Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Published: November 17, 2020 doi: 10.3791/61050

Summary

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å indusere aktiv eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) hos mus. En metode for isolasjon og karakterisering av infiltrerte lymfocytter i sentralnervesystemet (CNS) presenteres også for å vise hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Abstract

Multippel sklerose (MS) er en autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) forårsaket av kombinasjonen av miljøfaktorer og mottakelig genetisk bakgrunn. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en typisk sykdomsmodell av MS som er mye brukt til å undersøke patogenesen der T-lymfocytter spesifikke for myelinantigener initierer en inflammatorisk reaksjon i CNS. Det er svært viktig å vurdere hvordan lymfocytter i CNS regulerer utviklingen av sykdommen. Imidlertid er tilnærmingen for å måle mengden og kvaliteten på infiltrerte lymfocytter i CNS svært begrenset på grunn av vanskelighetene med å isolere og oppdage infiltrerte lymfocytter fra hjernen. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for det som er nyttig for isolasjon, identifisering og karakterisering av infiltrerte lymfocytter fra CNS og vil være nyttig for vår forståelse av hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Introduction

Som en kronisk demyeliniserende sykdom i CNS påvirker MS ca. 2,5 millioner mennesker over hele verden og mangler kurative behandlinger1. Det regnes også som en autoimmun sykdom, hvor myelinantigenspesifikke T-lymfocytter initierer en inflammatorisk reaksjon og fører til demyelinasjon og axonal skade i CNS2. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) har blitt mye brukt til å undersøke patogene mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelinasjonssykdomsmodell i CNS3. Det er to måter å indusere EAE: en er å indusere EAE aktivt ved å immunisere dyr med myelinkomponenter, en annen er adoptivoverføring ved å overføre encefalitogene T-celler tilreseptor 2,,4,,5. Følsomheten for EAE er forskjellige i forskjellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus induserer myelin oligodendrocyttglykoprotein (MOG) 35–55-utfordring en monofasisk sykdom med omfattende demyelinasjon og betennelse i CNS, som ofte brukes i eksperimenter med genmålrettede mus7.

Genereringen av myelinspesifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og utvikling av sykdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverte autoreaktive T-lymfocytter krysser blodhjernsbarrieren (BBB) inn i den sunne CNS og initierer EAE-sykdommen. Når MOG 35–55 Ag oppstår, induserer disse T-lymfocytene betennelse og rekruttering av effektorceller til CNS, noe som resulterer i demyelinasjon og aksonødeleggelse8,9. I EAE-modellen er det rikelig med bevis for at nevroantigenspesifikke CD4+ T-celler kan initiere og opprettholde nevroinflammasjon og patologi3,10. Avhengig av de store cytokinene som produseres, har CD4+ T-lymfocytter blitt klassifisert i forskjellige undergrupper: Th1 (preget av produksjon av interferon-γ), Th2 (preget av produksjon av interleukin 4), og Th17 (preget av produksjon av interleukin 17). Det antas at aktivering av Th1 og Th17 celler bidra til induksjon, vedlikehold og regulering av inflammatorisk demyelination i EAE og MS ved å skille ut effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til å aktivere makrofager og rekruttere nøytrofiler til de inflammatoriske stedene for å akselererelesjonene 11.

Fordi autoreaktive T-celler krysser BBB inn i CNS og induserer utviklingen av sykdom i MS og EAE, er det svært viktig å analysere T-celler i CNS. Det er imidlertid svært få etablerte protokoller for isolering av lymfocytter fra CNS12. Derfor ble en metode optimalisert for å isolere mononukleære celler fra hjernen og analysere T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for strømningscytometri utviklet. Metoden bruker MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra og Pertussis Toxin Working Solution (PTX) for å indusere en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos mus. Deretter brukes mekanisk separasjon og tetthet gradient sentrifugeringsmetoder for isolering av CNS mononukleære celler. Til slutt brukes en optimalisert strømningscytometri gating strategi for å identifisere T-lymfocytter og undergrupper fra hjernen ved å farge flere markører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av dyrekomiteen ved School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.

