Summary
כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.
Abstract
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הנגרמת על ידי שילוב של גורמים סביבתיים ורקע גנטי רגיש. אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הוא מודל מחלה טיפוסי של טרשת נפוצה בשימוש נרחב לחקירת הפתוגנזה שבה לימפוציטים T ספציפי לאנטיגנים מיאלינים ליזום תגובה דלקתית ב- CNS. חשוב מאוד להעריך כיצד לימפוציטים במערכת העצבים תסדיר את התפתחות המחלה. עם זאת, הגישה למדידת הכמות והאיכות של לימפוציטים חדרו ב-CNS מוגבלת מאוד בשל הקשיים בבידוד ואיתור לימפוציטים חדרו מהמוח. כתב יד זה מציג פרוטוקול לכך שימושי לבידוד, זיהוי, ואפיון של לימפוציטים הסתננו ממערכת העצבים הצרפתית ויהיה מועיל להבנתנו כיצד לימפוציטים מעורבים בפיתוח המחלה האוטואימונית CNS.
Introduction
כמחלה demyelinating כרונית של CNS, טרשת נפוצה משפיעה על 2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם וחסר טיפוליםמרפאים 1. הוא נחשב גם מחלה אוטואימונית, שבה לימפוציטים T אנטיגן מימין ספציפיים ליזום תגובה דלקתית ולהוביל demyelination ופציעה סקסונית ב CNS2. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) שימשה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים פתוגנים של טרשת נפוצה כמודל קלאסי מחלת דמיאליציה אוטואימונית ב CNS3. ישנן שתי דרכים לגרום EAE: אחת היא לגרום EAE באופן פעיל על ידי חיסון בעלי חיים עם רכיבים מילין, אחר הוא העברה מאמצת על ידי העברת תאי T encephalitogenic לתוךקולטן 2,,4,,5. הרגישות ל-EAE שונה בזני בעלי חייםשונים 6. בעכברים C57BL/6, מיטלין אוליגודנדרוציט גליקופרוטין (MOG) 35-55 אתגר גורם למחלה monophasic עם demyelination נרחב ודלקת ב-CNS, אשר משמש לעתים קרובות בניסויים עם עכברים ממוקדיםבגן 7.
הדור של תאי T תגובתיים ספציפיים מילין נדרש להתרחשות ופיתוח של מחלה בEAE והוא סימן חיסוני של EAE ו טרשת נפוצה. לימפוציטים T אוטומטי פעיל לחצות את מחסום מוח הדם (BBB) לתוך CNS בריא ליזום מחלת EAE. כאשר MOG 35-55 Ag נתקל, לימפוציטים T אלה לגרום לדלקת וגיוס של תאי אפקט לתוך CNS, וכתוצאה מכך demyelination והרס axon8,9. במודל EAE, יש ראיות רבות כי נוירואנטיגן ספציפי CD4+ T תאים יכולים ליזום ולקיים דלק עצבי ופתולוגיה3,,10. בהתאם ציטוקינים העיקריים המיוצרים, CD4+ T לימפוציטים סווגו לתוך קבוצות משנה שונות: Th1 (מאופיין בייצור של אינטרפרון-γ), Th2 (מאופיין בייצור של interleukin 4), ו Th17 (מאופיין בייצור של interleukin 17). הוא האמין כי ההפעלה של תאי Th1 ו Th17 לתרום אינדוקציה, תחזוקה, ורגולציה של demyelination דלקתי ב EAE ו טרשת נפוצה על ידי הפרשת ציטוקינות effector IFN-γ ו IL-17, אשר מסוגלים להפעיל מקרופאגים וגיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים כדי להאיץ אתהנגעים 11.
בגלל תאי T תגובה אוטומטית לחצות את BBB לתוך CNS ול לגרום להתפתחות המחלה ב-MS ו- EAE, חשוב מאוד לנתח תאי T ב-CNS. עם זאת, יש מעט מאוד פרוטוקולים מבוססים לבידוד של לימפוציטים מ CNS12. לכן, שיטה אופטימיזציה לבידוד תאים חד-נו-קוטריים מהמוח וניתוח לימפוציטים T עם סמנים CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g, ו IL-17 עבור ציתימטריית זרימה פותחה. השיטה משתמשת MOG35-55 adjuvant Mycobacterium שחפת H37 Ra ו פתרון עבודה רעלן Pertussis (PTX) כדי לגרום מודל חיסון פעיל של EAE בעכברים. לאחר מכן, שיטות צנטריפוגציה הדרגתית של הפרדה מכנית ושיפוע צפיפות משמשים לבידוד של תאים חד-נו-נו-קוטביים CNS. לבסוף, אסטרטגיה ממוטבת cytometry gating זרימה משמש כדי לזהות לימפוציטים T ותת קבוצות מהמוח על ידי הכתמת סמנים מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת בעלי החיים של בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת שנגחאי Jiao טונג.
