Summary
Dobbel i utero elektroporasjon gjør det mulig å målrette cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Denne teknikken er nyttig for å visualisere interaksjoner mellom disse cellepopulasjonene ved hjelp av fluorescerende proteiner under normale forhold, men også etter funksjonelle eksperimenter for å perturb gener av interesse.
Abstract
In utero elektroporasjon er en in vivo DNA-overføringsteknikk som brukes mye til å studere molekylære og cellulære mekanismer underliggende pattedyrkortikogenese. Denne prosedyren utnytter hjernen ventriklene for å tillate innføring av DNA av interesse og bruker et par elektroder for å lede inngangen til det genetiske materialet inn i cellene som fôrer ventrikkelen, nevrale stamceller. Denne metoden gjør det mulig for forskere å merke de ønskede cellene og / eller manipulere uttrykket av gener av interesse for disse cellene. Den har flere applikasjoner, inkludert analyser rettet mot nevronal migrasjon, avstamning sporing, og axonal pathfinding. Et viktig trekk ved denne metoden er dens timelige og regionale kontroll, slik at omgåelse av potensielle problemer knyttet til embryonisk dødelighet eller mangel på spesifikke CRE drivermus. Et annet relevant aspekt ved denne teknikken er at det bidrar til å redusere de økonomiske og timelige begrensningene som involverer generering av nye muselinjer, som blir spesielt viktig i studiet av interaksjoner mellom celletyper som stammer fra fjerne områder av hjernen i ulike utviklingsaltider. Her beskriver vi en dobbel elektroporasjonsstrategi som muliggjør målretting av cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Med denne tilnærmingen kan vi merke forskjellige undertyper av celler på forskjellige steder med utvalgte fluorescerende proteiner for å visualisere dem, og / eller vi kan manipulere gener av interesse uttrykt av disse forskjellige cellene til de aktuelle tidspunktene. Denne strategien forbedrer potensialet i in utero elektroporasjon og gir et kraftig verktøy for å studere oppførselen til timelig og romlig separerte cellepopulasjoner som migrerer for å etablere nære kontakter, samt langsiktige interaksjoner gjennom axonale anslag, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader.
Introduction
Hjernebarken er en svært kompleks og intrikat organisert struktur. For å oppnå en slik grad av organisering, går kortikale projeksjonsnevroner gjennom komplekse utviklingsprosesser som krever deres timelige generasjon, migrasjon til deres endelige destinasjon i kortikal plate, og etablering av kort- og langdistanseforbindelser1,2. I lang tid var den klassiske måten å studere kortikogenese basert på bruk av knockout eller knock-in murine modeller av gener av interesse. Imidlertid er denne strategien, og spesielt bruken av betingede knockoutmus, tidkrevende og dyrt, og noen ganger presenterer ytterligere problemer med eksistensen av genetisk redundans eller mangel på spesifikke CRE-drivere, blant andre problemer. En av tilnærmingene som oppsto for å prøve å løse disse problemene, og det er i dag mye brukt til å studere kortikal utvikling er i utero elektroporasjon3,4. In utero elektroporasjon er en teknikk som brukes til somatisk transgenese, slik at in vivo målretting av nevrale stamceller og deres avkom. Denne metoden kan brukes til å merke celler ved uttrykk for fluorescerende proteiner5,6, for genmanipulering in vivo (dvs. gevinst eller tap av funksjonsanalyser)7,8,9, for å isolere elektroporerte kortikater in vitro og kulterende celler8,10. Videre, i utero elektroporasjon tillater timelig og regional kontroll av det målrettede området. Denne teknikken har mange applikasjoner og har vært mye brukt til å studere nevronal migrasjon, stamcelledeling, nevronal tilkobling og andre8,,9,,11,,12.
Det nåværende manuskriptet beskriver bruken av en in utero elektroporasjonsvariant, kalt dobbel i utero elektroporasjon, for å analysere samspillet mellom celler i hjernebarken med forskjellig temporal og romlig opprinnelse. Disse studiene er svært komplekse å fullføre når de ansetter murine modeller fordi de krever kombinert bruk av flere transgene linjer. Noen av anvendelsene av protokollen som er beskrevet i dette papiret inkluderer studiet av nære interaksjoner mellom nærliggende celler, samt interaksjoner mellom fjerne celler gjennom langtrekkende projeksjoner. Metoden krever å utføre to uavhengige i utero elektroporasjon operasjoner, separert timelig og romlig, på de samme embryoene for å målrette ulike cellepopulasjoner av interesse. Fordelen med denne tilnærmingen er muligheten for å manipulere genfunksjonen i en eller begge typer nevroner ved hjelp av villtype dyr. I tillegg kan disse funksjonelle eksperimentene kombineres med uttrykket av cytoplasmatiske eller membran-merkede fluorescerende proteiner for å visualisere den fine morfologien til målrettede celler, inkludert dendritter og aksoner, og analysere mulige forskjeller i cellulære interaksjoner sammenlignet med en kontroll (dvs. celler bare merket med fluorescerende protein).