1. Utarbeidelse av materialene

  1. Bruk MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 for å få lyofilisert peptid fra kommersielle kilder. Kontroller at renheten på peptiden er >95%. Forbered 10 mg/ml MOG lageroppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS) og oppbevar ved -20 °C.
  2. Forbered en 4 mg/ml lagerløsning av M. tuberkulose H37 Ra ved å sette ett 100 mg rør med M. tuberkulose H37 Ra i 25 ml komplett Freunds Adjuvant (CFA) og blanding. Oppbevar lageroppløsningen ved -20 °C.
  3. Forbered 1 ng/μL Kikhostetoksinarbeidsløsning (PTX) ved å tilsette 50 μg PTX i 50 ml PBS. Oppbevar arbeidsløsningen ved -20 °C.
  4. Oppbevar alle antistoffer (det vil si FITC anti-mus CD3, PE/Cy7 anti-mus CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mus CD11b, Alexa Fluor700 anti-mus CD45.2, PE anti-mus IL-17A, og APC anti-mus IFN-γ) ved 4 ° C.
  5. Gjør Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer ved å legge til 2 mM etylendiamin tetraacetic acid (EDTA) og 1% fosterbovin serum (FBS) i 500 ml PBS.

2. Hus av C57BL/6 mus

  1. Bruk hunn C57BL/6 mus i alderen 8–12 uker.
  2. Akklimatisere C57BL/6J-mus i minst 7 dager før injeksjonen.
  3. Husmus i et dyreanlegg under patogene frie forhold ved konstant temperatur og fuktighet i en 12 h lys / mørk syklus og gir fri tilgang til vann og standard pelletmat.

3. Immunisering av C57BL/6 mus

  1. La alle lagerløsninger stå i 15 min ved romtemperatur (RT) for å sikre fullstendig rehydrering.
  2. Fortynn 300 μL MOG-peptid lageroppløsning med 700 μL PBS for tilberedning av 3 mg/ml arbeidsoppløsning.
  3. Sett 1 ml M. tuberkulose H37 Ra lagerløsning og 1 ml MOG35–55 peptider som arbeider oppløsning i separate 10 ml sprøyter, og bruk deretter en fireveis stoppkran for å emulgere i minst 10 min. Sørg for fullstendig emulgering før injeksjon.
  4. Bedøve mus på toppen av EAE med en intraperitonial injeksjon på 1 % natriumpentolog (50 mg/kg).
  5. Med en 1 ml sprøyte injiseres mus med 100 μL av en MOG 35–55/CFA-emulsjon (300 μg/200 μL) på to steder, begge bak nær halsen. Injiser subkutant kontrollmus med 200 μL PBS.
  6. På samme dag (dag 0) og på dag 2 postimmunisering (PI) injiserer Intraperitoneally mus med 200 μL på 1 ng/μL PTX arbeidsløsning. Injiser intraperitoneally kontrollmus med 200 μL PBS.
  7. Overfør musene til deres hjemmebur med en varmepute.
  8. Undersøk og vurder alle mus hver dag etter injeksjonen på en blindet måte for nevrologiske tegn vist i tabell 111,13. Euthanize dyrene hvis resultatene er verre enn klasse 4.
  9. Registrer vektendringene under sykdomsforløpet. Dette er et verdifullt tilleggsmål for sykdomsaktivitet i EAE-modellen11,13.
  10. Legg til den første dagen med kliniske tegn for individuelle mus og del med antall mus i gruppen; resultatet er utbruddet. Legg til den første dagen i maksimal EAE-poengsum for individuelle mus og del etter antall mus i gruppen; resultatet er toppen.

4. Encellede suspensjon forberedelse fra hjernen

  1. Fortynn tetthetsgradientmedium i 9:1-forhold med PBS i et konisk rør på 15 ml for å gi en endelig 100 % løsning.
  2. Bedøve mus på toppen av EAE med en intraperitonial injeksjon på 1% natriumpentolog (50 mg/kg) og perfuse intrakranielt med 20 ml steriliskald PBS. Oppnå dette ved sakte og jevnt å injisere PBS i venstre ventrikkel av hjertet ved hjelp av en 20 ml sprøyte og åpne høyre atrium.
  3. Skjær kraniet forsiktig fra nesen til nakken, og fjern deretter hjernen fra kranieboksen i 10 ml RPMI i 50 ml koniske rør. Bland godt for å fjerne tiltalende røde blodlegemer. Fjern deretter mediet ved aspirasjon og tilsett 10 ml RPMI.
  4. Legg hjernen og mediet i en 100 mm tallerken. Finhakk med barberblad.
  5. Overfør 6 ml fra fatet til en iskald 7 ml sintret glasshomogenisator med en ren pipette. Unngå å etterlate store mengder vev i pipetten. En liten mengde er uunngåelig.
  6. Grind hjernen ved hjelp av det "løse" stempelet av pestle først, bruk deretter det "stramme" stempelet til suspensjonen er homogen, og hell i et prechilled 15 ml konisk rør og hold på is.
  7. Etter at alle prøvene er homogenisert, estimere volumet. Juster volumet med RPMI til 7 ml. Plasser deretter 3 ml iskald 100% kjellermembranmatrise i et kjølt 15 ml konisk sentrifugerør og tilsett 7 ml hjernehomogenat for å gi et endelig 30% tetthetsgradientmedium. Bland ved inversjon et par ganger. Ikke vortex.
  8. For å sikre et skarpt grensesnitt, legg forsiktig og sakte til 1 ml 70% underlagt tetthetsgradientmedium i RPMI med en 3 ml pipette.
  9. Sentrifuge ved 800 x g i bare 20 min ved 4 °C. Sett akselerasjonen til 1 og retardasjon til 0. Etter sentrifugering aspirerer nesten hele toppfasen, vær forsiktig med å fjerne myelinen helt øverst (figur 1).
  10. Fjern grensesnittet i et nytt 15 sentrifugerør. Juster volumet til 10 ml med RPMI.
  11. Sentrifuge ved 500 x g i 10 min. Etter sentrifugering, aspirerer det overnaturante. Resuspend pellet i ~ 200 μL av strømningscytometri farging (FSC) buffer. Pellets er da klar til å flekke for FACS.

