दाढ़ी और यह 70% (v/v) इथेनॉल पोंछे के साथ 2x धोने, एक बार आयोडीन पोंछे के साथ, और एक इथेनॉल पोंछे के साथ एक आखिरी बार।
  4. जानवर के दाईं ओर त्वचा के माध्यम से 30 मिमी लंबा चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें और ध्यान से एक कुंद स्पैटुला के साथ मांसपेशियों से आसन्न त्वचा को अलग करें। बाद में, पेट की दीवार में एक दूसरा चीरा करें।
  5. पेट को मुड़ा हुआ ऊतक कागज के एक टुकड़े के साथ कवर करना पहले 70% इथेनॉल से कीटाणुरहित होता है जिसमें इसके केंद्र में 40 मिमी लंबी झिरी होती है। ध्यान से गर्भाशय को रिंग संदंश के साथ पेट की गुहा से बाहर खींचें।
    नोट: गर्भाशय को पूरी प्रक्रिया के दौरान चरण 1.3.2 में तैयार गर्म नमकीन समाधान के साथ गीला रखा जाना चाहिए।
  6. चरण 1.1.4 में तैयार डीएनए समाधान के साथ खींचे गए पिपेट को प्रीलोड करें। मुंह नियंत्रित एस्पिरेटर ट्यूब का उपयोग करके चयनित गोलार्द्ध के पार्श्व वेंट्रिकल में प्रति भ्रूण डीएनए समाधान के ~ 0.5 माइक्रोन इंजेक्ट करें जब तक कि तेजी से हरे रंग की डाई वेंट्रिकल के अंदर ध्यान देने योग्य न हो जाए।
  7. इंजेक्शन भ्रूण के सिर के चारों ओर बाद में संदंश-प्रकार प्लेटिनम इलेक्ट्रोड (जैसा कि चित्रा 1A और चित्रा 2A में दिखायागया है)। वांछित मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोड उन्मुख करें। उस क्षेत्र में उत्पन्न कोशिकाओं को लेबल करने के लिए कॉर्टिकल हेम (रणनीति ए) को इलेक्ट्रोप्यूट करने के लिए या पार्श्व प्रांतस्था (रणनीति बी) की ओर सकारात्मक ध्रुव को मध्यकालीन दीवार की ओर निर्देशित करें।
    नोट: सभी मामलों में, भ्रूणीय अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए दिल और अपरा से बचा जाना चाहिए।
  8. टेबल 1 (रणनीति ए E11.5 भ्रूण: 25 वी और 40 एमएस की चार दालें, 950 एमएस अंतराल से अलग; रणनीति बी E13.5 भ्रूण: 35 वी और 60 एमएस की पांच दालें, 950 एमएस अंतराल के साथ) में दिखाए गए संकेतों के बाद एक वर्ग तरंग इलेक्ट्रोपोरेटर के साथ इलेक्ट्रिक दालों के विशिष्ट अनुक्रम लागू करें।
  9. ध्यान से गर्भाशय को संदंश के साथ पेट की गुहा में वापस रखें, इसे गर्म नमकीन समाधान से भरें, और पेट की दीवार को सुई 6-0 सीवन के साथ बंद करें। त्वचा में किए गए प्रारंभिक चीरा के दो पक्षों में शामिल हों या तो सुई 6-0 सीवन या सीवन क्लिप का उपयोग करके।
  10. हीटिंग पैड पर जानवर बनाए रखें और संज्ञाहरण से इसकी वसूली तक इसकी निगरानी करें। अपने घर के   पिंजरे में रखे हाइड्रोजेल समाधान में एनाल्जेसिया (150 माइक्रोल) की एक अतिरिक्त खुराक प्रदान करें।
  11. सर्जरी के 24 घंटे बाद, एनाल्जेसिया (150 माइक्रोल) की एक अतिरिक्त खुराक प्रदान करते हैं। संभावित दर्द और संकट के लिए दृश्य निरीक्षण द्वारा दैनिक निगरानी जारी रखें। जानवर के व्यवहार का निरीक्षण करें, अपने सामान्य हिंद अंग सजगता का परीक्षण करें, और घाव की चाट या खरोंच के कारण नुकसान के संभावित संकेतों के लिए सीवन का निरीक्षण करें।

3. गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउनेशन में दूसरा

  1. प्रारंभिक सर्जरी के दो दिन बाद, 2.1−2.3 चरण दोहराएं। हालांकि सर्जरी के बाद गर्भवती महिलाओं की वसूली बहुत अच्छा है, जांच करें कि वे सामान्य व्यवहार दिखाते हैं और दूसरी सर्जरी (रणनीति ए के लिए E13.5 भ्रूण और रणनीति बी के लिए E15.5) प्रदर्शन करने से पहले दर्द या संकट के कोई संकेत नहीं पेश करते हैं।
  2. चरण 2.4 में त्वचा के माध्यम से 30 मिमी लंबा चीरा बनाएं और पेट की दीवार पर एक दूसरा चीरा, इस बार जानवर के बाईं ओर। चरण 2.5 में वर्णित कीटाणुरहित ऊतक के शीर्ष पर गर्भाशय को सावधानीपूर्वक बेनकाब करें।
    नोट: सावधान रहें कि पहले दूसरी तरफ किए गए चीरा में हस्तक्षेप न करें।
  3. गोलार्ध के पार्श्व मस्तिष्क वेंट्रिकल में डीएनए समाधान के प्रति भ्रूण लगभग 0.5 माइक्रोन इंजेक्ट करें जो पहले रणनीति ए के मामले में और रणनीति बी के लिए कॉन्ट्रालेटल गोलार्द्ध के पार्श्व मस्तिष्क वेंट्रिकल में इलेक्ट्रोपेटेड था।
    नोट: केवल सामान्य विकास दिखाने वाले भ्रूण का उपयोग करें और अवशोषण के कोई संकेत नहीं हैं।
  4. चरण 2.7 में वर्णित भ्रूण के सिर के चारों ओर इलेक्ट्रोड रखें, पार्श्व प्रांतस्था की ओर सकारात्मक इलेक्ट्रोड निर्देशन और तालिका 1 में दिखाए गए संकेतों के बाद उपयुक्त दालों को लागू करें (रणनीति ए E13.5 भ्रूण: 35 वी और 60 एमएस की पांच दालें 950 एमएस अंतराल से अलग; रणनीति बी E15.5 भ्रूण: 50 वी और 80 एमएस की पांच दालें 950 एमएस अंतराल से अलग हुई हैं)।
  5. चरण 2.8−2.10 में वर्णित सर्जरी को जारी रखें और समाप्त करें।

4. ऊतक संचयन और खंड

  1. रणनीति एक
    1. दूसरे इलेक्ट्रोपाउरेशन (E17.5) के चार दिन बाद, गर्भवती महिला की सर्वाइकल अव्यवस्था करें और इसे एक रीढ़ की स्थिति में रखें।
    2. कैंची का उपयोग करके, गर्भाशय सींग निकालने के लिए एक वेंट्रल चीरा बनाएं और संदंश के साथ उन्हें बर्फ पर रखे 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) से भरे पेट्री डिश में रखें।
      नोट: कम तापमान भ्रूण के एनेस्थेटाइजेशन संभव बनाता है ।
    3. चिमटी का उपयोग करना, एमनियोटिक थैली से भ्रूण निकालें और उन्हें एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत एक नए पीबीएस से भरे पेट्री डिश में संदंश के साथ स्थानांतरित करें। ध्यान से संदंश का उपयोग कर भ्रूण के सिर पकड़ और चिमटी के साथ मस्तिष्क विच्छेदन आचरण पहले सिर पर त्वचा को हटाने के लिए और फिर खोपड़ी । उजागर दिमाग को बाहर निकालने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें।
    4. एक चम्मच के साथ दिमाग ले लीजिए और उन्हें 1x PBS में फिक्सेटिव समाधान (4% [w/v] पैराफॉर्मलडिहाइड [पीएफए] से भरी 48 अच्छी तरह से प्लेट में जमा करें।) उदाहरण के लिए, एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दिमाग की जांच करके दोनों इलेक्ट्रोपाउंसन के सफल परिणाम के लिए तुरंत परीक्षण करें।
    5. एक कक्षीय शेखर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण दिमाग उतारना। पीएफए के निशान को खत्म करने के लिए 1x पीबीएस के साथ धोएं। फिर उन्हें एंटीफंगल परिरक्षकों (1x पीबीएस-0.05% (w/v) सोडियम एजाइड) के साथ पीबीएस में स्थानांतरित करें।
      सावधानी: पीएफए और सोडियम एजाइड साइटोटॉक्सिक यौगिक हैं जिन्हें उनके उपयोग के दौरान विशेष सावधानी की आवश्यकता होती है।
    6. 4% (w/v) कम पिघलने बिंदु में उतारना चाहते दिमाग एंबेड 1x PBS में agarose और ~10 मिनट इंतजार जब तक यह जमना । उन्हें कोरोनल वर्गों को प्राप्त करने के लिए ऊपर की ओर सामना कर रहे घ्राण बल्बों के साथ साइनोक्रेलेट गोंद का उपयोग करके वाइब्रेकोम ऊतक धारक से चिपकाएं।
    7. कंपन शुरू करें और वांछित मापदंडों का चयन करें: 100 माइक्रोन चौड़ाई, 0.60 माइक्रोन/एस गति, और 0.60 मिमी आयाम।
    8. वाइब्रेकोम कंटेनर के अंदर मस्तिष्क को सुरक्षित करें, इसे 1x पीबीएस समाधान से भरें, और 1x पीबीएस-0.05% (w/v) सोडियम अज़ाइड से भरी 48 अच्छी प्लेट में ब्रश की मदद से कोरोनल सीरियल सेक्शन एकत्र करना शुरू करें, मस्तिष्क का पूरा चित्रण करने के लिए (उदाहरण के लिए, लगभग सात वर्ग प्रति अच्छी तरह से और भ्रूण प्रति छह कुओं)।
    9. एक ठीक ब्रश का उपयोग कर माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड में वांछित वर्गों माउंट। उन्हें ग्लास कवर्लिप्स से ढक दें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए बढ़ते माध्यम जोड़ें, जो फोटोब्लैचिंग और फोटोऑक्सीडेशन को रोकता है। इलेक्ट्रोड्यूरेशन प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड्स देखें ।
  2. रणनीति बी
    1. पिल्ले को पहले E13.5 और E15.5 पर इलेक्ट्रोपेटेड होने दें और चरण 4.1.4 में उपयोग किए जाने वाले एक ही फिक्स्ड समाधान का उपयोग करके ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करने के लिए P15 तक प्रतीक्षा करें।
    2. परफ्यूजन से ठीक पहले, इंट्रापेरिटोनेली 75/1 मिलीग्राम/किलो केटामाइन/मेडेटोमिडीन की खुराक देता है । जब पेडल पलटा खो जाता है, एक रीढ़ की स्थिति में माउस सुरक्षित और दोनों रिब पिंजरे और डायाफ्राम का पर्दाफाश करने के लिए कैंची का उपयोग कर मध्य रेखा के बाद एक वेंट्रल चीरा बनाते हैं ।
    3. डायाफ्राम काटें और दिल तक पहुंच प्राप्त करने के लिए रिब पिंजरे को खोलें। एक हीमोस्टेट का उपयोग कर रिब पिंजरे पकड़ो और ठीक कैंची के साथ सही एट्रियम में एक चीरा बनाते हैं।
    4. एक पेरिस्टाल्टिक परफ्यूजन पंप के लिए एक लचीली ट्यूब से जुड़ी सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल को भेदें। ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन शुरू करें, 5.5 मिलियन (कुल समय ~ 5 मिनट) के निरंतर प्रवाह पर 4% पीएफए के कम से कम 25 एमएल वितरित करें।
    5. परफ्यूस किए गए जानवरों के मस्तिष्क को विच्छेदन करें। सबसे पहले, कैंची और संदंश के साथ सिर के ऊपर त्वचा को हटा दें। कैंची का उपयोग कर खोपड़ी काटना शुरू करें और ध्यान से खोपड़ी की हड्डियों के वर्गों को तब तक खींचें जब तक कि वे पूरी तरह से हटा न जाएं। अंत में, एक स्पैटुला की मदद से मस्तिष्क को निकालें।
    6. दिमाग को 24 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए के साथ ठीक करें। पीएफए को पीबीएस में 0.05% (w/v) सोडियम ̈जडाइड के साथ बदलकर निर्धारण बंद करें।
      नोट: जैसा कि चरण 4.1.5 में इंगित किया गया है, 1x पीबीएस के साथ एक मध्यवर्ती धोने की सलाह दी जाती है।
    7. पुनः चरण 4.1.6−4.1.9, प्रसवोत्तर दिमाग (40 माइक्रोन चौड़ाई, 1.20 माइक्रोम/एस गति, और 0.5 मिमी आयाम) के लिए वाइब्रेकोम मापदंडों को बदलते हुए।
      नोट: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशिष्ट सेल मार्कर का पता लगाने या इलेक्ट्रोपॉरेशन में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संकेत को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

5. कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें, माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर माउंटेड ब्रेन सेक्शन वाले माइक्रोस्कोप स्लाइड्स रखें और उन चैनलों का चयन करें जिन पर फ्लोरेसेंस इमेज ली जाएगी (यानी, बीएफपी के लिए 420−460 एनएम, जीएफपी के लिए 490−540 एनएम, और एमचेरी और टाडोटो के लिए 570−620 एनएम)।
  2. डबल इलेक्ट्रोपाउशन आउटपुट के सामान्य दृश्य के लिए दो अलग-अलग तरंगदैर्ध्य पर प्रत्येक मस्तिष्क अनुभाग की मानचित्र छवियों को प्राप्त करने के लिए नमूना स्कैनिंग करें। एक बार समाप्त होने के बाद, 10x लेंस और मल्टी-एरिया-जेड-स्टैक-टाइमलैप्स ऑब्जर्वेशन मोड का चयन करें। यह मस्तिष्क वर्गों के भीतर विभिन्न XYZ स्थानीयकरण पर फ्लोरेसेंस छवियों के स्वचालित अधिग्रहण प्रोग्रामिंग की अनुमति देगा।
  3. प्रत्येक चुने हुए क्षेत्र (XY) में, उचित इमेजिंग पैरामीटर (यानी, लेजर तीव्रता, फोटोमल्टीप्लायरी, और 1,024 x 1,024 का न्यूनतम संकल्प), साथ ही नमूने के विमानों के अनुसार स्कैनिंग (जेड) की गहराई निर्धारित करें जहां फ्लोरेसेंस दिखाई देता है।
  4. सभी चुने हुए क्षेत्रों की कम आवर्धन (10x) छवियां प्राप्त करें और माइक्रोस्कोप दर्शक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उन्हें ओआईएफ से TIFF प्रारूप में निर्यात करें।
  5. 60x लेंस में बदलें, चरण 5.3 दोहराएं और सेल-सेल इंटरैक्शन को अधिक विस्तृत तरीके से देखने के लिए उच्च आवर्धन छवियों को कैप्चर करें। उन्हें निर्यात के रूप में कदम 5.4 में संकेत दिया.
  6. आगे के विश्लेषण के लिए किसी भी इमेजिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी) के साथ अधिग्रहीत छवियों को खोलें।

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Representative Results

पड़ोसी कोशिकाओं के बीच बातचीत डिस्टल स्थानों में और अलग-अलग समय पर उत्पन्न हुई: कैजल-रेटज़ियस कोशिकाएं (सीआर-सेल) और जल्दी माइग्रेट कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (रणनीति ए)

