Summary
Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.
Abstract
Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per eradicare il virus variola (VARV), l'agente causale del vaiolo, dalla natura. Dal suo primo utilizzo come vaccino, VACV è stato sviluppato come vettore per i vaccini terapeutici e come virus oncolitico. Queste applicazioni sfruttano il genoma facilmente manipolabile di VACV e l'ampia gamma di host come una piattaforma eccezionale per generare virus ricombinanti con una varietà di applicazioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare VACV ricombinante, tra cui metodi di selezione dei marcatori e selezione dominante transitoria. Qui, presentiamo un perfezionamento di un metodo di selezione dell'intervallo host accoppiato con l'identificazione visiva dei virus ricombinanti. Il nostro metodo sfrutta la pressione selettiva generata dalla proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) accoppiata con un gene di fusione fluorescente che esprime E3L con tag mCherry, uno dei due antagonisti VACV PKR. La cassetta, compreso il gene di interesse e la fusione mCherry-E3L, è affiancata da sequenze derivate dal genoma VACV. Tra il gene di interesse e mCherry-E3L c'è una regione più piccola che è identica ai primi 150 nucleotidi del braccio da 3', per promuovere la ricombinazione omologa e la perdita del gene mCherry-E3L dopo la selezione. Dimostriamo che questo metodo consente una generazione efficiente e senza soluzione di continuità di rVACV in una varietà di tipi di cellule senza richiedere la selezione di farmaci o uno screening completo per i virus mutanti.
Introduction
Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per la prima eradicazione di successo di un patogeno umano, il virus variola (VARV), dalla natura. Fin dallo sterminio del virus della variola, i poxvirus tra cui VACV hanno continuato ad essere utili virus terapeutici sia per la medicina umana che per quella animale. Ad esempio, un vaccino contro il virus della rabbia basato su VACV è stato molto efficace nel prevenire la trasmissione della rabbia silvatica in Europa1 e negli Stati Uniti2. Più recentemente, i poxvirus ricombinanti che esprimono una varietà di molecole antitumorali (ad esempio, anticorpi a catena singola o eritropoietina umana) hanno visto un successo incoraggiante come agenti oncolitici3,4,5. VACV è particolarmente attraente come vettore perché è facilmente suscettibile di manipolazione genetica, possiede una vasta gamma di ospiti, ed è stabile in una varietà di condizioni, consentendo un facile trasporto e la vitalità del vaccino nel campo6,7. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare VACV ricombinante per esperimenti di laboratorio e generazione di vaccini, le attuali strategie per generare questi virus hanno notevoli limitazioni.
Grazie all'utilità di VACV, sono state sviluppate più strategie per generare virus ricombinanti. La prima strategia utilizza una ricombinazione omologa per introdurre una cassetta che include il transgene e un gene marcatore selezionabile come un gene di resistenza agli antibiotici. La cassetta è affiancata da due nucleotidi da 500 dollari (nt) o bracci più grandi che indirizzano il gene verso un sito specifico del genoma virale, che viene poi stabilmente integrato da eventi crossover doppi8,9,10. Questa strategia è rapida ed efficiente; tuttavia, si traduce in materiale genetico extra sotto forma di gene marcatore che può produrre effetti imprevisti. Inoltre, esiste un limite massimo pratico al numero di transgeni che possono essere introdotti limitata dal numero di marcatori unici selezionabili disponibili. Le strategie di selezione dominante transitoria (TDS) hanno affrontato questo problema facilitando la generazione di virus ricombinanti "senza cicatrici"11. Utilizzando questa strategia, un plasmide contenente un gene MUTANTe VACV e un gene marcatore selezionabile sono integrati nel genoma virale, ma senza ulteriore fianco DNA VACV affiancato. Questo approccio si traduce nell'integrazione transitoria dell'intero plasmide e nella duplicazione del gene VACV come risultato dell'integrazione da parte di un singolo evento di crossover. Questo intermedio è stabile finché viene mantenuto sotto pressione di selezione, permettendo l'arricchimento di questo costrutto. Quando la selezione viene rimossa, la duplicazione VACV consente un secondo evento di crossover che comporta la rimozione del plasmide e la successiva formazione del virus di tipo selvaggio (wt) o ricombinante in un rapporto approssimativo di 50:50. Mentre tDS genera virus ricombinanti senza richiedere l'introduzione stabile del DNA estraneo, più cloni di virus devono essere sottoposti a screening per la mutazione prevista mediante l'analisi del sequenziamento, un passo potenzialmente dispendioso in termini di tempo e denaro.