Protokollen avgrenset her er fokusert på studiet av cellulære interaksjoner inne i neocortex, men denne strategien kan også brukes til å undersøke interaksjoner med ekstrakortikale områder som kan målrettes ved hjelp av i utero elektroporasjon, som subpallium eller thalamus13,14, eller celle-celle interaksjoner i andre strukturer, som cerebellum15. Målretting av ulike områder er basert på elektrodenes orientering og på ventrikkelen der DNA injiseres (lateral, tredje eller fjerde). Med strategien som er beskrevet her, kan vi merke et betydelig antall celler, noe som er nyttig for å evaluere generelle endringer i tilkobling / innervering i funksjonelle eksperimenter. Likevel, for å studere fine endringer i tilkobling, kan man bruke modifiserte versjoner av in utero elektroporasjon for å få sparser merking og identifisere enkeltceller16. Oppsummert er dobbel i utero elektroporasjon en allsidig metode som gjør det mulig å målrette timelig og romlig separerte cellepopulasjoner og studere deres interaksjoner i detalj, enten i kontrollforhold eller kombinert med funksjonelle eksperimenter, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader betydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyren heri beskrevet har blitt godkjent av den etiske komiteen med ansvar for eksperimentering, dyrevelferd av Universidad de Valencia og Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica fra Comunidad Valenciana, og overholder retningslinjene til International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) gjennomgått i Real Decreto 53/2013 av den spanske lovgivningen, så vel som i direktivet 2010/63/EU i Europaparlamentet og rådet.
MERK: Denne protokollen innebærer to forskjellige formål: 1) den første studien, referert til som "strategi A", tillater analyse av interaksjonene mellom Cajal-Retzius celler (CR-celler) og tidligfødte kortikale projeksjon nevroner innenfor samme hjernehalvhalv; 2) den andre studien, "strategi B", utføres for å undersøke innervering av det øvre laget callosal projeksjon nevroner til contralateral side av neocortex.
1. Presurgery forberedelse
- DNA-forberedelse
- Forvandle kjemisk eller elektrokompetent E. coli DH5α celler med plasmider av interesse, plate dem på LB agar plater med riktig antibiotika, og inkubere dem over natten ved 37 ° C.
MERK: Alle plasmider som brukes her inneholder den generelle arrangøren for kylling β-actin (CAG) som driver uttrykket av et fluorescerende reporterprotein (CAG-mCherry og CAG-EGFP for strategi A og CAG-BFP og CAG-nEGFP-2A-mtdTomato for strategi B). Alle av dem inneholder motstand mot ampicillin (AMP). - Velg individuelle kolonier fra hver plasmidtransformasjon og start en startvæskekultur i 2 ml Luria-buljong + ampicillin (LB+AMP) i bakterielle kulturrør under 3-4 timer ved 37 °C med kraftig risting (200 o/min). Etter, sett en større bakteriell kultur i en 500 ml Erlenmeyer kolbe legge 200 ml LB + AMP og 1 ml av startkulturen. Inkuber over natten ved 37 °C i orbital shaker ved 200 rpm.
- Bruk et endotoksinfritt maxi-prep-sett (Tabell over materialer) etter produsentens instruksjoner for å oppnå rent og konsentrert plasmid DNA fra flytende kulturer. Bruk DNA i ~50-100 μL enetoksinfri Tris-EDTA (TE)-buffer for å oppnå konsentrasjoner på minst 5 μg/μL.
- For hver operasjon, lag en løsning med et endelig volum på 10 μL som inneholder 1 μL hurtiggrønn fargestoff, plasmid DNA-løsning av interesse for en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL for hver plasmid og endotoksinfri TE-buffer. Bland for eksempel 1 μL hurtiggrønn fargestoff, 2 μL av en 5 μg/μL plasmid DNA-løsning og 7 μL TE-buffer.
- Forvandle kjemisk eller elektrokompetent E. coli DH5α celler med plasmider av interesse, plate dem på LB agar plater med riktig antibiotika, og inkubere dem over natten ved 37 ° C.
- Pipette trekk
- Trekk borosilikatglasskapilillærer (1/0,58 mm ytre/indre diameter) i en vertikal mikropipetteavtrekker til spissen når en lengde på 1−1,5 cm og trim den med dissekere tang i en vinkel på ca. 30° under et disseksjonsområde.
- Oppsett av operasjonsrom
- Sett alt utstyret på operasjonsbordet (dvs. pinsett, saks, tang, mikropipetter, nål og nålholder). Slå på varmeputen og dekk den med en steril kirurgisk absorberende pute. Sørg for at reservoaret i maskinen for innånding anestesi er fylt med isofluran, oksygentanken inneholder nok oksygen, og systemet fungerer riktig.