सीआर-कोशिकाओं और प्रारंभिक कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स की बातचीत को पहले डबल इलेक्ट्रोपॉजेशन रणनीति8का उपयोग करके नेक्टिन और कैडेरिन आसंजन अणुओं के माध्यम से सोमल स्थानांतरण को विनियमित करने के लिए आवश्यक बताया गया था। सीआर-कोशिकाएं पैलियम के किनारों पर न्यूरोएपिथेलियम से उत्पन्न होती हैं और कॉर्टेक्स के सबसे सतही हिस्से,,सीमांत क्षेत्र17, 18,,19को आबाद करने के लिए स्पर्शपूर्वक प्रवास करती हैं, जबकि कॉर्टिकल अनुमान न्यूरॉन्स सेरेब्रल कॉर्टेक्स के प्रसार क्षेत्र में उत्पन्न होते हैं और नवजात कॉर्टिकल प्लेट20में रेडिकल रूप से माइग्रेट करते हैं।19 दोनों प्रकार की कोशिकाओं के उत्पादन में लौकिक अंतर होता है। सीआर-कोशिकाएं E10.521, 22,22 और कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स से बहुत शुरुआती भ्रूणीय चरणों में उत्पन्न होती हैं जो सोमल स्थानांतरण द्वारा माइग्रेट करते हैं, E12.5-E13.523से पैदा होते हैं। गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में डबल का उपयोग करना, सर्जरी के बीच लौकिक अंतर सीआर-कोशिकाओं की अनुमति देता है, जो अपने मूल स्थानों में से एक (कॉर्टिकल हेम) में E11.5 पर लक्षित है, जो समय में सोमाटोसेंसरी क्षेत्र सहित पार्श्व नियोकॉर्टेक्स के सीमांत क्षेत्र तक पहुंचने के लिए E13.5(चित्रा 1A,बी)पर लेबल कॉर्टिकल अनुमानों न्यूरॉन्स के साथ संपर्क स्थापित करने के लिए है। प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स की प्रमुख प्रक्रियाएं बढ़ी हुई जीएफपी (ईजीएफपी) को व्यक्त करने वाली कॉर्टेक्स के सीमांत क्षेत्र में दरियादिली से आर्बराइज करती हैं और सीआर-कोशिकाओं की प्रक्रियाओं के साथ आपस में मिल जाती हैं जो रीचेरी(चित्रा 1 सी)को व्यक्त करती हैं। कार्यात्मक प्रयोगों से पता चला है कि प्रक्षेपण न्यूरॉन्स या सीआर-कोशिकाओं द्वारा व्यक्त सेल-सेल आसंजन अणुओं का क्षोभ दोनों कोशिका प्रकार8के बीच परिवर्तित संपर्कों के परिणामस्वरूप उनकी प्रक्रियाओं के आर्बरीकरण को प्रभावित करता है।

अलग-अलग समय पर उत्पन्न डिस्टल कोशिकाओं के बीच लंबी दूरी की बातचीत: ऊपरी परत कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स का इनरवेशन नियोकॉर्टेक्स (रणनीति बी) के कॉन्ट्रालेटरल साइड में

कैलोसल कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स सेरेब्रल कॉर्टेक्स में मौजूद होते हैं, जो ऊपरी परतों में अधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं24। ये न्यूरॉन्स कॉर्पस कैलोसम के माध्यम से अपने एक्सॉन को प्रोजेक्ट करते हैं और अपने लक्षित कोशिकाओं, प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स से संपर्क करते हैं जो कॉन्ट्रालेट्रल कॉर्टेक्स 25,26, 27,27की विभिन्न परतों में स्थित हैं।, ऊपरी परत प्रक्षेपण न्यूरॉन्स निचले परत न्यूरॉन्स की तुलना में विकासवादी रूप से नए होते हैं और वानरों में इसका विस्तार किया गया है28. ये कोशिकाएं जटिल विचार और उच्च साहचर्य कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं, और कोशिकाओं की इस आबादी द्वारा विशेष रूप से व्यक्त जीन के समूहों में डिस्फंक्शन हाल ही में ऑटिज्म29से संबंधित हैं।

