Summary
Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
Abstract
La sclerosi multipla (MS) è una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) causata dalla combinazione di fattori ambientali e background genetico suscettibile. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello tipico di malattia della SM ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi in cui i linfociti T specifici per gli antigeni della mielina avviano una reazione infiammatoria nel SNC. È molto importante valutare come i linfociti nel SNC regolano lo sviluppo della malattia. Tuttavia, l'approccio per misurare la quantità e la qualità dei linfociti infiltrati nel SNC è molto limitato a causa delle difficoltà nell'isolare e rilevare i linfociti infiltrati dal cervello. Questo manoscritto presenta un protocollo per che è utile per l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati dal SNC e sarà utile per la nostra comprensione di come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
Introduction
Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi1. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell'antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC2. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS3. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attivamente immunizzando gli animali con componenti mielin, un altro è il trasferimento adottivo trasferendo le cellule T encefalogeniche nelrecettore 2,4,5. Le suscettibilità a EAE sono diverse in diversi ceppi animali6. Nei topi C57BL/6, la glicoproteina mielina oligodendrocite (MOG) 35-55 induce una malattia monofasica con estatissima demelinazione e infiammazione nel SNC, che viene spesso utilizzata negli esperimenti con topi gene-mirati7.
La generazione di cellule T reattive specifiche della mielina è necessaria per l'insorgenza e lo sviluppo della malattia nell'EAE ed è un segno immunologico sia di EAE che di SM. I linfociti T autoreattivi attivati attraversano la barriera ematica del cervello (BBB) nel SNC sano e avviano la malattia EAE. Quando si incontra MOG 35-55 Ag, questi linfociti T inducono infiammazione e il reclutamento di cellule estruse nel SNC, con conseguente demielinazione e distruzione dell'assone8,9. Nel modello EAE, ci sono ampie prove che le cellule CD4 specifiche del neuroantigenopossono avviare e sostenere la neuroinfiammazione e lapatologia 3,10. A seconda delle principali citochine prodotte, i linfocitiCD4 e T sono stati classificati in diversi sottoinsiemi: Th1 (caratterizzato dalla produzione di interferone-γ), Th2 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 4) e Th17 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 17). Si ritiene che l'attivazione delle cellule Th1 e Th17 contribuisca all'induzione, al mantenimento e alla regolazione della demistelinazione infiammatoria in EAE e MS secernendo le citochine effettore IFN-γ e IL-17, che sono in grado di attivare macrofagi e reclutare neutroni nei siti infiammatori per accelerare le lesioni11.
Poiché le cellule T autoreattive attraversano il BBB nel SNC e inducono lo sviluppo della malattia nella SM e nell'EAE, è molto importante analizzare le cellule T nel SNC. Tuttavia, ci sono pochissimi protocolli stabiliti per l'isolamento dei linfociti dal CNS12. Pertanto, è stato sviluppato un metodo ottimizzato per isolare le cellule mononucleari dal cervello e analizzare i linfociti T con marcatori CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 per la citometria di flusso. Il metodo utilizza MOG35-55 adiuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra e Pertussis Toxin Working Solution (PTX) per indurre un modello di immunizzazione attiva di EAE nei topi. Quindi, i metodi di separazione meccanica e di centrifugazione del gradiente di densità vengono utilizzati per l'isolamento delle cellule mononucleari CNS. Infine, viene utilizzata una strategia ottimizzata di gating della citometria del flusso per identificare i linfociti T e i sottoinsiemi dal cervello colorando più marcatori.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato animali della Scuola di Scienze Mediche Di Base, Shanghai Jiao Tong University.
1. Preparazione dei materiali
- Utilizzare la sequenza MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK di MOG35–55 per ottenere il peptide liofilizzato da fonti commerciali. Assicurarsi che la purezza del peptide sia >95%. Preparare la soluzione di stock MOG da 10 mg/mL in una salina tamponata di fosfati (PBS) e conservarla a -20 gradi centigradi.
- Preparare una soluzione di stock di 4 mg/mL di M. tuberculosis H37 Ra mettendo un tubo da 100 mg di M. tuberculosis H37 Ra in 25 mL di Complete Freund's Adjuvant (CFA) e miscelazione. Conservare la soluzione di magazzino a -20 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione di lavoro ptxin toxin (PTX) di ng/L Pertussis aggiungendo 50 g di PTX in 50 mL di PBS. Conservare la soluzione funzionante a -20 gradi centigradi.
- Memorizzare tutti gli anticorpi (ad esempio, FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A, e APC anti-mouse IFN-γ) a 4 gradi centigradi.