MERK: Operasjonsrommet og det resistente materialet må oppbevares så sterilt som mulig (dvs. alt materialet må autoklaveres før operasjonen og overflatene må renses med 70% etanol). Platinaelektroder må desinfiseres nøye først med bakteriedisk såpe og andre med 70% etanol før operasjonen. - Forbered 100 ml 0,9 % (w/v) steril saltvannsoppløsning som inneholder penicillin-streptomycin 1:100 og fyll en 10 cm petriskål. Plasser platen på toppen av den oppvarmede puten for å varme opp løsningen.
- Fyll en 1 ml sprøyte med 150 μL smertestillende oppløsning (f.eks. 0,1 mg/kg buprenorfin).
- Last den trukket pipetten med 5 μL av den endelige plasmid DNA-løsningen tilberedt i trinn 1.1.4. Koble kapillæren til et munnstyrt aspiratorrør.
- Sett alt utstyret på operasjonsbordet (dvs. pinsett, saks, tang, mikropipetter, nål og nålholder). Slå på varmeputen og dekk den med en steril kirurgisk absorberende pute. Sørg for at reservoaret i maskinen for innånding anestesi er fylt med isofluran, oksygentanken inneholder nok oksygen, og systemet fungerer riktig.
2. Første i utero elektroporasjon kirurgi
- Plasser en E11.5 (strategi A) eller E13.5 (strategi B) C57BL/6 gravid mus inne i et lukket induksjonskammer med 2,5 % (v/v) isofluran ved 0,8 l/min og vent til den er bedøvet. Overfør musen til varmeputen og legg nesen i en maske for konstant levering av isofluran. Se etter fravær av en pedalrefleks som en indikator på riktig anestesi.
MERK: Embryonic alder bestemmes basert på dagen når vaginalpluggen observeres (E0.5). - Injiser den gravide kvinnen med smertestillende oppløsning (0,1 mg/kg buprenorfin) subkutøst. For å hindre at øynene tørker under prosedyren, bruk en dråpe øyesalve i hvert øye ved hjelp av en bomullspinne.
- Barber musmageområdet med en elektrisk barberhøvel og vask den 2x med 70% (v / v) etanolservietter, en gang med jodservietter, og en siste gang med en etanolsletting.
- Bruk saks til å lage et 30 mm langt snitt gjennom huden på høyre side av dyret og forsiktig skille den tilstøtende huden fra muskelen med en stump slikkepott. Etterpå gjør et nytt snitt i bukveggen.
- Dekk magen med et stykke brettet vevpapir som tidligere er desinfisert med 70% etanol som inneholder en 40 mm lang spalte i midten. Trekk livmoren forsiktig ut av bukhulen med ringspisser.
MERK: Livmoren må holdes våt med den varme saltvannsløsningen tilberedt i trinn 1.3.2 under hele prosedyren. - Forhåndslast de trukket pipetter med DNA-løsningen utarbeidet i trinn 1.1.4. Injiser ~0,5 μL av DNA-løsningen per embryo i den laterale ventrikkelen på den valgte halvkule ved hjelp av det munnstyrte aspiratorrøret til det raske grønne fargestoffet er merkbart inne i ventrikkelen.
- Plasser pinsett-type platinaelektroder sidelengs rundt hodet på det injiserte embryoet (som vist i figur 1A og figur 2A). Orienter elektrodene for å målrette mot ønsket hjerneregion. Rett den positive polen mot den mediale veggen for å elektroporate den kortikale hem (strategi A) eller mot lateral cortex (strategi B) for å merke celler generert i dette området.
MERK: I alle tilfeller må hjertet og morkaken unngås for å sikre embryonisk overlevelse. - Påfør den spesifikke sekvensen av elektriske pulser med en firkantbølgeelektroporator etter indikasjonene vist i tabell 1 (strategi A E11.5 embryoer: fire pulser på 25 V og 40 ms, atskilt med 950 ms intervaller; strategi B E13.5 embryoer: fem pulser på 35 V og 60 ms, med 950 ms intervaller).
- Plasser livmoren forsiktig tilbake i bukhulen med tang, fyll den med varm saltløsning og lukk bukveggen med en nål 6-0 sutur. Bli med de to sidene av det første snittet laget i huden enten ved hjelp av en nål 6-0 sutur eller suturklips.
- Opprettholde dyret på varmeputen og overvåke det til utvinning fra anestesi. Gi en ekstra dose analgesi (150 μL) i en hydrogelløsning plassert i hjemmeburet.
- 24 timer etter operasjonen, administrer en ekstra dose analgesi (150 μL). Fortsett daglig overvåking ved visuell inspeksjon for mulig smerte og nød. Observer dyrets oppførsel, test sine normale bakbensreflekser, og inspiser suturen for mulige tegn på skade på grunn av slikking eller riper av såret.
