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Immunology and Infection

मेजबान रेंज और दृश्य चयन का उपयोग करके पुनः संयोजन पॉक्सवायरस की रैपिड, निर्बाध पीढ़ी

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61049
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston
* These authors contributed equally

Summary

यह मेजबान-रेंज चयन और पुनः संयोजन वायरस की दृश्य पहचान का उपयोग करके "स्कारलेस" पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस उत्पन्न करने की एक विधि है।

Abstract

वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रकृति से चेचक के कारक एजेंट वेरिओला वायरस (VARV) को समाप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी। एक टीके के रूप में अपने पहले उपयोग के बाद से, VACV चिकित्सकीय टीक्टर के लिए एक वेक्टर के रूप में और एक कोकोलिटिक वायरस के रूप में विकसित किया गया है । ये एप्लिकेशन विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच के रूप में VACV के आसानी से हेरफेर जीनोम और व्यापक मेजबान रेंज का लाभ उठाते हैं। मार्कर चयन विधियों और क्षणिक प्रमुख चयन सहित पुनर्संयोजन VACV उत्पन्न करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। यहां, हम एक मेजबान रेंज चयन विधि का शोधन प्रस्तुत करते हैं जिसमें रिकॉम्बिनेंट वायरस की दृश्य पहचान होती है। हमारी विधि मेजबान एंटीवायरल प्रोटीन किनेज आर (पीकेआर) द्वारा उत्पन्न चयनात्मक दबाव का लाभ उठाती है, जिसमें एक फ्लोरोसेंट फ्यूजन जीन के साथ मिलकर एमचेरी-टैग E3L, दो VACV पीकेआर विरोधियों में से एक व्यक्त किया जाता है। ब्याज के जीन और mCherry-E3L संलयन सहित कैसेट, VACV जीनोम से प्राप्त दृश्यों से घिरा हुआ है । ब्याज के जीन और mCherry-E3L के बीच एक छोटा क्षेत्र है जो चयन के बाद एमचेरी-ई3एल जीन के सहरूप पुनर्संयोजन और हानि को बढ़ावा देने के लिए 3 'बांह के पहले ~ 150 न्यूक्लियोटाइड्स के समान है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों में कुशल, निर्बाध उत्पादन की अनुमति देती है, बिना उत्परिवर्ती वायरस के लिए दवा चयन या व्यापक स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है।

Introduction

वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रकृति से मानव रोगजनक, वेरिओला वायरस (VARV) के पहले सफल उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी । कभी वैरिओला वायरस के संहार के बाद से, VACV सहित पॉक्सवायरस मानव और पशु चिकित्सा दोनों के लिए उपयोगी चिकित्सीय वायरस होना जारी रखा है । उदाहरण के लिए, एक VACV आधारित रेबीज वायरस वैक्सीन यूरोप1 और संयुक्त राज्य अमेरिका2में सिल्वेटिक रेबीज के संचरण को रोकने में बहुत प्रभावी रहा है । हाल ही में, ट्यूमर रोधी अणुओं (जैसे, एकल श्रृंखला एंटीबॉडी या मानव एरिथ्रोपोइटिन) की एक किस्म व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन पॉक्सवायरस ने ऑन्कोलिटिकएजेंटों 3,,4,,5के रूप में सफलता को प्रोत्साहित करते हुए देखा है। VACV विशेष रूप से एक वेक्टर के रूप में आकर्षक है क्योंकि यह आनुवंशिक हेरफेर के लिए आसानी से उत्तरदायी है, एक व्यापक मेजबान रेंज के पास है, और यह विभिन्न परिस्थितियों में स्थिर है, जिससे क्षेत्र6,,7में आसान परिवहन और वैक्सीन व्यवहार्यता की अनुमति है। जबकि प्रयोगशाला प्रयोगों और वैक्सीन उत्पादन के लिए पुनर्संयोजन VACV उत्पन्न करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है, इन वायरसों को उत्पन्न करने के लिए वर्तमान रणनीतियों की उल्लेखनीय सीमाएं हैं।