- Rendere il Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer aggiungendo 2 mM diamine diamine acido tetraacetico (EDTA) e 1% siero bovino fetale (FBS) in 500 mL di PBS.
2. Alloggiamento di topi C57BL/6
- Utilizzare topi femmina C57BL/6 a 8-12 settimane di età.
- Acclimate C57BL/6J topi per almeno 7 giorni prima dell'iniezione.
- I topi domestici in un impianto animale in condizioni di senza agenti patogeni a temperatura e umidità costanti in un ciclo chiaro/scuro di 12 h e forniscono libero accesso all'acqua e agli alimenti standard per pellet.
3. Immunizzazione dei topi C57BL/6
- Lasciare tutte le soluzioni di magazzino per 15 min a temperatura ambiente (RT) per garantire una completa reidratazione.
- Diluire 300 L della soluzione di stock MOG-peptide con 700 L di PBS per la preparazione di una soluzione di lavoro da 3 mg/mL.
- Mettere 1 mL di M. tuberculosis H37 Ra soluzione stock e 1 mL di MOG35-55 peptides soluzione di lavoro in siringhe separate 10 mL, quindi utilizzare un cazzo di arresto a quattro modi per emulsionare per almeno 10 min. Garantire l'emulsione completa prima dell'iniezione.
- Anestesizzare i topi al culmine dell'EAE con un'iniezione intraperitoniale dell'1% di pentobarbital di sodio (50 mg/kg).
- Con una siringa da 1 mL, iniettare sottocutaneamente i topi con 100 L di un'emulsione MOG 35–55/CFA (300 g/200 l) in due siti, entrambi nella parte posteriore vicino al collo. Iniettare sottocutaneamente topi di controllo con 200 L di PBS.
- Lo stesso giorno (giorno 0) e il giorno 2 dopo l'immunizzazione (PI), iniettare intraperitonealmente i topi con 200 L di 1 ng/L PTX soluzione di lavoro. Topi di controllo iniettati intraperitonealmente con 200 L di PBS.
- Trasferire i topi nella loro gabbia di casa con un pad riscaldante.
- Esaminare e classificare tutti i topi ogni giorno dopo l'iniezione in modo accecato per i segni neurologici mostrati nella tabella 111,13. Eutanasia gli animali se i punteggi sono peggiori di grado 4.
- Registrare i cambiamenti di peso durante il corso della malattia. Si tratta di una misura aggiuntiva preziosa per l'attività della malattia nel modelloEAE 11,13.
- Aggiungere il primo giorno di segni clinici per i singoli topi e dividere per il numero di topi nel gruppo; il risultato è l'insorgenza. Aggiungere il primo giorno del punteggio massimo EAE per i singoli topi e dividere per il numero di topi nel gruppo; il risultato è il picco.
4. Preparazione delle sospensioni a uni cellula dal cervello
- Diluire il gradiente di densità medio nel rapporto 9:1 con PBS in un tubo conico da 15 mL per produrre una soluzione finale al 100%.
- Anestesizzare i topi al picco dell'EAE con un'iniezione intraperitoniale dell'1% di pentobarbital di sodio (50 mg/kg) e perfuse intracardially con 20 mL di PBS sterile ghiacciato. Raggiungere questo problema iniettando lentamente e costantemente PBS nel ventricolo sinistro del cuore utilizzando una siringa da 20 mL e aprendo l'atrio destro.
- Tagliare il cranio con attenzione dal naso al collo, quindi rimuovere il cervello dalla scatola cranica in 10 mL di RPMI in tubi conici da 50 mL. Mescolare bene per rimuovere i globuli rossi aderenti. Quindi rimuovere il mezzo per aspirazione e aggiungere 10 mL di RPMI.
- Mettere il cervello e il mezzo in un piatto da 100 mm. Tritare finemente con una lama di rasoio.
- Trasferire 6 mL dal piatto a un omogeneizzatore di vetro sintered da 7 mL ghiacciato con una pipetta pulita. Evitare di lasciare grandi quantità di tessuto nella pipetta. Una piccola quantità è inevitabile.
- Macinare il cervello utilizzando prima lo stantuffo "sciolto" del pestello, quindi utilizzare lo stantuffo "stretto" fino a quando la sospensione è omogenea, e versare in un tubo conico prechilled 15 mL e tenere sul ghiaccio.
- Dopo che tutti i campioni sono omogeneizzati, stimare il volume. Regolare il volume con RPMI a 7 mL. Quindi mettere 3 mL di matrice di membrana 100% intercarica ghiacciata in un tubo di centrifugazione conica refrigerata di 15 mL e aggiungere 7 mL dell'omogenea cerebrale per produrre un mezzo di pendenza di densità finale del 30%. Mescolare per inversione un paio di volte. Non vortice.