विशेष रूप से कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध में वितरित अपने लक्षित कोशिकाओं के साथ ऊपरी परतों में स्थित कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स की उपआबादी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हमने गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन प्रोटोकॉल में एक डबल विकसित किया। ऊपरी परत कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स की लक्षित कोशिकाओं को लेबल करने के लिए हमने E13.5 पर यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में प्लाज्मिड(चित्रा 2A−C)व्यक्त करते हुए बीएफपी का उपयोग करके प्रदर्शन किया। इस उम्र को रणनीतिक रूप से चुना गया था क्योंकि यह न केवल कई परत-वी न्यूरॉन्स सहित एक व्यापक कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन आबादी को लक्षित करने की अनुमति देता है, बल्कि ऊपरी परतों(चित्रा 2C)में स्थित न्यूरॉन्स की काफी संख्या भी है, मूल रूप से कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध से कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स के सभी लक्षित क्षेत्रों को कवर करता है। E15.5 पर कॉन्ट्रालेटरल साइड में एक दूसरे इलेक्ट्रोपाउशन ने ऊपरी परत कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन उपजनसंख्या (nEGFP और mtdTomato को व्यक्त करतेहुए) (चित्रा 2 ए,बी,डी)को लक्षित किया, लेकिन पहले की उम्र में पैदा हुए निचली परत अनुमानों न्यूरॉन्स नहीं। इसलिए हेट्रोक्रोनिक डबल इलेक्ट्रोपॉन्टेशन की आवश्यकता को उचित ठहराया गया था क्योंकि ब्याज की अनुमानित कोशिकाओं और उनके द्वारा इनरवेट की गई कोशिकाओं की पीढ़ी में अलग-अलग समय था। उन ऊपरी परत लक्षित न्यूरॉन्स एक विशेषता आर्बोराइजेशन पैटर्न(चित्रा 2C)के साथ कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध में अपने एक्सॉन भेजते हैं। इस विशिष्ट अक्षीय आर्बरीकरण पैटर्न में अंतर इस दोहरे इलेक्ट्रोपॉरेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके लक्षित कोशिकाओं में कार्य प्रयोगों के लाभ या हानि पर मूल्यांकन किया जा सकता है। उच्च आवर्धन विश्लेषण विस्तार से पता चलता है कैलिसल एक्सॉन इनरवेटिंग लक्षित प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध(चित्रा 2E)में ।

Figure 2
चित्रा 1: विभिन्न स्थानिक और लौकिक मूल के साथ कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ बातचीत का अध्ययन करने के लिए गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन रणनीति में रणनीति ए डबल। (क)प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध तरीके 1जीएफपी व्यक्त करते हुए रीचेरी और कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स व्यक्त करने वाली सीआर-कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ख)कॉर्टिकल हेम और पार्श्व प्रांतस्था में डबल इलेक्ट्रोपाउशन के बाद मस्तिष्क के कोरोनल सेक्शन की प्रतिनिधि छवि। कॉर्टिकल हेम (लाल) में लक्षित कोशिकाएं नियोकॉर्टेक्स के सीमांत क्षेत्र को पॉप्युलेट करते हुए स्पर्शरेखा रूप से प्रवास करती हैं। कॉर्टेक्स के वेंट्रिकुलर जोन में लेबल की गई कोशिकाएं कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (ग्रीन) उत्पन्न करती हैं जो नवजात कॉर्टिकल प्लेट में प्रवेश करने के लिए रेडिकल माइग्रेट करती हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन (सी)पैनल बी में बॉक्स्ड क्षेत्र का आवर्धन पार्श्व प्रांतस्था और डबल इलेक्ट्रोपॉजेशन प्रोटोकॉल के बाद लेबल की गई दो प्रकार की कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है। धराशायी लाइनें सीमांत क्षेत्र और कॉर्टिकल प्लेट को फ्रेम करते हैं । स्केल बार = 100 माइक्रोन। दाईं ओर उच्च आवर्धन सीमांत क्षेत्र का विस्तार दिखाता है जिसमें सीआर-कोशिकाओं के निकायों और प्रक्रियाओं के साथ आपस में जुड़े प्रक्षेपण न्यूरॉन्स की आर्बरिज्ड अग्रणी प्रक्रियाएं होती हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन सीटीएक्स = कॉर्टेक्स; हेम = कॉर्टिकल हेम; MZ = सीमांत क्षेत्र; सीपी = कॉर्टिकल प्लेट; IZ = मध्यवर्ती क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न स्थानिक और लौकिक मूल के साथ कोशिकाओं के बीच लंबी दूरी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए रणनीति बी डबल इलेक्ट्रोपॉरेशन रणनीति। (क)विभिन्न गोलार्द्धों में सोमाटोसेंसरी क्षेत्र सहित पार्श्व नियोकॉर्टेक्स में कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स की विभिन्न आबादी को लक्षित करने की रणनीति को प्रदर्शित करने वाली योजना यूटेरो इलेक्ट्रोपॉरेशन में डबल द्वारा । E13.5 पर लक्षित सही गोलार्द्ध के सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स में प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स ने बीएफपी व्यक्त किया। E15.5 पर लक्षित कॉन्ट्रालेट्रल साइड में लक्षित प्रक्षेपण न्यूरॉन्स ने परमाणु ईजीएफपी (nEGFP) और झिल्ली-लक्षित टीडीटोमाटो (एमटीडीटोमाटो) व्यक्त किया। (ख) मस्तिष्क के कोरोनल सेक्शन की प्रतिनिधि छवि , जिसने पैनल एमें उल्लिखित प्लाज्मिड्स के साथ डबल इलेक्ट्रोपॉइपेशन सर्जरी की । बीएफपी या एनईजीएफपी द्वारा लेबल की गई कोशिकाओं के विभिन्न वितरण और E15.5 पर लेबल किए गए ऊपरी परत कैलोसल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (एमटीडीटोमाटो) के एक्सॉन की गहन लेबलिंग पर ध्यान दें। स्केल बार = 500 माइक्रोन (C)डबल इलेक्ट्रोपेटेड मस्तिष्क में सही गोलार्द्ध में स्थित सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स की छवि। परतों में प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (नीला) के व्यापक वितरण और कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध में लक्षित प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से आने वाले कैलोसल एक्सॉन (लाल) के विपुल आर्बरीकरण पर ध्यान दें। स्केल बार = 100 माइक्रोन(डी)डबल इलेक्ट्रोपोरेटेड मस्तिष्क के बाएं गोलार्द्ध में सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स की छवि। nEGFP (हरे रंग) की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए कॉर्टिकल प्लेट के ऊपरी हिस्से में लक्षित प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के असतत स्थानीयकरण के साथ-साथ सेल निकायों और सभी न्यूरोनल अनुमानों (लाल) के आसपास के विपुल लाल लेबलिंग पर ध्यान दें। स्केल बार = 100 माइक्रोन।(ई)सही गोलार्द्ध में सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स के उच्च आवर्धन चित्र लक्षित प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के आसपास कैलोसल एक्सॉन के आर्बरीकरण का विवरण दिखाते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रणनीति इलेक्ट्रोपाउनेशन का क्रम लक्ष्य कोशिकाएं लक्षित क्षेत्र वेंट्रिकल इंजेक्शन इलेक्ट्रोड का स्थान वोल्टेज और दालें प्लाज्मिड्स का उपयोग किया जाता है विश्लेषण की आयु
एक पहले E11.5 पर सीआर सेल कॉर्टिकल हेम बाएँ बाएं गोलार्द्ध में सकारात्मक (मध्याक्षम दीवार की ओर निर्देशित) 25 वी, 40 एमएस, 4p कैग-एमएचरी E17.5
दूसरा E13.5 पर कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स बाएँ बाएं गोलार्द्ध में सकारात्मक 35 वी, 60 एमएस, 5p कैग-ईजीएफपी
(कॉर्टेक्स की ओर निर्देशित)
बी पहले E13.5 पर कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स सही सही गोलार्द्ध में सकारात्मक 35 वी, 60 एमएस, 5p कैग-बीएफपी पी 15
(कॉर्टेक्स की ओर निर्देशित)
दूसरा E15.5 पर कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स बाएँ बाएं गोलार्द्ध में सकारात्मक 50 वी, 80 एमएस, 5p कैग-nEGFP-2A-mTdTomato
(कॉर्टेक्स की ओर निर्देशित)