VACV की उपयोगिता के कारण, पुनर्संयोजन वायरस उत्पन्न करने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है। पहली रणनीति ट्रांसजीन और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन जैसे एक चयन मार्कर जीन सहित एक कैसेट शुरू करने के लिए के रूपमें के रूप में मेल न को रोजगार । कैसेट वायरल जीनोम में एक विशिष्ट साइट के लिए जीन निर्देशन दो ~ 500 न्यूक्लियोटाइड्स (nt) या बड़े हथियारों से घिरा हुआ है, जिसे तब डबल क्रॉसओवर घटनाओं8,,9,,10द्वारा एकीकृत किया जाता है। यह रणनीति तेजी से और कुशल है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप मार्कर जीन के रूप में अतिरिक्त आनुवंशिक सामग्री होती है जो अप्रत्याशित प्रभाव पैदा कर सकती है। इसके अलावा, ट्रांसजीन की संख्या के लिए एक व्यावहारिक ऊपरी सीमा है जिसे उपलब्ध अद्वितीय चुनिंदा मार्कर की संख्या से सीमित किया जा सकता है। क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) रणनीतियों ने "स्कारलेस" रिकॉम्बिनेंट वायरस11की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाकर इस मुद्दे को संबोधित किया है। इस रणनीति का उपयोग करके, एक म्यूटेंट VACV जीन और एक चुनिंदा मार्कर जीन युक्त प्लाज्मिड वायरल जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, लेकिन अतिरिक्त flanking VACV डीएनए के बिना । इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप एक ही क्रॉसओवर इवेंट द्वारा एकीकरण के परिणामस्वरूप पूरे प्लाज्मिड और VACV जीन के दोहराव का क्षणिक एकीकरण होता है। यह मध्यवर्ती तब तक स्थिर है जब तक इसे चयन दबाव में बनाए रखा जाता है, इस निर्माण को संवर्धन की अनुमति देता है । जब चयन हटा दिया जाता है, तो VACV दोहराव एक दूसरी क्रॉसओवर घटना को सक्षम बनाता है जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड को हटाया जाता है और लगभग 50:50 अनुपात में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या पुनः संयोजन वायरस का गठन होता है। जबकि टीडीएस विदेशी डीएनए की स्थिर शुरूआत की आवश्यकता के बिना पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न करता है, कई वायरस क्लोन अनुक्रमण विश्लेषण, एक संभावित समय लेने वाली और महंगा कदम द्वारा अपेक्षित उत्परिवर्तन के लिए जांच की जानी चाहिए ।

यहां, हम इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण के सर्वोत्तम पहलुओं के संयोजन के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो प्रतिकृति अक्षम संशोधित वास्तुक अंकारा12,,13,,14के लिए वर्णित दृष्टिकोण के समान है। यह रणनीति दृश्य और मेजबान रेंज चयन को जोड़ती है ताकि डबल क्रॉसओवर घटनाओं द्वारा पुनः संयोजन वायरस को तेजी से उत्पन्न किया जा सके, और बाद में समरूप पुनर्संयोजन द्वारा चयनित मार्कर जीन को खत्म किया जा सके। यह दृष्टिकोण टीडीएस दृष्टिकोणों की "स्कारलेस" प्रकृति के साथ, समरूप पुनर्संयोजन द्वारा मध्यस्थता किए गए म्यूटेंट की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है, जबकि जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती वायरस को अलग करने के लिए बाद में स्क्रीनिंग चरण की आवश्यकता नहीं होती है। हमारी विधि एंटीबायोटिक चयन के स्थान पर मेजबान रेंज चयन का भी उपयोग करती है, सेल लाइन में रासायनिक रूप से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों के जोखिम को दूर करती है। इस दृष्टिकोण के लिए, हमने रिकॉम्बिनेंट VACV उत्पन्न करने के लिए चुनिंदा एजेंट के रूप में मेजबान एंटीवायरल प्रोटीन किनेज आर (पीकेआर) का उपयोग करने के लिए चुना है। पीकेआर को अधिकांश सेलप्रकार15में निष्क्रिय मोनोमर के रूप में व्यक्त किया जाता है। एन-टर्मिनल डीएसआरएनए-बाध्यकारी डोमेन में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को बाध्यकारी करने पर, पीकेआर डिमेराइज़ करता है और16ऑटोफॉस्फेरीटेड है। पीकेआर का यह सक्रिय रूप यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 2 (ईआईएफ2) के अल्फा उपइकाई को फॉस्फोरस करता है, अंततः रिबोसोम में सर्जक मेथिओनिल-टीआरएनए के वितरण को बाधित करता है, जिससे इंट्रासेलर अनुवाद को रोका जा सके और मोटे तौर पर कई वायरस परिवारों की प्रतिकृति को बाधित किया जा सके17,,18।

पीकेआर की व्यापक और शक्तिशाली एंटीवायरल गतिविधि के जवाब में, कई वायरस पीकेआर सक्रियण को रोकने के लिए कम से कम एक रणनीति विकसित की है। अधिकांश पॉक्सवायरस दो पीकेआर विरोधी व्यक्त करते हैं, जो VACV में E3L और K3L जीन द्वारा एन्कोड किए गए हैं, जो दो अलग-अलग तंत्र19के माध्यम से पीकेआर का विरोध करते हैं। ई 3 डबल-फंसे आरएनए20,,21को बाध्यकारी बनाकर पीकेआर होमोडिमराइजेशन को रोकता है, जबकि के3 सीधे सक्रिय पीकेआर के लिए बाध्य करके एक छद्म सब्सट्रेट अवरोधक के रूप में कार्य करता है और इस तरह इसके सब्सट्रेट eIF2α22के साथ बातचीत को बाधित करता है । महत्वपूर्ण बात, इन दो पीकेआर विरोधी जरूरी सभी प्रजातियों से पीकेआर बाधा नहीं है । उदाहरण के लिए, भेड़ पॉक्स वायरस से K3 समरूपता ने पीकेआर को भेड़ों से दृढ़ता से बाधित किया, जबकि भेड़ पॉक्स E3 होमोलॉग में काफी पीकेआर अवरोध23,,24नहीं दिखा। इस अध्ययन में, हम ई3एल और के3एल (VC-R4) के लिए हटाए गए VACV पुनर्संयोजन उत्पन्न करने के लिए फ्लोरेस चयन के साथ संयुक्त पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जो विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त पीकेआर सक्षम कोशिकाओं में दोहराने नहीं कर सकता है। यह पुनः संयोजन वायरस देशी E3L प्रमोटर के नियंत्रण में जीन व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन वायरस की तेजी से पीढ़ी के लिए एक उत्कृष्ट पृष्ठभूमि प्रदान करता है।