1. הכנת החומרים
- השתמש ברצף MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK של MOG35-55 כדי להשיג את הפפטיד lyophilized ממקורות מסחריים. ודא כי טוהר הפפטיד הוא >95%. הכן 10 מ"ג/מ"ל MOG פתרון מניות בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) ולאחסן ב -20 °C.
- להכין פתרון מניות 4 מ"ג /מ"ל של M. שחפת H37 Ra על ידי הצבת אחד 100 מ"ג שפופרת של M. שחפת H37 Ra לתוך 25 מ"ל של Adjuvant של פרוינד שלם (CFA) ומערבוב. אחסן את פתרון המלאי ב- -20 °C.
- להכין 1 ng/μL Pertussis רעלן פתרון עבודה (PTX) על ידי הוספת 50 μg של PTX לתוך 50 מ"ל של PBS. אחסן את פתרון העבודה ב- -20 °C.
- אחסן את כל הנוגדנים (כלומר, FITC נגד עכבר CD3, PE/Cy7 נגד עכבר CD4, PerCP/Cy5.5 נגד עכבר CD11b, Alexa Fluor700 נגד עכבר CD45.2, PE נגד עכבר IL-17A ו- APC נגד עכבר IFN-γ) ב 4 °C.
- להפוך את זרימת Cytometry כתמים (FCS) מאגר על ידי הוספת 2 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ו 1% סרום שור עוברי (FBS) לתוך 500 מ"ל של PBS.
2. דיור של C57BL /6 עכברים
- השתמש בעכברים C57BL/6 נקבה בגיל 8-12 שבועות.
- התאקלם C57BL/6J עכברים לפחות 7 ימים לפני הזריקה.
- עכברי בית במתקן בעלי חיים בתנאים ללא פתוגן בטמפרטורה ולחות קבועות במחזור אור/כהה של 12 שעות ומספקים גישה חופשית למים ולמזון רגיל.
3. חיסון של עכברים C57BL/6
- השאר את כל פתרונות המלאי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח התייבשות מלאה.
- לדלל 300 μL של פתרון מניות MOG-פפטיד עם 700 μL של PBS להכנת 3 מ"ג / מ"ל פתרון עבודה.
- לשים 1 מ"ל של M. שחפת H37 Ra פתרון מניות 1 מ"ל של MOG35-55 פפטידים עובד פתרון לתוך מזרקים נפרדים 10 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש ב זין עצירה ארבעה דרך כדי לחקות לפחות 10 דקות. ודאו את ההתמהמה המלאה לפני ההזרקה.
- עכברים מרדים בשיא ה-EA עם הזרקה תוך-אפרטיטונאלית של 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג לק"ג).
- עם מזרק 1 מ"ל, תת עורית להזריק עכברים עם 100 μL של MOG 35-55/ CFA אמולסיה (300 μg/200 μL) בשני אתרים, שניהם בחלק האחורי ליד הצוואר. תת עורית להזריק עכברי שליטה עם 200 μL של PBS.
- באותו יום (יום 0) וביום 2 לאחר חיסון (PI), תוך-אפרטון להזריק עכברים עם 200 μL של 1 ng/μL PTX פתרון עבודה. תוך-פריטנלית להזריק עכברי שליטה עם 200 μL של PBS.
- להעביר את העכברים לכלוב הבית שלהם עם משטח חימום.
- לבחון ולדרג את כל העכברים כל יום לאחר הזריקה באופן עיוור עבור סימנים נוירולוגיים המוצגים בטבלה 11111,13. להמתת החיות אם הציונים גרועים מכיתה ד'.
- להקליט את שינויי המשקל במהלך קורס המחלה. זהו מדד נוסף בעל ערך לפעילות המחלה במודל EAE11,13.