5. Flow cytometrisk analyse av enkeltceller fra hjernen

  1. Bruk et hemocytometer og mikroskop for å telle cellene. Tilsett 10 μL av cellene til 10 μL trypan blå, bland godt og legg 10 μL på et hemocytometer for å telle cellene. Beregn deretter antall levende celler per mikroliter under et omvendt mikroskop (f.eks. Olympus invertert mikroskop).
  2. Aliquot ca 2 x 106 av cellene i RPMI i en enkelt brønn av en 96 brønnplate.
  3. Tilsett 500x cellestimulering cocktail pluss protein transporthemmere til brønnene.
  4. Inkuber platen i inkubatoren ved 37 °C i 4 timer.
  5. Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten og gjenoppuss cellene i 100 μL fcs buffer.
  6. Forhåndsdeikusjon cellene med anti-mus CD16/CD32 Fc blokk (1:33) for 10 min ved 4 °C før farging for å blokkere uspesifikke Fc-medierte interaksjoner.
  7. Flekkcelleoverflatemarkører uten vask. Legg til anti-mus CD45.2 (1:200), anti-mus CD11b (1:200), anti-mus CD3 (1:200) og anti-mus CD4 (1:200) antistoffer.
    MERK: For å bestemme positive og negative porter, bør en fluorescens minus en (FMO) for hver farge og et isotypekontrollantistoff være farget.
  8. Inkuber platen i minst 30 min ved 4 °C eller på is. Beskytt mot lys.
  9. Vask cellene ved å legge til FCS Buffer. Bruk 200 μL/brønn for mikrotiterplater. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
  10. Tilsett 200 μL intracellulær (IC) fikseringsbuffer til hver brønn for å fikse cellene. Sørg for at cellene er helt resuspended i løsningen.
  11. Inkuber 30–60 min ved RT. Beskytt mot lys.
  12. Sentrifuger prøvene ved 400 x g ved RT i 5 min. Kast det overnaturlige.
  13. Tilsett 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønn og sentrifuge prøvene ved 400 x g ved RT i 5 min. Kast det overnaturlige.
  14. Gjenbruk pelleten i restvolum og juster volumet til ca. 100 μL med 1x permeabiliseringsbuffer.
  15. Legg anti-mus IL-17A (1:200) og anti-mus IFN-g (1:200) antistoffer for påvisning av intracellulære antigener til celler.
  16. Inkuber i minst 30 min ved 4 °C. Beskytt mot lys.
  17. Tilsett 100 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønn og sentrifuge prøvene ved 400 x g ved RT i 5 min. Kast det overnaturlige.
  18. Resuspend de beisede cellene i 100 μL av strømningscytometri farging buffer.
  19. Analyser med strømningscytometri.
    MERK: Laser- og kompensasjonsinnstillingene på strømningssytometeret justeres, prøvene plasseres på cytometeret, og alle hendelser registreres i henhold til produsentens anbefalinger.