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Protocol

1. पुनर्संयोजन वेक्टर पैदा करना

  1. चयन कैसेट उत्पन्न करने के लिए डिजाइन प्राइमर। कई ऑनलाइन प्राइमर डिजाइन टूल ्स का उपयोग करके, डीएनए अणुओं के आइसोथर्मल एंजाइमैटिक असेंबली को सुविधाजनक बनाने के लिए पड़ोसी एम्प्लिस और वेक्टर के साथ ओवरलैपिंग दृश्यों के साथ प्रत्येक व्यक्ति एम्प्लिकन डिजाइन करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल को पारंपरिक प्रतिबंध एंडोन्यूलीज-आधारित क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके भी पूरा किया जा सकता है। उस मामले में, ओवरलैपिंग दृश्यों के बजाय उचित प्रतिबंध साइटों के साथ प्राइमर डिजाइन करें।
  2. चरण 1.1 में डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके, पीसीआर निम्नलिखित तत्वों को 5 से 3 तक बढ़ाती है(चित्र 1):ई3एल (5'बांह), ईजीएफपी या ब्याज के जीन के VACV जीनोमिक क्षेत्र 5 के ~ 500 न्यूक्लियोटाइड्स, VACV जीनोमिक क्षेत्र से ~ 150 न्यूक्लियोटाइड्स ई 3एल (शॉर्ट 3' आर्म), एक सिंथेटिक अर्ली/लेट पॉक्सवायरस प्रमोटर25,एमचेरी-ई3एल फ्यूजन जीन, और ई3एल के VACV जीनोमिक क्षेत्र 3' से ~ 500 न्यूक्लियोटाइड्स जिसमें शॉर्ट 3'आर्म (लंबे 3' आर्म) शामिल हैं।
    1. पीसीआर ट्यूब में, प्रत्येक एम्प्लिकॉन के लिए निम्नलिखित क्रम में अभिकर्मकजोड़ें: DNase मुक्त पानी के 17 माइक्रोन, प्रत्येक प्राइमर के 1.2 माइक्रोन (प्रारंभिक एकाग्रता = 10 माइक्रोन, अंतिम एकाग्रता = 0.5 माइक्रोन), 5x पीसीआर प्रतिक्रिया बफर के 5 μL, टेम्पलेट डीएनए (प्लाज्मिड्स से परिलक्षित एम्प्लिस के लिए 10 एनजी: EGFP और E/L प्रमोटर-mCherry-E3L कैसेट; एम्प्लिस के लिए 100 एनजी वायरल जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित: 5' और 3 ' हथियार), और डीएनए बहुलक के 0.5 μL। 50 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए जोड़े गए पानी की मात्रा को समायोजित करलें।
      नोट: टेम्पलेट डीएनए की एकाग्रता अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए, लेकिन हम आम तौर पर 10 एनजी के साथ शुरू/
    2. ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें, और डीएनए को 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं, और फिर तीन चरण पीसीआर प्रोटोकॉल के 25 राउंड का उपयोग करें: 5 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए निर्माता के सुझाए गए टीएम के आधार पर पिघलने के तापमान का निर्धारण करें। प्रत्येक एम्प्लिकन (1 मिनट/केबी) की लंबाई के आधार पर उचित विस्तार समय निर्धारित करें।
  3. प्रवर्धन उत्पादों को 1% अगारोज जेल पर कल्पना करें। प्रत्येक डीएनए उत्पाद के 10 μL और प्रत्येक अच्छी तरह से लोड हो रहा बफर के 2 μL जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 8 V/cm पर चलाते हैं ।
  4. जेल डीएनए जेल निष्कर्षण किट और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक एम्प्लिकन को शुद्ध करता है। DNase मुक्त पानी के 50 माइक्रोन जोड़कर और तुरंत अपकेंद्री जोड़कर कॉलम से एम्प्लिस को एल्यूट करें।
  5. इकोआरआई एंटोन्यूलीज पाचन का उपयोग करके pUC19 क्लोनिंग वेक्टर को लाइनारी इज़ करें। एक ट्यूब में, 1 माइक्रोन ऑफ प्यूक19, पानी को 17 माइक्रोन, रिएक्शन बफर के 2 एल और इकोरीके 1 माइक्रोन (20 इकाइयों) की मात्रा में जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    1. 1% अगारोज जेल पर प्रवर्धन उत्पादों की कल्पना करें 1 घंटे के लिए 8 V/सेमी पर चलते हैं। 1 घंटे से बैंड को उत्पादित करें, और चरण 1.4 में वर्णित डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें।
  6. सभी व्यक्ति को लिगेट करें, मास्टर मिक्स किट का उपयोग करके सभी व्यक्ति, जेल शुद्ध एम्प्लिस और रैखिकीकृत वेक्टर को अलग करें।
    1. एक पीसीआर ट्यूब के लिए, रैखिकp19 और प्रत्येक एम्प्लिकन (5' बांह, EGFP, लघु 3 ' हाथ, ई/एल प्रमोटर-mCherry-E3L कैसेट, 3'बांह) के ०.२ pmol जोड़ें । 10 μL की एक अंतिम मात्रा में DNase मुक्त पानी जोड़ें, और फिर डीएनए विधानसभा मास्टर मिश्रण के 10 μL जोड़ें । 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने।
  7. रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई को चरण 1.6 से इकट्ठे उत्पाद के 2 माइक्रोन के साथ बदलें जैसा कि पहले26,,27वर्णित था। एलबी अगारोज प्लेटों पर परिवर्तित कोशिकाओं की प्लेट 100 माइक्रोन जिसमें 100 μg/mL ampicillin होता है। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. अच्छी तरह से अलग कालोनियों उठाओ और १०० μg/mL ampicillin के साथ Luria शोरबा युक्त ट्यूबों के लिए व्यक्तिगत कालोनियों हस्तांतरण । ट्यूबों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जबकि 225 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  9. प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करके प्लाज्मिड को रातोंरात संस्कृति से अलग करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की एकाग्रता और शुद्धता की जांच करें। १.८ और २.० के बीच A260/A280 अनुपात स्वीकार्य है ।
  10. सेंगर अनुक्रमण के लिए प्लाज्मिड ्स सबमिट करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वांछित क्लोनिंग उत्पाद सही है या नहीं। डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. रिकॉम्बिनेंट वायरस पैदा करना