3. Andre i utero elektroporasjon
- To dager etter den første operasjonen gjentar du trinn 2.1−2.3. Selv om utvinningen av gravide kvinner etter operasjonen er veldig bra, kontrollerer du at de viser normal oppførsel og ikke presenterer tegn på smerte eller nød før du utfører den andre operasjonen (E13.5 embryoer for strategi A og E15.5 for strategi B).
- Gjør et 30 mm langt snitt gjennom huden som i trinn 2.4 og et andre snitt på bukveggen, denne gangen i venstre side av dyret. Utsett livmoren forsiktig på toppen av et desinfisert vev som beskrevet i trinn 2.5.
MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer snittet som tidligere er gjort på den andre siden. - Injiser rundt 0,5 μL per embryo av DNA-løsningen i den laterale hjerneventileicleen på halvkule tidligere elektroporert i tilfelle av strategi A og i den laterale hjerne ventrikkelen i den kontralaterale halvkule for strategi B.
MERK: Bruk bare embryoer som viser normal utvikling og ingen tegn på reabsorpsjon. - Plasser elektrodene rundt embryoets hode som beskrevet i trinn 2.7, som styrer den positive elektroden mot lateral cortex og bruker de riktige pulsene etter indikasjonene vist i tabell 1 (strategi A E13.5 embryoer: fem pulser på 35 V og 60 ms atskilt med 950 ms intervaller; strategi B E15.5 embryoer: fem pulser på 50 V og 80 ms separert med 950 ms intervaller).
- Fortsett og fullfør operasjonen som beskrevet i trinn 2.8−2.10.
4. Vevshøsting og snitting
- Strategi A
- Fire dager etter den andre elektroporasjonen (E17.5), utfører cervical dislokasjon av den gravide kvinnen og plasserer den i liggende stilling.
- Ved hjelp av saks, lage et ventral snitt for å trekke ut livmorhornene og med tang plassere dem i en petriskål fylt med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) plassert på is.
MERK: Den lave temperaturen gjør bedøvelse av embryoene mulig. - Ved hjelp av pinsett, trekk embryoene ut av fostersekken og overfør dem med tang til en ny PBS-fylt petriskål under et disseksjonsområde. Hold forsiktig embryoenes hode ved hjelp av tang og gjennomføre hjernedisseksjon med pinsett for først å fjerne huden over hodet og deretter skallen. Bruk en slikkepott til å trekke ut de eksponerte hjernene.
- Samle hjernen med en skje og deponere dem i en 48 brønnplate fylt med fikseringsløsningen (4% [w / v] paraformaldehyd [PFA] i 1x PBS). Test umiddelbart for det vellykkede resultatet av begge elektroporasjoner ved å undersøke hjernen ved hjelp av et omvendt epifluorescensmikroskop, for eksempel.
- Fest embryoniske hjerner over natten ved 4 °C i en orbital shaker. Vask med 1x PBS for å eliminere spor av PFA. Deretter overfører du dem til PBS med antifungale konserveringsmidler (1x PBS-0,05% (w / v) natriumazit).
FORSIKTIG: PFA og natriumazid er cytotoksiske forbindelser som krever spesielle forholdsregler under utnyttelsen. - Bygg inn de fikserte hjernene i 4% (w / v) lavt smeltepunkt agarose i 1x PBS og vent ~ 10 min til det stivner. Hold dem til vibratome vevholderen ved hjelp av cyanoakryler lim med olfaktoriske pærer vendt oppover for å få koronale seksjoner.
- Start vibratomen og velg de ønskede parametrene: 100 μm bredde, 0,60 μm/s hastighet og 0,60 mm amplitude.
- Sikre hjernen inne i vibratomebeholderen, fyll den med 1x PBS-løsning, og begynn å samle koronale serieseksjoner ved hjelp av en børste i en 48-brønnplate fylt med 1x PBS-0,05% (w / v) natriumazit for å ha en fullstendig skildring av hjernen (f.eks. rundt syv seksjoner per brønn og seks brønner per embryo).
- Monter de ønskede delene i mikroskopglassglass ved hjelp av en fin børste. Dekk dem med glassdeksler. For langsiktig lagring legge montering medium, som hindrer fotobleking og photooxidation. Vær oppmerksom på lysbildene under et oppreist epifluorescensmikroskop for å vurdere elektroporasjonseffekt.
- Strategi B
- La valpene tidligere elektroporert på E13.5 og E15.5 bli født og vent til P15 utfører transkortial perfusjon ved hjelp av samme fikseringsmiddeloppløsning som brukes i trinn 4.1.4.
- Like før perfusjon administrerer intraperitonealt en dose på 75/1 mg/kg ketamin/medetomidin. Når pedalrefleksen går tapt, fest musen i liggende stilling og gjør et ventral snitt etter midtlinjen ved hjelp av saks for å eksponere både brystkassen og membranen.
- Klipp membranen og åpne brystkassen for å få tilgang til hjertet. Hold brystkassen ved hjelp av en hemostat og gjør et snitt i høyre atrium med fin saks.
