Summary
Målet med detta protokoll är att kvantifiera bindningen av eukaryota patogenen humant norovirus till bakterier. Efter att ha utfört en första virusbakterien fastsättningsanalys, flöde cytometri används för att upptäcka viralt bundna bakterier inom befolkningen.
Abstract
Commensal bakterier är väl etablerade för att påverka infektion av eukaryota virus. Direkt bindning mellan patogenen och värdmikrobiomet är ansvarig för att ändra infektion för många av dessa virus. Således, karakterisera arten av virus-bakterier bindande är ett grundläggande steg som behövs för att belysa den mekanism (er) genom vilken bakterier ändra virusinfektion. För humant norovirus, commensal bakterier förbättra B-cellinfektion. Viruset binder direkt till dessa bakterier, vilket tyder på att denna direkta interaktion är involverad i mekanismen för infektionsförbättring. En mängd olika tekniker kan användas för att kvantifiera interaktioner mellan bakterier och virus, inklusive scintillation räkna radiolabeled virus och polymeras kedjereaktion (PCR). Båda metoderna kräver användning av levande virus, som kan behöva genereras i laboratoriet. För närvarande är inget av de etablerade in vitro-odlingssystem som finns tillgängliga för humant norovirus tillräckligt robusta för att möjliggöra generering av starkt koncentrerade viruslager. I stället för levande virus har virusliknande partiklar (VLPs) använts för att karakterisera samspelet mellan norovirus och bakterier. Häri beskrivs en flödescytometrimetod med användningar av virusspecifika antikroppar för att kvantifiera VLP-bindning till gramnegativa och grampositiva bakterier. Införande av endast bakterier och isotypkontroller som är tillåtna för optimering av analysen för att minska bakgrundsantikroppsbindning och exakt kvantifiering av VLP-fastsättning på de testade bakterierna. Höga VLP:bakterieförhållanden resulterar i VLPs som binder till stora andelar av bakteriepopulationen. Men när VLP-mängder minskas minskar också andelen bakterier som är bundna. I slutändan kan denna metod användas i framtida experiment som belyser de specifika villkor och strukturella komponenter som reglerar norovirus:bakteriella interaktioner.
Introduction
Humana norovirus (HuNoVs) är den främsta orsaken till gastrointestinal sjukdom över hela världen, som ansvarar för 685 miljoner infektioner och över 200.000 dödsfall varje år1. Som med andra enteriska virus, förekomsten av commensal bakterier har visat sig öka infektion av denna patogen samt dess surrogatvirus, murine norovirus2,3. Det finns också motstridiga rapporter om att bakterier kan hämma infektion av humant norovirus4,,5,6. För flera virus verkar direkt interaktion mellan viruset och bakterier ligga bakom de mekanismer som påverkar virusinfektion2,7,8,9,10, och det har visats genom elektronmikroskopi att humana norovirus binder direkt till ytan av bakterier11,12. Därför har karakterisering av dessa interaktioner blivit avgörande för att bestämma de mekanismer genom vilka bakterier påverkar virusinfektion. Denna karakterisering har klassiskt börjat med att kvantifiera viral bindning till en rad bakteriearter som är komponenter i värdmikrobiomet7,,12,13. Dessa bifogad fil analyser inte bara avslöja mängden virus bunden till bakterier, men också stöd för att fastställa effekterna av denna interaktion på viral kondition och överlevnad.
För att kvantifiera viral kvarstad, traditionellt använda metoder inkluderar PCR-baserade analyser som kvantifierar virala genom12 eller generering av radioaktivt märkt virus och användning av scintillation räkna för att kvantifiera viruspartiklar7,8,9,13. Användningen av dessa metoder kräver i allmänhet tillgång till högiterviruslager och in vitro-odlingstekniker för att generera dem. Medan flera kultursystem för humant norovirus nu finns2,14,15, stöder ingen den robusta replikering som krävs för att generera dessa starkt koncentrerade bestånd som begränsar eller eliminerar användningen av PCR och scintillation räkna för att kvantifiera humant norovirus /bakteriella interaktioner.
