Summary
Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.
Abstract
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central (SNC) causada por la combinación de factores ambientales y antecedentes genéticos susceptibles. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad típico de la EME ampliamente utilizado para investigar la patogénesis en la que los linfocitos T específicos para los antígenos de mielina inician una reacción inflamatoria en el SNC. Es muy importante evaluar cómo los linfocitos en el SNC regulan el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, el enfoque para medir la cantidad y calidad de los linfocitos infiltrados en el SNC es muy limitado debido a las dificultades para aislar y detectar linfocitos infiltrados del cerebro. Este manuscrito presenta un protocolo para el cual es útil para el aislamiento, identificación y caracterización de linfocitos infiltrados del SNC y será útil para nuestra comprensión de cómo los linfocitos están involucrados en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.
Introduction
Como enfermedad desmielinizante crónica del SNC, la SME afecta a unos 2,5 millones de personas en todo el mundo y carece de tratamientos curativos1. También se considera una enfermedad autoinmune, en la que los linfocitos T específicos del antígeno de mielina inician una reacción inflamatoria y conducen a la desmielinización y lesión axonal en el SNC2. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) se ha utilizado ampliamente para investigar mecanismos patógenos de la EME como un modelo clásico de la enfermedad de desmielinización autoinmune en el SNC3. Hay dos maneras de inducir EAE: una es inducir EAE activamente inmunizando animales con componentes de mielina, otra es la transferencia adoptiva mediante la transferencia de células T encefalitgénicas al receptor2,4,5. Las susceptibilidades a EAE son diferentes en diferentes cepas animales6. En ratones C57BL/6, el desafío de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) 35–55 induce una enfermedad monofásica con desmielinización e inflamación extensas en el SNC, que se utiliza con frecuencia en experimentos con ratones dirigidos a genes7.
La generación de células T reactivas específicas de mielina es necesaria para la aparición y el desarrollo de la enfermedad en EAE y es un signo inmunológico de EAE y MS. Los linfocitos T autoreactivos activados cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) hacia el SNC sano e inician la enfermedad de EAE. Cuando se encuentra MOG 35–55 Ag, estos linfocitos T inducen inflamación y el reclutamiento de células efectores en el SNC, lo que resulta en desmielinización y destrucción de axones8,,9. En el modelo EAE, hay una amplia evidencia de que las células CD4+ T específicas de neuroantigen pueden iniciar y sostener la neuroinflamación y la patología3,,10. Dependiendo de las principales citoquinas producidas, los linfocitos CD4+ T se han clasificado en diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado por la producción de interferón-γ), Th2 (caracterizado por la producción de interleucina 4), y Th17 (caracterizado por la producción de interleucina 17). Se cree que la activación de las células Th1 y Th17 contribuyen a la inducción, mantenimiento y regulación de la desmielinización inflamatoria en EAE y EM mediante el secretamiento de las citoquinas efectoras IFN-γ e IL-17, que son capaces de activar macrófagos y reclutar neutrófilos a los sitios inflamatorios para acelerar las lesiones11.
Debido a que las células T autorreactivas cruzan el BBB hacia el SNC e inducen el desarrollo de la enfermedad en la EMA y eas, es muy importante analizar las células T en el SNC. Sin embargo, hay muy pocos protocolos establecidos para el aislamiento de linfocitos del SNC12. Por lo tanto, se desarrolló un método optimizado para aislar células mononucleares del cerebro y analizar linfocitos T con marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para la citometría de flujo. El método utiliza la solución de trabajo Mycobacterium tuberculosis de toxinas de perersis (PTX) adyuvante MOG35–55 para inducir un modelo de inmunización activa de EAE en ratones. Luego, los métodos de separación mecánica y centrifugación de gradiente de densidad se utilizan para el aislamiento de células mononucleares del SNC. Por último, se utiliza una estrategia de medición de citometría de flujo optimizada para identificar linfocitos T y subconjuntos del cerebro mediante la tinción de múltiples marcadores.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el comité animal de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Shanghai Jiao Tong University.
1. Preparación de los materiales
- Utilice la secuencia MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35–55 para obtener el péptido liofilizado de fuentes comerciales. Asegúrese de que la pureza del péptido es >95%. Preparar 10 mg/ml de solución en stock de MOG en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y almacenar a -20 oC.
- Preparar una solución de 4 mg/ml en stock de M. tuberculosis H37 Ra poniendo un tubo de 100 mg de M. tuberculosis H37 Ra en 25 ml de adyuvante completo de Freund (CFA) y mezclando. Almacene la solución de stock a -20 oC.