- להוסיף את היום הראשון של סימנים קליניים עבור עכברים בודדים ולחלק על ידי מספר העכברים בקבוצה; התוצאה היא ההתחלה. הוסף את היום הראשון של הציון המרבי של EAE עבור עכברים בודדים וחלוק לפי מספר העכברים בקבוצה; התוצאה היא הפסגה.
4. הכנת השעיה חד-תאית מהמוח
- תדלל את צפיפות מעבר הצבע בינוני ביחס של 9:1 עם PBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל כדי להניב פתרון סופי של 100%.
- עכברים מרדים בשיא ה-EA עם הזרקה תוך-פרקתית של 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג לק"ג) וטפטוף תוך-לב עם 20 מ"ל של PBS קר כקרח סטרילי. להשיג את זה על ידי לאט ובהתמדה הזרקת PBS לתוך החדר השמאלי של הלב באמצעות מזרק 20 מ"ל ופתיחת האטריום הימני.
- חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר, ואז להסיר את המוח מתיבה גולגולת לתוך 10 מ"ל של RPMI בצינורות חסונים 50 מ"ל. מערבבים היטב כדי להסיר תאי דם אדומים דבקים. לאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI.
- מניחים את המוח והבינוני בצלחת של 100 מ"מ. קוצצים דק עם סכין גילוח.
- מעבירים 6 מ"ל מהצלחת להומוגניזר זכוכית קר כקרח של 7 מ"ל עם פיפטה נקייה. הימנע מהשארת כמויות גדולות של רקמות בפיפטה. כמות קטנה היא בלתי נמנעת.
- לטחון את המוח באמצעות הבוכנה "רופף" של העלי הראשון, לאחר מכן להשתמש בוכנה "הדוק" עד המתלים הוא הומוגני, ולשפוך לתוך צינור 15 מ"ל חוטי מראש ולשמור על קרח.
- לאחר שכל הדגימות הומוגניות, העריכו את עוצמת הקול. כוונן את עוצמת הקול עם RPMI ל- 7 מ"ל. לאחר מכן מניחים 3 מ"ל של קר כקרח 100% מטריצת קרום מרתף בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה חונית 15 מ"ל ולהוסיף 7 מ"ל של המוח homogenate כדי להניב סופי 30% צפיפות צפיפות בינונית הדרגתית. מערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. אל תמערבולת.
- כדי להבטיח ממשק חד, בזהירות ולאט להוסיף 1 מ"ל של 70% שכבה בינונית הדרגתית ב- RPMI עם פיפטה 3 מ"ל.
- צנטריפוגה ב-800 x g ל-20 דקות בלבד ב-4°C. g הגדר את ההאצה ל- 1 והאטה ל- 0. לאחר צנטריפוגה, לשאוף כמעט את כל השלב העליון, להיות זהיר להסיר לחלוטין את המילין בראש(איור 1).
- הסר את הממשק לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15. כוונן את עוצמת הקול ל- 10 מ"ל באמצעות RPMI.
- צנטריפוגה ב-500 x גרם ל-10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, לשאוף את supernatant. תחשוף מחדש את הכדור ב- כ- 200 μL של כתמים ציטומיטריה זרימה (FSC). הכדורים מוכנים להכתים עבור FACS.
5. זרימה ניתוח ציטומטרי של תאים בודדים מהמוח
- השתמשו בהמוציטומטר ובמיקרוסקופ כדי לספור את התאים. להוסיף 10 μL של התאים 10 μL של טריפאן כחול, לערבב היטב, ולמקם 10 μL על hemocytometer לספור את התאים. לאחר מכן לחשב את מספר התאים החיים לכל מיקרוליטר תחת מיקרוסקופ הפוך (למשל, מיקרוסקופ הפוך אולימפוס).
- Aliquot כ 2 x 106 של תאים RPMI לתוך באר אחת של צלחת 96 באר.
- להוסיף קוקטייל גירוי תא 500x בתוספת מעכבי הובלת חלבון לבארות.
- דגירה את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- צנטריפוגה התאים ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT. בטל את supernatant ולתוח מחדש את התאים ב 100 μL של מאגר FCS.
- קדם לצנרר את התאים עם בלוק CD16/CD32 Fc נגד עכבר (1:33) במשך 10 דקות ב- 4 °C לפני הכתמה כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות בתיווך FC.
- כתם סמנים פני השטח של התא ללא כביסה. הוסף CD45.2 נגד עכבר (1:200), CD11b נגד עכבר (1:200), CD3 נגד עכבר (1:200) ונוגדנים נגד עכבר CD4 (1:200).
הערה: כדי לקבוע שערים חיוביים ושליליים, יש להכתים פלואורסץ מינוס אחד (FMO) עבור כל צבע ונוגדן בקרת איזוטיפ. - דגירה את הצלחת לפחות 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח. הגן מפני אור.
- שטוף את התאים על-ידי הוספת מאגר FCS. השתמש 200 μL / גם עבור צלחות microtiter. צנטריפוגה ב- 400 x g עבור 5 דקות ב RT.
- הוסף 200 μL של מאגר קיבעון תאי (IC) לכל באר כדי לתקן את התאים. ודא שהתאים יתווסתו מחדש במלואם בפתרון.
- דגירה 30-60 דקות ב RT. הגן מפני אור.
- צנטריפוגה הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
- הוסף 200 μL של 1 x permeabilization מאגר לכל באר צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
- תוסתה מחדש את הכדורי בנפח שיורית והתאימה את עוצמת הקול ל-100 μL עם מאגר אחד של יציבות.
- הוסף נוגדנים נגד עכבר IL-17A (1:200) ואנטי-עכבר IFN-g (1:200) לזיהוי אנטיגנים תאיים לתאים.
- דגירה לפחות 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הגן מפני אור.
- הוסף 100 μL של 1 x permeabilization מאגר לכל באר צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
- תוסתה מחדש את התאים המוכתמים ב-100 μL של חוצץ הכתמים של ציתומיה זרימה.
- נתח לפי ציתום זרימה.
הערה: הגדרות הלייזר והפיצוי על ציטומטר הזרימה מותאמות, הדגימות ממוקמות על ציטוטומטר, וכל האירועים נרשמים בהתאם להמלצות היצרן.
6. ניתוח נתונים
- סינגלים שער באמצעות FSC-A לעומת FSC-H ו SSC-A לעומת SSC-H.
- גייט תאים חיים באמצעות FSC-A ו- SSC-A בהתבסס על גודל.
- לאחר מכן, זהה את הלוקוציטים, לא כולל המונוציטים, על-ידי גתות ב- CD45+ CD11b- תאים.
- לאחר מכן, זהה את הלימפוציטים CD4 T על-ידי gating על CD3 + CD4+ תאים.
- לבסוף, זהה את ערכות המשנה Th1 ו- Th17 על-ידי גתות בתאי IFN-γ+ ותאי IL-17+ בנפרד, ולקבוע את האוכלוסיות החיוביות והשליליות באמצעות פקדי איזוטיפ ו-FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר חיסון של עכברים C57BL/6, כל העכברים נשקלו, נבדקו, ותודרגו מדי יום עבור סימנים נוירולוגיים. הקורס הקליני המייצג של EAE צריך לגרום עקומת מחלה כפי שמוצג איור 2A ושינוי משקל הגוף בעכבר כפי שמוצג איור 2B. C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG35-55 בדרך כלל התחיל לפתח תסמיני מחלה סביב היום 10-12 והשיג את שיא המחלה סביב היום 15-21 לאחר חיסון פעיל (איור 2A). שינוי משקל היה אינדיקטור בעל ערך במודל EAE. לפני תחילת המחלה, משקל הגוף של עכברים מחוסנים גדל בהדרגה, אז בדרך כלל ירד מתאם לתסמיני המחלה הגוברת. בשיאו של EAE, עכברים גם הראו את משקל הגוף הנמוך ביותר(איור 2B). ואז משקל הגוף התאושש מעט כמו תסמינים קליניים ירדו. עם זאת, העכברים בדרך כלל לא התאוששו באופן מלא. עכברים C57BL/6 פיתחו פתולוגיה מחלה כרונית monophasic על אתגר MOG35-55 (איור 2A).