  1. वायरस के साथ उपयुक्त कोशिकाओं के एक शंकुमुखी मोनोलेयर को 6-अच्छी तरह की प्लेट में 1.0 (एमओआई = 1.0) के संक्रमण की बहुलता पर फिर से जोड़ना संक्रमित करें। संक्रमित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे ताजा डीएमईएम से बदलें। संक्रमित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें ।
    नोट: प्रतिकृति सक्षम वायरस जैसे कि एक वैक्सिनिया वायरस के लिए जिसमें K3L22का अभाव है, यूरोपीय खरगोश गुर्दे की कोशिका रेखा आरके13 (एटीसीसी #CCL-37) या बीएससी-40 जैसी सेल लाइन उपयुक्त है। हालांकि, प्रतिकृति कमी वायरस के लिए, जैसे इस कागज में वर्णित वायरस दोनों पीकेआर विरोधी E3L और K3L की कमी, ट्रांस या पीकेआर नॉक-डाउन या नॉक-आउट कोशिकाओं में इन दो जीन ों को व्यक्त करने वाली एक पूरक सेल लाइन की आवश्यकता होती है।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का उपयोग करके उत्पन्न वेक्टर के 500 एनजी के साथ संक्रमित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और चरण 1.10 में मान्य किया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5 प्रतिशत सीओ2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि ई3एल और K3L दोनों की कमी वाले वैक्सिनिया वायरस का उपयोग करके, पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव पुनर्संयोजन वायरस का चयन करेगा और इन कोशिकाओं में एमचेरी-ई3एल फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति बनाए रखेगा। यदि वांछित है, तो पीसीआर को पूरे प्लाज्मिड के बजाय ट्रांसफेक्शन के लिए उपयोग करने के लिए केवल सम्मिलित करना भी संभव होना चाहिए।
  3. संक्रमण के बाद 48 घंटे, संक्रमित मोनोलेयर को फसल करें। कुछ मामलों में, कोशिकाओं को पाइपिंग द्वारा काटा जा सकता है, लेकिन यदि वे अभी भी कसकर पालन कर रहे हैं, तो उन्हें सेल स्क्रैपर के साथ फसल करें। कोशिकाओं को तीन बार फ्रीज-गल, और फिर 50% आयाम पर 15 एस के लिए lysates sonicate । उपयोग करने के लिए तैयार होने तक - 80 डिग्री सेल्सियस पर इसे स्टोर करें।
  4. क्रमिक रूप से 10 गुना पतला लिसैट 10-1 से10-6 चरण में काटा गया डीएमईएम (10-1)के 1080 माइक्रोन में 120 माइक्रोन जोड़कर, और फिर डीएमईएम (10-2) के-21080 माइक्रोन में इस कमजोर पड़ने के 120 माइक्रोन को जोड़कर, और इस प्रक्रिया को चार बार दोहराना। इस मामले में आरके13 कोशिकाओं को पीकेआर सक्षम सेल लाइन के एक व्यक्ति, अच्छी तरह से अनुकूल करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने का 1 एल जोड़ें।
    1. संक्रमित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे ताजा डीएमईएम के साथ बदलें जो संक्रमित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें ।
  5. संक्रमण के बाद 24 से 48 घंटे, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पुनः संयोजन वायरस की पहचान करें। रिकॉम्बिनेंट वायरस से सजीले टुकड़े एमचेरी-ई3एल फ्यूजन जीन(चित्रा 2)एकीकरण के कारण लाल फ्लोरेसेंस व्यक्त करते हैं। यदि पीकेआर अवरोधकों से रहित वायरस का उपयोग शुरू में किया गया था, तो सभी सजीले टुकड़े में पुनः संयोजन वायरस होगा।
  6. पट्टिका RK13 कोशिकाओं पर तीन बार पुनः संयोजन वायरस शुद्ध । पट्टिका शुद्धि के अंतिम दौर के बाद, सभी सजीले टुकड़े लाल फ्लोरेसेंस व्यक्त करना चाहिए।
  7. 2.6 चरण से पट्टिका-शुद्ध लाल फ्लोरोरिंग वायरस के साथ VACV पीकेआर अवरोधक E3L और K3L (RK13+E3L + K3L कोशिकाओं28)को व्यक्त करने वाले आरके13 कोशिकाओं की एक अनुकूल 6-अच्छी प्लेट को संक्रमित करें। प्रति अच्छी तरह से लगभग 50-100 सजीले टुकड़े के लिए लक्ष्य।
    नोट: ये कोशिकाएं ट्रांस में VACV PKR विरोधी प्रदान करती हैं और एमचेरी-ई3एल फ्यूजन जीन को बनाए रखने के लिए पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव को कम करती हैं, इस प्रकार पुनः संयोजन वायरस की "स्कारलेस" पीढ़ी को बढ़ावा देती हैं।
  8. एक EVOS2 माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपद्वारा ढह वायरस की पहचान करें, और एक GFP फिल्टर घन (उत्तेजना: 470/22, उत्सर्जन: 525/50) और एक RFP फिल्टर घन (उत्तेजना: 531/40, उत्सर्जन: 593/40) ।
    नोट: जिस आवृत्ति पर एमचेरी-ई3एल फ्यूजन जीन खो जाता है, वह लगभग 2.5%(तालिका 2)है। यदि EGFP एक मार्कर जीन के रूप में शामिल नहीं है, उत्परिवर्ती वायरस है कि mCherry-E3L संलयन जीन खो दिया है से सजीले टुकड़े बेरंग हो जाएगा ।
  9. पट्टिका RK13 +E3L + K3L कोशिकाओं पर तीन बार हरे रंग की (कुलपति-R4) या रंगहीन सजीले टुकड़े (E3L) को शुद्ध करती है। सुनिश्चित करें कि कोई सजीले टुकड़े फ्लोरेस लाल।
  10. एमचेरी-ई3एल के नुकसान और पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण द्वारा अपेक्षित उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करें।
    नोट: यदि जीन या ब्याज के उत्परिवर्तन में पीकेआर निरोधात्मक गतिविधि नहीं है, तो recombinant वायरस RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं या एक समकक्ष पीकेआर-हिचकते या पीकेआर कमी सेल लाइन(चित्रा 3)पर उगाया जाना चाहिए ।

