Summary
Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.
Abstract
Rahim elektroporasyonunda, memeli kortikogenezinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için yaygın olarak kullanılan in vivo DNA transfer tekniğidir. Bu prosedür ilgi DNA giriş sağlamak için beyin ventrikülleri yararlanır ve venörl astar hücrelere genetik malzemenin girişini yönlendirmek için elektrotlar bir çift kullanır, nöral kök hücreleri. Bu yöntem, araştırmacıların istenilen hücreleri etiketlemelerine ve/veya bu hücrelerdeki ilgi genlerinin ekspresyonunu manipüle etmesine olanak tanır. Nöronal göçü, soy takibini ve aksonal yol bulmayı hedefleyen tahliller de dahil olmak üzere birden fazla uygulaması vardır. Bu yöntemin önemli bir özelliği, embriyonik öldürücülük veya belirli CRE sürücü farelerin eksikliği ile ilgili potansiyel sorunların circumvention sağlayan, onun zamansal ve bölgesel kontrol. Bu tekniğin bir diğer ilgili yönü de, farklı gelişimsel yaşlarda beynin uzak bölgelerinde ortaya çıkan hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde özellikle önemli hale gelen yeni fare hatlarının oluşumunu içeren ekonomik ve zamansal sınırlamaların önemli ölçüde azaltılmasına yardımcı olmasıdır. Burada, mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının hedeflemesini sağlayan çift elektroporasyon stratejisini açıklıyoruz. Bu yaklaşımla farklı konumlardaki farklı hücre alt tiplerini, onları görselleştirmek için seçili floresan proteinlerle etiketleyebilir ve/veya bu farklı hücrelerin ifade ettiği ilgi genlerini uygun zamanlarda manipüle edebiliriz. Bu strateji rahim elektroporasyon potansiyelini artırır ve yakın temas kurmak için göç zamansal ve mekansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının davranışını incelemek için güçlü bir araç sağlar, yanı sıra aksonal projeksiyonlar yoluyla uzun menzilli etkileşimler, zamansal ve ekonomik maliyetleri azaltarak.
Introduction
Serebral korteks çok karmaşık ve karmaşık organize bir yapıdır. Organizasyon böyle bir dereceye ulaşmak için, kortikal projeksiyon nöronlar kendi zamansal nesil gerektiren karmaşık gelişimsel süreçler geçmesi, kortikal plaka nihai hedefe göç, ve kısa ve uzun menzilli bağlantıların kurulması1,2. Uzun bir süre, kortikogenez çalışma için klasik yol ilgi genlerin nakavt veya knock-in murine modellerinin kullanımına dayanıyordu. Ancak, bu strateji, ve özellikle koşullu nakavt farelerin kullanımı, zaman alıcı ve pahalı, ve bazen diğer konular arasında, genetik fazlalık veya belirli CRE sürücülerin eksikliği varlığı ile ilgili ek sorunlar sunuyor. Bu sorunları çözmek için ortaya çıkan yaklaşımlardan biri ve günümüzde yaygın kortikal gelişim çalışması için kullanılan rahim elektroporasyon3,4. Rahim elektroporasyonunda somatik transgenez için kullanılan bir tekniktir, nöral kök hücrelerin ve bunların soyundan in vivo hedefleme sağlayan. Bu yöntem floresan proteinlerin ekspresyonu ile hücreleri etiketlemek için kullanılabilir5,6, in vivo gen manipülasyonu için (yani, kazanç veya fonksiyon tahlilkaybı)7,8,9, in vitro elektroporated korteksizole ve culturing hücreleri8için,10. Ayrıca, rahim elektroporasyon hedeflenen alanın zamansal ve bölgesel kontrol sağlar. Bu teknik çok sayıda uygulama vardır ve yaygın nöronal göç, kök hücre bölünmesi, nöronal bağlantı ve diğer konular8,9,,11,12çalışma için kullanılmıştır.
Mevcut el yazması, farklı zamansal ve uzamsal kökenleri ile serebral korteks hücrelerin etkileşimlerini analiz etmek için, rahim elektroporasyon çift olarak adlandırılan bir utero elektroporasyon varyantı kullanımını açıklar. Bu çalışmalar, birkaç transgenik hattın kombine kullanımını gerektirdiğinden, mindik modellerini kullanırken tamamlamak son derece karmaşıktır. Bu makalede açıklanan protokolün uygulamalarından bazıları komşu hücreler arasındaki yakın etkileşimlerin yanı sıra uzun menzilli projeksiyonlar aracılığıyla uzak hücreler arasındaki etkileşimleri incelemeyi içerir. Bu yöntem, farklı hücre popülasyonlarını hedeflemek için aynı embriyolar üzerinde zamansal ve mekansal olarak ayrılmış iki bağımsız rahim elektroporasyon ameliyatlarında performans gerektirir. Bu yaklaşımın avantajı vahşi tip hayvanları kullanarak bir veya her iki nöron türünde gen fonksiyonunu manipüle etme olasılığıdır. Buna ek olarak, bu fonksiyonel deneyler dendritler ve aksonlar da dahil olmak üzere hedeflenen hücrelerin ince morfolojisini görselleştirmek ve bir kontrolle karşılaştırıldığında hücresel etkileşimlerde olası farklılıkları analiz etmek için sitoplazmik veya membran etiketli floresan proteinlerin ekspresyonu ile kombine edilebilir (örn. sadece floresan proteinle etiketlenmiş hücreler).