- Per garantire un'interfaccia nitida, aggiungere con attenzione e lentamente 1 mL del 70% di pendenza di densità di underlay media in RPMI con una pipetta da 3 mL.
- Centrifuga a 800 x g per soli 20 minuti a 4 gradi centigradi. Impostare l'accelerazione su 1 e decelerazione su 0. Dopo la centrifugazione, aspirare quasi tutta la fase superiore, facendo attenzione a rimuovere completamente la mielina in alto (Figura 1).
- Rimuovere l'interfaccia in un nuovo tubo di centrifuga 15. Regolare il volume a 10 mL con RPMI.
- Centrifuga a 500 x g per 10 min. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernante. Risuosire il pellet in 200 usd di buffer di colorazione della citometria di flusso (FSC). I pellet sono quindi pronti a macchiare per FACS.
5. Analisi citometrica del flusso di singole cellule dal cervello
- Utilizzare un emocitometro e un microscopio per contare le cellule. Aggiungete 10 L delle cellule a 10 L di blu di meta, mescolate bene e posizionate 10 L su un emocitometro per contare le cellule. Quindi calcolare il numero di cellule vive per microlitore al microscopio invertito (ad esempio, microscopio invertito Olympus).
- Aliquot circa 2 x 106 di cellule in RPMI in un singolo pozzo di una piastra di 96 bene.
- Aggiungere ai pozzi il cocktail di stimolazione cellulare 500x più gli inibitori del trasporto proteico.
- Incubare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 4 h.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a RT. Scartare il supernante e rispendere le cellule in 100 lL di FCS Buffer.
- Preincubare le cellule con blocco CD16/CD32 Fc anti-mouse (1:33) per 10 min a 4 gradi centigradi prima di colorare per bloccare le interazioni non specifiche mediate da Fc.
- Marcatori di superficie delle cellule macchiate senza lavaggio. Aggiungere gli anticorpi anti-mouse CD45.2 (1:200), anti-mouse CD11b (1:200), anti-mouse CD3 (1:200) e anti-mouse CD4 (1:200).
NOTA: Per determinare i cancelli positivi e negativi, una fluorescenza meno uno (FMO) per ogni colore e un anticorpo di controllo isotipo devono essere macchiati. - Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio. Proteggere dalla luce.
- Lavare le celle aggiungendo FCS Buffer. Utilizzare 200 l/well per piastre di microtiter. Centrifuga a 400 x g per 5 min a RT. Scartare il supernante.
- Aggiungere 200 L di buffer di fissazione intracellulare (IC) a ciascuno bene per fissare le celle. Assicurarsi che le celle siano completamente risspettete nella soluzione.
- Incubare 30-60 min a RT. Proteggere dalla luce.
- Centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant.
- Aggiungere 200 L di 1x buffer di permeabilizzazione ad ogni pozzo e centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant.
- Risundere il pellet in volume residuo e regolare il volume a circa 100 L con 1x buffer di permeabilizzazione.
- Aggiungere anticorpi anti-mouse IL-17A (1:200) e anti-mouse IFN-g (1:200) per il rilevamento di antigeni intracellulari alle cellule.
- Incubare per almeno 30 min a 4 gradi centigradi. Proteggere dalla luce.
- Aggiungere 100 L di 1x buffer di permeabilizzazione ad ogni pozzo e centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant.
- Riesposo le celle macchiate in 100 L di buffer di colorazione della citometria di flusso.
- Analizzare per citometria di flusso.
NOTA: le impostazioni del laser e della compensazione sul citometro di flusso vengono regolate, i campioni vengono posizionati sul citometro e tutti gli eventi vengono registrati secondo le raccomandazioni del produttore.
6. Analisi dei dati
- Singlet di gate che utilizzano FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs SSC-H.
- Gate celle vive utilizzando FSC-A e SSC-A in base alle dimensioni.
- Successivamente, identificare i leucociti, esclusi i monociti, gating su CD45- CD11b- cellule.
- Quindi, identificare i linfociti T CD4 gating su cellule CD3-CD4.
- Infine, identificare i sottoinsiemi Th1 e Th17 tramite gating sulle celle IFN-γ e le celle IL-17 e determinare le popolazioni positive e negative utilizzando i controlli isotipi e FMO.
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Representative Results
Dopo l'immunizzazione dei topi C57BL/6, tutti i topi sono stati pesati, esaminati e classificati quotidianamente per segni neurologici. Il corso clinico rappresentativo di EAE dovrebbe provocare una curva della malattia come presentato nella Figura 2A e un cambiamento del peso corporeo nel topo come presentato nella figura 2B. I topi C57BL/6 immunizzati con MOG35-55 di solito hanno iniziato a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e hanno raggiunto il picco di malattia intorno al giorno 15-21 dopo l'immunizzazione attiva (Figura 2A). Il cambiamento di peso è stato un indicatore prezioso nel modello EAE. Prima dell'insorgenza della malattia, il peso corporeo dei topi immunizzati è aumentato gradualmente, quindi in genere è diminuito in relazione ai sintomi crescenti della malattia. Al culmine dell'EAE, i topi hanno anche mostrato il peso corporeo più basso (Figura 2B). Poi il peso corporeo recuperato leggermente come sintomi clinici diminuiti. Tuttavia, i topi di solito non si sono completamente riprendati. I topi C57BL/6 hanno sviluppato una patologia monofasica della malattia cronica su MOG35-55(Figura 2A).
La gravità clinica di EAE è direttamente associata all'attivazione automatica della cellula T14. Le celluleCD4 specifiche del neuroantigeno sono in grado di avviare e sostenere la neuroinfiammazione e la patologia in EAE3. Le caratteristiche tipiche dellecelleCD4 e T nel picco di EAE sono illustrate nella Figura 3. Inoltre, la proporzione di sottoinsiemi Th1 e Th17 nelle cellule encefalogene, che sono le principali cellule patogene che mediano l'EAE, è stata analizzata dalla citometria del flusso. In seguito alla separazione di una sospensione a un solo cellula dal cervello, le cellule sono state macchiate con anticorpi CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ e IL-17, che sono espressi da linfociti T. FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs SSC-H sono stati utilizzati per gate singlet (Figura 3A, B), quindi FSC-A vs SSC-A sono stati utilizzati per il gate di celle vive in base alle dimensioni e granularità (Figura 3C). Dopo, CD45- CD11b- le cellule sono state recintate per identificare i leucociti escludendo i monociti (Figura 3D). Quindi, il cancello è stato impostato su CD3-CD4- per identificare CD4e linfociti T (Figura 3E). Infine, IFN-γ e IL-17 sono stati utilizzati per identificare i sottoinsiemi Th1 e Th17 e valutare l'effetto funzionale in base alle citochine effettore (Figura 3F). Secondo la gravità clinica della malattia, i risultati rappresentativi hanno mostrato che le cellule Th1 e Th17 che producono IFN-γ- producono Th1 e IL-17 - sono aumentate significativamente nelle cellule encefalogene dei topi EAE.
| Grado | Segno clinico |
| 0 | nessuna malattia |
| 1 | diminuzione del tono della coda o andatura leggermente goffa |
| 2 | coda atony e moderatamente goffo andatura e / o scarsa capacità di righting |
| 3 | debolezza degli arti |
| 4 | paralisi degli arti |
| 5 | stato moribondo. |
Tabella 1: Sistema di punteggio clinico. I topi C57BL/6 sono stati immunizzati con il peptide MOG35-55. Poi, sono stati registrati segni neurologici. Per valutare la gravità dell'EAE è stato utilizzato un sistema di punteggio a 5 punti.
Figura 1: Schema dell'impostazione del gradiente Percoll per l'isolamento delle celle mononucleari. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Corso rappresentativo del SEE. L'EAE è stato indotto nei topi C57BL/6 per iniezione di MOG35–55, come descritto nel protocollo. Il punteggio clinico (A) e il cambiamento del peso corporeo (B) sono stati determinati in questi topi. I dati sono presentati come ± SEM; n 8 per ogni gruppo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi rappresentativa della citometria del flusso dei linfociti nel cervello. Una sospensione di un solo cellula è stata isolata dal cervello nel picco dell'EAE. Viene mostrata la strategia gating dei linfociti T. Le single sono state recintate come FSC-A contro FSC-H e SSC-A contro SSC-H (A,B). Le cellule vive sono state recintate come FSC-A contro SSC-A (C). I leucociti, esclusi i monociti, sono stati recintati come CD45- CD11b- (D). CD4- I linfociti T sono stati recintati come CD3,CD4 (E). I sottoinsiemi Th1 e Th17 sono stati recintati come IFN-γe IL-17+ (F). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio presenta un protocollo per indurre e monitorare l'EAE utilizzando MOG35-55 nei topi C57BL/6, che sono considerati un tipico modello animale sperimentale neuroimmunico della MS. Ad esempio, l'uso di peptidi PLP139–151 nei topi SJL può indurre un corso di malattia EAE recidivante che è particolarmente adatto per valutare gli effetti terapeutici sulle ricadute15. La procedura sperimentale qui descritta può essere applicata anche ad altri protocolli EAE7. In questo modello, i topi C57BL/6 sono immunizzati con peptide MOG35-55 e sviluppano una malattia monofasica. Un sistema di punteggio a 5 punti viene utilizzato per valutare la gravità dell'EAE. Anche se diversi sistemi di punteggio che vanno da 0-3 punti o 0-10 punti sono impiegati per segnare la gravitàdella malattia 7,16,17, questi risultati mostrano che un sistema di punteggio di 5 punti è in grado di determinare differenze statisticamente significative nei punteggi delle malattie tra i gruppi e altri sistemi di punteggio EAE non portano a miglioramenti evidenti.