- Penyre inn i venstre ventrikkel med en nål forbundet med et fleksibelt rør til en peristaltisk perfusjonspumpe. Start transcardial perfusjon, levere minst 25 ml av 4% PFA ved en konstant fluks på 5,5 ml / min (total tid ~ 5 min).
- Dissekere hjernen til perfunderte dyr. Først fjerner du huden over hodet med saks og tang. Begynn å kutte skallen ved hjelp av saks og trekk forsiktig av deler av skallen bein til de er helt fjernet. Til slutt trekker du ut hjernen ved hjelp av en slikkepott.
- Overfør hjernen til en 24 brønnplate og fest dem med 4% PFA over natten ved 4 °C på en orbital shaker. Stopp fiksering ved å erstatte PFA med 0,05 % (w/v) natriumazid i PBS.
MERK: Som angitt i trinn 4.1.5, anbefales det å utføre en mellomvask med 1x PBS. - Gjenta trinn 4.1.6−4.1.9, endre vibratomeparametrene for postnatal hjerne (40 μm bredde, 1,20 μm/s hastighet og 0,5 mm amplitude).
MERK: Immunohistochemistry eller immunofluorescens kan utføres for å oppdage spesifikke cellemarkører eller forbedre signalet av fluorescerende proteiner som brukes i elektroporasjon.
5. Konfikal fluorescensavbildning og analyse
- Slå på det konfusante mikroskopet, plasser mikroskoplysbildene som inneholder de monterte hjerneseksjonene på mikroskopets lysbildeholder, og velg kanalene der fluorescensbilder skal tas (dvs. 420–460 nm for BFP, 490–540 nm for GFP og 570–620 nm for mCherry og tdTomato).
- Utfør prøveskanning for å få kartbilder av hver hjerneseksjon ved to forskjellige bølgelengder for en generell visning av den doble elektroporasjonsutgangen. Når du er ferdig, velger du 10x-objektivet og observasjonsmodusen for flere områder-Z-stack-timelapse. Dette vil tillate programmering automatisk oppkjøp av fluorescensbilder ved forskjellige XYZ lokaliseringer i hjerneseksjoner.
- I hvert av de valgte områdene (XY) angir du riktige bildeparametere (dvs. laserintensitet, fotomultiplierfølsomhet og en minimumsoppløsning på 1024 x 1024), samt dybden på skanningen (Z) i henhold til planene til prøven der fluorescens er synlig.
- Få bilder med lav forstørrelse (10x) av alle de valgte regionene og eksporter dem fra OIF til TIFF-format ved hjelp av mikroskopviserprogramvaren.
- Endre til 60x-objektivet, gjenta trinn 5.3 og ta opp høye forstørrelsesbilder for å observere cellecelleinteraksjonene på en mer detaljert måte. Eksporter dem som angitt i trinn 5.4.
- Åpne de oppkjøpte bildene med bildebehandlingsprogramvare (f.eks. Fiji) for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interaksjoner mellom nærliggende celler oppsto på distale steder og til forskjellige tider: Cajal-Retzius celler (CR-celler) og tidlig migrere kortikale projeksjon nevroner (strategi A)
Samspillet mellom CR-celler og tidlige kortikale projeksjonsnevroner ble tidligere beskrevet som nødvendig for å regulere somal translokasjon via nectin og kadherin adhesjonsmolekyler ved hjelp av en dobbel elektroporasjonsstrategi8. CR-celler stammer fra neuroepithelium på kantene av pallium og migrerer tangentielt for å fylle den mest overfladiske delen av cortex, marginal sone17,18,19, mens kortikale projeksjon nevroner genereres i proliferativ sone av hjernebarken og migrere radially inn i den gryende kortikale plate20. Det er en temporal forskjell i generering av begge typer celler. CR-celler genereres i svært tidlige embryonale stadier fra E10.521,,22 og kortikale projeksjonsnevroner som migrerer ved somal translokasjon er født fra E12.5-E13.523. Ved hjelp av dobbel i utero elektroporasjon, den temporale gapet mellom operasjonene tillater CR-celler, målrettet på E11.5 i en av sine opprinnelsessteder (kortikale hem), for å nå marginal sone av lateral neocortex inkludert somatosensorisk området i tide for å etablere kontakter med kortikale projeksjon nevroner merket på E13.5 (Figur 1A,B). De ledende prosessene med projeksjonsnevroner som uttrykker forbedret GFP (EGFP) voldsomt arborize i den marginale sonen av cortex og intermingle med prosessene til CR-celler som uttrykker mCherry (Figur 1C). Funksjonelle eksperimenter har vist at perturbasjon av cellecelleadhesjonsmolekyler uttrykt av projeksjonsnevroner eller CR-celler påvirker arboriseringen av sine prosesser som følge av endrede kontakter mellom begge celletypene8.