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Representative Results

हमने के3एल (vP872) के लिए पहले से हटाए गए वायरस में ईजीएफपी के साथ E3L की जगह लेते हुए, पीकेआर विरोधी E3L और K3L दोनों की कमी वाले VACV उत्पन्न करने के लिए चित्रा 1 में चित्रा 1 में आरेखित प्रक्रिया का उपयोग किया। चित्रा 2 पीकेआर सक्षम RK13 कोशिकाओं में लाल फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े दिखाता है जो एमचेरी-ई3एल की वायरल अभिव्यक्ति का संकेत देता है, साथ ही साथ आरके 13 + E3L + K3L कोशिकाओं में व्यक्त किया गया ई3एल के नुकसान और एमचेरी-ई3एल चयन मार्कर के पतन की पुष्टि करता है। चित्रा 3 इस बात की पुष्टि करता है कि यह पुनः संयोजन वायरस, कुलपति-R4, दोनों पीकेआर विरोधी की कमी पीकेआर सक्षम RK13 कोशिकाओं में दोहराने नहीं कर सकती है, जबकि मूल वायरस, VP872 E3L व्यक्त करता है, प्रतिकृति सक्षम है। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि RK13 कोशिकाओं में दोहराने में यह असमर्थता केवल E3L के नुकसान के कारण थी, हमने ई3एल के साथ वीसी-आर4 में ईजीएफपी की जगह ली, एक ही चयन प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक वापस वायरस उत्पन्न करने के लिए। चित्रा 3 यह भी मान्य करता है कि यह रिवर्सिटेन वायरस RK13 कोशिकाओं में vP872 के रूप में कुशलता पूर्वक प्रतिकृति करता है। दिलचस्प बात यह है कि एमचेरी-ई3एल चयन मार्कर के पतन के अनुरूप बेरंग सजीले टुकड़े RK13 +E3 + K3 कोशिकाओं में चयन से पहले पहचाने गए थे जिन्हें आम तौर पर "स्कारलेस" पुनर्संयोजन का चयन करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि एमचेरी-ई3एल पुनर्संयोजन कैसेट और ई3एल जीन को कुलपति-आर 4 में डाला जा रहा है। इसलिए, पुनर्संयोजन की दक्षता और पतन की दर को निर्धारित करने के लिए हमने23के प्रारंभिक पतन की समस्या से बचने के लिए पॉक्सवायरस पीकेआर विरोधी K3L को व्यक्त करने वाले वायरस का उत्पादन करने के लिए चुना। चित्रा 4 RK13 +E3L + K3L कोशिकाओं के संक्रमण के बाद रंगहीन सजीले टुकड़े (तीरसिर) की उपस्थिति को इंगित करता है। तालिका 1 तीन स्वतंत्र प्रयोगों के परिणामों को दर्शाती है, जहां औसतन 12.6% संतान विरऑन ट्रांससंक्रमित प्लाज्मिड के साथ पुनर्संयोजन से गुजरा था, जो पहले रिपोर्ट की गई आवृत्तियों29,,30,,31 केसमान था। तालिका 2 में RK13 +E3L + K3L कोशिकाओं में कुल सजीले टुकड़े के सापेक्ष रंगहीन सजीले टुकड़े की आवृत्ति का विवरण है, जो लगभग 1.8% की आवृत्ति पर हुआ, जो एमचेरी-ई3एल चयन मार्कर के पतन और हानि की दर का प्रदर्शन करता है।

Figure 1
चित्रा 1: p837-GOI-mCherry-E3L के आरेख के साथ ही मेजबान रेंज और दृश्य पुनर्संयोजन रणनीति । (A)5 ' बांह (काला) और 3 ' बांह (ग्रे) VACV में E3L लोकस (भूरे रंग) पार्श्व । (ख)p837-GOI-mCherry-E3L में, इन हथियारों ब्याज के जीन युक्त एक कैसेट पार्श्व (भारत सरकार), इस मामले में EGFP, (हरे) सिंथेटिक जल्दी के नियंत्रण में एक mCherry-E3L (लाल) संलयन जीन से अलग/देर से पॉक्सवायरस प्रमोटर25 नीले) एक छोटे से 3 ' हाथ (ग्रे) द्वारा । ये बाहरी हथियार VACV और p837-GOI-mCherry-E3L के बीच के मुताबिक़ पुनर्संयोजन चलाते हैं। ब्लैक एरोहेड्स गिब्सन क्लोनिंग द्वारा इस प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ओवरलैपिंग प्राइमर की साइटों का संकेत देते हैं। (C)जब पीकेआर चयनात्मक दबाव को हटा दिया जाता है, तो शॉर्ट और लॉन्ग 3 आर्म्स के बीच इंट्रामॉलिक्यूलर रीकॉम्बिनेशन से गुजरने वाले वायरस का चयन किया जा सकता है । (डी)जिसके परिणामस्वरूप एक वायरस (वीसी-आर 4) जिसमें ई3एल लोकस में केवल रुचि का जीन होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: (शीर्ष) के फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ (शीर्ष) एक पुनर्संयोजन वायरस पट्टिका 24 घंटे के साथ पुनर्संयोजन के बाद p837-GOI-mCherry-E3L दोनों mCherry (बाएं) और EGFP (दाएं) RK13 कोशिकाओं में व्यक्त । (नीचे) आरके13 + + कोशिकाओं में पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव को हटाए जाने के 48 घंटे बाद एक पुनर्संयोजन वायरस पट्टिका का माइक्रोग्राफ, ईजीएफपी (दाएं) को व्यक्त करता है, लेकिन एमचेरी (बाएं) नहीं।। स्केल बार सभी पैनलों के लिए 650 माइक्रोन इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कुलपति-R4 पीकेआर सक्षम कोशिकाओं में दोहराने नहीं कर सकते । संकेतित सेल लाइनें एमओआई = 0.1 पर वीपी872 (नीला), वीसी-आर 4 (ग्रीन), या वीसी-आर4 +E3L (मजेंटा) से संक्रमित थीं। संक्रमण के बाद 48 घंटे संक्रमित कोशिकाओं को RK13 +E3L + K3L कोशिकाओं पर धारावाहिक कमजोर पड़ने से काटा और टिटर किया गया। Titers PFU/mL में सूचित कर रहे हैं, त्रुटियों सलाखों के तीन दोहराने प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: RK13 +E3L + K3L कोशिकाओं में mCherry-E3L अभिव्यक्ति का नुकसान। वीसी-आर4 +K3L-mCherry-E3L संक्रमित RK13 +E3L +K3L कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट और चरण विपरीत माइक्रोग्राफ का ओवरले। तीन सजीले टुकड़े अब वीसी-R4 + K3L उपज चयन कैसेट के पतन के कारण mCherry (हलकों) व्यक्त करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रयोग 1 प्रयोग 2 प्रयोग 3
लाल सजीले टुकड़े (RK13) 30 11 18
कुल सजीले टुकड़े (RK13+E3L+K3L) 225 64 249
पुनर्संयोजन दर 13.30% 17.20% 7.20%