För att kringgå detta problem, virusliknande partiklar (VLPs) kan användas som ett surrogat för att leva virus för att undersöka interaktioner mellan mänskliga norovirus och bakterier16,17. Vlps är icke-infektiösa partiklar som liknar det virus som de härrör från. När det gäller humant norovirus genereras dessa partiklar från uttrycket av VP1 -proteinet (och någon gång VP2)-proteinet, som självmonterar för att skapa intakta viruskapsider som saknar genetiskt material (dvs. RNA för norovirus). Dessa VLPs har väl karakteriserats, är strukturellt och antigeniskt liknar de vilda virus från vilka de härstammar18,19,20,21,22,23. Därför fungerar VLPs som ett idealiskt surrogat för att undersöka ytan interaktioner mellan mänskliga norovirus och commensal bakterier. Med tanke på att VLPs saknar genetiskt material kan PCR-baserade analyser inte användas för att kvantifiera virusbindning. En antikroppsbaserad flödescytometrimetod har tidigare beskrivits och kan detektera låga nivåer av VLP-bindning till bakterier på ett semikvantativt sätt16. Denna metod har optimerats för att möjliggöra exakt kvantifiering av humant norovirus VLP bindning till både gramnegativa och grampositiva commensalbakterier16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: De bakterietillväxtförhållanden som beskrivs i protokollet är standardodlingsförhållanden för Enterobacter cloacae och Lactobacillus gasseri. För att utföra viruset: bakterier fastsättning analys med andra bakteriearter, bör de valda bakterierna odlas under standardförhållanden som är lämpliga för bakterien.
1. Förbereda bakteriell tillväxt Medium
-
Enterobacter cloacae tillväxt media
- Förbered flytande medium genom att lösa upp 10 g trypton, 5 g jästextrakt och 10 g natriumklorid (NaCl) i 1 L avjoniserat (DI) vatten (se Materialtabell). Blanda alla medier noggrant och sterilisera genom autoklavering i 30 min.
- Förbered fast medium genom att lösa upp 10 g trypton, 5 g jästextrakt, 10 g NaCl och 15 g agar i 1 L DI vatten. Blanda alla medier noggrant och sterilisera genom autoklavering i 30 min.
-
Lactobacillus gasseri tillväxt media
- Förbered flytande medium genom att lösa upp 55 g De Man, Rogosa och Sharpe (MRS; se Tabell över material) pulver i 1 L DI vatten. Använd medium inom en månad efter beredningen. För att sterilisera, värm medium i 15 min tills kokning följt av autoklavering i 15 min.
- Förbered fast medium genom att lösa upp 55 g MRS-pulver och 15 g agar i 1 L DI vatten. För att sterilisera, värm medium i 15 min tills kokning följt av autoklavering i 15 min.
2. Upprättande av en standardkurva som korrelerar optisk densitet (OD) och bakteriekoncentration
- Inokulera 5 ml lämpligt flytande medium med en enda, isolerad koloni från en agarplatta (E. cloacae) eller direkt från fryst glycerollager (L. gasseri).
- Odla bakterien över natten, under lämpliga atmosfäriska förhållanden(Enterobacter cloacae:37 °C med aerob skakning vid 200 varv/min; L. gasseri: 37 °C vattenbad utan skakning i en lufttät behållare).
- Överför 2 x 1,3 ml alikvoter av över natten kultur i två separata 1,5 ml centrifugrör och centrifugbakterier vid 10.000 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och tvätta proverna med 1 ml steril 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Upprepa detta tvättsteg för totalt 2 tvättar.
- Centrifugera proverna igen vid 10 000 x g i 5 min, ta bort supernatanten och resuspend i 1,3 ml steril 1x PBS.
- Från och med 0,5 ml tvättad kultur, späd seriellt bakterierna i 1x PBS från 10-1 till 10-4.
- Med hjälp av en spektrofotometer mäter du den optiska densiteten hos den tvättade, outspädda kulturen och var och en av de fyra utspädningarna vid 600 nm (OD600).
- Utför 10-faldig seriell utspädning i 1x PBS för varje utspädning från steg 2.6. Spridningsplatta 100 μL av de senaste 3 utspädningarna för varje serie på lämpligt fast medium för att bestämma antalet kolonibildande enheter per milliliter (CFU/ml) för varje prov. Platta varje utspädning i tre exemplar.