Protokol burada neokorteks içinde hücresel etkileşimlerin çalışma odaklanmıştır, ama bu strateji de rahim elektroporasyon kullanılarak hedeflenebilir ekstrakortikal alanlar ile etkileşimleri incelemek için kullanılabilir, subpallium veya talamus gibi13,14, veya diğer yapılarda hücre hücre etkileşimleri, beyincik gibi15. Farklı alanların hedefedilmesi elektrotların yönelimine ve DNA'nın enjekte edildiği ventriküle (lateral, üçüncü veya dördüncü) bağlıdır. Burada açıklanan strateji ile, işlevsel deneylerde bağlanabilirlik/innervasyondaki genel değişiklikleri değerlendirmek için yararlı olan önemli sayıda hücreyi etiketleyebiliriz. Yine de, bağlantı ince değişiklikleri incelemek için, bir seyrek etiketleme almak ve tek hücreleri tanımlamak için rahim elektroporasyon değiştirilmiş sürümlerini kullanabilirsiniz16. Özetle, rahim elektroporasyonunda çift zamansal ve mekansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının hedefleştirilmesine ve kontrol koşullarında ya da fonksiyonel deneylerle birlikte etkileşimlerinin ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanıyan çok yönlü bir yöntemdir, zamansal ve ekonomik maliyetleri önemli ölçüde azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan prosedür, deneyden sorumlu etik komite, Universidad de Valencia ve Conselleria de Agricultura'nın hayvan refahı, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Comunidad Valenciana'dan Transición Ecológica ve İspanyol mevzuatının 53/2013 tarihli Real Decreto'da ve Avrupa Parlamentosu ve Konsey Konseyi'nin 2010/63/AB direktifinde gözden geçirilen Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bilimi Konseyi 'nin (ICLAS) yönergelerine bağlıdır.
NOT: Bu protokol iki farklı amacı içerir: 1) ilk çalışma, "strateji A" olarak anılacaktır, Cajal-Retzius hücreleri (CR-hücreleri) ve aynı beyin yarımküreiçinde erken doğan kortikal projeksiyon nöronlar arasındaki etkileşimlerin analizisağlar; 2) ikinci çalışma, "strateji B", neokorteks kontralateral tarafına üst tabaka callosal projeksiyon nöronların innervasyon incelemek için yapılır.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- DNA hazırlığı
- Kimyasal veya elektrobeceriksiz E. coli DH5α hücrelerini ilgi plazmidleri ile dönüştürün, uygun antibiyotikle LB agar plakalarına plakalayın ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Burada kullanılan tüm plazmidler tavuk β-actin için genel promotör içerir (CAG- mCherry ve CAG-EGFP strateji A ve CAG-BFP ve CAG-nEGFP-2A-mtdTomato strateji B için) ifadesini sürüş. Hepsi ampisilin (AMP) direnci içerir. - Her plazmid dönüşümünden ayrı koloniler seçin ve 3−4 saat boyunca bakteri kültürü tüplerinde 2 mL Luria suyu + ampisilin (LB+AMP) ile 37 °C'de güçlü bir titreme (200 rpm) ile başlangıç sıvısı kültürünü başlatın. Daha sonra, 500 mL Erlenmeyer şişesinde 200 mL LB+AMP ve başlangıç kültürünün 1 mL'si ekleyerek daha büyük bir bakteri kültürü belirleyin. 200 rpm orbital shaker 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Sıvı kültürlerden saf ve konsantre plazmid DNA'sı elde etmek için üreticinin talimatlarına uyarak endotoksiniçermeyen bir maxi hazırlık kiti(Malzeme Tablosu)kullanın. Endotoksiniçermeyen Tris-EDTA (TE) tamponunun ~50−100 μL'lik DNA'sını en az 5 μg/μL konsantrasyonelde etmek için yeniden askıya alın.
- Her ameliyat için, 1 μL hızlı yeşil boya içeren 10 μL son hacmi, her plazmid için 1 μg/μL son konsantrasyoniçin ilgi plazmid DNA çözeltisi ve endotoksin içermeyen TE tamponiçeren bir çözüm hazırlayın. Örneğin, 1 μL hızlı yeşil boya, 2 μL 5 μg/μL plazmid DNA çözeltisi ve 7 μL TE tamponu karıştırın.
- Kimyasal veya elektrobeceriksiz E. coli DH5α hücrelerini ilgi plazmidleri ile dönüştürün, uygun antibiyotikle LB agar plakalarına plakalayın ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Pipet çekme
- Uç 1−1,5 cm uzunluğa ulaşana kadar borosilikat cam kılcal damarları (1/0,58 mm dış/iç çap) dikey bir mikropipet çekmecesine çekin ve diseksiyon tersesi kuvvetini yaklaşık 30° açıyla keserek kesin.
- Ameliyathane kurulumu
- Tüm ekipmanları ameliyat masasına koyun (örneğin, cımbız, makas, forceps, micropipeettes, iğne ve iğne tutucu). Isıtma yastığını açın ve steril bir cerrahi emici ped ile kaplayın. Inhalasyon anestezisi için makinedeki haznenin isofluran ile dolu olduğundan, oksijen tankının yeterli oksijen içerdiğinden ve sistemin düzgün çalışmasını sağlayın.
NOT: Ameliyathane ve dirençli malzeme mümkün olduğunca steril tutulmalıdır (yani, tüm malzeme ameliyattan önce otoklavved edilmeli ve yüzeyler %70 etanol ile dezenfekte edilmelidir). Platin elektrotlar dikkatle mikrop öldürücü sabun ile ilk dezenfekte edilmesi gerekir ve ikinci% 70 etanol ameliyat öncesi. - 100 mL%0.9 (w/v) penisilin-streptomisin içeren steril tuzlu çözeltiyi 1:100 hazırlayın ve 10 cm Petri kabını doldurun. Çözeltiyi ısıtmak için plakayı ısıtmalı pedin üzerine yerleştirin.
- 1 mL'lik bir şırıngayı 150 μL analjezik solüsyon (örn. 0,1 mg/kg buprenorfin) ile doldurun.
- 1.1.4 adımda hazırlanan son plazmid DNA çözeltisinin 5 μL'si ile çekilen pipetleri yükleyin. Kılcal damarı ağız kontrollü bir aspiratör tüpüne bağlayın.
- Tüm ekipmanları ameliyat masasına koyun (örneğin, cımbız, makas, forceps, micropipeettes, iğne ve iğne tutucu). Isıtma yastığını açın ve steril bir cerrahi emici ped ile kaplayın. Inhalasyon anestezisi için makinedeki haznenin isofluran ile dolu olduğundan, oksijen tankının yeterli oksijen içerdiğinden ve sistemin düzgün çalışmasını sağlayın.
2. Rahim elektroporasyon cerrahisinde ilk
- E11.5 (strateji A) veya E13.5 (strateji B) C57BL/6 hamile fareyi kapalı bir indüksiyon odasına %2,5 (v/v) izoflurane 0,8 L/dk'da yerleştirin ve anestezi yapılana kadar bekleyin. Isıtma yastığı için fare aktarın ve isoflurane sürekli teslimat için bir maske içine burnunu koymak. Uygun anestezi bir göstergesi olarak bir pedal refleks yokluğu olup olmadığı kontrol edin.
NOT: Vajinalfişin gözlendiği güne göre e mbryonik yaş belirlenir (E0.5). - Hamile kadına analjezik solüsyon (0.1 mg/kg buprenorfin) deri altına enjekte edin. İşlem sırasında gözlerin kurumasını önlemek için, pamuklu bir bez kullanarak her göze bir damla göz merhemi uygulayın.
- Farenin karın bölgesini elektrikli bir jiletle tıraş edin ve %70 (v/v) etanol mendille 2 kat yıkayın, bir kez iyot mendilile ve son bir kez de etanol mendille yıkayın.
- Hayvanın sağ tarafındaki deriden 30 mm uzunluğunda bir kesi yapmak için makas kullanın ve bitişik deriyi künt bir spatula ile kaslardan dikkatlice ayırın. Daha sonra, karın duvarında ikinci bir kesi yapmak.
- Daha önce merkezinde 40 mm uzunluğunda yarık içeren% 70 etanol ile dezenfekte katlanmış kağıt bir parça ile karın kapağı. Dikkatle halka forceps ile karın boşluğundan rahim çekin.
NOT: Tüm işlem sırasında 1.3.2 adımda hazırlanan sıcak tuzlu çözelti ile rahim ıslak tutulmalıdır. - 1.1.4 adımda hazırlanan DNA çözeltisi ile çekilen pipetleri önceden yükleyin. Hızlı yeşil boya ventrikül içinde fark edilene kadar ağız kontrollü aspiratör tüp kullanarak seçilen yarımkürenin lateral ventrikül içine embriyo başına DNA çözeltisi ~ 0.5l enjekte.
- Aşılanan embriyonun başının etrafına kuvvetli platin elektrotlar yerleştirin (Şekil 1A ve Şekil 2A'dagösterildiği gibi). İstenilen beyin bölgesini hedeflemek için elektrotları yönlendirin. Kortikal hem (strateji A) veya lateral korteks (strateji B) doğru bu alanda üretilen hücreleri etiketlemek için medial duvara doğru pozitif kutup doğrudan.
NOT: Her durumda, kalp ve plasenta embriyonik sağkalımı sağlamak için kaçınılmalıdır. - Tablo 1'de gösterilen endikasyonları takip eden bir kare dalga elektroporatörlü elektrik darbelerinin özel sırasını uygulayın (strateji A E11.5 embriyolar: 25V ve 40 ms'lik dört darbe, 950 ms aralıklarla ayrılmış; strateji B E13.5 embriyolar: 5 darbe 35 V ve 60 ms, 950 ms aralıklı).
- Dikkatle forseps ile karın boşluğuna rahim geri yerleştirin, sıcak tuzlu çözelti ile doldurun ve bir iğne ile karın duvarını kapatın 6-0 sütür. Deride yapılan ilk kesinin iki tarafına bir iğne 6-0 dikiş veya dikiş klipsi kullanarak katılın.
- Isıtma yastığı üzerinde hayvan korumak ve anestezi onun kurtarma kadar izlemek. Ev kafesine yerleştirilen hidrojel çözeltisinde ekstra doz analjezi (150 μL) sağlayın.
- Ameliyattan 24 saat sonra ekstra doz analjezi (150°L) uygulayın. Olası ağrı ve sıkıntı için görsel muayene ile günlük izlemeye devam edin. Hayvanın davranışını gözlemleyin, normal arka ekstremite reflekslerini test edin ve yaranın yalanması veya çizilmesi nedeniyle olası hasar belirtileri için sütürü inceleyin.
3. Rahim elektroporasyonunda ikinci
- İlk ameliyattan iki gün sonra 2.1−2.3 adımlarını tekrarlayın. Ameliyat sonrası gebe lerin iyileşmesi çok iyi olmasına rağmen, ikinci ameliyatı (Strateji B için E13.5 embriyoları) yapmadan önce normal davranış gösterdiklerini ve ağrı veya sıkıntı belirtisi göstermediklerini kontrol edin.
- Adım 2.4 ve karın duvarında ikinci bir kesi gibi deri ile 30 mm uzunluğunda bir kesi yapmak, bu kez hayvanın sol tarafında. Dikkatle adım 2.5 açıklandığı gibi dezenfekte doku üstüne rahim maruz.
NOT: Daha önce diğer tarafta yapılan kesi müdahale etmemeye dikkat edin. - A stratejisi durumunda daha önce elektroporated ve strateji B için kontralateral hemisfer lateral beyin ventrikül içine DNA çözeltisi embriyo başına 0.5 μL enjekte.
NOT: Sadece normal gelişim gösteren ve reabsorbsiyon belirtisi göstermeyen embriyolar kullanın. - Adım 2.7'de açıklandığı gibi elektrotları embriyonun başının etrafına yerleştirin, pozitif elektrodu lateral kortekse doğru yönlendirin ve Tablo 1'de gösterilen endikasyonları izleyerek uygun darbeleri uygulayın (strateji A E13.5 embriyolar: 950 ms aralıklarla ayrılmış 35 V ve 60 ms'lik beş darbe; strateji B E15.5 embriyoları: 50 V ve 80 ms'in beş darbesi 95ms aralıklarla ayrılmıştır).
- 2.8−2.10 adımlarında açıklandığı gibi ameliyata devam edin ve bitirin.
4. Doku toplama ve kesit
- Strateji A
- İkinci elektroporasyondan dört gün sonra (E17.5), gebe kadının servikal çıkığını gerçekleştirin ve supine pozisyona yerleştirin.
- Makas kullanarak, rahim boynuzları ayıklamak için bir ventral kesi yapmak ve forseps ile 1x fosfat tamponlu salin (PBS) buz üzerine yerleştirilen dolu bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Düşük sıcaklık embriyoların anestezisini mümkün kılar. - Cımbız kullanarak, amniyotik kese den embriyolar ayıklamak ve bir diseksiyon kapsamı altında yeni bir PBS dolu Petri kabına forceps ile transfer. Dikkatle forceps kullanarak embriyoların başını tutun ve ilk baş ve daha sonra kafatası üzerinde deri kaldırmak için cımbız ile beyin diseksiyonu yapmak. Maruz kalan beyinleri çıkarmak için bir spatula kullanın.
- Bir kaşıkla beyinleri toplayın ve fiksatif solüsyonla dolu 48 kuyuplakaya koyun (%4 [w/v] paraformaldehit [PFA] 1x PBS). Örneğin, ters epifloresans mikroskobu kullanarak beyinleri inceleyerek her iki elektroporasyonun da başarılı sonucunu hemen test edin.
- Embriyonik beyinleri bir gecede 4 °C'de yörüngesel bir çalkalayıcıyla sabitle. PFA izlerini ortadan kaldırmak için 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra antifungal koruyucular (1x PBS-0.05% (w/ v) sodyum azid ile PBS'ye aktarın.
DİkKAT: PFA ve sodyum azit, kullanımları sırasında özel önlem gerektiren sitotoksik bileşiklerdir. - Sabitlenmiş beyinleri 1x PBS'de %4 (w/v) düşük erime noktasına gömün ve katılanına kadar ~10 dk bekleyin. Koronal kesitler elde etmek için yukarı bakan koku ampulleri ile siyanoakrilat tutkal kullanarak vibratom doku tutucuya yapıştırın.
- Vibratomu başlatın ve istenilen parametreleri seçin: 100 μm genişlik, 0,60 m/s hız ve 0,60 mm genlik.
- Beyni vibratom kabının içine yerleştirin, 1x PBS solüsyonu ile doldurun ve koronal seri bölümleri 1x PBS-0.05% (w/v) sodyum azit ile doldurulmuş 48 kuyu plakasında ki bir fırça yardımıyla toplamaya başlayın ve beynin tam bir tasvirine sahip olun (örn. kuyu başına yedi bölüm ve embriyo başına altı kuyu).
- İnce bir fırça kullanarak mikroskop cam slaytlarda istenilen bölümleri monte edin. Cam kapaklı dudaklarla kaplayın. Uzun süreli depolama için fotobeyazrlama ve fotooksidasyonu önleyen montaj ortamı ekleyin. Elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek için dik epifloresan mikroskobu altında slaytları gözlemleyin.
- Strateji B
- Daha önce E13.5 ve E15.5'te elektroporated yavrular doğmuş olsun ve adım 4.1.4 kullanılan aynı fiksatif çözelti kullanarak transkardiyal perfüzyon gerçekleştirmek için P15 kadar bekleyin.
- Perfüzyondan hemen önce intraperitoneal olarak 75/1 mg/kg ketamin/medetomidin dozu verin. Pedal refleksi kaybolduğunda, fareyi bir supine pozisyonda sabittutun ve hem göğüs kafesini hem de diyaframı ortaya çıkarmak için makas kullanarak orta çizgiyi takip eden ventral kesi yapın.
- Diyaframı kesin ve kalbe ulaşmak için göğüs kafesini açın. Bir hemostat kullanarak göğüs kafesi tutun ve ince makas ile sağ atriyumda bir kesi yapmak.
- Peristaltik perfüzyon pompası esnek bir tüp ile bağlı bir iğne ile sol ventrikül nüfuz. Transkardiyal perfüzyonu başlatın ve sabit 5,5 mL/dk (toplam süre ~5 dk) en az 25 mL 4 PFA sunar.
- Perfüzyonhayvanların beynini inceleyin. İlk olarak, makas ve forceps ile baş üzerinde deri çıkarın. Kafatasını makas kullanarak kesmeye başlayın ve kafatası kemiklerinin bölümlerini tamamen çıkarılana kadar dikkatlice çekin. Son olarak, bir spatula yardımıyla beyin ayıklayın.
- Beyinleri 24 kuyu plakasına aktarın ve bir orbital shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede %4 PFA ile düzeltin. PBS'de PFA'yı %0,05 (w/v) sodyum azit ile değiştirerek fiksasyonu durdurun.
NOT: Adım 4.1.5'te belirtildiği gibi, 1x PBS ile ara yıkama yapmak tavsiye edilir. - 4.1.6−4.1.9 adımlarını tekrarlayın, doğum sonrası beyinler için vibratom parametreleri (40 μm genişlik, 1,20 μm/s hız ve 0,5 mm genlik).
NOT: İmmünohistokimya veya immünütrioresans belirli hücre belirteçlerini tespit etmek veya elektroporasyonda kullanılan floresan proteinlerin sinyalini geliştirmek için yapılabilir.
5. Konfokal floresan görüntüleme ve analizi
- Konfokal mikroskobu açın, monte edilmiş beyin bölümlerini içeren mikroskop slaytlarını mikroskop slayttutucuya yerleştirin ve floresan görüntülerinin çekilecek kanalları seçin (örneğin, BFP için 420−460 nm, GFP için 490−540 nm ve mCherry ve tdTomato için 570−620 nm).
- Çift elektroporasyon çıkışının genel görünümü için her beyin bölümünün harita görüntülerini iki farklı dalga boyunda elde etmek için örnek tarama yapın. Tamamlandıktan sonra, 10x lensi ve çok alanlı Z-stack-timelapse gözlem modunu seçin. Bu beyin bölümleri içinde farklı XYZ lokalizasyonlarında floresan görüntülerin otomatik edinimi programlama sağlayacaktır.
- Seçilen bölgelerin her birinde (XY), floresanların görülebildiği numunenin düzlemlerine göre tarama (Z) derinliğinin yanı sıra uygun görüntüleme parametrelerini (yani lazer yoğunluğu, fotoçarpan hassasiyeti ve minimum 1.024 x 1.024 çözünürlüğü) ayarlayın.
- Seçilen tüm bölgelerin düşük büyütme (10x) görüntülerini edinin ve mikroskop görüntüleyici yazılımını kullanarak OIF'ten TIFF formatına aktarın.
- 60x lens değiştirin, adım 5.3 tekrarlayın ve daha ayrıntılı bir şekilde hücre-hücre etkileşimleri gözlemlemek için yüksek büyütme görüntüleri yakalamak. Adım 5.4'te belirtildiği gibi dışa aktarın.
- Elde edilen görüntüleri daha fazla analiz için herhangi bir görüntüleme yazılımıyla (örneğin, Fiji) açın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Komşu hücreler arasındaki etkileşimler distal yerlerde ve farklı zamanlarda ortaya çıkmıştır: Cajal-Retzius hücreleri (CR hücreleri) ve erken göç eden kortikal projeksiyon nöronlar (strateji A)
CR-hücrelerinin ve erken kortikal projeksiyon nöronların etkileşimi daha önce nektin ve kadherin adezyon molekülleri ile somal translokasyon düzenlemek için gerekli olarak tanımlanmıştır8 . CR-hücreleri pallium kenarlarında nöroepitel kaynaklanır ve korteksin en yüzeysel kısmını doldurmak için teğet göç, marjinal bölge17,18,19, kortikal projeksiyon nöronlar serebral korteksproliferatif bölgede oluşturulur ve yeni doğan kortikal plaka içine yayılan göç ise20. Her iki hücre türünün oluşumunda zamansal bir fark vardır. CR-hücreleri E10.521,,22 ve somal translokasyon ile göç kortikal projeksiyon nöronlar çok erken embriyonik aşamalarında üretilen E12.5-E13.523doğarlar . Utero elektroporasyon da çift kullanarak, ameliyatlar arasındaki zamansal boşluk CR hücreleri sağlar, E11.5 hedefleyen kendi yerlerinden birinde (kortikal hem), e13.5 etiketli kortikal projeksiyon nöronlar ile temas kurmak için zaman içinde somatosensoriyel alan da dahil olmak üzere lateral neokorteks marjinal bölgeye ulaşmak için(Şekil 1A,B). Gelişmiş GFP ifade projeksiyon nöronların önde gelen süreçleri (EGFP) bolkorteks marjinal bölgesinde arborize ve mCherry ifade CR-hücrelerin süreçleri ile iç içe(Şekil 1C). Fonksiyonel deneyler, projeksiyon nöronları veya CR hücreleri tarafından ifade edilen hücre-hücre yapışma moleküllerinin tedirginliği her iki hücre tipi arasında değiştirilmiş temasların bir sonucu olarak süreçlerinin arborization etkiler göstermiştir8.
Farklı zamanlarda üretilen distal hücreler arasındaki uzun menzilli etkileşimler: üst tabaka callosal projeksiyon nöronların neokorteksin kontralateral tarafına innervasyonu (strateji B)
Callosal kortikal projeksiyon nöronlar serebral korteks boyunca mevcut, üst tabakalarda daha bol olmak24. Bu nöronlar korpus callosum ile aksonları proje ve hedef hücreleri temas, kontralateral korteks in farklı katmanları arasında bulunan projeksiyon nöronlar 25,26,27. Üst tabaka projeksiyon nöronlar evrimsel olarak alt tabaka nöronlar daha yeni ve büyük ölçüde primatlar28genişletilmiştir . Bu hücreler karmaşık düşünce ve daha yüksek ilişkilendirsel görevler için kritik, ve özellikle hücrelerin bu popülasyon tarafından ifade gen gruplarının işlev bozuklukları son zamanlarda otizm ile ilgili olmuştur29.
Özellikle üst tabakalarda bulunan callosal projeksiyon nöronların alt popülasyonunun kontralateral yarımküreye dağılmış hedef hücreleri ile etkileşimlerini incelemek için rahim elektroporasyon protokolünde bir çift geliştirdik. Üst tabaka kalozal projeksiyon nöronların hedef hücrelerini etiketlemek için E13.5'te rahim elektroporasyonunda plazmid(Şekil 2A−C)ifade eden bir BFP kullanarak gerçekleştirdik. Bu yaş stratejik olarak seçildi çünkü sadece birçok katman-V nöronlar da dahil olmak üzere geniş bir kortikal projeksiyon nöron popülasyonunun hedeflemesine izin vermiyor, aynı zamanda üst tabakalarda bulunan önemli sayıda nöronların(Şekil 2C),temelde kontralateral yarımküreden gelen tüm kalonal projeksiyon nöronların hedef alanlarını kapsamaktadır. E15.5'te kontralateral tarafta ikinci bir elektroporasyon üst tabaka callosal projeksiyon nöron alt popülasyonu hedef (nEGFP ve mtdTomato ifade) (Şekil 2A,B,D) ama daha erken yaşlarda doğan alt tabaka projeksiyon nöronlar değil. Heterokronik çift elektroporasyon ihtiyacı bu nedenle ilgi ve onlar tarafından innerve hücrelerin ingeneration farklı zamanlarda haklı oldu. Bu üst tabaka hedefli nöronlar karakteristik bir ağaçlandırma deseni ile aksonları kontralateral yarımküreye gönderirler(Şekil 2C). Bu tipik aksonal ağaçlandırma paternindeki farklılıklar, bu çift elektroporasyon protokolü kullanılarak hedef hücrelerde fonksiyon deneylerinin kazanılması veya kaybedilmesi üzerine değerlendirilebilir. Yüksek büyütme analizi, kontralateral yarımküredeki hedefli projeksiyon nöronları innerve eden callosal aksonların ayrıntılı olarakgöstermektedir (Şekil 2E).
Şekil 1: Strateji A. Farklı mekansal ve zamansal kökenli hücreler arasındaki yakın etkileşimleri incelemek için rahim elektroporasyon stratejisinde çift. (A) Protokol şemaları CR-hücreleri hedefleyen mCherry ve kortikal projeksiyon nöronlar EGFP ifade hedeflemek için kullanılır. (B) Kortikal hem ve lateral kortekste çift elektroporasyon sonrası beynin koronal bölümünün temsili görüntüsü. Kortikal hem (kırmızı) hedeflenen hücreler teğet göç, neokorteks marjinal bölge doldurma. Korteksin ventriküler bölgesinde etiketli hücreler, yeni ortaya çıkan kortikal plakaya girmek için radyal olarak göç eden kortikal projeksiyon nöronlarını (yeşil) oluştururlar. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C) Lateral korteksi ve çift elektroporasyon protokolünden sonra etiketlenmiş iki hücre türünü gösteren B panelinde kutulanan alanın büyütülmesi. Kesik çizgiler marjinal bölge ve kortikal plaka çerçeve. Ölçek çubuğu = 100 μm. Sağdaki yüksek büyütme, CR-hücre cisimleri ve süreçleri ile iç içe olan projeksiyon nöronların ağaçlandırma öncü süreçlerini içeren marjinal bölgenin ayrıntılarını gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Ctx = korteks; Hem = kortikal hem; MZ = marjinal bölge; CP = kortikal plaka; IZ = ara bölge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Strateji B. Farklı mekansal ve zamansal kökenli hücreler arasındaki uzun menzilli etkileşimleri incelemek için çift elektroporasyon stratejisi. (A) Şema utero elektroporasyon çift tarafından farklı yarımkürede somatosensoriyel alan da dahil olmak üzere lateral neokorteks kortikal projeksiyon nöronların farklı popülasyonları hedef strateji gösteren. Sağ yarımkürenin somatosensoriyel korteksindeki projeksiyon nöronlar E13.5'i hedef aldı. E15.5 hedeflenen kontralateral tarafında hedeflenen projeksiyon nöronlar nükleer EGFP (nEGFP) ve membran hedefli tdTomato (mtdTomato) ifade. (B) Panel A'dabelirtilen plazmidler ile çift elektroporasyon ameliyatı geçiren bir beynin koronal bölümünün temsili görüntüsü . BFP veya nEGFP etiketli hücrelerin farklı dağılımlarına ve E15.5 etiketli üst tabaka callosal projeksiyon nöronların (mtdTomato) aksonların yoğun etiketlemelerine dikkat edin. Ölçek çubuğu = 500 μm. (C) Sağ yarımkürede bulunan somatosensoriyel korteksin çift elektroporated beyinde görüntüsü. Projeksiyon nöronların geniş dağılımına dikkat edin (mavi) katmanlar arasında ve kontralateral yarımkürede hedeflenen projeksiyon nöronların gelen nasosal aksonların bol arborization (kırmızı). Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Çift elektroporated beynin sol yarımkürede somatosensoriyel korteks görüntüsü. NEGFP (yeşil) ifadesi ile gösterildiği gibi kortikal plakanın üst kısmında hedeflenen projeksiyon nöronların ayrık lokalizasyonu dikkat, yanı sıra bol kırmızı etiketleme çevreleyen hücre organları ve tüm nöronal projeksiyonlar (kırmızı). Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) Sağ yarımkürede somatosensoriyel korteksin yüksek büyütme resimleri hedeflenen projeksiyon nöronların etrafında nasırsal aksonların arborization ayrıntılarını gösteren. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Strateji | Elektroporasyon sırası | Hedef hücreler | Hedeflenen bölge | Ventrikül enjekte | Elektrotların konumu | Voltaj ve darbeler | Kullanılan plazmidler | Analiz yaşı |
| A | Ilk | E11.5'te CR hücresi | Kortikal Hem | Sol | Sol hemisferde pozitif (medial duvara doğru yönlendirilir) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mKiraz | E17.5 |
| Ikinci | Kortikal Projeksiyon nöronlar E13.5 | Somatosensoriyel Korteks | Sol | Sol hemisferde pozitif | 35 V, 60 ms, 5p | ÇAĞ-EGFP | ||
| (kortekse doğru yönlendirilir) | ||||||||
| B | Ilk | Kortikal Projeksiyon nöronlar E13.5 | Somatosensoriyel Korteks | Doğru | Sağ hemisferde pozitif | 35 V, 60 ms, 5p | ÇAĞ-BFP | P15 |
| (kortekse doğru yönlendirilir) | ||||||||
| Ikinci | Kortikal Projeksiyon nöronlar E15.5 | Somatosensoriyel Korteks | Sol | Sol hemisferde pozitif | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdDomates | ||
| (kortekse doğru yönlendirilir) |
Tablo 1: Farklı deneylerde kullanılan elektroporasyon koşullarının özeti.
| Strateji A'da rahim elektroporasyonunda çift ekibe takip eden embriyoların hayatta kalması | |||||||||
| Çöp sayısı | İlk embriyo sayısı | İlk EP'den sağ kurtulan embriyo sayısı | İkinci EP'den sağ kurtulan embriyo sayısı | İlk EP'den sonra sağkalım % | İkinci EP*'den sonra sağkalım % | Küresel sağkalım oranının %'si | |||
| 9 | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2.08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4.44 ± 1.01 | ||||
| İlk EP'den sonra iptal edilen embriyo sayısı | İkinci EP'den sonra iptal edilen embriyo sayısı | İptal edilen toplam embriyo sayısı | İlk EP'den sonra kürtajın %'si | İkinci EP*'den sonra kürtajın %'si* | Küresel kürtaj oranının %'si | ||||
| Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1.8 ± 1.09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| *İlk elektroporasyondan kurtulan embriyolar göz önünde bulundurularak hesaplanan sağkalım ve kürtaj | |||||||||
Tablo 2: Strateji A'da rahim elektroporasyonunda çift etabı takip eden embriyoların sağkalım.
| Strateji B'den sonra embriyo ve yavruların hayatta kalması (çift EP E13.5 ve E15.5) | |||||||||||
| Çöp sayısı | İlk embriyo sayısı | İlk EP'den sağ kurtulan embriyo sayısı | Çift EP'den sonra doğan yavru sayısı | P15'te hayatta kalan embriyo sayısı | İlk EP'den sonra sağkalım % | İkinci EP sonrası sağkalım % | P15'te sağkalım % | ||||
| 8 | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6.5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3.63 ± 1.6 | ||||
| E13.5'te tek EP'den sonra embriyo ve yavruların hayatta kalması | ||||||||
| Çöp sayısı | İlk embriyo sayısı | EP'den sonra doğan yavru sayısı | P15'te hayatta kalan embriyo sayısı | EP sonrası sağkalım % | P15'te sağkalım % | |||
| 11 | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | Toplam sayı | (Avg. çöp ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7.1 ± 1.64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4.09 ± 2.07 | |||
Tablo 3: Strateji B'de rahim elektroporasyonunda çift etabı takip eden yavruların hayatta kalması basit elektroporasyona göre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serebral korteks gibi yüksek hücresel yoğunluğa sahip bölgelerde in vivo hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi karmaşık bir iştir. Nöritleri etiketlemek için antikor kullanımını içeren geleneksel yaklaşımlar, farklı hücre popülasyonları için özel belirteçlerin olmaması nedeniyle uygun değildir. Belirli bir hücre tipinin floresan proteini ifade ettiği transgenik murine modellerinin kullanımı, nöronal süreçleri görselleştirmek için yararlıdır, ancak bu tür modellerin kullanılabilirliğine bağlıdır. Bu görev, iki özel hücre tipi arasındaki etkileşimlerdeki olası farklılıkları, ilgi genlerinin tedirginedilmesi üzerine görselleştirmeye çalışırken daha da karmaşıktır, çünkü nakavt fareler gibi diğer hayvan modellerinin kullanımını içerir. Tüm bu konular, ekonomik ve zamansal maliyetler nedeniyle geçmişte bu çalışmaları karmaşık hale getirmiştir.