La gravità EAE è generalmente valutata da un punteggio clinico EAE tenendo conto della gravità della disfunzioneneurologica 11,13. Per garantire la comparabilità dell'esperimento per tutti i topi, è importante tenerli alle stesse condizioni, compresi i cambiamenti di gabbia, la somministrazione di cibo e acqua, e in particolare le condizioni di alloggiamento dei topi. Inoltre, l'immunizzazione incrociata deve essere eseguita anche per evitare fenomeni specifici della gabbia indotti dallo sperimentatore.
Questo studio fornisce un metodo per separare le cellule mononucleari dal SNC che è adatto per l'analisi FACS o studio funzionale. Per garantire che il sangue venga rimosso dal tessuto CNS, i topi devono essere perfusi prima di dissociare il tessuto. La purificazione delle cellule mononucleari su una centrifugazione di gradiente di densità è un passo chiave nell'isolamento. Per garantire un effetto di separazione, l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga devono essere impostate rispettivamente su 1 e 0. Utilizzando questo metodo, le rese delle singole cellule sono solitamente basse dal cervello normale, ma più alte dal cervello masope con EAE. I risultati rappresentativi mostrano che c'è un evidente aumento dei linfocitiCD3, CD4 e T, in particolare le cellule che producono IFN-γ e le cellule che producono IL-17, che sono considerate contribuire al peggioramento della malattia.
Esistono alcune limitazioni di questo protocollo. Il modello EAE indotto con MOG35-55 mostra principalmente una rispostaimmunologica basata sulle cellule T CD4. Se è necessario analizzare ilruolo delle cellule CD8 e T e delle cellule B, è necessario considerare i protocolli alternativi. Come malattia infiammatoria del SNC, un fenotipo patologico grave si trova anche nel midollo spinale nel modello EAE. Tuttavia, a causa della presenza di grandi quantità di mielina, è difficile ottenere abbastanza singole cellule dal midollo spinale per l'analisi FACS. In tal caso, è necessario utilizzare l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza per analizzare il tessuto del midollo spinale. Ci sono anche ricercatori che mettono insieme il cervello e il midollo spinale per separare le cellule mononucleari per l'analisi FACS12. Questo protocollo separa singole cellule dal cervello per l'analisi FACS e il tessuto del midollo spinale per l'immunohistochimica e l'analisi dell'immunofluorescenza.
L'importanza dei linfociti T nella regolazione immunitaria della SM e dell'EAE ha ricevuto di recente un'attenzione sempre maggiore. Gran parte della letteratura pubblicata si concentra sulla milza e sui linfonodi11; tuttavia, i linfociti si trovano in tutto il SNC dei topi EAE e, quindi, è necessaria l'analisi caratteristica dei linfociti T nel SNC. La colorazione immunosologica delle sezioni può identificare le cellule infiltranti nel SNC. Tuttavia, l'analisi fenotipico e funzionale è limitata. Dopo l'isolamento delle cellule immunitarie dal SNC di topi normali o mati, l'analisi di fenotipi più dettagliati diventa possibile. Con questo metodo, i linfociti T nel cervello possono essere studiati cellule per cellula, e l'espressione di diversi marcatori superficiali, citochine, chemiochini e fattori di trascrizione (ad esempio, proteine intracellulari) può essere analizzata meglio. Il protocollo sarà utile per studi futuri per valutare il fenotipo e la funzione dei linfociti T nel cervello durante il corso di SM ed EAE.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (31570921 a ,J, 81571533 a LS), dalla Commissione Municipale di Pianificazione Della Salute di Shanghai e dalla Pianificazione Familiare (201540206 a J), dalla sovvenzione per la ricerca del Ruijin Hospital North (dal 2017 alla J).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
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