Qui, presentiamo un approccio alla generazione di poxvirus ricombinanti che combinano i migliori aspetti di ciascuno di questi approcci, simile a un approccio che è stato descritto per la replica incompetente modificato vaccini Ankara12,13,14. Questa strategia combina la selezione della gamma visiva e dell'ospite per generare rapidamente virus ricombinanti mediante eventi di crossover doppi e successivamente elimina il gene marcatore selezionabile mediante la ricombinazione omologa. Questo approccio consente la rapida generazione di mutanti mediati dalla ricombinazione omologa, con la natura "senza cicatrici" degli approcci TDS, pur non richiedendo una successiva fase di screening per distinguere il tipo selvaggio e i virus mutanti. Il nostro metodo utilizza anche la selezione della gamma host al posto della selezione degli antibiotici, eliminando il rischio di cambiamenti fenotipici chimicamente indotti nella linea cellulare. Per questo approccio, abbiamo scelto di utilizzare la proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) come agente selettivo per generare VACV ricombinante. PKR è espresso come un monomero inattivo nella maggior parte dei tipi di cella15. Quando si lega l'RNA a doppio filamento (dsRNA) nei domini di legame dsRNA del terminale N, pKR si dimerde e viene autofosforelofillato16. Questa forma attiva di fosforolato PKR la sottounità alfa del fattore di avvio eucariotico 2 (eIF2), inibendo infine la consegna di frattempo meticonil-tRNA al ribosoma, impedendo così la traduzione intracellulare e inibendo ampiamente la replicazione di molte famiglie virus17,18.
In risposta all'ampia e potente attività antivirale del PKR, molti virus hanno sviluppato almeno una strategia per prevenire l'attivazione del PKR. La maggior parte dei poxvirus esprime due antagonisti del PKR, codificati dai geni E3L e K3L in VACV, che antagonizzano il PKR attraverso due meccanismi distinti19. E3 previene l'omodimerizzazione del PKR legando l'RNA a doppio filamento20,21, mentre K3 agisce come un inibitore pseudosubstrate legandosi direttamente al PKR attivato e quindi inibendo l'interazione con il suo substrato eIF2 .22 È importante sottolineare che questi due antagonisti del PKR non inibiscono necessariamente il PKR a tutte le specie. Ad esempio, l'omolologo K3 del virus del vaiolo delle pecore inibiva fortemente il PKR dalle pecore, mentre il pologio di pecora E3 non mostrava una notevole inibizione del PKR23,24. In questo studio, presentiamo un metodo per utilizzare la pressione selettiva mediata da PKR combinata con la selezione della fluorescenza per generare un ricombinante VACV eliminato per E3L e K3L (VC-R4), che non può replicare in cellule competenti pKR derivate da specie diverse. Questo virus ricombinante fornisce un eccellente background per la generazione rapida di virus ricombinanti che esprimono geni sotto il controllo del promotore nativo E3L.
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Protocol
1. Generazione del vettore di ricombinazione
- Progettare i numeri primi per generare la cassetta di selezione. Progettare ogni singolo amplificatore con sequenze sovrapposte con amplificatori vicini e il vettore per facilitare l'assemblaggio enzimatico isotermico di molecole di DNA, chiamato anche assemblaggio Gibson, utilizzando uno dei diversi strumenti di progettazione primer online.