तालिका 1: P837-K3L-mCherry-E3L प्लाज्मिड के साथ VACV की पुनर्संयोजन आवृत्ति।

प्रयोग 1 प्रयोग 2 प्रयोग 3
कुल सजीले टुकड़े (RK13+E3L+K3L) 115 44 210
बेरंग सजीले टुकड़े (RK13+E3L+K3L) 3 1 1
पुनर्संयोजन दर 2.60% 2.30% 0.50%

तालिका 2: आरके13 +E3+K3 कोशिकाओं में कुलपति-R4+K3L-mCherry-E3L से mCherry-E3L नुकसान की आवृत्ति।

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Discussion

यहां हम अंतिम पुनः संयोजन वायरस में विदेशी डीएनए को बनाए रखने के बिना पुनः संयोजन vaccinia वायरस उत्पन्न करने के लिए एक क्षणिक मार्कर चयन रणनीति ३२ की एक भिन्नता पेश करते हैं । हमारी रणनीति एंटीबायोटिक दवाओं जैसे चयनात्मक दबाव के अन्य रूपों के बजाय मेजबान एंटीवायरल प्रोटीन पीकेआर द्वारा मध्यस्थता किए गए चयनात्मक दबाव का उपयोग करती है। मेजबान एंटीवायरल जीन का उपयोग कोशिकाओं में रासायनिक रूप से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तन, या चयन दवाओं के कारण उत्परिवर्तन के जोखिम में वृद्धि की संभावना को समाप्त करता है। इसके अलावा, दवा चयन के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण के लिए कोई अंतराल चरण नहीं है, क्योंकि पीकेआर सभी कोशिकाओं में संविलियन रूप से व्यक्त किया जाता है। एमचेरी अभिव्यक्ति के आधार पर माध्यमिक दृश्य चयन यह सुनिश्चित करके इस विधि की विशिष्टता में भी सुधार करता है कि पहले चरण के दौरान ट्रांसजीन व्यक्त करने वाले केवल सजीले टुकड़े चुने जाते हैं, और परिपक्व पुनर्संयोजन वायरस का चयन करते समय एक नकारात्मक चयनात्मक मार्कर के समान रूप से कुशल हैं जिन्होंने एमचेरी-ई3एल जीन खो दिया है।

इस पुनर्संयोजन रणनीति के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उपयुक्त पुनर्संयोजन वेक्टर की पीढ़ी है, और यह सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त पट्टिका शुद्धि है कि चयनित वायरस क्लोनल है। इस पेपर में हम रिकॉम्बिनेशन वेक्टर जेनरेट करने के लिए "गिब्सन असेंबली" का सुझाव देते हैं। यह रणनीति बेहद कुशल है और एक ही दिन में पुनर्संयोजन वेक्टर को शामिल करने वाले सभी टुकड़ों की असेंबली की अनुमति देती है। हालांकि, क्योंकि शॉर्ट 3 ' आर्म और लॉन्ग 3 ' आर्म शेयर समान सीक्वेंस, इन टुकड़ों में क्लोनिंग रिएक्शन के दौरान एक साथ जुड़ने की क्षमता है, और कुछ वैक्टर में एमचेरी-ई3एल कैसेट शामिल नहीं हो सकता है । हमारे अनुभव में यह दुर्लभ है, लेकिन क्लोनिंग के बाद वेक्टर की संरचना की पुष्टि आवश्यक है । हमने पारंपरिक एंडोन्यूलीज और लिगास विधियों का उपयोग करके इस रणनीति के लिए पुनर्संयोजन वेक्टर भी उत्पन्न किए हैं। यह रणनीति ऊपर वर्णित समस्या से बचा जाती है लेकिन अधिक श्रम गहन हो सकती है। पट्टिका शुद्धि आम तौर पर सीधा है और प्रारंभिक पुनर्संयोजन के लिए उपयुक्त स्वतंत्र कोशिकाओं का उपयोग करने पर मुख्य रूप से निर्भर है, प्रारंभिक पट्टिका शुद्धि के लिए पीकेआर-सक्षम कोशिकाएं यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल पुनः संयोजन वायरस दोहरासकते हैं, और फिर अनुमेय कोशिकाएं फिर से इंट्रामॉलिक्यूलर पुनर्संयोजन और चुनिंदा मार्कर के नुकसान को सुविधाजनक बनाने के लिए। सेल लाइनों पर करीब ध्यान इसलिए इस रणनीति के सफल और कुशल आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में, हम इस विधि के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं ताकि पीकेआर विरोधी ई3एल और के3एल दोनों के लिए हटाए गए एक VACV रिकॉम्बिनेंट उत्पन्न किए जा सके और ई3एल प्रमोटर के नियंत्रण में ईजीएफपी व्यक्त किया जा सके। आगे बढ़ते हुए, यह वायरस भविष्य के पुनर्संयोजन वायरस के लिए एक कुशल पृष्ठभूमि के रूप में काम करेगा, क्योंकि यह पीकेआर सक्षम कोशिकाओं में नकल करने में असमर्थ है। इसलिए, एमचेरी-ई3एल पुनर्संयोजन कैसेट को संतान विरोधन में चलाने के लिए मजबूत पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव होगा, जबकि एक ही समय में अनिवार्य रूप से गैर-पुनर्संयोजन वायरस की प्रतिकृति को रोकता है। इसके अलावा, पुनर्संयोजन कैसेट के तेज द्वारा ईजीएफपी का नुकसान एक उपयोगी माध्यमिक चयन मार्कर है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चुनी गई सजीले टुकड़े गैर-पुनर्संयोजन वायरस से सह-संक्रमित नहीं हैं। हमने VACV के लिए पहले बताई गई दरों के अनुरूप पुनर्संयोजन की दरों का अवलोकन किया, लेकिन दृश्य फ्लोरोसेंट मार्कर यह सुनिश्चित करके पुनर्संयोजन वायरस पैदा करने की दक्षता में वृद्धि करते हैं कि उचित पुनः संयोजन वायरस का चयन किए जाने की संभावना बढ़ जाए। पीकेआर-सक्षम कोशिकाओं पर चयन के दो दौर के बाद रंगहीन सजीले टुकड़े का हमारा अवलोकन, संभवतः E3L और mCherry-E3L मार्कर जीन के बीच समान अनुक्रम की बढ़ी हुई लंबाई के कारण, पता चलता है कि mCherry-E3L नुकसान की दर 3 ' शॉर्ट आर्म की लंबाई को बढ़ाने या कम करके "ट्यून" हो सकती है। इस तकनीक की प्राथमिक सीमा पुनर्संयोजनके लिए चयनात्मक दबाव के रूप में पीकेआर का उपयोग है। इस पुनर्संयोजन रणनीति का सबसे कुशल उपयोग पीकेआर विरोधी की पृष्ठभूमि में इन वायरस ों को पैदा कर रहा है। हालांकि, रंगेमीय चयन मार्कर इस पुनर्संयोजन रणनीति को पीकेआर द्वारा मध्यस्थता किए गए चयन के बिना भी उपयोग करने की अनुमति देता है, बस पट्टिका द्वारा mCherry-व्यक्त सजीले टुकड़े को शुद्ध करके। जबकि पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव की कमी पहले स्क्रीनिंग चरण की दक्षता को कम करेगी, एमचेरी व्यक्त सजीले टुकड़े का प्रतिशत अभी भी काफी अधिक है कि रंग आधारित चयन व्यवहार्य है। इस प्रकार, इस विधि का उपयोग पॉक्सवायरस जीनोम में लगभग किसी भी जीन को डालने के लिए किया जा सकता है।

जैसा कि ईजीएफपी के सम्मिलन द्वारा प्रदर्शित किया गया है, इस दृष्टिकोण के साथ, किसी भी जीन को देशी प्रमोटर के नियंत्रण में ई3एल लोकस में तेजी से डाला जा सकता है, बशर्ते कि पीकेआर नल कोशिकाओं या प्रशंसा सेल लाइनों का उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए किया जाता है यदि ट्रांसजीन पीकेआर विरोधी नहीं है। यह रणनीति, वीसी-आर 4 वायरस के साथ संयुक्त है कि हम यहां रिपोर्ट, तेजी से और मज़बूती से मेजबान मध्यस्थता चयनात्मक दबाव और इस प्रक्रिया में जल्दी recombinants के दृश्य पहचान का उपयोग कर पुनः संयोजन vaccinia वायरस उत्पन्न करने के लिए एक नया और शक्तिशाली विधि कहते हैं ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एआई114851) द्वारा एसआर को वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X-Q5 Master Mix NEB M0492L High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin ThermoFisher Scientific 11593027 Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers ThermoFisher Scientific 08-100-242 Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system ThermoFisher Scientific AMAFD2000 Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP ThermoFisher AMEP4651 GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP ThermoFisher AMEP4652 RFP Cube
GenJet SignaGen Laboratories SL100489 Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth Gibco 10855021 Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit NEB T1020L Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit NEB T1010L Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix NEB E2621L Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator Qsonica Q500-110 Sonicator for virus lysates
RK13 cells ATCC CCL-37 Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates VWR 10062-892 Cell culture plates

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References

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Vipat, S., Brennan, G., Park, C., Haller, S. L., Rothenburg, S. Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection. J. Vis. Exp. (159), e61049, doi:10.3791/61049 (2020).

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