Utero elektroporasyonda olduğu gibi in vivo'da somatik transgenezin ortaya çıkmasına olanak tanıyan yeni tekniklerin ortaya çıkması, bu protokolde açıklanan gibi stratejiler tasarlama olanağı sunarak, kombine muhabir ve nakavt hayvanlarının kullanımını veya neslini aşarak bu tür deneyleri daha uygulanabilir hale getirmektedir. Bu yayında gösterilen sonuçlar ve daha önce yayınlanmış çalışmalar8, bu protokol 1) farklı zamansal ve mekansal kökene sahip hücre popülasyonlarının hedeflanmasına başarılı bir şekilde izin verdiğini göstermektedir; 2) mümkün yüksek çözünürlük ile hücre hücre temaslarının görselleştirilmesi yapar; ve 3) fonksiyonel deneylerden sonra hücre temaslarında farklılıkları tespit etmek için yararlıdır.
Rahim elektroporasyonunda geniş kullanımına rağmen, bu teknik ameliyatı güvenli bir şekilde gerçekleştirmek, embriyoları zarar vermeden işlemek ve istenilen bölgenin doğru hedeflemesini sağlamak için önemli ölçüde eğitim gerektirir. Ancak, bu eğitimden sonra, hamile kadınların sağkalım mükemmel (elimizde yaklaşık% 100) ve biz utero elektroporasyon tek ve çift arasında hiçbir fark bulduk. Tek ve çift elektroporated hamile kadınlar ameliyattan çok hızlı bir şekilde iyileşirler. Vakaların büyük çoğunluğunda, tek veya çift cerrahi den sonraki gün davranışları normal görünür ve bu hamile kadınlar acı ve sıkıntı belirtisi olmadan yemek, içmek, yürümek ve hatta zorluk çekmeden tırmanmak.
Birinci ve ikinci elektroporasyondan sonra embriyoların sağkalım oranı da genel olarak iyidir ve embriyoların yaşı arttıkça kürtaj oranı azalır(Tablo 2 ve Tablo 3). Ana zorluk her iki elektroporasyonda da başarılı hedeflemedir. E13.5'ten itibaren daha yaşlı embriyolarda başarı derecesi çok yüksektir. E11.5 gibi erken yaşlar daha zordur çünkü embriyoların küçük boyutu kullanım ve enjeksiyonu daha zor hale getirir, bu da onların hayatta kalmalarını etkiler. Ancak, ilk E11.5 elektroporasyonundan sağ kurtulan embriyolar, E13.5'teki ikinci elektroporasyondan sonra çok iyi sağkalım oranları sunarlar(Tablo 2). Bu teknikle yeterliliği artırmak için~ E14.5'te yavrularda ameliyatlar uygulamanızı ve daha genç yaşlarda giderek ameliyatlar denemenizi önemle tavsiye ediyoruz.
Bir diğer zorluk da doğum sonrası sağkalımdır, çünkü ameliyat olan anneler her zaman yavrularının hepsine bakamaz, ancak hamile dişiler tek veya çift elektroporated yavruları sorunsuz bir şekilde teslim ederler(Tablo 3) ve davranışları ve fitness durumları normal görünür. Elimizde ve burada açıklanan zamanlama ile, basit ve çift elektroporasyon dan sonra doğum sonrası sağkalımda önemli bir fark bulmuyoruz(Tablo 3),ancak olası sağkalım problemlerini atlatmak için yavrular doğum sırasında anne annelerin doğumda kötü anne davranışı sergilediğinde koruyucu annelere aktarılabilir. Doğum tarihinden önce hamile kadınlara ekstra yuvalama malzemesi ve zengin gıda sağlanması da yavruların sağkalım oranlarını artırmak için yardımcı olabilir.
Bu stratejinin en önemli avantajlarından biri fonksiyonel çalışmalar için yabani tip farelerin kullanımıdır, ancak örneğin, cre muhabiri farelere veya varsa genler için floxed farelere de uygulanabilir. Bu farelerde, plazmidleri ifade eden CRE-rekombinase elektroporasyonu, muhabir genin kalıcı ekspresyonuna veya hedeflenen hücrelerde sırasıyla istenilen genin inaktivasyonuna olanak sağlayacaktır. İşlevsel deneyler için yapının ifadesini yalnızca yalnızca hücre tipinde kontrol edebiliriz. Örneğin, bir nöronal organizatör sadece nöronlarda değil, nöral kök hücrelerde aday bir gen işlemek için kullanılabilir, bu nedenle ata düzeyinde istenmeyen etkileri önlemek. Tüm bu hususlar, zamanın ve hedeflenen bölgenin kontrolü ile birlikte, rahim elektroporasyonunda çift yapmak sadece korteks içinde değil, aynı zamanda bu teknoloji kullanılarak hedeflenebilir diğer yapılarda hücre-hücre etkileşimleri incelemek için çok yönlü bir teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Cristina Andrés Carbonell ve Universidad de Valencia Hayvan Bakım tesisi üyeleri teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Isabel Fariñas ve Sacramento R. Ferrón'a reaktifler ve ekipmanlarının bizimle paylaşılması için teşekkür etmek istiyoruz. I.M.W, Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D tarafından ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) tarafından finanse edilmektedir. C.Gil-Sanz, İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades'ten (MICINN) Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) aldı. Bu çalışma RYC-2015-19058 ve SAF2017-82880-R (MICINN) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