NOTA: questo protocollo può essere completato anche utilizzando i metodi tradizionali di clonazione basati su endonuclease. In tal caso, progettare i numeri di prima livello con i siti di restrizione appropriati anziché con sequenze sovrapposte. - Utilizzando i primer progettati nel passaggio 1.1, la PCR amplifica i seguenti elementi in ordine da 5' a 3' (Figura 1): 500 nucleotidi della regione genomica VACV 5' di E3L (5' braccio), EGFP o il gene di interesse, 150 nucleotidi dalla regione genomica VACV immediatamente 3 di E3L (corto 3' braccio), un promotore di poxvirus precoce/tardire sintetico25, il gene di fusione mCherry-E3L e i nucleotidi 500 dalla regione genomica VACV 3' di E3L compreso il braccio corto 3' (lungo 3' braccio).
- In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine per ogni amplificatore: 17 luna di acqua libera DNase, 1,2 l di ogni primer (concentrazione iniziale concentrazione finale: 0,5 m), 5 luna di buffer di reazione PCR 5x, DNA modello (10 ng per gli amplificatori amplificati da plasmidi: EGFP e e/L promoter-mCherry-E3L cassetta; 100 ng per amplificatori amplificati dal DNA genomico virale: 5' e 3') e 0,5 L di polimerasi di DNA. Regolare il volume d'acqua aggiunto per un volume di reazione finale di 50.L.
NOTA: La concentrazione del DNA del modello deve essere determinata empiricamente, ma generalmente iniziamo con 10 ng/reazione. - Mettere i tubi in un termociclista, sciogliere il DNA a 98 gradi centigradi per 30 s, quindi utilizzare 25 giri di un protocollo PCR in tre fasi: 98 gradi centigradi per 5 s, 55 gradi c per 10 s e 72 gradi per 1 min.
NOTA: Determinare la temperatura di fusione in base al Tm suggerito dal produttore per ogni set di primer. Determinare il tempo di estensione appropriato in base alla lunghezza di ciascun amplificatore (1 minuto/kb).
- In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine per ogni amplificatore: 17 luna di acqua libera DNase, 1,2 l di ogni primer (concentrazione iniziale concentrazione finale: 0,5 m), 5 luna di buffer di reazione PCR 5x, DNA modello (10 ng per gli amplificatori amplificati da plasmidi: EGFP e e/L promoter-mCherry-E3L cassetta; 100 ng per amplificatori amplificati dal DNA genomico virale: 5' e 3') e 0,5 L di polimerasi di DNA. Regolare il volume d'acqua aggiunto per un volume di reazione finale di 50.L.
- Visualizza i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1%. Aggiungete 10 l di ciascun prodotto di DNA e 2 l di tampone di carico a ciascun pozzo, e eseguite a 8 V/cm per 1 h.
- Gel purifica ogni amplificatore utilizzando un kit di estrazione gel di DNA e il protocollo del produttore. Eluire gli amplicons dalla colonna aggiungendo 50 -L di acqua libera da DNase e centrifugando immediatamente.
- Linearizzare il vettore di clonazione pUC19 utilizzando la digestione endonucleale EcoRI. Ad un tubo, aggiungere 1 g di pUC19, acqua a un volume di 17 L, 2 L di buffer di reazione e 1 L (20 unità) di EcoRI. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
- Visualizzate i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1% eseguito a 8 V/cm per 1 h. Accisie la banda dal gel e purificate il prodotto utilizzando il kit di estrazione del gel di DNA come descritto al punto 1.4.
- Ligate tutti i singoli, gel purificati ampi e il vettore linearizzato utilizzando un kit master mix.
- Ad un tubo PCR, aggiungere 0,2 pmol di pUC19 linearizzato e ogni amplificatore (braccio 5', EGFP, braccio corto 3', e/l promotore-mCherry-E3L cassetta, 3'braccio). Aggiungere l'acqua libera di DNase ad un volume finale di 10 o L, quindi aggiungere 10 L di miscela master di assemblaggio del DNA. Incubare campioni a 50 gradi centigradi per 1 h.