- Preparar 1 ng/L Solución de Trabajo de Toxinas (PTX) añadiendo 50 g de PTX en 50 mL de PBS. Almacene la solución de trabajo a -20 oC.
- Almacene todos los anticuerpos (es decir, EL DR3 antiratón FITC, PE/Cy7 antiratón CD4, PerCP/Cy5.5 antiratón CD11b, Alexa Fluor700 antiratón CD45.2, PE antiratón IL-17A y APC antiratón IFN-γ) a 4 oC.
- Haga que la Tinción de Citometría de Flujo (FCS) Tampón añadiendo 2 mM de ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA) y 1% de suero bovino fetal (FBS) en 500 mL de PBS.
2. Carcasa de ratones C57BL/6
- Utilice ratones hembra C57BL/6 a las 8–12 semanas de edad.
- Aclimate C57BL/6J ratones durante al menos 7 días antes de la inyección.
- Ratones domésticos en una instalación animal bajo condiciones libres de patógenos a temperatura y humedad constantes en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y proporcionan acceso gratuito al agua y a los alimentos estándar para pellets.
3. Inmunización de ratones C57BL/6
- Deje todas las soluciones de stock durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) para garantizar una rehidratación completa.
- Diluir 300 ml de solución en stock de MOG-péptido con 700 l de PBS para preparar una solución de trabajo de 3 mg/ml.
- Poner 1 ml de solución de M. tuberculosis H37 Ra y 1 ml de solución de trabajo de péptidos MOG35–55 en jeringas separadas de 10 ml, luego utilizar un grifo de tope de cuatro vías para emulsionar durante al menos 10 minutos. Asegurar la emulsión completa antes de la inyección.
- Anestesia a los ratones en el pico de EAE con una inyección intraperitonial de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg).
- Con una jeringa de 1 ml, inyectar por vía subcutánea a ratones con 100 l de una emulsión MOG 35–55/CFA (300 g/200 l) en dos sitios, ambos en la parte posterior cerca del cuello. Inyectar por vía subcutánea ratones de control con 200 l de PBS.
- En el mismo día (día 0) y en el día 2 después de la inmunización (PI), inyectar por vía intraperitoneal a los ratones con 200 l de 1 ng/L de solución de trabajo PTX. Inyectar intraperitonealmente ratones de control con 200 ml de PBS.
- Transfiera los ratones a la jaula de su casa con una almohadilla de calentamiento.
- Examine y califique todos los ratones todos los días después de la inyección de forma cegada para los signos neurológicos que se muestran en la Tabla 111,13. Eutanasia a los animales si las puntuaciones son peores que el grado 4.
- Registre los cambios de peso durante el curso de la enfermedad. Esta es una medida adicional valiosa para la actividad de la enfermedad en el modeloEAE 11,13.
- Añadir el primer día de signos clínicos para ratones individuales y dividir por el número de ratones en el grupo; el resultado es el inicio. Añadir el primer día de la puntuación máxima EAE para ratones individuales y dividir por el número de ratones en el grupo; el resultado es el pico.
4. Preparación de suspensión de una sola célula del cerebro
- Diluir el medio de gradiente de densidad en relación 9:1 con PBS en un tubo cónico de 15 ml para producir una solución final del 100%.
- Anestesia a los ratones en el pico de EAE con una inyección intraperitonial de 1% pentobarbital sódico (50 mg/kg) y perfunde intracardialmente con 20 ml de PBS estéril helado. Para lograrlo, inyecte lenta y constantemente PBS en el ventrículo izquierdo del corazón con una jeringa de 20 ml y abriendo la aurícula derecha.
- Cortar el cráneo cuidadosamente de la nariz al cuello, luego quitar el cerebro de la caja craneal en 10 ml de RPMI en tubos cónicos de 50 ml. Mezclar bien para eliminar los glóbulos rojos adherentes. A continuación, retire el medio por aspiración y añada 10 ml de RPMI.
- Coloque el cerebro y el medio en un plato de 100 mm. Pica finamente con una cuchilla de afeitar.
- Transfiera 6 ml del plato a un homogeneizador de vidrio sinterado de 7 ml helado con una pipeta limpia. Evite dejar grandes cantidades de tejido en la pipeta. Una pequeña cantidad es inevitable.
- Moler el cerebro usando el émbolo "flojo" del pestle primero, luego utilizar el émbolo "apretado" hasta que la suspensión sea homogénea, y verter en un tubo cónico prechilled 15 mL y mantener en hielo.