Langtrekkende interaksjoner mellom distale celler generert på forskjellige tidspunkter: innervation av øvre lag callosal projeksjon nevroner til contralateral side av neocortex (strategi B)
Callosal kortikale projeksjon nevroner er til stede i hele hjernebarken, blir rikere i øvre lag24. Disse nevronene projiserer sine aksoner gjennom corpus callosum og kontakter sine målceller, projeksjon nevroner plassert over de forskjellige lagene i contralateral cortex 25,26,27. Øvre lag projeksjon nevroner er evolusjonært nyere enn lavere lag nevroner og har blitt sterkt utvidet i primater28. Disse cellene er kritiske for komplekse tanker og høyere assosiative oppgaver, og dysfunksjoner i grupper av gener spesielt uttrykt av denne populasjonen av celler har nylig vært relatert til autisme29.
For å studere spesifikt samspillet mellom underbefolkningen av callosale projeksjonsnevroner som ligger i de øvre lagene med sine målceller fordelt over den kontralaterale halvkule, utviklet vi en dobbel in utero elektroporasjonsprotokoll. For å merke målcellene til øvre lag callosal projeksjon nevroner vi utført i utero elektroporasjon på E13.5 ved hjelp av en BFP uttrykker plasmid (Figur 2A−C). Denne alderen ble strategisk valgt fordi det tillater ikke bare målretting av en bred kortikale projeksjon neuron populasjon inkludert mange lag-V nevroner, men også et betydelig antall nevroner som ligger i øvre lag (Figur 2C), i utgangspunktet dekker alle målområder av callosal projeksjon nevroner fra contralateral halvkule. En annen elektroporasjon i den kontralaterale siden på E15.5 målrettet det øvre laget callosal projeksjon neuron subpopulation (uttrykker nEGFP og mtdTomato) (Figur 2A,B,D), men ikke det nedre laget projeksjon nevroner født i tidligere aldre. Behovet for heterokronisk dobbeltelektroporasjon ble derfor berettiget på grunn av de forskjellige tider i genereringen av de projiserte cellene av interesse og cellene som er innervert av dem. De øvre lag målrettede nevroner sende sine aksoner til contralateral halvkule med en karakteristisk arborization mønster (Figur 2C). Forskjeller i dette typiske axonal arboriseringsmønsteret kan evalueres ved gevinst eller tap av funksjonseksperimenter i målceller ved hjelp av denne doble elektroporasjonsprotokollen. Høy forstørrelsesanalyse viser i detalj callosal axons innervating målrettet projeksjon nevroner i contralateral halvkule (Figur 2E).
Figur 1: Strategi A. Dobbel i utero elektroporasjonsstrategi for å studere nære interaksjoner mellom celler med forskjellig romlig og temporal opprinnelse. (A)Skjemaer av protokollen som brukes til å målrette CR-celler som uttrykker mCherry og kortikale projeksjon nevroner som uttrykker EGFP. (B)Representativt bilde av en koronal del av en hjerne etter dobbel elektroporasjon i kortikal hem og lateral cortex. Celler målrettet i kortikale hem (rød) migrerer tangentielt, og fyller den marginale sonen av neocortex. Merkede celler i den ventrikulære sonen i cortex genererer kortikale projeksjonsnevroner (grønn) som migrerer radalt for å gå inn i den gryende kortikale platen. Skalalinje = 200 μm. (C) Forstørrelse av området som er bokset i panel B som viser lateral cortex og de to typene celler merket etter den doble elektroporasjonsprotokollen. Stiplede linjer rammer marginal sone og kortikale plate. Skala bar = 100 μm. Høy forstørrelse til høyre viser en detalj av den marginale sonen som inneholder de arboriserte ledende prosessene til projeksjonsnevronene blandet med CR-celler kropper og prosesser. Skala bar = 10 μm. Ctx = cortex; Hem = kortikal hem; MZ = marginal sone; CP = kortikale plate; IZ = mellomliggende sone. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Strategi B. Dobbel elektroporasjonsstrategi for å studere langdistanse interaksjoner mellom celler med forskjellig romlig og temporal opprinnelse. (A)Ordning som viser strategien for å målrette ulike populasjoner av kortikale projeksjonsnevroner i lateral neocortex, inkludert somatosensorisk område på forskjellige halvkuler ved dobbel in utero elektroporasjon. Projeksjon nevroner i somatosensorisk cortex av høyre halvkule rettet mot E13.5 uttrykt BFP. Målrettede projeksjonsnevroner i den kontralaterale siden rettet mot E15,5 uttrykte kjernefysisk EGFP (nEGFP) og membranmålsatt tdTomato (mtdTomato). (B) Representativt bilde av en koronal del av en hjerne som gjennomgikk dobbel elektroporasjonskirurgi med de nevnte plasmidene i panel A. Legg merke til de ulike distribusjonene av cellene merket av BFP eller nEGFP og intens merking av aksoner av øvre lag callosal projeksjon nevroner (mtdTomato) merket på E15.5. Skala bar = 500 μm. (C) Bilde av somatosensorisk cortex ligger på høyre halvkule i en dobbel elektroporert hjerne. Legg merke