- Trasformare l'E. coli chimicamente competente con 2 l del prodotto assemblato dal punto 1.6 come descritto in precedenza26,27. Piastra 100 L delle cellule trasformate su piastre di agarose LB che contengono 100 g/mL di ampicillina. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
- Scegli colonie ben isolate e trasferisci singole colonie su tubi contenenti brodo di Luria con 100 ampicillina. Incubare i tubi per una notte a 37 s mentre si agita a 225 giri/min.
- Isolare i plasmidi dalla cultura notturna utilizzando un kit miniprep plasmide. Controllare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 è accettabile.
- Inviare i plasmidi per il sequenziamento di Sanger per determinare se il prodotto di clonazione desiderato è corretto. Conservare il DNA a -20 gradi centigradi.
2. Generazione del virus ricombinante
- Infettare un monostrato confluente di cellule adatte con il virus da ricombinedcombined a una molteplicità di infezione di 1,0 (MOI - 1,0) in una piastra a 6 pozze. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2.
NOTA: Per la replicazione virus competenti come un virus vaccinia che manca K3L22, una linea cellulare come la linea cellulare renale coniglio europeo RK13 (ATCC #CCL-37) o BSC-40 è appropriata. Tuttavia, per i virus carenti di replicazione, come il virus descritto in questo documento privo sia di PKR antagonisti E3L e K3L, è necessaria una linea cellulare complementare che esprima questi due geni nelle cellule trans o PKR knock-down o knock-out. - Trasfecare le cellule infette con 500 ng del vettore generato e convalidato nel passaggio 1.10 utilizzando un reagente di trasfezione disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. Incubare le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h.
NOTA: Se si utilizza un virus vaccinia privo di E3L e K3L, la pressione selettiva mediata da PKR guiderà la selezione di virus ricombinati e manterrà l'espressione della proteina di fusione mCherry-E3L in queste cellule. Se lo si desidera, dovrebbe anche essere possibile amplificare PCR solo l'inserto da utilizzare per la trasfezione invece dell'intero plasmide. - 48 ore dopo l'infezione, raccogliere il monostrato infetto. In alcuni casi, le cellule possono essere raccolte tramite pipettaggio, ma se sono ancora strettamente aderenti, raccoglile con un raschietto cellulare. Congelare le cellule tre volte, e poi sonicare i lisati per 15 s al 50% di ampiezza. Conservare questo lisato a -80 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso.
- Diluire in modo seriale il lisato raccolto al punto 2,3 da 10-1 a10-6 aggiungendo 120 luna del lisato a 1080 gradi di DMEM (10-1), e quindi aggiungendo 120 l di questa diluizione a 1080 ldi dMEM (10-2) e ripetendo questo processo altre quattro volte. Aggiungere 1 mL di ogni diluizione a un singolo pozzo confluente di una linea cellulare competente PKR, in questo caso cellule RK13.
- Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco Incubare le cellule infette a 37 e 5% CO2.
- 24-48 ore dopo l'infezione, identificare i virus ricombinanti mediante microscopia a fluorescenza. Le placche dei virus ricombinanti esprimono fluorescenza rossa a causa dell'integrazione del gene di fusione mCherry-E3L (Figura 2). Se inizialmente è stato utilizzato un virus privo di inibitori del PKR, tutte le placche conterranno virus ricombinante.
- La placca purifica i virus ricombinanti tre volte sulle cellule RK13. Dopo l'ultimo giro di purificazione della placca, tutte le placche devono esprimere fluorescenza rossa.
- Infettare una piastra confluente a 6 pozze di cellule DI RK13 che esprimono gli inibitori vaCV PKR E3L e K3L (RK13-E3L-K3L cellule28) con il virus di fluorescinaggio rosso purificato dalla placca dal passo 2.6. Mirare a circa 50-100 placche per pozzo.
NOTA: Queste cellule forniscono gli antagonisti VACV PKR in trans e alleviano la pressione selettiva mediata dal PKR per mantenere il gene di fusione mCherry-E3L, promuovendo così la generazione "senza cicatrici" del virus ricombinante. - Identificare i virus collassati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio EVOS2 e un cubo di filtro GFP (Eccitazione: 470/22, Emissione: 525/50) e un cubo di filtro RFP (Eccitazione: 531/40, Emissione: 593/40).