- Después de homogeneizar todas las muestras, estime el volumen. Ajuste el volumen con RPMI a 7 mL. A continuación, coloque 3 ml de matriz de membrana sótano 100% helada en un tubo de centrífuga cónica refrigerado de 15 ml y agregue 7 ml de homogeneidad cerebral para producir un medio de gradiente de densidad final del 30%. Mezclar por inversión un par de veces. No vórtice.
- Para asegurar una interfaz nítida, agregue cuidadosamente y lentamente 1 ml de 70% de medio de gradiente de densidad subyacente en RPMI con una pipeta de 3 ml.
- Centrifugar a 800 x g durante sólo 20 min a 4oC. Establezca la aceleración en 1 y la desaceleración en 0. Después de la centrifugación, aspirar casi toda la fase superior, teniendo cuidado de eliminar completamente la mielina en la parte superior (Figura 1).
- Retire la interfaz en un nuevo tubo de 15 centrífugas. Ajuste el volumen a 10 ml con RPMI.
- Centrífuga a 500 x g durante 10 min. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 200 l de tampón de tinción de citometría de flujo (FSC). Los pellets están listos para manchar para FACS.
5. Análisis citométrico de flujo de células individuales del cerebro
- Utilice un hemocitociómetro y un microscopio para contar las células. Agregue 10 l de las células a 10 l de azul tripano, mezcle bien y coloque 10 l en un hemocitoómetro para contar las células. A continuación, calcule el número de células vivas por microlitro bajo un microscopio invertido (por ejemplo, microscopio invertido Olympus).
- Aliquot aproximadamente 2 x 106 de células en RPMI en un solo pozo de una placa de 96 pozos.
- Añadir 500x cóctel de estimulación celular más inhibidores de transporte de proteínas a los pozos.
- Incubar la placa en la incubadora a 37oC durante 4 h.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 l de búfer FCS.
- Preincucha las células con bloque antiratón CD16/CD32 Fc (1:33) durante 10 min a 4 oC antes de manchar para bloquear interacciones mediadas por Fc inespecíficos.
- Manche los marcadores de la superficie celular sin lavarse. Agregue CD45.2 antiratón (1:200), CD11b antiratón (1:200), CD3 antiratón (1:200) y anticuerpos CD4 antiratón (1:200).
NOTA: Para determinar las puertas positivas y negativas, se debe teñir una fluorescencia menos una (FMO) para cada color y un anticuerpo de control de isotipo. - Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 4oC o sobre hielo. Proteger de la luz.
- Lave las células agregando el búfer FCS. Utilice 200 l/pozo para placas de microtíter. Centrifugar a 400 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
- Agregue 200 l de búfer de fijación intracelular (IC) a cada pocóver para fijar las celdas. Asegúrese de que las células estén completamente resuspendidas en la solución.
- Incubar 30–60 min en RT. Proteger de la luz.
- Centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 200 l de 1x tamplización de permeabilización a cada pocóter y centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el pellet en volumen residual y ajustar el volumen a aproximadamente 100 l con 1x tampabilización.
- Agregue anticuerpos antiratón IL-17A (1:200) y antiratón IFN-g (1:200) para la detección de antígenos intracelulares a las células.
- Incubar durante al menos 30 min a 4oC. Proteger de la luz.
- Añadir 100 l de 1x tamplización de permeabilización a cada pocóter y centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender las células manchadas en 100 l de tampón de tinción de citometría de flujo.
- Analizar por citometría de flujo.
NOTA: Los ajustes de láser y compensación en el citómetro de flujo se ajustan, las muestras se colocan en el citómetro y todos los eventos se registran según las recomendaciones del fabricante.
6. Análisis de datos
- Singlets de puerta que utilizan FSC-A frente a FSC-H y SSC-A frente a SSC-H.
- Puerta de celdas vivas utilizando FSC-A y SSC-A en función del tamaño.
- A continuación, identifique los leucocitos, excluyendo los monocitos, mediante el gating en CD45+ CD11b- células.
- A continuación, identifique los linfocitos CD4 T mediante el gating en células CD3+CD4+.
- Por último, identifique los subconjuntos Th1 y Th17 mediante el gating en celdas IFN-γ+ y células IL-17+ por separado, y determine las poblaciones positivas y negativas utilizando controles de isotipo y FMO.