- Låt plattorna torka i rumstemperatur i 5 min. Invertera plattorna och inkubera under lämpliga atmosfäriska förhållanden(E. cloacae:aerob vid 37 °C, inkubera plattor över natten; L. gasseri:anaerob vid 37 °C, inkubera plattor för 48 timmar i en lufttät behållare med aneroba luftpåsar (se Materialförteckning)).
OBS: Använd 1 anaerob luftpåse per 2,5 L burk eller 3 påsar per 7,0 L burk (se Tabell över material). - Använd plåtantal för att bestämma CFU/ml för vart och ett av de 5 proverna (dvs. outspädd, 10-1,10-2, 10-3, 10-4). Generera en standardkurva som jämför OD600 vs CFU/ml. Ekvationen för denna linje kommer att användas i VLP-bakterier fästanalyser för att bestämma CFU / ml baserat på OD600.
3. VLP-bakterier Attachment Analys
VARNING: VlPs för humant norovirus är en biosäkerhetsnivå (BSL)-2-fara och allt arbete med VLPs bör utföras i ett biosäkerhetsskåp. Beredning av bakteriekulturerna, före fästanalysen, bör utföras med hjälp av säkerhetsförhållanden som är lämpliga för organismen.
- Förberedelse av reagens
- 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)
- Förbered 1 L 10x PBS genom att lösa upp ett helt paket i 1 L DI vatten.
- Autoklavlösning i 30 min.
- Förbered en 1x lösning genom att späda ut ovanstående lösning 1:10 i DI-vatten.
- Filtrera sterilisera lösningen genom att passera den genom ett 0,22 μm filter och förvara i rumstemperatur.
- 5% BSA
- Tillsätt 5 g bovint serumalbumin (BSA) pulver till 100 ml PBS för att generera en 5% (w / v) lösning.
- Blanda lösningen genom att virvla eller på en omrörningsplatta med hjälp av en metallrörstång tills klumparna har lösts upp.
- Filtrera sterilisera med ett 0,22 μm filter.
- Förvara lösningen vid 4 °C.
- Flödescytometrifläcksbuffert (FCSB)
- Filtrera inköpt FCSB (se Tabell över material)genom ett 0,22 μm filter.
- Förvara återstående lösning vid 4 °C.
- 5% blockerande buffert (BB)
OBS: Förbered dig på nytt varje gång.- Tillsätt 0,5 g BSA till 10 ml steril FCSB.
- Vortex att helt blanda prov och lämna på is tills användning.
- 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)
- Antikroppkonjugering
- Konjugera GII-antikroppen för humant norovirus (se Materialförteckning)med r-phycoerythrin (PE) med hjälp av en R-PE-antikroppsmärkningssats enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell över material).
- Förvara den konjugerade antikroppen i mörker vid 4 °C för framtida användning i VLP-bakteriens fästanalysanalys.
OBS: Den primära antikroppen ska titreras före användning i VLP-bakteriernas fästsats för att bestämma den koncentration som krävs för flödescytometrianalys. Antikroppstitrering ska utföras varje gång konjugationsreaktionen utförs och för varje bakterie som används i tillbehörsanalysen.
- Antikroppstitrering
- Späd den konjugerade anti-humana norovirus GII-antikroppen 100 gånger, med en startutspädning på 1:100 och en slutspädning på 1:600 (totalt sex utspädningar).
- Utför en virustillbehörsanalys enligt beskrivningen nedan med följande undantag: i steg 3.5.7 återanvändas bakteriepelleten på 350 μL på 5 % BB.
- Dela upp provet i sju μl alikvoter.
- Tillsätt 50 μl av varje antikroppsutspädning till ett rör.
- Tillsätt 50 μL 5% BB till det sjunde röret som en ofläckad kontroll.
- Utför flödescytometri på alla prover enligt beskrivningen nedan.
- Jämför utspädda antikroppsprover med ofläckade kontroller och med varandra. Den lägsta antikroppskoncentrationen som inte leder till en minskning eller förlust av positiv signal bör väljas för användning i efterföljande analyser.
- Beredning av bakterier
- Odla bakterierna i 40 ml lämpligt flytande medium under lämpliga atmosfäriska förhållanden tills bakterierna är i stationär fas.