NOTA: La frequenza con cui viene perso il gene di fusione mCherry-E3L è di circa il 2,5%(tabella 2). Se EGFP non è incluso come gene marcatore, le placche di virus mutanti che hanno perso il gene di fusione mCherry-E3L saranno incolore. - La placca purifica le placche solo verdi (VC-R4) o incolore (E3L) per tre volte sulle cellule RK13-E3L-K3L. Assicurarsi che non si fluoriscano in rosso.
- Confermare la perdita di mCherry-E3L e la presenza della mutazione prevista da parte del sequenziamento PCR e Sanger.
NOTA: Se il gene o la mutazione di interesse non ha attività inibitoria del PKR, i virus ricombinanti devono essere coltivati su cellule RK13-E3L-K3L o una linea cellulare equivalente inibita al PKR o carente di PKR (Figura 3).
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Representative Results
Abbiamo usato la procedura illustrata nella Figura 1 per generare un VACV privo sia di PKR antagonisti E3L che di K3L, sostituendo E3L con EGFP in un virus già eliminato per K3L (vP872). La figura 2 mostra le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 competenti di PKR che indicano l'espressione virale di mCherry-E3L, nonché EGFP espresse nelle cellule RK13-E3L-K3L che confermano la perdita di E3L e il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L. Figura 3 conferma che questo virus ricombinante, VC-R4, privo di entrambi gli antagonisti PKR non può replicare nelle cellule RK13 competenti PKR competente, mentre il virus genitore, vP872 che esprime E3L, è replicabile competente. Per confermare che questa incapacità di replicare nelle cellule RK13 era solo a causa della perdita di E3L, abbiamo sostituito EGFP in VC-R4 con E3L, per generare un virus ripristinante utilizzando lo stesso protocollo di selezione. Figura 3 convalida anche che questo virus ripristinante replica in modo efficiente come vP872 nelle cellule RK13. È interessante notare che le placche incolore coerenti con il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L sono state identificate prima della selezione nelle cellule RK13-E3-K3 che sono generalmente necessarie per selezionare ricombinanti "senza cicatrici", probabilmente a causa dell'identità della sequenza estesa tra la cassetta di ricombinazione mCherry-E3L e il gene E3L inserito in VC-R4. Pertanto, per determinare l'efficienza della ricombinazione e il tasso di collasso abbiamo scelto di produrre virus che esprimono l'antagonista poxvirus PKR K3L per evitare il problema del collasso precoce23. Figura 4 indica la comparsa di placche incolore (punte di freccia) dopo l'infezione di cellule RK13-E3L-K3L. La tabella 1 mostra i risultati di tre esperimenti indipendenti, in cui in media il 12,6% dei virioni progenie aveva subito una ricombinazione con il plasmide trasandato, simile alle frequenze precedentemente riportate29,30,31. La Tabella 2 descrive in dettaglio la frequenza delle placche incolore rispetto alle placche totali nelle cellule di RK13-E3L-K3L, dimostrando che il tasso di collasso e perdita del marcatore di selezione mCherry-E3L si è verificato ad una frequenza di circa l'1,8%.