6. Dataanalyse

  1. Gate singlets ved hjelp av FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs. SSC-H.
  2. Gate levende celler ved hjelp av FSC-A og SSC-A basert på størrelse.
  3. Deretter identifiserer du leukocytter, unntatt monocytter, ved gating på CD45+ CD11b- celler.
  4. Deretter identifiserer du CD4 T-lymfocytter ved å giting på CD3 + CD4 + celler.
  5. Til slutt, identifisere Th1 og Th17 undergrupper ved gating på IFN-γ + celler og IL-17 + celler separat, og bestemme de positive og negative populasjoner ved hjelp av isotype kontroller og FMO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter immunisering av C57BL/6-mus ble alle mus veid, undersøkt og gradert daglig for nevrologiske tegn. Det representative kliniske løpet av EAE bør resultere i en sykdomskurve som presentert i figur 2A og en endring av kroppsvekt i musen som presentert i figur 2B. C57BL/6-mus immunisert med MOG35-55 begynte vanligvis å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10–12 og oppnådde sykdomstoppen rundt dag 15–21 etter aktiv immunisering (figur 2A). Vektendring var en verdifull indikator i EAE-modellen. Før sykdomsutbruddet økte kroppsvekten til immuniserte mus gradvis, og reduserte vanligvis korrelering av de økende sykdomssymptomene. På toppen av EAE viste mus også den laveste kroppsvekten (figur 2B). Deretter kroppsvekt gjenopprettet litt som kliniske symptomer redusert. Musene ble imidlertid vanligvis ikke helt gjenopprettet. C57BL/6 mus utviklet en monofasisk kronisk sykdomspatologi ved MOG35-55 utfordring (figur 2A).

Den kliniske alvorlighetsgraden av EAE er direkte forbundet med autoreaktiv T-celleaktivering14. Neuroantigen-spesifikke CD4+ T-celler er i stand til å initiere og opprettholde nevroinflammasjon og patologi i EAE3. De typiske egenskapene til CD4+T-celler i toppen av EAE er vist i figur 3. Videre ble andelen av Th1- og Th17-undergrupper i encefalitogene celler, som er de viktigste patogene cellene som medierer EAE, analysert av strømningscytometri. Etter separasjonen av en encellede suspensjon fra hjernen, ble cellene farget med CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ og IL-17 antistoffer, som uttrykkes av T-lymfocytter. FSC-A vs. FSC-H og SSC-A vs. SSC-H ble brukt til å gate singlets (Figur 3A, B), deretter FSC-A vs. SSC-A ble brukt til å gate levende celler basert på størrelse og detaljnivå (Figur 3C). Etter, CD45+ CD11b- celler ble inngjerdet for å identifisere leukocytter unntatt monocytter (Figur 3D). Deretter ble porten satt på CD3 + CD4+for å identifisere CD4+ T lymfocytter (figur 3E). Til slutt ble IFN-γ og IL-17 brukt til å identifisere Th1- og Th17-undergrupper og vurdere den funksjonelle effekten i henhold til effektorcytokiner (figur 3F). Ifølge den kliniske alvorlighetsgraden av sykdommen viste representative resultater at IFN-γ-produserende Th1 og IL-17-produserende Th17-celler økte betydelig i encefalitogene celler fra EAE-mus.

Klasse Klinisk tegn
0 ingen sykdom
1 redusert haletone eller litt klønete gangart
2 haletony og moderat klønete gangart og/eller dårlig rettingsevne
3 svakhet i lemmer
4 lammelse av lemmer
5 moribund tilstand.

Tabell 1: Klinisk poengsystem. C57BL/6-mus ble vaksinert med PEPTIDET MOG35–55. Deretter ble nevrologiske tegn registrert. Et 5-punkts poengsystem ble brukt til å vurdere alvorlighetsgraden av EAE.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av Percoll gradient oppsett for isolering av mononukleære celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt kurs i EAE. EAE ble indusert i C57BL/6 mus ved injeksjon av MOG35–55 som beskrevet i protokollen. Den kliniskeskåren( A ) og endring av kroppsvekt (B) ble bestemt hos disse musene. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM; n = 8 for hver gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ flytcytometrianalyse av lymfocytter i hjernen. En encellede suspensjon ble isolert fra hjernen i toppen av EAE. Gating strategien for T-lymfocytter er vist. Singlets ble inngjerdet som FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs SSC-H (A,B). Levende celler ble inngjerdet som FSC-A vs. SSC-A (C). Leukocytter unntatt monocytter ble inngjerdet som CD45+ CD11b- (D). CD4+ T-lymfocytter ble inngjerdet som CD3+CD4+ (E). Th1 og Th17 undergrupper ble inngjerdet som IFN-γ+ og IL-17+ (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien presenterer en protokoll for å indusere og overvåke EAE ved hjelp av MOG35-55 i C57BL/6 mus, som regnes som en typisk nevroimmunologisk eksperimentell dyremodell av MS. EAE kan induseres varierende musstammer eller type protein som brukes til induksjon i henhold til formålet med studien. For eksempel kan bruk av PLP139-151 peptid hos SJL-mus indusere et residerende remitteringskurs for EAE-sykdom som er spesielt egnet for å vurdere terapeutiske effekter på tilbakefall15. Den eksperimentelle prosedyren som er skissert her, kan også brukes på andre EAE-protokoller7. I denne modellen vaksineres C57BL/6 mus med MOG35–55 peptid og utvikler en monofasisk sykdom. Et 5-punkts poengsystem brukes til å vurdere alvorlighetsgraden av EAE. Selv om flere poengsystemer fra 0–3 poeng eller 0–10 poeng er brukt til å scoresykdomsalvorlighetsgrad 7,16,17– viser disse resultatene at et 5-poengs poengsystem er i stand til å fastslå statistisk signifikante forskjeller i sykdomsscore mellom grupper og andre EAE-poengsystemer fører ikke til en åpenbar forbedring.