החומרה הקלינית של EAE קשורה ישירות עם הפעלת תא T autoreactive14. תאי CD4+ T ספציפיים לנוירואנטיגן מסוגלים ליזום ולקיים דלקות עצביות ופתולוגיה ב- EAE3. המאפיינים האופייניים של CD4+T תאים בשיא EAE מוצגים איור 3. יתר על כן, חלקם של Th1 ו Th17 תת-ערכות בתאים encephalitogenic, שהם התאים הפתוגניים העיקריים בתיווך EAE, נותח על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר ההפרדה של מתלה חד-תאי מהמוח, התאים היו מוכתמים CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ, ו IL-17 נוגדנים, אשר באים לידי ביטוי על ידי לימפוציטים T. FSC-A לעומת FSC-H ו- SSC-A לעומת SSC-H שימשו לסינגלים שער(איור 3A, ב), אזFSC-A לעומת SSC-A שימשו לשער תאים חיים בהתבסס על גודל וגרגריות (איור 3C). לאחר מכן, CD45+ CD11b- תאים היו מגודרים כדי לזהות לוקוציטים למעט מונוציטים(איור 3D). לאחר מכן, השער נקבע על CD3+CD4+ כדי לזהות CD4+ לימפוציטים T (איור 3E). לבסוף, IFN-γ ו-IL-17 שימשו לזיהוי ערכות משנה Th1 ו- Th17 ולהעריך את ההשפעה הפונקציונלית על פי ציטוקינות effector (איור 3F). על פי חומרת המחלה הקלינית, תוצאות מייצגות הראו כי IFN-γ-ייצור Th1 ו IL-17-ייצור תאי Th17 גדל באופן משמעותי בתאים encephalitogenic מעכברי EAE.
| כיתה | סימן קליני |
| 0 | אין מחלה |
| 1 | גוון זנב מופחת או הליכה מעט מגושמת |
| 2 | הליכה מגושמת במתינות ו/או יכולת נכונה לקויה |
| 3 | חולשת גפיים |
| 4 | שיתוק גפיים |
| 5 | מדינת מוריבונד. |
טבלה 1: מערכת ניקוד קלינית. עכברים C57BL/6 חוסנו עם פפטיד MOG35-55. ואז נרשמו סימנים נוירולוגיים. מערכת ניקוד של 5 נקודות שימשה להערכת חומרת EAE.
איור 1: סכמטי של כיוונון מעבר הצבע של Percoll לבידוד תאים מונוכרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: קורס מייצג של EAE. EAE היה מושרה בעכברים C57BL/6 על ידי הזרקה של MOG35-55 כמתואר בפרוטוקול. הציון הקליני (A) ושינוי משקל הגוף(B)נקבעו בעכברים אלה. הנתונים מוצגים כנתונים ± SEM; n = 8 עבור כל קבוצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח ציתומיטריה זרימה מייצג של לימפוציטים במוח. מתלה חד-תאי היה מבודד מהמוח בשיא ה-EAE. אסטרטגיית ההתפתלות של T לימפוציטים מוצגת. סינגלים היו מגודרים כ-FSC-A לעומת FSC-H ו-SSC-A נגד SSC-H (A,B). תאים חיים היו מגודרים כמו FSC-A לעומת SSC-A (C). לוקוציטים למעט מונוציטים היו מגודרים כ- CD45+ CD11b- (D). CD4+ לימפוציטים T היו מגודרים כמו CD3+CD4+ (E). תת-ערכות Th1 ו- Th17 היו מגודרות כ- IFN-γ+ ו- IL-17+ (F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מציג פרוטוקול כדי לגרום ולפקח EAE באמצעות MOG35-55 בעכברים C57BL/6, אשר נחשבים מודל בעלי חיים ניסיוני נוירואימונולוגי טיפוסי של MS. EAE יכול להיות מושרה משתנה זנים עכברים או סוג של חלבון המשמש אינדוקציה על פי מטרת המחקר. לדוגמה, באמצעות PLP139-151 פפטיד בעכברים SJL יכול לגרום קורס מחלת EAE relapsing remitting כי הוא מתאים במיוחד להערכת השפעות טיפוליות עלנסיגה 15. ניתן להחיל את ההליך הניסיוני המתואר כאן גם על פרוטוקולי EAE אחרים7. במודל זה, עכברים C57BL/6 מחוסנים עם פפטיד MOG35-55 ומפתחים מחלה מונופגית. מערכת ניקוד של 5 נקודות משמשת להערכת חומרת EAE. למרות שמספר מערכות ניקוד הנעות בין 0-3 נקודות או 0-10 נקודות מועסקותכדי להבקיע את חומרת המחלה 7,16,17- תוצאות אלה מראות כי מערכת ניקוד של 5 נקודות מסוגלת לקבוע הבדלים משמעותיים סטטיסטית בתוצאות המחלה בין קבוצות ומערכות ניקוד אחרות של EAE אינן מובילות לשיפור ברור.