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Representative Results
Después de la inmunización de ratones C57BL/6, todos los ratones fueron pesados, examinados y clasificados diariamente en busca de signos neurológicos. El curso clínico representativo de EAE debe dar lugar a una curva de la enfermedad como se presenta en la Figura 2A y un cambio de peso corporal en el ratón como se presenta en la Figura 2B. Los ratones C57BL/6 inmunizados con MOG35-55 generalmente comenzaron a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededor del día 10-12 y alcanzaron el pico de la enfermedad alrededor del día 15–21 después de la inmunización activa (Figura 2A). El cambio de peso fue un indicador valioso en el modelo EAE. Antes de la aparición de la enfermedad, el peso corporal de los ratones inmunizados aumentó gradualmente, y luego, por lo general, disminuyó la correlación con el aumento de los síntomas de la enfermedad. En el pico de EAE, los ratones también mostraron el peso corporal más bajo (Figura 2B). Luego, el peso corporal se recuperó ligeramente a medida que disminuyeron los síntomas clínicos. Sin embargo, los ratones generalmente no se recuperaron completamente. Los ratones C57BL/6 desarrollaron una patología monofásica de la enfermedad crónica tras el desafío MOG35–55 (Figura 2A).
La gravedad clínica de EAE se asocia directamente con la activación automática de células T14. Los células CD4+ T específicas de Neuroantigen son capaces de iniciar y mantener la neuroinflamación y la patología en EAE3. Las características típicas de las células CD4+T en el pico de EAE se muestran en la Figura 3. Además, la proporción de subconjuntos Th1 y Th17 en células encefalogénicas, que son las principales células patógenas que median EAE, fue analizada por citometría de flujo. Después de la separación de una suspensión de una sola célula del cerebro, las células se mancharon con anticuerpos CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ e IL-17, que son expresados por linfocitos T. FSC-A frente a FSC-H y SSC-A frente a SSC-H se utilizaron para gatear singlets(Figura 3A, B),luego FSC-A frente a SSC-A se utilizaron para cercar células vivas basadas en el tamaño y la granularidad (Figura 3C). Después, CD45+ CD11b- las células fueron cerradas para identificar leucocitos excluyendo monocitos (Figura 3D). A continuación, la puerta se fijó en CD3+CD4+ para identificar linfocitos CD4+ T (Figura 3E). Por último, se utilizaron IFN-γ e IL-17 para identificar subconjuntos Th1 y Th17 y evaluar el efecto funcional de acuerdo con las citoquinas efectores (Figura 3F). Según la gravedad clínica de la enfermedad, los resultados representativos mostraron que IFN-γ,produciendo Células Th1 e IL-17-produciendo células Th17 aumentaron significativamente en las células encefalitógenas de ratones EAE.
| Grado | Signo clínico |
| 0 | ninguna enfermedad |
| 1 | disminución del tono de la cola o marcha ligeramente torpe |
| 2 | atonía de cola y marcha moderadamente torpe y/o pobre capacidad de enredete |
| 3 | debilidad de las extremidades |
| 4 | parálisis de las extremidades |
| 5 | estado moribundo. |
Tabla 1: Sistema de puntuación clínica. Los ratones C57BL/6 fueron inmunizados con el péptido MOG35-55. Luego, se registraron signos neurológicos. Se utilizó un sistema de puntuación de 5 puntos para evaluar la gravedad de EAE.
Figura 1: Esquema de la configuración del degradado Percoll para el aislamiento de celdas mononucleares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curso representativo de EAE. EAE fue inducido en ratones C57BL/6 por inyección de MOG35–55 como se describe en el protocolo. La puntuación clínica (A) y el cambio de peso corporal (B) se determinaron en estos ratones. Los datos se presentan como la media ± SEM; n 8 para cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis representativo de citometría de flujo de linfocitos en el cerebro. Una suspensión de una sola célula fue aislada del cerebro en el pico de EAE. Se muestra la estrategia de gating de los linfocitos T. Los singlets fueron cerrados como FSC-A frente a FSC-H y SSC-A frente a SSC-H (A,B). Las células vivas fueron cerradas como FSC-A frente a SSC-A (C). Los leucocitos excluyendo los monocitos fueron cerrados como CD45+ CD11b- (D). Los linfocitos CD4+ T fueron cerrados como CD3+CD4+ (E). Los subconjuntos Th1 y Th17 fueron cerrados como IFN-γ+ e IL-17+ (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio presenta un protocolo para inducir y monitorear EAE utilizando MOG35-55 en ratones C57BL/6, que se consideran un modelo animal experimental neuroinmunológico típico de MS. EAE se puede inducir variando las cepas de ratones o el tipo de proteína utilizada para la inducción de acuerdo con el propósito del estudio. Por ejemplo, el uso de péptido PLP139–151 en ratones SJL puede inducir un curso de enfermedad eaE recurrente-remitante que es especialmente adecuado para evaluar los efectos terapéuticos en las recaídas15. El procedimiento experimental descrito aquí también se puede aplicar a otros protocolos EAE7. En este modelo, los ratones C57BL/6 se inmunizan con péptido MOG35–55 y desarrollan una enfermedad monofásica. Se utiliza un sistema de puntuación de 5 puntos para evaluar la gravedad de EAE. Aunque se emplean varios sistemas de puntuación que van desde 0-3 puntos o 0-10 puntos para puntuar la gravedad de la enfermedad7,,16,,17, estos resultados muestran que un sistema de puntuación de 5 puntos es capaz de determinar diferencias estadísticamente significativas en las puntuaciones de enfermedades entre grupos y otros sistemas de puntuación EAE no conducen a una mejora obvia.
La gravedad de eae se evalúa generalmente mediante una puntuación clínica EAE teniendo en cuenta la gravedad de la disfunción neurológica11,13. Para garantizar la comparabilidad del experimento para todos los ratones, es importante mantenerlos en las mismas condiciones, incluidos los cambios en la jaula, la administración de alimentos y agua, y especialmente las condiciones de alojamiento del ratón. Además, también se debe realizar una inmunización cruzada para evitar fenómenos específicos de jaulas inducidos por el investigador.
Este estudio proporciona un método para separar las células mononucleares del SNC que es adecuado para el análisis FACS o estudio funcional. Para asegurarse de que la sangre se extrae del tejido del SNC, los ratones deben perfundirse antes de disociar el tejido. La purificación de las células mononucleares en una centrifugación de gradiente de densidad es un paso clave en el aislamiento. Para garantizar un efecto de separación, la aceleración y desaceleración de la centrífuga debe establecerse en 1 y 0, respectivamente. Usando este método, los rendimientos de una sola célula son generalmente bajos del cerebro normal, pero más altos del cerebro enfermo con EAE. Los resultados representativos muestran que hay un aumento evidente en los linfocitos CD3+CD4+ T, especialmente las células productoras de ifN-γ y las células productoras de IL-17, que se consideran para contribuir al empeoramiento de la enfermedad.
Hay algunas limitaciones de este protocolo. El modelo EAE inducido con MOG35–55 muestra principalmente una respuesta inmunológica impulsada por células CD4+ T. Si el papel de las células CD8+ T y las células B necesita ser analizado, los protocolos alternativos deben ser considerados. Como enfermedad inflamatoria del SNC, un fenotipo patológico grave también se encuentra en la médula espinal en el modelo EAE. Sin embargo, debido a la presencia de grandes cantidades de mielina, es difícil obtener suficientes células individuales de la médula espinal para el análisis de FACS. En ese caso, se necesita el uso de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia para analizar el tejido de la médula espinal. También hay investigadores que juntan el cerebro y la médula espinal para separar las células mononucleares para el análisis FACS12. Este protocolo separa las células individuales del cerebro para el análisis FACS y el tejido de la médula espinal para el análisis de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.
La importancia de los linfocitos T en la regulación inmune de la EMA y EAE ha recibido cada vez más atención recientemente. Gran parte de la literatura publicada se centra en el bazo y los ganglios linfáticos11; sin embargo, los linfocitos se encuentran en todo el SNC de ratones EAE y, por lo tanto, es necesario el análisis característico de los linfocitos T en el SNC. La tinción inmunohistológica de las secciones puede identificar las células infiltradas en el SNC. Sin embargo, el análisis fenotípico y funcional es limitado. Tras el aislamiento de las células inmunitarias del SNC de ratones normales o enfermos, se hace posible el análisis de fenotipos más detallados. Con este método, los linfocitos T en el cerebro se pueden estudiar célula por célula, y la expresión de diferentes marcadores superficiales, citoquinas, quimioquinas y factores de transcripción (por ejemplo, proteínas intracelulares) se puede analizar mejor. El protocolo será útil para futuros estudios para evaluar el fenotipo y la función de los linfocitos T en el cerebro durante el curso de la EMA y EAE.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31570921 a ZJ, 81571533 a LS), la Comisión Municipal de Salud de Shanghái y la Planificación Familiar (201540206 a ZJ), la beca de investigación Ruijin Hospital North (2017ZX01 a ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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