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Immunology and Infection

Quantifier les particules humaines de norovirus ressemblant à un virus se liant aux bactéries commensales utilisant la cytométrie des débits

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

L’objectif de ce protocole est de quantifier la liaison du norovirus humain d’agent pathogène eucaryote aux bactéries. Après avoir effectué un premier essai d’attachement de virus-bactérie, la cytométrie d’écoulement est employée pour détecter des bactéries virales-liées dans la population.

Abstract

Les bactéries commensales sont bien établies pour avoir un impact sur l’infection des virus eucaryotes. La liaison directe entre l’agent pathogène et le microbiome hôte est responsable de la modification de l’infection pour bon nombre de ces virus. Ainsi, la caractérisation de la nature de la liaison virus-bactéries est une étape fondamentale nécessaire pour élucider le mécanisme (s) par lequel les bactéries modifient l’infection virale. Pour le norovirus humain, les bactéries commensales améliorent l’infection de cellules B. Le virus se lie directement à ces bactéries, ce qui indique que cette interaction directe est impliquée dans le mécanisme d’amélioration de l’infection. Une variété de techniques peuvent être utilisées pour quantifier les interactions entre les bactéries et les virus, y compris le comptage de scintillation des virus radiolacés et la réaction en chaîne de polymérase (PCR). Les deux méthodes nécessitent l’utilisation du virus vivant, qui peut devoir être généré en laboratoire. À l’heure actuelle, aucun des systèmes de culture in vitro établis disponibles pour le norovirus humain n’est suffisamment robuste pour permettre la production de stocks viraux hautement concentrés. Au lieu du virus vivant, des particules virales (VVL) ont été utilisées pour caractériser les interactions entre le norovirus et les bactéries. Ici, une méthode de cytométrie de flux est décrite avec des anticorps spécifiques au virus pour quantifier la liaison VLP aux bactéries gram-négatives et gram-positives. L’inclusion des deux bactéries seulement et des contrôles d’isotype a permis l’optimisation de l’essai pour réduire la liaison d’anticorps de fond et la quantification précise de l’attachement de VLP aux bactéries testées. Les rapports élevés de VLP:bactérie ont comme conséquence des VVL se liant aux pourcentages importants de la population bactérienne. Cependant, lorsque les quantités de VLP sont diminuées, le pourcentage de bactéries liées diminue également. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée dans de futures expériences élucidant les conditions spécifiques et les composants structurels qui régulent le norovirus : les interactions bactériennes.

Introduction

Les norovirus humains (VHS) sont la principale cause de maladie gastro-intestinale dans le monde, responsable de 685 millions d’infections et de plus de 200 000 décès chaque année1. Comme avec d’autres virus entériques, la présence de bactéries commensales a été montré pour améliorer l’infection de cet agent pathogène ainsi que son virus de substitution, le norovirus murine2,3. Il ya aussi des rapports contradictoires que les bactéries peuvent inhiber l’infection par le norovirus humain4,5,6. Pour plusieurs virus, l’interaction directe entre le virus et les bactéries semblent sous-tendre les mécanismes qui ont un impact sur l’infection virale2,7,8,9,10, et il a été démontré par microscopie électronique que les norovirus humains se lient directement aux surfaces des bactéries11,12. Par conséquent, la caractérisation de ces interactions est devenue essentielle pour déterminer les mécanismes par lesquels les bactéries ont un impact sur l’infection virale. Cette caractérisation a classiquement commencé avec la quantification de la liaison virale à un tableau d’espèces bactériennes qui sont des composants du microbiome hôte7,12,13. Ces essais d’attachement révèlent non seulement la quantité de virus lié aux bactéries, mais aident également à déterminer l’impact de cette interaction sur la forme physique virale et la survie.

Pour quantifier l’attachement viral, les méthodes traditionnellement utilisées comprennent des essais basés sur pcR qui quantifient les génomes viraux12 ou la génération de virus radiolacés et l’utilisation de scintillation comptant pour quantifier les particules virales7,8,9,13. L’utilisation de ces méthodes nécessite généralement l’accès à des stocks de virus à haute teneur en particules et à des techniques de culture in vitro pour les générer. Alors que plusieurs systèmes de culture pour le norovirus humain existent maintenant2,14,15, aucun ne supporte la réplication robuste nécessaire pour générer ces stocks très concentrés qui restreint ou élimine l’utilisation de PCR et scintillation compter pour quantifier les norovirus humains / interactions bactériennes.

Pour contourner ce problème, les particules virales (VVL) peuvent être utilisées comme substitut au virus vivant pour étudier les interactions entre le norovirus humain et les bactéries16,17. Les VVL sont des particules non infectieuses qui ressemblent étroitement au virus d’où elles sont dérivées. Dans le cas du norovirus humain, ces particules sont générées à partir de l’expression de la protéine VP1 (et parfois du VP2), qui s’assemble pour créer des capsids viraux intacts dépourvus de matériel génétique (c.-à-d. ARN pour les norovirus). Ces VP ont été bien caractérisés, sont structurellement et antigéniquement similaires aux virus de type sauvage à partir de laquelle ils sont dérivés18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les VJR servent de substitut idéal pour étudier les interactions de surface entre le norovirus humain et les bactéries commensales. Étant donné que les VVL ne disposent pas de matériel génétique, les essais à base de PCR ne peuvent pas être utilisés pour quantifier la liaison virale. Une méthode de cytométrie de flux à base d’anticorps a été précédemment décrite et capable de détecter de faibles niveaux de liaison VLP aux bactéries d’une manière semi-quantitative16. Cette méthode a été optimisée pour permettre une quantification précise de la liaison humaine de norovirus VLP à la fois gram-négative et gram-positive bactéries commensales16.

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Protocol

REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne décrites dans le protocole sont des conditions de culture standard pour le cloacae d’Enterobacter et le gasseri de Lactobacillus. Pour effectuer le virus : l’analyse d’attachement des bactéries avec d’autres espèces bactériennes, les bactéries choisies doivent être cultivées dans des conditions standard appropriées à la bactérie.

1. Préparation du milieu de croissance bactérienne

  1. Médias de croissance de cloacae enterobacter
    1. Préparer le milieu liquide en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 1 L d’eau déionisée (DI) (voir Tableau des matériaux). Mélanger tous les médias à fond et stériliser en autoclaving pendant 30 min.
    2. Préparer le milieu solide en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 15 g d’agar dans 1 L d’eau DI. Mélanger tous les médias à fond et stériliser en autoclaving pendant 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri médias de croissance
    1. Préparer le milieu liquide en dissolvant 55 g de poudre De Man, Rogosa et Sharpe (MRS; voir Tableau des matériaux)dans 1 L d’eau DI. Utilisez le milieu dans un mois suivant la préparation. Pour stériliser, chauffer à feu moyen pendant 15 minutes jusqu’à ébullition suivi d’autoclaving pendant 15 min.
    2. Préparer le milieu solide en dissolvant 55 g de poudre de MRS et 15 g d’agar dans 1 L d’eau DI. Pour stériliser, chauffer à feu moyen pendant 15 minutes jusqu’à ébullition suivi d’autoclaving pendant 15 min.

2. Établir une courbe standard corréléssant la densité optique (OD) et la concentration de bactéries

  1. Inoculer 5 ml de milieu liquide approprié avec une colonie isolée simple d’une plaque d’agar (E. cloacae) ou directement à partir du stock de glycérol congelé (L. gasseri).
  2. Cultivez la bactérie pendant la nuit, dans des conditions atmosphériques appropriées (Cloacae Enterobacter: 37 oC avec secousse aérobie à 200 tr/min; L. gasseri: bain d’eau à 37 oC sans secousses dans un récipient hermétique).
  3. Transférer 2 aliquots de 1,3 mL de culture de nuit en deux tubes de centrifugeuses distincts de 1,5 ml et bactéries centrifugeuses à 10 000 x g pendant 5 min.
  4. Retirer les échantillons supernatants et laver avec 1 ml de saline tamponnée stérile de 1x de phosphate (PBS). Répétez cette étape de lavage pour un total de 2 lavages.
  5. Centrifugez à nouveau les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min, retirez le supernatant et la résuspendance dans 1,3 mL de 1x PBS stérile.
  6. Commençant par 0.5 mL de culture lavée, diluez en série les bactéries dans 1x PBS de 10-1 à 10-4.
  7. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de la culture lavée et non diluée et chacune des quatre dilutions à 600 nm (OD600).
  8. Effectuez des dilutions en série 10 fois en 1x PBS pour chaque dilution de l’étape 2.6. Étendre la plaque 100 L des 3 dernières dilutions pour chaque série sur le milieu solide approprié pour déterminer le nombre d’unités de formation de colonies par millilitre (CFU/mL) de chaque échantillon. Plaquez chaque dilution en triplicate.
  9. Laisser sécher les plaques à température ambiante pendant 5 min. Inverser les plaques et incuber dans les conditions atmosphériques appropriées (E. cloacae: aérobic à 37 oC, plaques d’incubation toute la nuit; L. gasseri: anaérobie à 37 oC, plaques d’incubation pour 48 h dans un contenant hermétique avec des sachets d’air anérobie (voir Tableau des matériaux)).
    REMARQUE : Utilisez 1 sachet d’air anaérobie par pot de 2,5 L ou 3 sachets par pot de 7,0 L (voir Tableau des matériaux).
  10. Utilisez le nombre de plaques pour déterminer CFU/mL pour chacun des 5 échantillons (c.-à-d., non dilué, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Générer une courbe standard comparant OD600 vs CFU/mL. L’équation de cette ligne sera utilisée dans les essais d’attachement VLP-bactéries pour déterminer CFU/ mL basé sur OD600.

3. VLP-bactéries Attachement Assay

CAUTION : Les VLP de norovirus humain sont un risque de biosécurité (BSL)-2 et tous les travaux impliquant des VVL doivent être exécutés dans une armoire de biosécurité. La préparation des cultures bactériennes, avant l’analyse d’attachement, doit être effectuée en utilisant des conditions de sécurité appropriées pour l’organisme.

  1. Préparation de réactif
    1. 1x phosphate tamponné salin (PBS)
      1. Préparer 1 L de 10x PBS en dissolvant un paquet entier dans 1 L d’eau DI.
      2. Solution Autoclave pour 30 min.
      3. Préparer une solution 1x en dilant la solution ci-dessus 1:10 dans l’eau DI.
      4. Filtrer stériliser la solution en la passant à travers un filtre de 0,22 m et le stocker à température ambiante.
    2. 5% BSA
      1. Ajouter 5 g de poudre d’albumine de sérum bovin (BSA) à 100 ml de PBS pour générer une solution de 5 % (w/v).
      2. Mélanger la solution en vortexing ou sur une plaque à remuer à l’aide d’une barre de remuer en métal jusqu’à ce que les touffes se soient dissous.
      3. Filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
      4. Conservez la solution à 4 oC.
    3. Tampon de tache de cytométrie d’écoulement (FCSB)
      1. Filtre acheté FCSB (voir Tableau des matériaux) à travers un filtre de 0,22 m.
      2. Conserver la solution restante à 4 oC.
    4. 5% Tampon de blocage (BB)
      REMARQUE : Préparez-vous frais à chaque fois.
      1. Ajouter 0,5 g de BSA à 10 ml de FCSB stérile.
      2. Vortex pour mélanger complètement l’échantillon et laisser sur la glace jusqu’à l’utilisation.
  2. Conjugaison d’anticorps
    1. Anticorps gastro-intestins humains conjugués (voir Tableau des matériaux)avec r-phycoerythrine (PE) à l’aide d’un kit d’étiquetage des anticorps R-PE selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
    2. Conservez l’anticorps conjugué dans l’obscurité à 4 oC pour une utilisation future dans l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d
      REMARQUE : L’anticorps primaire doit être titré avant utilisation dans l’essai d’attachement de VLP-bactéries pour déterminer la concentration appropriée nécessaire pour l’analyse de cytométrie d’écoulement. La titration d’anticorps doit être effectuée chaque fois que la réaction de conjugaison est effectuée et pour chaque bactérie utilisée dans l’essai d’attachement.
  3. Titration d’anticorps
    1. Diluer l’anticorps anti-humain conjugué GII 100 fois, avec une dilution de départ de 1:100 et une dilution de fin de 1:600 (six dilutions au total).
    2. Effectuez un essai de fixation du virus tel que décrit ci-dessous à l’exception suivante : dans l’étape 3.5.7 résumance la granule bactérienne dans 350 'L de 5% BB.
    3. Diviser l’échantillon en sept aliquots de 50 L.
    4. Ajouter 50 l de chaque dilution d’anticorps dans un tube.
    5. Ajoutez 50 L de 5% de BB au septième tube comme contrôle non souillé.
    6. Effectuez la cytométrie d’écoulement sur tous les échantillons décrits ci-dessous.
    7. Comparez les échantillons d’anticorps dilués aux commandes non contaminées et les uns aux autres. La concentration d’anticorps la plus faible qui n’entraîne pas une diminution ou une perte de signal positif doit être choisie pour être utilisée dans les essais suivants.
  4. Préparation des bactéries
    1. Cultivez les bactéries en 40 ml de milieu liquide approprié dans des conditions atmosphériques appropriées jusqu’à ce que les bactéries soient en phase stationnaire.
      1. Cultivez les cultures E. cloacae aérobie pendant la nuit à Luria Broth à 37 oC, secouant à 200 tr/min pour atteindre la phase stationnaire.
      2. Cultivez les cultures L. gasseri dans le bouillon de MRS dans des tubes à vis noir sans trembler dans un bain d’eau réglé à 37 oC pendant 18 h pour atteindre la phase stationnaire.
    2. Transférer les cultures de phase stationnaire pour nettoyer les tubes coniques et les échantillons de centrifugeuses de 50 ml à 2 288 x g pendant 10 min pour pelleter la bactérie.
    3. Retirez le supernatant et la résuspendance dans 13 ml de PBS stérile 1x. Répétez cette étape de lavage pour un total de deux lavages.
    4. Centrifugez à nouveau les échantillons, retirez les échantillons supernatants et résutilisons dans 20 ml de PBS 1x.
      REMARQUE : Si la boulette cellulaire est petite, le volume de résuspension peut être diminué.
    5. Mesurer l’OD600 de la culture.
    6. À l’aide de la courbe standard préparée précédemment, déterminez l’UMC par ml de la culture lavée.
    7. Diluer les bactéries au besoin avec 1x PBS pour ajuster la concentration de la culture à 1 x 108 CFU/mL.
    8. Transférer 1 ml de la culture bactérienne 1 x10 8 CFU/mL au nombre requis de tubes de centrifugeuse de 1,5 mL.
    9. Centrifuge les tubes à 10.000 x g pendant 5 min.
    10. Résuspendez la granule bactérienne dans 1 ml de sterile 5% BSA.
    11. Incuber les tubes pendant 1 h à 37 oC avec rotation constante.
  5. Pièce jointe au virus
    1. Travailler à l’intérieur d’une armoire de biosécurité BSL-2, ajouter 10 g de RLP HuNoV (voir Tableau des matériaux) à chaque tube contenant des bactéries résiliées dans PBS et mélanger à fond par tuyauterie.
      REMARQUE : La concentration de VLP diffère avec chaque préparation VLP. Par conséquent, le volume ajouté aux bactéries varie d’un lot de préparation à l’autre et doit être ajusté en conséquence afin que 10 g soient ajoutés à chaque tube de l’expérience. Pour les bactéries ne contrôlent que les bactéries (p. ex., les échantillons sans VLP), ajoutez un volume de PBS qui équivaut au volume de VLP ajouté aux échantillons expérimentaux.
    2. Tubes incubés pour 1 h à 37 oC avec rotation constante.
      REMARQUE : Un revolver à tube (voir tableau des matériaux) réglé à 40 tr/min est utilisé pendant l’incubation.
    3. Après l’incubation, centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
    4. Jeter les granulés bactériens supernatants et résutilisables dans 1 ml de PBS.
    5. Répétez les étapes de lavage 3.5.3 et 3.5.4.
    6. Centrifuge les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    7. Jetez les granules bactériennes supernatants et résutilisables dans 150 L de 5 % DE BB.
  6. Coloration d’anticorps
    1. Préparer frais 5% BB.
      REMARQUE : Tous les travaux à l’aide de l’anticorps marqué fluorescent doivent être exécutés dans l’obscurité et l’anticorps, le BB et le FCSB doivent être conservés sur la glace.
    2. Diluer l’anticorps gastro-intestinal humain dilué 1:125 pour les échantillons de cloacae E. et 1:150 pour les échantillons de gazeri de L. dans 5% BB, préparant 50 l d’anticorps dilué par échantillon.
    3. Diluer l’anticorps isotype de la même manière que l’anticorps gastro-intestinal de norovirus humain a été dilué pour chaque bactérie dans 5% BB, préparant 50 l de contrôle dilué d’isotype par échantillon.
    4. Répartir chaque échantillon d’analyse d’attache de l’étape 3.3.7 en trois aliquots de 50 L en les transférant dans des tubes de centrifugeuse propres de 1,5 mL.
    5. Pour la première série d’échantillons, ajouter 50 L de BB. Cet ensemble sera le non-détenu (Uns) contrôles.
    6. Au deuxième set, ajouter 50 L de dilution des anticorps GII. Il en résulte une concentration finale d’anticorps de 1:250 pour E. cloacae et 1:300 pour L. gasseri. Cet ensemble d’échantillons sera les échantillons tachés (AB).
    7. Au troisième set, ajoutez 50 l d’anticorps isotype dilué. Cet ensemble sera le contrôle de l’isotype (IC). Bien mélanger en tuyautant. Incuber les échantillons sur la glace et dans l’obscurité pendant 30 min.
    8. Centrifuger tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    9. Jetez le supernatant et réutilisez les échantillons dans 100 L de FCSB.
    10. Centrifuge tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ressinner les échantillons dans 100 L de FCSB.
    11. Centrifuger tous les échantillons à 10.000 x g pendant 5 min.
    12. Jetez le supernatant et réutilisez les échantillons dans 150 L de FCSB.
    13. Transférer chaque échantillon dans un tube FCSB contenant 400 l de tampon FCSB pour un volume total de 550 ll.
    14. Conserver les échantillons à 4 oC jusqu’à ce qu’ils soient analysés par cytométrie d’écoulement.
      REMARQUE : La cytométrie d’écoulement est exécutée dans un rayon de 4 h de coloration d’anticorps.

4. Cytométrie d’écoulement

REMARQUE : Les paramètres de tension décrits ci-dessous sont basés sur le cytomètre de débit et le logiciel énumérés dans le tableau des matériaux et varieront probablement avec différents cytomètres de débit. Les paramètres doivent être optimisés pour chaque bactérie. Assurez-vous que les axes pour tous les graphiques sont en phase biexponentielle.

  1. Mise en place de l’espace de travail
    REMARQUE : La configuration des parcelles utilisées pour établir l’espace de travail diffère de celle utilisée dans l’analyse des données et du gating. Le but de la mise en place de l’espace de travail est de visualiser la population cellulaire, de s’assurer qu’il n’y a pas d’agglomération excessive des cellules bactériennes qui pourraient avoir un impact sur l’analyse en aval et de distinguer entre les cellules tachées et non contaminées pendant la collecte de données.
    1. Afin de s’assurer que les bactéries ne s’agglutinent pas, mettez en place une série de parcelles de densité.
      1. Générer une zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) par rapport à la zone de dispersion latérale (SSC-A) pour visualiser la population totale.
      2. Configurez des parcelles pour évaluer les cellules simples par rapport aux amas cellulaires en créant deux graphiques qui comparent à la fois la largeur vers l’avant (FSC-W) et la largeur de dispersion latérale (SSC-W) pour avancer (FSC-H) et la hauteur de dispersion latérale (SSC-H), respectivement.
      3. Créez une parcelle qui ne montre que la population positive PE (PE-A vs SSC-A).
    2. Définissez la tension de base à 500 pour E. cloacae et 340 pour L. gasseri. Ceux-ci seront ajustés plus tard.
    3. Définissez le total des événements comptés à 10 000 événements.
  2. Échantillons en cours d’exécution
    1. Créez trois parcelles histogrammes distinctes qui montrent le nombre tracé contre SSC-A, FSC-A ou PE-A.
    2. Placez un échantillon non souillé sur le cytomètre de débit et acquérez les événements de l’échantillon, en veillant à ce que le pic maximum sur l’histogramme pour SSC-A soit dans les 102 à 103 et le pic maximum sur l’histogramme pour FSC-A est entre 104 à 105 sur l’axe x. Si ce n’est pas le cas, les pics ne se situent pas dans les plages spécifiées, ajustez les tensions FSC et SSC en conséquence.
    3. Placez un échantillon taché (AB) sur le cytomètre d’écoulement et ajustez le PE de tension pour faire le pic maximum passé 103 sur l’axe x.
    4. Sur la base de ces mesures, définissez la porte PE positive et placez la porte sur le graphique de densité PE-A par rapport à SSC-A.
    5. Exécuter tous les échantillons sous les paramètres déterminés à basse ou moyenne vitesse.

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Representative Results

Les stratégies de gating utilisées pour quantifier la liaison humaine de norovirus VLP aux bactéries commensales sont montrées dans la figure 1. Le point de densité représentatif donne un aperçu de la façon dont les échantillons ont été fermés pour éliminer les débris cellulaires et les amas cellulaires afin que l’attachement VLP a été déterminé sur les populations de singlet(figure 1A). Les histogrammes représentatifs démontrent de faibles niveaux de signal d’anticorps anti-norovirus chez les bactéries seulement des échantillons manquant de norovirus VLP et un faible signal de fond d’échantillons de bactéries VLP tachés avec l’anticorps de contrôle d’isotype(figure 1B). Les pics de contrôle d’isotype se chevauchent également avec des échantillons non contaminés tandis que la soucoupe des mêmes échantillons avec l’anticorps anti-humain de norovirus GII entraîne un changement significatif dans le pic.

La méthode Overton de soustraction d’histogramme a été utilisée pour comparer le signal PE-positif dans les échantillons tachés d’anticorps anti-humains de norovirus GII au signal PE-positif du contrôle d’isotype correspondant et déterminer le pourcentage de la population bactérienne liée par des VVL de norovirus humain(figure 1B). Après 1 h d’incubation avec 10 g de VLP, la cytométrie d’écoulement a détecté la liaison des particules à E. cloacae et À L. gasseri (figure 2). En fait, des niveaux élevés de liaison se sont produits dans ces conditions pour les deux bactéries; la liaison à L. gasseri s’est produite à des niveaux légèrement plus élevés, mais significatifs (p’lt; 0,0001), par rapport à E. cloacae. Ces essais démontrent que la cytométrie des débits peut être utilisée pour détecter la liaison humaine de norovirus aux bactéries Gram-positives et Gram-negative.

Pour déterminer la limite de quantification de liaison pour cet essai, une série de dilution des VVL a été générée avant l’ajout à la bactérie(figure 3). Pour les deux genres de bactéries, la réduction de la quantité de VLP ajoutée à la culture bactérienne a entraîné des réductions correspondantes du pourcentage de bactéries liées par VLP. Les changements dans le pourcentage de E. cloacae liés par la particule ont été plus progressifs par rapport à L. gasseri, mais l’attachement pour cent pour les deux bactéries s’est stabilisé en dépit de nouvelles réductions de la concentration de VLP. Plus précisément, 0,1 g ou moins (données non indiquées) de VLP dans 108 CFU de bactéries a eu comme conséquence un plateau de fixation de pour cent moyenne entre 13-19% pour les deux bactéries, ce qui indique que ce pourcentage est la limite de quantification pour cet essai.

Figure 1
Figure 1 : Analyse cytométrique représentative du flux de liaison VLP de norovirus humain. (A) Stratégie représentative de gification de cytométrie de débit pour quantifier la liaison VLP aux bactéries. Des parcelles de densité ont été utilisées pour éliminer les débris cellulaires, suivies d’une parcelle de points subséquente pour enlever les doublets bactériens et les amas cellulaires. (B) Les histogrammes représentatifs démontrent un manque de signal d’EP dans les échantillons bactériens seulement et un changement dans l’intensité de signal de PE dans des échantillons de VLP: bactériium comparés aux contrôles non souillés et isotype. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : attachement VLP à E. cloacae et L. gasseri. Les cultures de nuit de E. cloacae (n - 6) et L. gasseri (n - 6) ont été diluées à 1 x 108 CFU/mL dans PBS. Les bactéries ont été incubées avec 10 g de GII.4 VLP pour 1 h puis l’attachement VLP a été mesuré en utilisant la cytométrie de flux. Une parcelle représentative se trouve dans la figure 1B. La pièce jointe de pourcentage a été déterminée utilisant la méthode d’Overton de soustraction d’histogramme comparant le signal PE-positif des échantillons souillés de Norovirus humain de GII au signal PE-positif du contrôle correspondant d’isotype. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du t-test d’un étudiant non appréré (p’lt; 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Série de dilution VLP pour E. cloacae et L. gasseri. 10 g de GII.4 VPP ont été dilués en série et les dilutions VLP ont été ajoutées chacune à 1 x 108 bactéries dans un volume final de 1 ml (n - 3 pour les deux bactéries). Les échantillons ont été incubés pendant une heure à 37 oC. L’attachement de VLP aux bactéries a été mesuré utilisant la cytométrie d’écoulement. La pièce jointe de pourcentage a été déterminée utilisant la méthode d’Overton de soustraction d’histogramme comparant le signal PE-positif des échantillons souillés de Norovirus humain de GII au signal PE-positif du contrôle correspondant d’isotype. La réduction des quantités d’intrants de VLP a entraîné des réductions progressives de la fixation pour cent pour les deux (A) E. cloacae et (B) L. gasseri. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La capacité de quantifier la liaison des virus entériques aux bactéries est une première étape cruciale pour élucider les mécanismes par lesquels ces bactéries modifient l’infection virale. Les méthodes décrites ici ont été optimisées pour mesurer les interactions humaines norovirus VLP avec E. cloacae (bactérie gram-négative) et L. gasseri (une bactérie gram-positive), mais peuvent être adaptées pour une utilisation avec n’importe quel virus de mammifères et bactérie d’intérêt. Alors que les VVLP sont une alternative idéale au virus vivant pour une utilisation dans les essais d’attachement et ces particules peuvent être facilement quantifiées à l’aide de la cytométrie des débits, particules P ont également été utilisés pour examiner les interactions entre les norovirus humains et les bactéries24. Dans cette étude, la quantité de virus lié à la bactérie a été quantifiée par opposition à la population bactérienne, comme cela est rapporté ici. Les particules P offrent un avantage sur les VVL en ce qu’elles sont plus faciles à produire tout en fournissant une similitude antigénique avec les VVL et le virus de type sauvage24,25. Cependant, les VLP de norovirus humain sont disponibles dans le commerce fournissant un moyen pour les laboratoires qui n’ont pas la capacité de produire des VVL ou des particules P. Les particules P diffèrent des VVL en ce que, tandis que les VVL maintiennent la taille d’une particule virale de type sauvage, les particules P sont plus petites et ont la symétrie tétraérale plutôt que la symétrie icosahedral25. L’impact de ces caractéristiques sur les interactions avec les bactéries n’a pas été exploré et les particules P peuvent servir d’alternative viable aux VVL pour caractériser les interactions de surface entre le norovirus humain et les bactéries.

Comme mentionné précédemment, l’analyse décrite ci-dessus peut être utilisée pour caractériser davantage les interactions entre les VVL de norovirus humain et les bactéries. Des recherches sur la façon dont les conditions de croissance et les changements dans l’expression de la structure de surface bactérienne modifient la liaison virale peuvent être explorées à l’aide de cette technique. En outre, cet essai peut également être utilisé pour déterminer des structures bactériennes spécifiques liées par le virus par des essais d’inhibition compétitives utilisant des protéines bactériennes ou des glycanes, un traitement enzymatique pour enlever des structures de surface spécifiques, ou l’incubation avec des souches bactériennes mutantes déficientes en particulier une structure. Cet essai peut également être utilisé pour étudier la capacité d’autres souches de norovirus d’interagir avec les bactéries commensales.

Étant donné que cet essai quantifie la proportion de la population bactérienne liée par le norovirus VLP, il est essentiel de déterminer avec précision la corrélation entre CFU/mL et OD600 afin que la concentration de la culture bactérienne puisse être mesurée. Les fluctuations du rapport VLP:bactéries modifient le pourcentage de la population de bactéries liées par les VLP et peuvent conduire à la variabilité des résultats. Il faut également prendre soin d’ajouter des quantités suffisantes de particules virales, car la limite de détection de cet essai approche de 0,1 g de VLP/108 CFU de bactéries. Les ratios inférieurs à cette limite ont systématiquement donné des valeurs de fixation de 13 à 19 %; ainsi l’attachement de la population observée à ou en dessous de ces pourcentages peut ne pas être réel.

Des titrations d’anticorps ont été exécutées pour chaque anticorps nouvellement conjugué et contre chaque souche bactérienne avant utilisation dans les expériences d’attachement de bactéries de VLP:. Les concentrations d’anticorps requises pour chaque bactérie étaient similaires allant de 1:250 pour E. cloacae et 1:300 pour L. gasseri. La petite taille des bactéries, par rapport à la taille des cellules eucaryotes, nécessite à la fois un ajustement de tension ainsi que l’utilisation d’une distribution binomiale lors de la collecte de données pour séparer adéquatement les bactéries des débris qui peuvent être trouvés dans des échantillons ou circulant dans l’instrument. Après la collecte de données, le gating approprié peut être employé pour enlever davantage de plus grandes particules de débris et des amas bactériens ainsi seules les populations de cellules simples sont analysées. Il est également essentiel d’établir des réglages de tension uniques pour chaque espèce bactérienne testée car celles-ci fluctuent considérablement, en particulier entre les bactéries gram-négatives et les bactéries gram-positives.

L’inclusion de contrôles appropriés, y compris les bactéries seulement et les contrôles isotypes sont également essentiels pour une analyse précise des données. Les deux types de contrôles informent concernant les niveaux de liaison d’anticorps non spécifiques. Nos résultats démontrent que les anticorps utilisés pour ne pas se lier non spécifiquement aux espèces bactériennes testées, mais la liaison non spécifique pourrait changer avec les changements dans les espèces bactériennes ou les anticorps.

La méthode présentée ici quantifie la liaison des particules de norovirus humain aux bactéries gram-positives et gram-négatives et est utile pour caractériser le virus : interactions bactériennes. En outre, ce protocole de base peut être facilement optimisé pour une utilisation avec d’autres génotypes du norovirus humain, ainsi que d’autres virus et bactéries mammifères.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Sutonuka Bhar et Chanel Mosby-Haundrup pour leur examen critique du manuscrit écrit, ainsi que Alfonso Carrillo pour l’aide à générer des courbes bactériennes standard. Ces travaux sont financés en partie par une subvention du National Institute of Health (R21AI140012) et par une subvention de semences de l’Université de Floride, Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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Quantifier les particules humaines de norovirus ressemblant à un virus se liant aux bactéries commensales utilisant la cytométrie des débits
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Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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