Figura 1: Diagramma di p837-GOI-mCherry-E3L, nonché la strategia di ricombinazione visiva e dell'intervallo host. (A) braccio 5' (nero) e braccio 3' (grigio) fiancheggiano il locus E3L (marrone) in VACV. (B) Nel p837-GOI-mCherry-E3L, queste braccia fiancheggiano una cassetta contenente il gene di interesse (GOI), in questo caso EGFP, (verde) separata da un gene di fusione mCherry-E3L (rosso) sotto il controllo del prodotto del poxvirus precoce/tardivo sintetico25 blu) con un breve braccio grigio del 3' (un braccio grigio). Questi bracci esterni guidano la ricombinazione omologa tra VACV e il p837-GOI-mCherry-E3L. Le frecce nere indicano i siti dei primer sovrapposti usati per generare questo plasmide mediante la clonazione Gibson. (C) Quando la pressione selettiva PKR viene rimossa, è possibile selezionare virus che hanno subito una ricombinazione intramolecolare tra le braccia corte e lunghe 3.3'. (D) Risultato in un virus (VC-R4) contenente solo il gene di interesse nel locus E3L. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micrografie fluorescenti di (in alto) una placca di virus ricombinante 24 ore dopo la ricombinazione con p837-GOI-mCherry-E3L che esprime sia mCherry (sinistra) che EGFP (destra) nelle cellule RK13. (In basso) Micrografia di una placca di virus ricombinante 48 ore dopo che la pressione selettiva mediata da PKR è stata rimossa nelle cellule di RK13, esprimendo EGFP (destra) ma non mCherry (sinistra). La barra della scala indica 650 m per tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: VC-R4 non può replicare in celle competenti PKR. Le linee di celle indicate sono state infettate da vP872 (blu), VC-R4 (verde) o VC-R4-E3L (magenta) in MOI : 0,1. 48 ore dopo l'infezione le cellule infette sono state raccolte e titolate per diluizione seriale sulle cellule di RK13-E3L-K3L. I titer sono riportati in PFU/mL, le barre degli errori rappresentano la deviazione standard di tre esperimenti di replica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Perdita dell'espressione mCherry-E3L nelle celle di RK13-E3L-K3L. Sovrapposizione di micrografie a contrasto fluorescente e di fase di cellule di colore VC-R4-K3L-mCherry-E3L infettate da RK13-E3L-K3L. Tre placche non esprimono più mCherry (cerchi) a causa del collasso della cassetta di selezione che produce VC-R4-K3L. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Esperimento 1 | Esperimento 2 | Esperimento 3 | |
| Placche rosse (RK13) | 30 | 11 | 18 |
| Placche totali (RK13-E3L-K3L) | 225 | 64 | 249 |
| Frequenza di ricombinazione | 13.30% | 17.20% | 7.20% |
Tabella 1: Frequenza di ricombinazione di VACV con p837-K3L-mCherry-E3L plasmide.
| Esperimento 1 | Esperimento 2 | Esperimento 3 | |
| Placche totali (RK13-E3L-K3L) | 115 | 44 | 210 |
| Placche incolore (RK13-E3L-K3L) | 3 | 1 | 1 |
| Frequenza di ricombinazione | 2.60% | 2.30% | 0.50% |
Tabella 2: Frequenza di perdita di mCherry-E3L da VC-R4-K3L-mCherry-E3L nelle celle RK13-E3-K3.
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Discussion
Qui presentiamo una variazione di una strategia di selezione dei marcatori transitoria 32 per generare virus della vaccino ricombinante senza trattenere il DNA estraneo nel virus ricombinante finale. La nostra strategia utilizza una pressione selettiva mediata dalla proteina antivirale ospite PKR piuttosto che da altre forme di pressione selettiva come gli antibiotici. L'uso di geni antivirali ospiti elimina la possibilità di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente nelle cellule o un aumento del rischio di mutazione a causa di farmaci di selezione. Inoltre, a differenza della selezione dei farmaci, non esiste una fase di ritardo per il nostro approccio, perché il PKR è espresso in modo stitutivo in tutte le cellule. La selezione visiva secondaria basata sull'espressione mCherry migliora anche la specificità di questo metodo assicurando che durante la prima fase vengano raccolte solo le placche che esprimono il transgene ed è altrettanto efficiente come marcatore selettivo negativo durante la selezione di virus ricombinanti maturi che hanno perso il gene mCherry-E3L.