- Odla E. cloacae kulturer aerobt över natten i Luria Buljong vid 37 °C, skakar vid 200 rpm för att nå stationär fas.
- Odla L. gasserikulturer i MRS-buljong i svarta skruvlocksrör utan att skaka i ett vattenbad inställt på 37 °C i 18 timmar för att nå stillastående fas.
- Överför stationära faskulturer för att rengöra 50 ml koniska rör och centrifugprover vid 2 288 x g i 10 minuter för att pelleta bakterierna.
- Ta bort supernatanten och resuspend i 13 ml steril 1x PBS. Upprepa detta tvättsteg för totalt två tvättar.
- Centrifugera proverna igen, ta bort supernatanten och resuspendproverna i 20 ml 1x PBS.
OBS: Om cellpelleten är liten kan återsuspensionsvolymen minskas. - Mäta OD600 av kulturen.
- Med hjälp av den tidigare beredda standardkurvan bestämmer du CFU per ml för den tvättade kulturen.
- Späd bakterierna efter behov med 1x PBS för att justera odlingskoncentrationen till 1 x 108 CFU/ml.
- Överför 1 ml av bakteriekulturen 1 x 108 CFU/mL till önskat antal centrifugrör på 1,5 ml.
- Centrifugera rören på 10.000 x g i 5 min.
- Resuspend bakteriepellet i 1 ml steril 5% BSA.
- Inkubera rören i 1 h vid 37 °C med konstant rotation.
- Odla bakterierna i 40 ml lämpligt flytande medium under lämpliga atmosfäriska förhållanden tills bakterierna är i stationär fas.
- Tillsats av virus
- Arbeta inuti ett BSL-2 biosäkerhetsskåp, tillsätt 10 μg HuNoV VLPs (se Tabell över material)till varje rör som innehåller bakterier som återutnyttjas i PBS och blanda noggrant genom pipettering.
OBS: VLP-koncentrationen skiljer sig åt med varje VLP-beredning. Därför varierar den volym som tillsätts bakterier mellan beredningssatser och bör justeras i enlighet med detta så att 10 μg tillsätts till varje rör i försöket. För bakteriekontroller (t.ex. prover utan VLP) lägger du till en volym PBS som motsvarar den volym VLP som läggs till i experimentella prover. - Inkubera rör i 1 h vid 37 °C med konstant rotation.
OBS: En rörrevolver (se Tabell över material) inställd på 40 rpm används under inkubationen. - Efter inkubationen centrifugera proverna vid 10 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatant och resuspend bakteriell pellet i 1 ml PBS.
- Upprepa tvättstegen 3.5.3 och 3.5.4.
- Centrifugera proverna vid 10 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatant och resuspend bakteriell pellet i 150 μL av 5% BB.
- Arbeta inuti ett BSL-2 biosäkerhetsskåp, tillsätt 10 μg HuNoV VLPs (se Tabell över material)till varje rör som innehåller bakterier som återutnyttjas i PBS och blanda noggrant genom pipettering.
- Antikroppsfärgning
- Förbered färska 5% BB.
OBS: Allt arbete med fluorescerande taggade antikroppar ska utföras i mörker och antikroppen, BB och FCSB ska förvaras på is. - Späd humant norovirus GII-antikropp 1:125 för E. cloacae prover och 1:150 för L. gasseriprover i 5% BB, förbereda 50 μL utspädd antikropp per prov.
- Späd isotypantikroppen på samma sätt som gii-antikroppen för humant norovirus späddes ut för varje bakterie i 5% BB och förberedde 50 μl utspädd isotypkontroll per prov.
- Dela upp varje fästanalysprov från steg 3.3.7 i tre μl alikvoter genom att överföra dem till rena 1,5 ml centrifugrör.
- Tillsätt 50 μl BB till den första uppsättningen prover. Den här uppsättningen kommer att vara de ofläckade (Uns) kontrollerna.
- Tillsätt 50 μL av GII-antikroppsutspädningen till den andra uppsättningen. Detta resulterar i en slutlig antikroppskoncentration på 1:250 för E. cloacae och 1:300 för L. gasseri. Detta provset kommer att vara de färgade (AB) proverna.