तालिका 1: विभिन्न प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली इलेक्ट्रोपॉरेशन स्थितियों का सारांश।

रणनीति ए में गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में डबल के बाद भ्रूण का अस्तित्व
कूड़े की संख्या भ्रूण की प्रारंभिक संख्या पहले EP जीवित भ्रूण की संख्या दूसरे EP जीवित भ्रूण की संख्या पहले EP के बाद अस्तित्व का% दूसरे EP के बाद अस्तित्व का% * वैश्विक जीवित रहने की दर का%
9 कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) 75% 83.33% 62.50%
64 7.11 ± 2.08 48 5.33 ± 1.22 40 4.44 ± 1.01
पहले EP के बाद गर्भपात भ्रूण की संख्या दूसरे EP के बाद गर्भपात भ्रूण की संख्या गर्भपात भ्रूण की कुल संख्या पहले EP के बाद गर्भपात का% दूसरे EP के बाद गर्भपात का% * वैश्विक गर्भपात दर का%
कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) 25% 16.66% 37.50%
16 1.8 ± 1.09 8 0.88 ± 0.78 24 2.67 ± 1.32
* अस्तित्व और गर्भपात भ्रूण है कि पहले इलेक्ट्रोपॉर्मेशन बच पर विचार की गणना

तालिका 2: रणनीति ए में गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में डबल के बाद भ्रूण का अस्तित्व।

रणनीति बी के बाद भ्रूण और पिल्ले का अस्तित्व (डबल EP E13.5 और E15.5)
कूड़े की संख्या भ्रूण की प्रारंभिक संख्या पहले EP जीवित भ्रूण की संख्या डबल EP के बाद पैदा हुए पिल्ले की संख्या P15 में जीवित भ्रूण की संख्या पहले EP के बाद अस्तित्व का% दूसरे EP के बाद अस्तित्व का% P15 पर अस्तित्व का%
8 कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) 88.46% 82.69% 55.77%
52 6.5 ± 2 46 5.75 ± 2.05 43 5.38 ± 1.77 29 3.63 ± 1.6
E13.5 पर एकल EP के बाद भ्रूण और पिल्ले का अस्तित्व
कूड़े की संख्या भ्रूण की प्रारंभिक संख्या EP के बाद पैदा हुए पिल्ले की संख्या P15 में जीवित भ्रूण की संख्या EP के बाद अस्तित्व का% P15 पर अस्तित्व का%
11 कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) कुल संख्या (औसत कूड़े ± एसडी) 89.74% 57.69%
78 7.1 ± 1.64 70 6.36 ± 1.7 45 4.09 ± 2.07

तालिका 3: सरल इलेक्ट्रोपाउशन की तुलना में रणनीति बी में यूटेरो इलेक्ट्रोपाउरेशन में डबल के बाद पिल्ले का अस्तित्व।