til den brede fordelingen av projeksjonsnevronene (blå) på tvers av lag og den voldsomme arboriseringen av callosale aksoner (rød) som kommer fra projeksjonsnevroner rettet mot den kontralaterale halvkule. Skala bar = 100 μm. (D) Bilde av somatosensorisk cortex i venstre halvkule av en dobbel elektroporert hjerne. Legg merke til den diskrete lokaliseringen av de målrettede projeksjonsnevronene i den øvre delen av kortikale platen som vist ved uttrykket av nEGFP (grønn), samt den rikelige røde merkingen rundt cellelegemer og alle nevronale projeksjoner (rød). Skala bar = 100 μm. (E) Høy forstørrelsesbilder av somatosensorisk cortex i høyre halvkule som viser detaljer om arborisering av callosal axons rundt målrettede projeksjon nevroner. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Strategi | Rekkefølgen av elektroporasjon | Målceller | Målrettet område | Ventrikkel injisert | Plasseringen av elektrodene | Spenning og pulser | Plasmids brukt | Alder av analyse |
| A | Første | CR-celle ved E11.5 | Kortikal hem | Venstre | Positiv i venstre halvkule (rettet mot den mediale veggen) | 25 V, 40 ms, 4p | Cag-mCherry (andre) | E17.5 (andre) |
| Andre | Kortikale projeksjonsnevroner på E13.5 | Somatosensorisk Cortex | Venstre | Positiv i venstre halvkule | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP (andre) | ||
| (rettet mot cortex) | ||||||||
| B | Første | Kortikale projeksjonsnevroner på E13.5 | Somatosensorisk Cortex | Høyre | Positiv i høyre halvkule | 35 V, 60 ms, 5p | Cag-BFP (andre) | P15 (andre) |
| (rettet mot cortex) | ||||||||
| Andre | Kortikale projeksjonsnevroner på E15.5 | Somatosensorisk Cortex | Venstre | Positiv i venstre halvkule | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (rettet mot cortex) |
Tabell 1: Sammendrag av elektroporasjonsforholdene som brukes i de ulike eksperimentene.
| Overlevelse av embryoer etter dobbel i utero elektroporasjon i strategi A | |||||||||
| Antall kull | Første antall embryoer | Antall embryoer som overlever første EP | Antall embryoer som overlever andre EP | % av overlevelsen etter første EP | % av overlevelse etter andre EP* | % av den globale overlevelsesraten | |||
| 9 | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7,11 ± 2,08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4,44 ± 1,01 | ||||
| Antall avbrutte embryoer etter første EP | Antall avbrutte embryoer etter andre EP | Totalt antall avbrutte embryoer | % av abort etter første EP | % av abort etter andre EP* | % av den globale abortfrekvensen | ||||
| Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 ± 1,09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| * Overlevelse og abort beregnet med tanke på embryoene som overlevde første elektroporasjon | |||||||||
Tabell 2: Overlevelse av embryoer etter dobbel i utero elektroporasjon i strategi A.
| Overlevelse av embryoer og unger etter strategi B (dobbel EP E13.5 og E15.5) | |||||||||||
| Antall kull | Første antall embryoer | Antall embryoer som overlever første EP | Antall unger født etter dobbel EP | Antall embryoer som overlever ved P15 | % av overlevelsen etter første EP | % av overlevelse etter andre EP | % av overlevelsen ved P15 | ||||
| 8 | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3,63 ± 1,6 | ||||
| Overlevelse av embryoer og valper etter enkelt EP på E13.5 | ||||||||
| Antall kull | Første antall embryoer | Antall unger født etter EP | Antall embryoer som overlever ved P15 | % av overlevelsen etter EP | % av overlevelsen ved P15 | |||
| 11 | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | Totalt antall | (Gj.sn. kull ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 ± 1,64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4,09 ± 2,07 | |||
Tabell 3: Overlevelse av valper etter dobbel i utero elektroporasjon i strategi B sammenlignet med enkel elektroporasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien av celle-celle interaksjoner in vivo i regioner med høy cellulær tetthet som hjernebarken er en kompleks oppgave. Tradisjonelle tilnærminger inkludert bruk av antistoffer for å merke neurites er ikke egnet på grunn av mangel på spesifikke markører for ulike cellepopulasjoner. Bruken av transgene murinmodeller, hvor en bestemt celletype uttrykker et fluorescerende protein, er nyttig for å visualisere nevronale prosesser, men dette avhenger av tilgjengeligheten av slike modeller. Denne oppgaven er enda mer komplisert når du prøver å visualisere mulige forskjeller i samspillet mellom to bestemte celletyper ved perturbasjon av genene av interesse, fordi det innebærer bruk av andre dyremodeller, som knockout mus. Alle disse problemene gjorde disse studiene kompliserte tidligere på grunn av økonomiske og timelige kostnader.