I passaggi più critici per questa strategia di ricombinazione sono la generazione del vettore di ricombinazione appropriato e l'appropriata purificazione della placca per garantire che il virus selezionato sia clonale. In questo articolo suggeriamo "Gibson assembly" per generare il vettore di ricombinazione. Questa strategia è estremamente efficiente e consente l'assemblaggio di tutti i frammenti che comprendono il vettore di ricombinazione in un solo giorno. Tuttavia, poiché il braccio corto da 3' e il braccio lungo 3' condividono sequenze identiche, questi frammenti hanno il potenziale per essere uniti durante la reazione di clonazione, e alcuni vettori potrebbero non contenere la cassetta mCherry-E3L. Nella nostra esperienza questo è raro, ma confermando la struttura del vettore dopo la clonazione è necessario. Abbiamo anche generato vettori di ricombinazione per questa strategia utilizzando metodi tradizionali endonuclease e ligase. Questa strategia evita il problema descritto in precedenza, ma può essere più laboriosa. La purificazione della placca è generalmente semplice ed è principalmente dipendente dall'utilizzo di cellule permissive appropriate per la ricombinazione iniziale, cellule pKR-competenti per la purificazione iniziale della placca per garantire che solo i virus ricombinanti possano replicarsi, e quindi le cellule permissive di nuovo per facilitare la ricombinazione intramolecolare e la perdita del marcatore selezionabile. Una particolare attenzione alle linee cellulari è quindi fondamentale per il successo e l'efficienza dell'applicazione di questa strategia.
In questo studio, dimostriamo l'uso di questo metodo per generare un ricombinante VACV cancellato sia per gli antagonisti PKR E3L che per K3L ed esprimendo EGFP sotto il controllo del promotore E3L. In futuro, questo virus servirà come sfondo efficiente per futuri virus ricombinanti, in quanto non è in grado di replicare in cellule competenti PKR. Pertanto, ci sarà una forte pressione selettiva mediata da PKR per guidare la cassetta di ricombinazione mCherry-E3L in virioni progenie, impedendo allo stesso tempo essenzialmente la replicazione del virus non ricombinante. Inoltre, la perdita di EGFP mediante l'assorbimento della cassetta di ricombinazione è un utile marcatore di selezione secondaria per garantire che le placche raccolte non siano co-infettate con un virus non ricombinante. Abbiamo osservato tassi di ricombinazione coerenti con i tassi precedentemente riportati per VACV, ma i marcatori fluorescenti visivi aumentano l'efficienza della generazione di virus ricombinanti assicurando che aumentando la probabilità che vengano selezionati i virus ricombinanti appropriati. La nostra osservazione di placche incolore dopo due cicli di selezione su cellule PKR-competenti, presumibilmente a causa dell'aumento della lunghezza della sequenza identica tra E3L e il gene marcatore mCherry-E3L, suggerisce che il tasso di perdita di mCherry-E3L può essere "sintonizzato" aumentando o diminuendo la lunghezza del braccio corto 3'. La limitazione primaria di questa tecnica è l'uso del PKR come pressione selettiva per i ricombinanti. L'uso più efficiente di questa strategia di ricombinazione è la generazione di questi virus in uno sfondo privo di antagonisti PKR. Tuttavia, il marcatore di selezione colorimetrica consente di utilizzare questa strategia di ricombinazione anche senza la selezione mediata dal PKR, semplicemente purificando le placche mCherry. Mentre la mancanza di pressione selettiva mediata da PKR ridurrà l'efficienza della prima fase di screening, la percentuale di placche che esprimono mCherry è ancora abbastanza alta da consentire la selezione basata sul colore. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per inserire quasi qualsiasi gene nel genoma del poxvirus.
Come dimostrato dall'inserimento di EGFP, con questo approccio, qualsiasi gene può essere rapidamente inserito nel locus E3L sotto il controllo del promotore nativo, a condizione che le cellule nulle PKR o le linee cellulari complementari siano utilizzate per esperimenti a valle se il transgene non è un antagonista PKR. Questa strategia, combinata con il virus VC-R4 che riportiamo qui, aggiunge un metodo nuovo e potente per generare rapidamente e in modo affidabile virus ricombinanti vaccinia utilizzando la pressione selettiva mediata dall'host e l'identificazione visiva dei ricombinanti nelle prime fasi del processo.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health (AI114851) a SR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
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