חומרת EAE מוערכת בדרך כלל על ידי ציון קליני EAE לוקח בחשבון את חומרת תפקודנוירולוגי 11,13. כדי להבטיח את ההשוואה של הניסוי לכל העכברים, חשוב לשמור אותם באותם תנאים, כולל שינויים בכלוב, ניהול מזון ומים, ובעיקר תנאי דיור עכבר. בנוסף, חיסון צולב צריך להתבצע גם כדי למנוע תופעות ספציפיות לכלוב המושרה על ידי החוקר.
מחקר זה מספק שיטה להפריד תאים חד-קוטביים מ-CNS המתאימה לניתוח FACS או למחקר פונקציונלי. כדי להבטיח שהדם יוסר מרקמות ה-CNS, יש לחדור את העכברים לפני ניתקה הרקמה. הטיהור של התאים החד-נו-שלושה על צנטריפוגציה הדרגתית בצפיפות הוא צעד מפתח בבידוד. כדי להבטיח אפקט הפרדה, יש להגדיר את ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה ל- 1 ו- 0, בהתאמה. באמצעות שיטה זו, תשואות התא יחיד הם בדרך כלל נמוכים ממוח נורמלי, אבל גבוה יותר ממוח מחלה עם EAE. תוצאות מייצגות מראות כי יש עלייה ברורה CD3+CD4+ T לימפוציטים, במיוחד IFN-γ ייצור תאים IL-17 תאים המייצרים, אשר נחשבים לתרום למחלה החמירה.
קיימות כמה מגבלות של פרוטוקול זה. מודל EAE המושרה עם MOG35-55 מציג בעיקר CD4+ T תא מונחה תגובה חיסונית. אם יש לנתח את התפקיד של תאי CD8+ T ותאי B, יש לשקול פרוטוקולים חלופיים. כמחלה דלקתית CNS, פנוטיפ פתולוגי חמור נמצא גם בחוט השדרה במודל EAE. עם זאת, בשל הנוכחות של כמויות גדולות של מילין, קשה לקבל מספיק תאים בודדים מחוט השדרה לניתוח FACS. במקרה זה, שימוש בחיסונים או אימונו-פלואורסנציה כדי לנתח רקמת חוט השדרה נדרש. ישנם גם חוקרים לשים את המוח וחוט השדרה יחד כדי להפריד תאים חד-נו-קוטביים לניתוח FACS12. פרוטוקול זה מפריד תאים בודדים מהמוח לניתוח FACS ורקמות חוט השדרה לניתוח אימונוהיסטוכימיה ואימונואורסצנציה.
החשיבות של לימפוציטים T ברגולציה חיסונית של טרשת נפוצה וEAE קיבל יותר ויותר תשומת לב לאחרונה. חלק גדול מהספרות שפורסמה מתמקד טחול ובלוטות הלימפה11; עם זאת, לימפוציטים נמצאים ברחבי CNS של עכברי EAE, ולכן, הניתוח האופייני של לימפוציטים T במערכת העצבים היא הכרחית. כתם חיסוני של חלקים יכול לזהות תאים חודרים בCNS. עם זאת, ניתוח פנוטיפי ופונקציונלי מוגבל. לאחר בידוד תאי החיסון ממערכת העצבים של עכברים נורמליים או החולים, הניתוח של פנוטיפים מפורטים יותר הופך לאפשרי. בשיטה זו, לימפוציטים T במוח ניתן ללמוד על בסיס תא אחר תא, ואת הביטוי של סמני פני השטח שונים, ציטוקינים, chemokines, ותמלול גורמים (למשל, חלבונים תאיים) ניתן לנתח טוב יותר. הפרוטוקול יהיה שימושי עבור מחקרים עתידיים כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של לימפוציטים T במוח במהלך טרשת נפוצה ו- EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק (31570921 ל ZJ, 81571533 לLS), הוועדה העירונית של שנגחאי לבריאות, ותכנון משפחה (201540206 ל ZJ), Ruijin בית החולים צפון מענק מחקר (2017ZX01 ל ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