EAE-alvorlighetsgraden evalueres vanligvis av en klinisk EAE-skår med hensyn til alvorlighetsgraden av nevrologiskdysfunksjon 11,,13. For å sikre sammenlignbarheten av eksperimentet for alle mus, er det viktig å holde dem under samme forhold, inkludert endringer i bur, administrering av mat og vann, og spesielt musehusforhold. I tillegg bør kryssimmunisering også utføres for å unngå burspesifikke fenomener indusert av utprøveren.

Denne studien gir en metode for å skille mononukleære celler fra CNS som er egnet for FACS analyse eller funksjonell studie. For å sikre at blodet fjernes fra CNS-vevet, bør musene perfunderes før de dissosierer vevet. Rensingen av de mononukleære cellene på en tetthet gradient sentrifugering er et viktig skritt i isolasjonen. For å sikre en separasjonseffekt bør akselerasjonen og retardasjonen av sentrifugen settes til henholdsvis 1 og 0. Ved hjelp av denne metoden er enkeltcelleutbyttene vanligvis lave fra normal hjerne, men høyere fra syk hjerne med EAE. Representative resultater viser at det er en åpenbar økning i CD3+CD4+ T-lymfocytter, spesielt IFN-γ produserende celler og IL-17 produserende celler, som anses å bidra til den forverrede sykdommen.

Det er noen begrensninger i denne protokollen. EAE-modellen indusert med MOG35–55 viser hovedsakelig en CD4+ T celledrevet immunologisk respons. Hvis rollen som CD8+ T-celler og B-celler må analyseres, bør alternative protokoller vurderes. Som en CNS inflammatorisk sykdom finnes en alvorlig patologisk fenotype også i ryggmargen i EAE-modellen. Men på grunn av tilstedeværelsen av store mengder myelin, er det vanskelig å få nok enkeltceller fra ryggmargen for FACS-analyse. I så fall er det nødvendig med immunohistokjemi eller immunofluorescence for å analysere ryggmargsvev. Det er også forskere som setter hjernen og ryggmargen sammen for å skille mononukleære celler for FACS analyse12. Denne protokollen skiller enkeltceller fra hjernen for FACS analyse og ryggmargsvev for immunohistochemistry og immunofluorescence analyse.

Betydningen av T-lymfocytter i immunregulering av MS og EAE har fått mer og mer oppmerksomhet nylig. Mye av den publiserte litteraturen fokuserer på milt og lymfeknuter11; Imidlertid finnes lymfocytter gjennom CNS av EAE-mus, og dermed er den karakteristiske analysen av T-lymfocytter i CNS nødvendig. Immunohistologisk farging av seksjoner kan identifisere infiltrerende celler i CNS. Imidlertid er fenotypisk og funksjonell analyse begrenset. Etter isolering av immuncellene fra CNS av normale eller syke mus, blir analysen av mer detaljerte fenotyper mulig. Med denne metoden kan T-lymfocytter i hjernen studeres på celle-for-celle-basis, og uttrykket av forskjellige overflatemarkører, cytokiner, chemokiner og transkripsjonsfaktorer (f.eks. intracellulære proteiner) kan analyseres bedre. Protokollen vil være nyttig for fremtidige studier for å vurdere fenotypen og funksjonen til T-lymfocytter i hjernen i løpet av MS og EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China stipend (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, og Familieplanlegging (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningsstipend (2017ZX01 til ZJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 165 multippel sklerose MS eksperimentell autoimmun encefalomyelitt EAE autoimmun sykdom sentralnervesystemet CNS T-lymfocytt strømningscytometri
Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., More

Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter