Summary
该协议的目标是量化真核病原体人类诺如病毒与细菌的结合。在进行初始病毒-细菌附件测定后，流细胞测定用于检测种群内的病毒结合细菌。
Abstract
共生细菌已广为人知，可影响真核病毒的感染。病原体和宿主微生物群之间的直接结合是改变许多这些病毒的感染的原因。因此，描述病毒-细菌结合的性质是阐明细菌改变病毒感染机制所需的基本步骤。对于人类诺如病毒，共性细菌可增强B细胞感染。病毒直接与这些细菌结合，表明这种直接相互作用涉及感染增强机制。多种技术可用于量化细菌和病毒之间的相互作用，包括放射性标记病毒的闪烁计数和聚合酶链反应 （PCR）。这两种方法都需要使用活病毒，可能需要在实验室中生成。目前，人类诺如病毒的成熟体外培养系统都不足以产生高度浓缩的病毒种群。代替活病毒，病毒样颗粒（VLP）被用来描述诺如病毒和细菌之间的相互作用。本文介绍一种流细胞测定方法，使用病毒特异性抗体来量化VLP与克阴性和克阳性细菌结合。只包含细菌和等感控制，可以优化测定，以减少背景抗体结合，并准确量化VLP附件对所测试的细菌。高VLP：细菌比导致VLP与细菌群的较大百分比结合。但是，当 VLP 数量减少时，细菌结合的百分比也会降低。最终，这种方法可用于未来的实验，阐明规范诺如病毒的特定条件和结构成分：细菌相互作用。
Introduction
人诺病毒（HuNOV）是全世界胃肠道疾病的主要原因，每年造成6.85亿例感染和超过20万例死亡。与其他肠道病毒一样，共性细菌的存在已证明能增强该病原体及其代理病毒——鼠诺如病毒22、33的感染。也有相互矛盾的报告，细菌可以抑制感染人类诺如病毒44，5，6。5,6对于几种病毒，病毒和细菌之间的直接相互作用似乎是影响病毒感染的机制的基础22，7，8，9，10，7,8,9,10并且通过电子显微镜证明，人类诺如病毒直接结合到细菌的表面11，12。,12因此，描述这些相互作用对于确定细菌影响病毒感染的机制至关重要。这种特性从量化病毒结合开始，这些细菌物种是宿主微生物群77、12、1312,13的组成部分。这些附件测定不仅揭示了与细菌结合的病毒数量，还有助于确定这种相互作用对病毒健康与生存的影响。
为了量化病毒附着，传统上使用的方法包括基于PCR的检测，量化病毒基因组12或产生放射性标记病毒，并使用闪烁计数来量化病毒颗粒77，8，9，13。8,9,13使用这些方法通常需要获得高数量病毒储存和体外培养技术，从而产生它们。虽然人类诺如病毒的几个培养系统现在存在2,2，14，15，,15没有一个支持所需的强大的复制，以产生这些高度集中的种群，限制或消除使用PCR和闪烁计数来量化人类诺如病毒/细菌相互作用。
为了规避这个问题，病毒状粒子（VlPs）可以作为活病毒的代用品来研究人类诺如病毒和细菌之间的相互作用16，17。16,VLP 是非传染性颗粒，与它们衍生的病毒非常相似。在人类诺如病毒的情况下，这些颗粒是由VP1（以及VP2）蛋白质的表达产生的，这种蛋白质自我组装，创造出缺乏遗传物质（即诺如病毒的RNA）的完整病毒帽。这些VlPs具有很好的特征，在结构和抗原上与野生病毒相似，它们来源于18、19、20、21、22、23。18,19,20,21,22,23因此，VLP是研究人类诺如病毒和共性细菌表面相互作用的理想代用品。鉴于VLP缺乏遗传物质，基于PCR的测定不能用于量化病毒结合。先前曾描述过一种基于抗体的流细胞测定方法，能够以半定量的方式检测与细菌结合的低水平VLP。该方法经过优化，使人类诺如病毒VLP与克阴性和克阳性共性细菌16结合进行精确定量。
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Protocol
注：协议中概述的细菌生长条件是肠杆菌氯酸和乳酸杆菌的培养条件。为了与其他细菌物种进行病毒：细菌附着测定，所选细菌应在适合细菌的标准条件下培养。