Fremveksten av nye teknikker som tillater somatisk transgenesis in vivo, for eksempel in utero elektroporasjon, gir muligheten til å designe strategier som den som er beskrevet i denne protokollen, som omgår bruken eller generering av kombinerte reporter og knockout dyr, noe som gjør denne typen eksperiment mer gjennomførbart. Resultatene som vises i denne publikasjonen og tidligere publiserte studier8 viser at denne protokollen 1) med hell tillater målretting av cellepopulasjoner med forskjellig temporal og romlig opprinnelse; 2) gjør det mulig visualisering av celle-celle kontakter med høy oppløsning; og 3) er nyttig for å oppdage forskjeller i cellekontakter etter funksjonelle eksperimenter.
Til tross for den brede bruken av in utero elektroporasjon, krever denne teknikken betydelig opplæring for å utføre operasjonen på en trygg sikkerhet, manipulere embryoene uten å skade dem, og sikre riktig målretting av ønsket region. Men etter denne treningen er overlevelsen av gravide kvinner utmerket (rundt 100% i våre hender), og vi har ikke funnet noen forskjeller mellom enkelt og dobbelt i utero elektroporasjon. Enkelt og dobbelt elektroporerte gravide kvinner gjenoppretter seg veldig raskt fra operasjonen. I de aller fleste tilfeller virker deres oppførsel dagen etter enkelt eller dobbel kirurgi normal, og disse gravide kvinnene spiser, drikker, går og klatrer til og med uten vanskeligheter uten tilsynelatende tegn på smerte og nød.
Overlevelse av embryoene etter den første og den andre elektroporasjonen er også god samlet, og frekvensen av abort minker etter hvert som embryoenes alder øker (tabell 2 og tabell 3). Hovedproblemet er vellykket målretting i begge elektroporasjoner. Med eldre embryoer fra E13.5 og utover er graden av suksess svært høy. Tidlig alder som E11.5 er mer utfordrende fordi den lille størrelsen på embryoene gjør håndtering og injeksjon vanskeligere, noe som i tillegg påvirker deres overlevelse. Embryoer som overlever den første E11,5 elektroporasjonen, gir imidlertid svært gode overlevelsesrater etter den andre elektroporasjonen på E13.5 (Tabell 2). For å forbedre ferdighetene med denne teknikken anbefaler vi på det sterkeste å praktisere operasjoner hos valper på ~ E14.5 og gradvis prøve operasjoner i yngre alder.
En annen utfordring er postnatal overlevelse, fordi mødre som gjennomgår kirurgi ikke alltid tar vare på alle sine valper, selv om gravide kvinner enkelt eller dobbelt elektroporert leverer valpene uten problemer (Tabell 3) og deres oppførsel og treningsstatus ser normal ut. I våre hender, og med timingen beskrevet her, finner vi ingen viktige forskjeller i postnatal overlevelse etter enkel og dobbel elektroporasjon (Tabell 3), men for å omgå mulige overlevelsesproblemer kan valper overføres til fostermødre ved levering når ekte mødre viser dårlig mors oppførsel ved fødselen. Å gi ekstra hekkemateriale og rik mat til gravide kvinner før leveringsdatoen kan også bidra til å øke overlevelsesraten til valpene.
En av de viktigste fordelene med denne strategien er bruk av villtype mus for funksjonelle studier, men det kan også brukes, for eksempel til CRE reporter mus eller floxed mus for gener av interesse, når tilgjengelig. I disse musene vil elektroporasjon av CRE-rekombinering som uttrykker plasmider tillate permanent uttrykk for reportergenet eller inaktivering av det ønskede genet, henholdsvis i de målrettede cellene. For funksjonelle eksperimenter kan vi også kontrollere uttrykket for konstruksjonen bare i celletypen interesse. For eksempel kan en nevronal promotor brukes til å manipulere et kandidatgen bare i nevroner og ikke i nevrale stamceller, og dermed forhindre uønskede effekter på stamfarsnivå. Alle disse hensynene, sammen med kontroll av tiden og den målrettede regionen, gjør dobbel i utero elektroporasjon en svært allsidig teknikk for å studere cellecelleinteraksjoner ikke bare inne i cortex, men også i andre strukturer som kan målrettes ved hjelp av denne teknologien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Cristina Andrés Carbonell og medlemmer av Animal Care-anlegget i Universidad de Valencia for teknisk hjelp. Vi vil også takke Isabel Fariñas og Sacramento R. Ferrón for reagenser og dele utstyret sitt med oss. I.M.W er finansiert av en Garantía Juvenil kontrakt fra Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D er finansiert av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz har en Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) fra den spanske ministerenio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dette arbeidet ble finansiert RYC-2015-19058 og SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