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Discussion

सेरेब्रल कॉर्टेक्स जैसे उच्च सेलुलर घनत्व वाले क्षेत्रों में वीवो में सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन एक जटिल कार्य है। विभिन्न सेल आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर की कमी के कारण न्यूराइट्स लेबल करने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग सहित पारंपरिक दृष्टिकोण उपयुक्त नहीं हैं। ट्रांसजेनिक मुरीन मॉडल का उपयोग, जहां एक विशेष सेल प्रकार फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है, न्यूरोनल प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए उपयोगी है, लेकिन यह ऐसे मॉडलों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। यह कार्य और भी जटिल है जब ब्याज के जीन के क्षोभ पर दो विशेष सेल प्रकारों के बीच बातचीत में संभावित मतभेदों की कल्पना करने की कोशिश कर रहा है, क्योंकि इसमें नॉकआउट चूहों की तरह अन्य पशु मॉडलों का उपयोग शामिल है। इन मुद्दों के सभी इन अध्ययनों को अतीत में आर्थिक और लौकिक लागत के कारण जटिल बना दिया ।

वीवो में दैहिक ट्रांसजेनेसिस की अनुमति देने वाली नई तकनीकों का उद्भव, जैसे कि गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीतियों को डिजाइन करने की संभावना प्रदान करता है, जो संयुक्त रिपोर्टर और नॉकआउट जानवरों के उपयोग या पीढ़ी को दरकिनार करता है, जिससे इस प्रकार का प्रयोग अधिक व्यवहार्य हो जाता है। इस प्रकाशन और पहले प्रकाशितअध्ययनों में दिखाए गए परिणाम 8 यह प्रदर्शित करते हैं कि यह प्रोटोकॉल 1) विभिन्न अस्थायी और स्थानिक मूल के साथ सेल आबादी को लक्षित करने की सफलतापूर्वक अनुमति देता है; 2) उच्च संकल्प के साथ सेल-सेल संपर्कों का दृश्य संभव बनाता है; और 3) कार्यात्मक प्रयोगों के बाद सेल संपर्कों में अंतर का पता लगाने के लिए उपयोगी है।

गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में व्यापक उपयोग के बावजूद, इस तकनीक को सुरक्षित रूप से सर्जरी करने, भ्रूण को नुकसान पहुंचाए बिना हेरफेर करने और वांछित क्षेत्र के सही लक्ष्यीकरण को आश्वस्त करने के लिए काफी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस प्रशिक्षण के बाद, गर्भवती महिलाओं का अस्तित्व उत्कृष्ट है (हमारे हाथों में लगभग 100%) और हमने गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में एकल और डबल के बीच कोई अंतर नहीं पाया है। एकल और डबल इलेक्ट्रोपेटेड गर्भवती महिलाएं सर्जरी से बहुत जल्दी ठीक हो जाते हैं। मामलों के विशाल बहुमत में, एकल या डबल सर्जरी के बाद उनके व्यवहार दिन सामान्य लगते हैं और इन गर्भवती महिलाओं को खाने, पीने, चलना, और यहां तक कि दर्द और संकट के स्पष्ट संकेत के बिना कठिनाइयों के बिना चढ़ाई ।

पहले और दूसरे इलेक्ट्रोपाउशन के बाद भ्रूण का अस्तित्व भी समग्र रूप से अच्छा है, और गर्भपात की दर कम हो जाती है क्योंकि भ्रूण की उम्र बढ़ जाती है(तालिका 2 और तालिका 3)। मुख्य कठिनाई दोनों इलेक्ट्रोपॉनेशन में सफल लक्ष्यीकरण है। E13.5 के बाद से पुराने भ्रूण के साथ सफलता की डिग्री बहुत अधिक है । E11.5 की तरह प्रारंभिक उम्र अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि भ्रूण के छोटे आकार हैंडलिंग और इंजेक्शन और अधिक कठिन है, जो इसके अलावा उनके अस्तित्व को प्रभावित करता है बनाता है । हालांकि, पहले E11.5 इलेक्ट्रोपाउरेशन जीवित भ्रूण E13.5(तालिका 2)में दूसरे इलेक्ट्रोपाउरेशन के बाद जीवित रहने की बहुत अच्छी दरों को पेश करते हैं। इस तकनीक के साथ प्रवीणता में सुधार करने के लिए, हम दृढ़ता से ~ E14.5 पर पिल्ले में सर्जरी का अभ्यास करने और उत्तरोत्तर छोटी उम्र में सर्जरी की कोशिश करने की सलाह देते हैं।

एक और चुनौती प्रसवोत्तर अस्तित्व है, क्योंकि सर्जरी के दौर से गुजर माताओं हमेशा अपने पिल्ले के सभी का ख्याल नहीं है, हालांकि गर्भवती महिलाओं को एकल या डबल इलेक्ट्रोपेटेड समस्याओं के बिना पिल्ले उद्धार(तालिका 3)और उनके व्यवहार और फिटनेस की स्थिति सामांय देखो । हमारे हाथों में, और यहां वर्णित समय के साथ, हम सरल और डबल इलेक्ट्रोपॉजेशन(तालिका 3)के बाद प्रसवोत्तर अस्तित्व में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाते हैं, लेकिन संभावित अस्तित्व की समस्याओं को दरकिनार करने के लिए पिल्ले प्रसव पर पालक माताओं को हस्तांतरित किया जा सकता है जब असली माताओं जन्म के समय गरीब मातृ व्यवहार प्रदर्शित करते हैं । प्रसव की तारीख से पहले गर्भवती महिलाओं को अतिरिक्त घोंसले की सामग्री और समृद्ध भोजन प्रदान करने से पिल्ले की जीवित रहने की दरों को बढ़ाने में भी मदद मिल सकती है।

इस रणनीति के मुख्य फायदों में से एक कार्यात्मक अध्ययन के लिए जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग है, लेकिन इसे तब भी लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सीआरई रिपोर्टर चूहों या ब्याज के जीन के लिए चूहों को जब उपलब्ध हो। इन चूहों में, प्लास्मिड व्यक्त करने वाले सीआरई-रिकॉम्बिनेंट का इलेक्ट्रोपाउशन रिपोर्टर जीन की स्थायी अभिव्यक्ति या वांछित जीन की निष्क्रियता, क्रमशः लक्षित कोशिकाओं में अनुमति देगा। कार्यात्मक प्रयोगों के लिए हम केवल सेल प्रकार के हित में निर्माण की अभिव्यक्ति को भी नियंत्रित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक न्यूरोनल प्रमोटर का उपयोग केवल न्यूरॉन्स में एक उम्मीदवार जीन में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है न कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में, इसलिए जनक स्तर पर अवांछित प्रभावों को रोका जा सकता है। इन सभी विचारों, समय और लक्षित क्षेत्र के नियंत्रण के साथ, गर्भाशय इलेक्ट्रोपेशन में डबल बनाने के लिए न केवल प्रांतस्था के अंदर सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही बहुमुखी तकनीक है, लेकिन यह भी अंय संरचनाओं में है कि इस तकनीक का उपयोग कर लक्षित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक क्रिस्टीना एंड्रेस कार्बोनेल और तकनीकी सहायता के लिए यूनीवर्सिड डी वेलेंसिया की एनिमल केयर सुविधा के सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी रिएजेंट्स के लिए इसाबेल Fariñas और सैक्रामेंटो आर Ferrón शुक्रिया अदा करना चाहते है और हमारे साथ अपने उपकरणों को साझा । I.M.W को कॉन्सेलेरिया डी एडुकासिओन डी वेलेंसिया (जीजीडीआई/2018/ए/221) से गार्न्टिया जुवेनिल अनुबंध द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, डी.डीए.डी को मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिडेस (MICINN) (एफपीआई-PRE2018-086150) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। सी गिल-सैंज के पास स्पेन के मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिड्स (एमआईसीएन) से रामोन वाई कैजल ग्रांट (RYC-2015-19058) है। इस कार्य को RYC-2015-19058 और SAF2017-82880-R (MICINN) वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-25G
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177-5EA
Baby-mixter hemostat (perfusion) Fine Science Tools (FST) 13013-14
Borosilicate glass capillary WPI 1B100-6
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) Rb Pharmaceuticals Limited 921425
CAG-BFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
Confocal microscope Olympus FV10i
Cotton Swabs BFHCVDF
Cyanoacrylate glue B. Braun Surgical 1050044
Dissecting scope Zeiss stemi 305
Dumont Forceps #5 Fine Forceps Fine Science Tools (FST) 11254-20
ECM830 Square Wave Electroporator BTX 45-0052
Electric Razor Oster 76998
Endotoxin-free TE buffer QIAGEN 1018499
Ethanol wipes BFHCVDF
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools (FST) 11150-10
Eye ointment Alcon 682542.6
Fast Green dye Sigma-Aldrich F7252-5G
Fine Scissors Fine Science Tools (FST) 14069-09
Fluorescence LEDs CoolLED pE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) Fine Science Tools (FST) 91308-12
Heating Pad UFESA AL5514
Inverted epifluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-S
Iodine wipes Lorsoul
Isofluorane vaporizer Flow-Meter A15B5001
Isoflurane Karizoo 586259
Ketamine (Anastemine) Fatro Ibérica SL 583889-2
Kimtech precision wipes Kimberly-Clark 7252
LB (Lennox) Agar GEN Labkem AGLB-00P-500
LB (Lennox) broth GEN Labkem LBBR-00P-500
Low-melting point agarose Fisher Scientific BP165-25
Medetomidine (Sedator) Dechra 573749.2
Microscope coverslips Menel-Gläser 15747592
Microscope Slides Labbox SLIB-F10-050
Mounting medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Mutiwell plates (24) SPL Life Sciences 32024
Mutiwell plates (48) SPL Life Sciences 32048
NaCl (for saline solution) Fisher Scientific 10112640
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Orbital incubator S150 Stuart Scientific 5133
P Selecta Incubator J. P. Selecta, s.a. 0485472
Paraformaldehyde PanReac AppliedChem A3813
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Peristaltic perfusion pump Cole-Parmer EW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter Btx 45-0489
Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 AgnThos 203-1000
Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm AgnThos 204-1000
Ring Forceps Fine Science Tools (FST) 11103-09
Sodium azide PanReac AppliedChem 122712-1608
Surgical absorbent pad (steryle) HK Surgical PD-M
Suture (Surgicryl PGA 6-0) SMI Suture Materials BYD11071512
Syringe 1ml (BD plastipak) Becton, Dickinson and Company 303172
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
Vertical Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-30
Vertical microscope Nikon Eclipse Ni
Vibratome Leica VT1200S

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References

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Mateos-White, I., Fabra-Beser, J., de Agustín-Durán, D., Gil-Sanz, C. Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations. J. Vis. Exp. (160), e61046, doi:10.3791/61046 (2020).

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