1. 制备细菌生长介质
-
肠杆菌生长介质
- 通过在1升脱电化（DI）水中溶解10克试油、5克酵母提取物和10克氯化钠（NaCl）来制备液体介质（见材料表）。将所有介质彻底混合，通过高压灭菌 30 分钟进行消毒。
- 通过在1L DI水中溶解10克试石酮、5克酵母提取物、10克NaCl和15克agar来制备固体介质。将所有介质彻底混合，通过高压灭菌 30 分钟进行消毒。
-
乳酸杆菌生长介质
- 通过在DI水中溶解55克德曼、罗戈萨和夏普（MRS;参见材料表）粉末来制备液体介质。在准备后一个月内使用介质。要消毒，加热介质15分钟，直到沸腾，然后高压15分钟。
- 通过在 1 L DI 水中溶解 55 克 MRS 粉和 15 g agar，制备固体介质。要消毒，加热介质15分钟，直到沸腾，然后高压15分钟。
2. 建立与光学密度（OD）和细菌浓度相关的标准曲线
- 从加盘（E.氯酮）或直接从冷冻甘油库存（L.gasseri）中分离出5 mL的适当液体介质，与单一的隔离菌体。
- 在适当的大气条件下，在适当的大气条件下，一夜之间生长细菌（肠杆菌氯酸：37°C，在200rpm时有氧摇动;L. gasseri： 37 °C 水浴，密封容器内无晃动）。
- 将2 x 1.3 mL过夜培养的分位转移到两个独立的1.5 mL离心管和离心细菌中，在10，000 x g下，5分钟。
- 去除上清液，用1 mL无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗样品。重复此洗涤步骤，总共洗涤 2 次。
- 在 10，000 x g下再次离心样品 5 分钟，去除上清液，重新悬浮在 1.3 mL 无菌 1x PBS 中。
- 从0.5 mL的洗涤培养开始，连续稀释1x PBS中的细菌，从10-1到10-4。
- 使用分光光度计，测量洗涤、未稀释的培养物的光学密度和在 600 nm （OD600） 处的四个稀释器中的每个。
- 在步骤 2.6 中的每个稀释中，在 1x PBS 中执行 10 倍的串行稀释。将每个系列最后3个稀释剂的100 μL展开板到适当的固体介质上，以确定每个样品每毫升（CFU/mL）的菌落形成单位数。盘每次稀释三联。
- 允许板在室温下干燥5分钟。反转板并在适当的大气条件下孵育（E. 氯卡：在37°C有氧，孵化板过夜;L. gasseri：在37°C下厌氧，在装有抗性气袋的密封容器中孵育48小时板（见材料表）。
注：每 2.5 L 罐使用 1 个厌氧空气小袋，或每 7.0 L 罐使用 3 袋（参见材料表）。 - 使用板计数确定 5 个样品中的每个样品的 CFU/mL（即未稀释、10-1、10-2、10-3、10-4）。-1-2-3生成比较 OD600与 CFU/mL 的标准曲线。这条线的方程将用于VLP细菌附件测定，以确定基于OD600的CFU/mL。
3. VLP细菌附件测定
注意：人类诺如病毒VLP是生物安全级别（BSL）-2危害，所有涉及VLP的工作都应在生物安全柜中执行。在附件测定之前，应使用适合生物体的安全条件进行细菌培养的准备。
- 试剂制备
- 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
- 通过在 1 L DI 水中溶解整个数据包，准备 1 L 的 10x PBS。
- 高压灭菌解决方案 30 分钟。
- 通过在 DI 水中稀释上述溶液 1：10，准备 1 倍解决方案。
- 过滤器通过0.22 μm过滤器对溶液进行消毒，并在室温下储存。
- 5% BSA
- 将5克牛血清白蛋白（BSA）粉加入100 mL的PBS，产生5%（w/v）溶液。
- 使用金属搅拌棒通过涡旋或在搅拌板上混合溶液，直到团块溶解。
- 使用 0.22 μm 过滤器进行滤芯消毒。
- 将溶液储存在 4 °C。
- 流动细胞测量染色缓冲液 （FCSB）
- 过滤器通过0.22μm过滤器购买了FCSB（参见材料表）。
- 将剩余的溶液储存在 4 °C 下。
- 5% 阻塞缓冲区 （BB）
注：每次准备新鲜。- 将 0.5 克 BSA 添加到 10 mL 无菌 FCSB。
- 涡旋将样品完全混合，并留在冰上，直到使用。
- 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
- 抗体结合
- 根据制造商的说明，使用 R-PE 抗体标签套件将人诺如病毒 GII 抗体（参见材料表）与 r-phycoeryrrin （PE） 结合使用（参见材料表）。
- 将结合抗体储存在黑暗中，温度为4°C，供将来在VLP-细菌附件测定分析中使用。
注：在VLP-细菌附件测定中使用之前，应对主要抗体进行定化，以确定流细胞测定所需的适当浓度。每次进行镇定反应时，以及附件测定中使用的每种细菌，都应进行抗体滴定。
- 抗体滴定
- 稀释偶联抗人类诺如病毒GII抗体100倍，开始稀释1：100，结束稀释1：600（共6稀释）。
- 执行病毒附件测定，如下所述，以下例外情况：在步骤 3.5.7 中，将细菌颗粒重新悬浮在 350 μL 的 5% BB 中。
- 将样品分为 7 个 50 μL 等位。
- 将每个抗体稀释剂的50μL添加到一个管中。
- 将 50 μL 的 5% BB 添加到第七管作为未染色的控制。
- 对所有样品执行流细胞测定，如下所述。
- 将稀释后的抗体样品与未染色的对照组和相互进行比较。应选择不导致阳性信号减少或损失的最低抗体浓度，供后续测定使用。
- 细菌的制备
- 在适当的大气条件下，将细菌在适当的液体介质的40 mL中生长，直到细菌处于静止阶段。
- 在37°C的Luria Broth中一夜之间，在Luria Broth中生长E.氯环培养物，在200rpm时摇动，达到固定阶段。
- 在 MRS 肉汤中生长L. gasseri培养物，在黑色螺钉帽管中，无需在水浴中摇动，达到 37°C，达到静止阶段。
- 将固定相培养液转移到50 mL锥形管和离心机样品上，以2，288 x g的速度进行10分钟颗粒细菌。
- 取出上清液，重新悬浮在 13 mL 无菌 1x PBS 中。重复此洗涤步骤，总共进行两次洗涤。
- 再次离心样品，取出上清液，并在 20 mL 的 1x PBS 中重新悬浮样品。
注：如果细胞颗粒较小，则重新悬浮体积可减小。 - 测量区域性的 OD600。
- 使用先前准备的标准曲线，确定洗涤培养剂每 mL 的 CFU。
- 根据需要使用 1x PBS 稀释细菌，将培养浓度调整到 1 x 108 CFU/mL。
- 将 1 x 108 CFU/mL 细菌培养物的 1 mL 转移到所需数量的 1.5 mL 离心管。
- 将管在 10，000 x g下离心 5 分钟。
- 将细菌颗粒重新悬浮在 1 mL 无菌 5% BSA 中。
- 在37°C下用恒定旋转孵育管1小时。
- 在适当的大气条件下，将细菌在适当的液体介质的40 mL中生长，直到细菌处于静止阶段。
- 病毒附件
- 在BSL-2生物安全柜内工作，在每个含有悬浮物的管中加入10μg的HuNoV VLP（见材料表），并通过移液彻底混合。
注：VLP 浓度与每次 VLP 制备不同。因此，添加到细菌的体积在制备批次之间会有所不同，应相应地进行调整，以便在实验中将10μg添加到每个管中。对于仅控制细菌（例如，没有 VLP 的样本），添加等于添加到实验样本的 VLP 体积的 PBS 体积。 - 在37°C下孵育管1小时，并持续旋转。
注：在孵育过程中使用设置为40 rpm的管左轮手枪（参见材料表）。 - 孵育后，将样品在10，000 x g下离心5分钟。
- 在 1 mL PBS 中丢弃上清液并重新悬浮细菌颗粒。
- 重复洗涤步骤 3.5.3 和 3.5.4。
- 将样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
- 在 150 μL 5% BB 中丢弃上清液并重新悬浮细菌颗粒。
- 在BSL-2生物安全柜内工作，在每个含有悬浮物的管中加入10μg的HuNoV VLP（见材料表），并通过移液彻底混合。
- 抗体染色
- 准备新鲜的 5% BB。
注：所有使用荧光标记抗体的工作都应在黑暗中进行，抗体、BB和FCSB应保存在冰上。 - 稀释人类诺如病毒GII抗体1：125E氯环酶样品和1：150为L.gasseri样品在5%BB，准备50μL稀释抗体每个样品。
- 稀释等体型抗体的方式与5%BB中每种细菌稀释人体诺如病毒GII抗体的方式相同，制备每个样品50μL的稀释等值型对照。
- 通过将每个附件测定样品从步骤 3.3.7 分成三个 50 μL 等位，将其转移到干净的 1.5 mL 离心机管中。
- 在第一组样品中，加入50μLBB。此集将是未染色 （Uns） 控件。
- 在第二组中，加入50μL的GII抗体稀释。这导致最终抗体浓度为1：250E氯卡和1：300的L.gasseri。此示例集将是染色 （AB） 样品。
- 在第三组中，加入稀释的等值型抗体50μL。此集将是等值型控件 （IC）。通过移液很好地混合。在冰上和黑暗中孵化样品30分钟。
- 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
- 丢弃上清液，并在FCSB的100μL中重新悬浮样品。
- 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。丢弃上清液，并在 100 μL 的 FCSB 中重新悬浮样品。
- 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
- 丢弃上清液，并在150μL的FCSB中重新悬浮样品。
- 将每个样品转移到含有 400 μL FCSB 缓冲液的 FCSB 管，总体积为 550 μL。
- 将样品保持在 4°C，直到通过流式细胞测定分析。
注：流动细胞测定在抗体染色的4小时内进行。
- 准备新鲜的 5% BB。
4. 流动细胞测量
注：下面描述的电压设置基于材料表中列出的流量细胞计和软件，并且可能会因不同的流量细胞计而异。应针对每种细菌优化设置。确保所有图形的轴处于双指数相位。
- 设置工作区
注： 用于建立工作区的绘图的设置与门控和数据分析中使用的图形的设置不同。设置工作区的目的是可视化细胞群，确保细菌细胞不会过度聚集，从而影响下游分析，并在收集数据时区分染色细胞和未染色细胞。- 为了确保细菌不聚集在一起，设置一系列密度图。
- 生成正向散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 之间的数据化总总体。
- 通过创建两个图形，分别比较正向 （FSC-W） 和侧散射宽度 （SSC-W） 到正向 （FSC-H） 和侧散射高度 （SSC-H） 和侧散射高度 （SSC-H），设置图以评估单个单元格与细胞团块。
- 创建仅显示 PE 正填充（PE-A 与 SSC-A）的绘图。
- 将E.氯卡的基线电压设置为 500，将 L. gasseri的基线电压设置为 540。这些将在以后进一步调整。
- 将计数的事件总数设置为 10，000 个事件。
- 为了确保细菌不聚集在一起，设置一系列密度图。
- 运行示例
- 创建三个单独的直方图图，显示针对 SSC-A、FSC-A 或 PE-A 绘制的计数。
- 在流式细胞仪上放置未染色的样本并获取样本事件，确保 SSC-A 直方图上的最大峰值在 102到 103之间，并且 FSC-A 直方图上的最大峰值在 x 轴上为 104到 105之间。如果没有，峰值不在指定范围内，请相应地调整 FSC 和 SSC 电压。
- 在流量细胞仪上放置一个染色样品 （AB），并调整电压 PE，使最大峰值超过 x 轴上的 103。
- 根据这些测量值，设置正 PE 门，并在 PE-A 与 SSC-A 密度图上设置门。
- 以低速或中速在确定的设置下运行所有样本。
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Representative Results
图1显示了用于量化人类诺如病毒VLP与交联细菌结合的浇注策略。代表性密度点概述了如何封闭样品以消除细胞碎屑和细胞团块，从而在单体上确定了VLP附件（图1A）。代表直方图显示，细菌中抗诺如病毒抗体信号水平较低，只有缺乏诺如病毒VLP的样品和带有等值对照抗体的VLP细菌样品的低背景信号（图1B）。等体型控制峰也与未染色的样品重叠，而同一样品的染色与抗人类诺如病毒GII抗体导致峰值显著变化。
通顿直方图减法用于比较抗人类诺如病毒GII抗体染色样品中的PE阳性信号与相应等型对照的PE阳性信号，并确定人类诺如病毒VLP约束的细菌群的百分比（图1B）。在1小时孵育10μg的VLP后，流细胞测定仪检测到与氯卡和L.gasseri结合的颗粒（图2）。事实上，在这些条件下，两种细菌都发生了高水平的结合;与E.氯卡卡相比，与L.gasseri的绑定程度略高，但显著（p < 0.0001）。与E.氯卡基相比。这些测定表明，流细胞测定可用于检测人类诺如病毒与革兰阳性和革兰阴性细菌结合。
为了确定这种测定的结合定量极限，在加入细菌之前生成了VLP的稀释系列（图3）。对于两种细菌，在细菌培养中添加的VLP量的减少导致VLP结合的细菌百分比相应减少。与L.gasseri相比，由颗粒结合的E.氯环酶百分比的变化更为缓慢，但尽管VLP浓度进一步降低，但两种细菌的附着百分比趋于平和。具体来说，在108 CFU细菌中0.1 μg或更少（未显示的数据）的VLP导致两种细菌的依恋率平均在13-19%之间，表明这个百分比是这种测定的定量极限。
图1：人类诺如病毒VLP结合的代表性流细胞学分析。（A） 代表流细胞测量门控策略，以量化 VLP 与细菌结合。密度图用于封闭细胞碎片，随后的点图门，以去除细菌双块和细胞团块。（B） 代表直方图显示，仅细菌样本中缺乏 PE 信号，VLP：细菌样本中的 PE 信号强度与未染色和等值型对照相比也发生变化。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：VLP附件E.氯卡卡和L.gasseri。在PBS中，E.氯烷（n = 6）和L.gasseri（n = 6）的过夜培养被稀释到1 x 108 CFU/mL。细菌用10μg的GII.4 VLP孵育1小时，然后用流细胞测定测量VLP附件。在图 1B中可以找到具有代表性的图。使用直方图减法确定百分比附着，将GII人类诺如病毒染色样品的PE阳性信号与相应等型对照的PE阳性信号进行比较。使用未配对的学生 t 检验（p < 0.0001）执行统计分析。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：E.氯卡卡和L.gasseri的VLP稀释系列。10 μg 的 GII.4 VLP 被连续稀释，VLP 稀释物分别添加到 1 x 108细菌中，最终体积为 1 mL（两种细菌为 n = 3）。样品在37°C下孵育一小时。使用流细胞测定测量细菌的VLP附着。使用直方图减法确定百分比附着，将GII人类诺如病毒染色样品的PE阳性信号与相应等型对照的PE阳性信号进行比较。减少 VLP 的输入量，使（A） E. 氯卡和（B） L. gasseri的附件百分比逐步降低。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
量化肠道病毒与细菌结合的能力是阐明这些细菌改变病毒感染机制的关键第一步。本文所述的方法经过优化，以测量人类诺如病毒VLP与E.氯环酶（克阴性细菌）和L.gasseri（一克阳性细菌）的相互作用，但可以适应任何哺乳动物病毒和感兴趣的细菌。虽然VLP是活病毒的理想替代品，用于附件测定，这些粒子可以很容易地量化使用流细胞测定，P粒子也被用来检查人类诺如病毒和细菌24之间的相互作用。在这项研究中，与细菌种群相比，与细菌种群相比，与细菌结合的病毒数量进行了量化，正如这里所报道的。P粒子比VlPs具有优势，因为它们更容易产生，同时提供对VLP和野生病毒24，25,25的抗原相似性。然而，人类诺如病毒VLP在商业上可用，为缺乏产生VLP或P粒子能力的实验室提供了一种手段。P粒子与VlPs不同，因为虽然VlPs保持野生型病毒粒子的大小，P粒子较小，具有四面体而不是异体对称性25。这些特性对细菌相互作用的影响尚未被探讨，P粒子可以作为VLP的可行替代品，在描述人类诺如病毒和细菌之间的表面相互作用时。
如前所述，上述测定可用于进一步描述人类诺如病毒VLP和细菌之间的相互作用。研究生长条件和细菌表面结构表达的变化如何改变病毒结合可以探索使用该技术。此外，该测定还可用于通过使用细菌蛋白或甘油进行竞争性抑制检测、酶处理以去除特定表面结构或孵化具有特别结构的突变细菌菌株，确定病毒约束的特定细菌结构。这种检测也可以用于调查其他诺如病毒菌株与共性细菌相互作用的能力。
由于这种测定量化了诺如病毒VLP所约束的细菌种群的比例，因此准确确定CFU/mL和OD600之间的相关性至关重要，因此可以测量细菌培养浓度。VLP的波动：细菌比改变由VLP约束的细菌种群的百分比，并可能导致结果变异。还应注意添加足够数量的病毒颗粒，因为这种检测的检测极限接近0.1 μg的VLP/108 CFU细菌。低于此限制的比率始终产生 13-19% 的固定值百分比;因此，观察到的以这些百分比或低于这些百分比进行的人口依恋可能不是真的。
在VLP：细菌附着实验中使用之前，对每种新结合抗体和每种细菌菌株均执行抗体定分。每种细菌所需的抗体浓度相似，从1：250到氯卡，1：300为L.gasseri。相对于真核细胞的大小，细菌体积小，既需要电压调整，也需要在数据收集期间使用二元分布，以充分分离细菌与样品中可能发现或仪器内循环的碎片的细菌。收集数据后，可以使用适当的浇注来进一步清除较大的碎屑颗粒和细菌团块，因此只分析单个细胞群。对于每个被测试的细菌物种建立独特的电压设置也至关重要，因为这些细菌会广泛波动，特别是在克阴性细菌和克阳性细菌之间。
包含适当的控制，包括细菌和等型控制对于准确分析数据也至关重要。这两种控制类型都提供有关非特异性抗体结合水平的信息。我们的结果表明，用于非特定结合的抗体与所测试的细菌物种不结合，但非特异性结合可能会随着细菌种类或抗体的变化而变化。
此处介绍的方法量化了人类诺如病毒颗粒与克阳性和克阴性细菌结合，有助于描述病毒：细菌相互作用。此外，该基础协议可以很容易地优化，用于人类诺如病毒的其他基因型，以及其他哺乳动物病毒和细菌。
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Disclosures
提交人没有任何利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢苏托努卡·巴哈尔和香奈儿·莫斯比-豪德鲁普对书面手稿的批判性审查，以及阿方索·卡里略在生成细菌标准曲线方面的帮助。这项工作部分由国家卫生研究所（R21AI140012）赠款和佛罗里达大学粮食和农业科学研究所的种子赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