- Tillsätt 50 μL av den utspädda isotypantikroppen till den tredje uppsättningen. Den här uppsättningen kommer att vara isotype-kontrollerna (IC). Blanda väl genom pipettering. Inkubera proverna på is och i mörker i 30 min.
- Centrifugera alla prover vid 10 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspend proverna i 100 μL FCSB.
- Centrifugera alla prover vid 10 000 x g i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspend proverna i 100 μl FCSB.
- Centrifugera alla prover vid 10 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspend proverna i 150 μL FCSB.
- Överför varje prov till ett FCSB-rör som innehåller 400 μl FCSB-buffert för en total volym på 550 μL.
- Förvara proverna vid 4 °C tills de analyseras med flödescytometri.
OBS: Flödescytometri utförs inom 4 h av antikroppsfärgning.
- Förbered färska 5% BB.
4. Flöde Cytometri
OBS: De spänningsinställningar som beskrivs nedan är baserade på flödescytometern och programvaran som anges i materialförteckningen och kommer sannolikt att variera med olika flödescytmätare. Inställningarna bör optimeras för varje bakterie. Se till att axlarna för alla grafer är i biexponential fas.
- Ställa in arbetsytan
Obs: Upplägget för områden som används för att upprätta arbetsytan skiljer sig från de som används vid gating och dataanalys. Syftet med att ställa in arbetsytan är att visualisera cellpopulationen, se till att det inte finns någon överdriven klumpning av bakteriecellerna som kan påverka nedströmsanalys och att skilja mellan färgade och ofläckade celler medan data samlas in.- För att säkerställa att bakterier inte klumpar ihop sig, inrätta en rad densitet tomter.
- Generera ett framåtspridområde (FSC-A) jämfört med side scatter-området (SSC-A) för att visualisera den totala populationen.
- Ställ in diagram för att utvärdera enskilda celler kontra cellklump genom att skapa två diagram som jämför både framåt (FSC-W) och sidspitbredd (SSC-W) framåt (FSC-H) respektive sidospridningshöjd (SSC-H).
- Skapa en ritlott som bara visar PE-positiv population (PE-A jämfört med SSC-A).
- Ställ in baslinjespänningen på 500 för E. cloacae och 340 för L. gasseri. Dessa kommer att justeras ytterligare senare.
- Ange totalt antal händelser som räknas till 10 000 händelser.
- För att säkerställa att bakterier inte klumpar ihop sig, inrätta en rad densitet tomter.
- Köra exempel
- Skapa tre separata histogramdiagram som visar antal plottade mot SSC-A, FSC-A eller PE-A.
- Placera ett ofläckat prov på flödescytometern och förvärva provhändelserna, så att den maximala toppen på histogrammet för SSC-A ligger inom 102 till 103 och den maximala toppen på histogrammet för FSC-A är mellan 104 till 105 på x-axeln. Om inte, toppar inte faller inom de angivna intervallen, justera FSC och SSC spänningar därefter.
- Placera ett färgat prov (AB) på flödescytometern och justera spänningen PE för att göra den maximala toppen förbi 103 på x-axeln.
- Baserat på dessa mätningar ställer du in den positiva PE-porten och ställer in porten på PE-A kontra SSC-A-densitetsdiagrammet.
- Kör alla prover under bestämda inställningar med låg eller medelhög hastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gatingstrategier som används för att kvantifiera VLP-bindning av humant norovirus till commensalbakterier visas i figur 1. Representativ densitet punkt ger en översikt över hur prover var gated att eliminera cellulära skräp och cell klumpar så VLP fastsättning fastställdes på singlet populationer (figur 1A). Representativa histogram visar låga nivåer av anti-norovirus antikroppssignal i bakterier endast prover som saknar norovirus VLP och låg bakgrundssignal av VLP-bakterier prover färgas med isotyp kontroll antikroppar (Figur 1B). Isotype kontroll toppar överlappar också med ofläckade prover medan färgning av samma prover med anti-mänskliga norovirus GII antikroppar resulterar i betydande förändring i topp.
Overton-metoden för histogram subtraktion användes för att jämföra PE-positiva signalen i anti-humana norovirus GII-antikroppsfärgade prover med PE-positiva signalen för motsvarande isotypkontroll och bestämma procenten av bakteriepopulationen som är bunden av humana norovirus-VIP-skivor (figur 1B). Efter 1 h inkubation med 10 μg VLP, flödescytometri detekterade partikelbindning till både E. cloacae och L. gasseri (figur 2). I själva verket, höga nivåer av bindning inträffade under dessa förhållanden för båda bakterierna; bindning till L. gasseri inträffade något högre, men signifikant (p < 0,0001), nivåer jämfört med E. cloacae. Dessa analyser visar att flödescytometri kan användas för att upptäcka humant norovirus som binder till både grampositiva och gramnegativa bakterier.
För att fastställa gränsen för bindande kvantifiering för denna analys genererades en utspädningsserie av de efterspädda energiärenden före tillägg till bakterierna (figur 3). För båda släktena av bakterier, minskningar av mängden VLP läggas till bakteriekulturen resulterade i motsvarande minskningar av procent av bakterier bundna av VLP. Förändringar i procent av E. cloacae bundna av partikeln var mer gradvis jämfört med L. gasseri, men procent fastsättning för båda bakterierna planade ut trots ytterligare minskningar i VLP koncentration. Närmare bestämt resulterade 0,1 μg eller mindre (data som inte visas) av VLP i 108 CFU av bakterier i en platå av procent kvarstad i genomsnitt mellan 13–19% för båda bakterierna, vilket indikerar att denna procentandel är gränsen för kvantifiering för denna analys.
Figur 1: Representativ flödescytometrisk analys av VLP-bindning på humant norovirus. (A)Representativ flödescytometri gating strategi för att kvantifiera VLP bindning till bakterier. Densitet tomter användes för att gate ut cellulära skräp, följt av efterföljande punkt tomt gating att ta bort bakteriella dubbletar och cellulära klumpar. B)Representativa histogram visar brist på PE-signal i enbart bakterieprover och en förskjutning av PE-signalintensiteten i VLP:bakterieprover jämfört med ofläckade kontroller och isotypkontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: VLP-fastsättning på E. cloacae och L. gasseri. Över natten kulturer av E. cloacae (n = 6) och L. gasseri (n = 6) späddes till 1 x 108 CFU/mL i PBS. Bakterierna inkuberades med 10 μg GII.4 VLPs för 1 h sedan VLP fastsättning mättes med hjälp av flöde cytometri. En representativ tomt finns i figur 1B. Procent kvarstad fastställdes med hjälp av Overton metod histogram subtraktion jämföra PE-positiva signalen i GII Human Norovirus färgade prover till PE-positiva signalen för motsvarande isotyp kontroll. Statistisk analys utfördes med hjälp av en oparad Students t-test (p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: VLP-utspädningsserier för E. cloacae och L. gasseri. 10 μg GII.4 VLPs späddes ut seriellt och VLP-utspädningarna tillsatts vardera till 1 x 108 bakterier i en slutlig volym på 1 ml (n = 3 för båda bakterierna). Proverna inkuberades i en timme vid 37 °C. VLP-anknytning till bakterierna mättes med hjälp av flödescytometri. Procent kvarstad fastställdes med hjälp av Overton metod histogram subtraktion jämföra PE-positiva signalen i GII Human Norovirus färgade prover till PE-positiva signalen för motsvarande isotyp kontroll. Att minska indatamängderna VLP resulterade i stegvisa minskningar av procenttillbehöret för både (A) E. cloacae och (B) L. gasseri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att kvantifiera bindning av enteriska virus till bakterier är ett kritiskt första steg för att belysa de mekanismer genom vilka dessa bakterier förändrar virusinfektion. De metoder som beskrivs häri har optimerats för att mäta humant norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gramnegativa bakterien) och L. gasseri (en grampositiv bakterie), men kan anpassas för användning med alla däggdjursvirus och bakterie av intresse. Medan VLPs är ett idealiskt alternativ till levande virus för användning i bifogade analyser och dessa partiklar kan lätt kvantifieras med hjälp av flödescytometri, P-partiklar har också använts för att undersöka interaktioner mellan mänskliga norovirus och bakterier24. I denna studie kvantifierades mängden virus som är bundet till bakterierna i motsats till bakteriepopulationen, vilket rapporteras här. P-partiklar ger en fördel jämfört med VLPs genom att de är lättare att producera samtidigt som antigen likhet med både VPP och vildtyp virus24,25. Devlps som inte är tillgängliga för humant norovirus är dock kommersiellt tillgängliga, vilket ger ett medel för laboratorier som saknar kapacitet att generera vip-partiklar eller p-partiklar. P-partiklar skiljer sig från VLPs i det, medan VLPs behålla storleken på en vild typ viruspartikel, P-partiklar är mindre och har tetraedral snarare än icosahedral symmetri25. Effekten av dessa egenskaper på interaktioner med bakterier har inte utforskats och P-partiklar kan fungera som ett lönsamt alternativ till VLPs i karakterisera ytan interaktioner mellan humant norovirus och bakterier.
Som tidigare nämnts, den analys som beskrivs ovan kan användas för att ytterligare karakterisera interaktioner mellan mänskliga norovirus VLPs och bakterier. Undersökningar av hur tillväxtförhållanden och förändringar i bakteriell ytstruktur uttryck förändra viral bindning kan undersökas med hjälp av denna teknik. Dessutom kan denna analys också användas för att bestämma specifika bakteriestrukturer bundna av viruset genom konkurrenshämningsanalyser med hjälp av bakterieproteiner eller glykaner, enzymatisk behandling för att avlägsna specifika ytstrukturer eller inkubation med muterade bakteriestammar som saknar särskilt en struktur. Denna analys kan också användas för att undersöka förmågan hos andra norovirus stammar att interagera med commensal bakterier.
Eftersom denna analys kvantifierar andelen bakteriepopulationen bunden av norovirus VLP, är det viktigt att exakt bestämma korrelationen mellan CFU/mL och OD600 så bakteriell kulturkoncentration kan mätas. Fluktuationer i VLP: bakterier förhållandet förändrar procent av bakteriepopulationen bunden av VLPs och kan leda till variationer i resultat. Man bör också se till att lägga till tillräckliga mängder viruspartiklar, eftersom detektionsgränsen för denna analys närmar sig 0,1 μg VLP/108 CFU av bakterier. Nyckeltal under denna gräns gav konsekvent procentuella anknytningsvärden på 13–19 %. således kan det hända att befolkningen inte är kvarstad på eller under dessa procentsatser.
Antikroppstitreringar utfördes för varje nyligen konjugerad antikropp och mot varje bakteriestam före användning i VLP:bakteriers kvarstadsexperiment. Antikroppskoncentrationer som krävdes för varje bakterie var liknande från 1:250 för E. cloacae och 1:300 för L. gasseri. Den lilla storleken på bakterier, i förhållande till storleken på eukaryota celler, kräver både spänningsjustering samt användning av en binomial distribution under datainsamling för att tillräckligt separera bakterier från skräp som kan hittas i prover eller cirkulerar inom instrumentet. Efter datainsamling kan korrekt gating användas för att ytterligare ta bort större skräppartiklar och bakterieklummar så att endast encelliga populationer analyseras. Det är också viktigt att fastställa unika spänningsinställningar för varje bakterieart som testas eftersom dessa varierar kraftigt, särskilt mellan gramnegativa och grampositiva bakterier.
Införandet av korrekta kontroller inklusive endast bakterier och isotypkontroller är också avgörande för noggrann analys av data. Båda typerna av kontroller informera om nivåer av icke-specifik antikroppsbindning. Våra resultat visar att de antikroppar som används för att inte binda icke-specifikt till de testade bakteriearter, men icke-specifik bindning kan förändras med förändringar i bakteriearter eller antikroppar.
Den metod som presenteras här kvantifierar human norovirus partikel bindning till både grampositiva och gramnegativa bakterier och är användbar för att karakterisera virus:bakteriella interaktioner. Dessutom kan detta basprotokoll enkelt optimeras för användning med andra genotyper av humant norovirus, liksom andra däggdjursvirus och bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Sutonuka Bhar och Chanel Mosby-Haundrup för deras kritiska granskning av det skriftliga manuskriptet, liksom Alfonso Carrillo för hjälp med att generera bakteriella standardkurvor. Detta arbete finansieras delvis av ett bidrag från National Institute of Health (R21AI140012) och av ett frö bidrag från University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
