Summary
Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.
Abstract
Multiple sclerose (MS) is een auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CNS) veroorzaakt door de combinatie van omgevingsfactoren en gevoelige genetische achtergrond. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is een typisch ziektemodel van MS dat op grote schaal wordt gebruikt voor het onderzoeken van de pathogenese waarbij T-lymfocyten specifiek voor myelineantigen een ontstekingsreactie in CNS initiëren. Het is zeer belangrijk om te beoordelen hoe lymfocyten in het CNS de ontwikkeling van de ziekte reguleren. Echter, de aanpak voor het meten van de hoeveelheid en de kwaliteit van geïnfiltreerde lymfocyten in het CNS is zeer beperkt als gevolg van de moeilijkheden bij het isoleren en detecteren van geïnfiltreerde lymfocyten uit de hersenen. Dit manuscript presenteert een protocol voor dat nuttig is voor de isolatie, identificatie en karakterisering van geïnfiltreerde lymfocyten uit het CNS en zal nuttig zijn voor ons begrip van hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van de CNS auto-immuunziekte.
Introduction
Als een chronische demyeliniserende ziekte van het CNS, MS treft ongeveer 2,5 miljoen mensen wereldwijd en mist curatieve behandelingen1. Het wordt ook beschouwd als een auto-immuunziekte, waarbij myeline-antigeenspecifieke T-lymfocyten een ontstekingsreactie initiëren en leiden tot demyelinatie en axonale schade in het CNS2. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is op grote schaal gebruikt om pathogene mechanismen van MS te onderzoeken als een klassiek auto-immuundemyeminatieziektemodel in CNS3. Er zijn twee manieren om EAE te induceren: een is om EAE actief te induceren door dieren te immuniseren met myeline componenten, een andere is adoptie-overdracht door het overbrengen van encefalogene T-cellen in receptor2,4,5. De gevoeligheden voor EAE zijn verschillend in verschillende dierlijke stammen6. In C57BL/6 muizen veroorzaakt myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35–55 uitdaging een monofasische ziekte met uitgebreide demyelinatie en ontsteking in het CNS, die vaak wordt gebruikt in experimenten met gengerichte muizen7.
De generatie van myeline-specifieke reactieve T-cellen is vereist voor het optreden en de ontwikkeling van de ziekte in EAE en is een immunologisch teken van zowel EAE als MS. Geactiveerde autoreactieve T-lymfocyten kruisen de bloedhersenbarrière (BBB) in het gezonde CZS en initiëren de ZIEKTE van EAE. Wanneer MOG 35–55 Ag wordt aangetroffen, veroorzaken deze T-lymfocyten ontstekingen en de rekrutering van effectorcellen in het CZS, wat resulteert in demyelinatie en axonvernietiging8,9. In het EAE-model is er voldoende bewijs dat neuroantigen-specifieke CD4+ T-cellen neuro-ontsteking en pathologie3,10kunnen initiëren en ondersteunen. Afhankelijk van de belangrijkste geproduceerde cytokinen zijn CD4+ T-lymfocyten ingedeeld in verschillende subsets: Th1 (gekenmerkt door de productie van interferon-γ), Th2 (gekenmerkt door de productie van interleukine 4) en Th17 (gekenmerkt door de productie van interleukine 17). Er wordt aangenomen dat activering van Th1- en Th17-cellen bijdraagt aan de inductie, het onderhoud en de regulering van ontstekingsdemyelinatie in EAE en MS door effectorcytokines IFN-γ en IL-17 te scheiden, die in staat zijn om macrofagen te activeren en neutrofielen te rekruteren voor de ontstekingssites om de laesies te versnellen11.
Omdat autoreactive T-cellen de BBB oversteken in het CZS en de ontwikkeling van ziekte bij MS en EAE veroorzaken, is het erg belangrijk om T-cellen in het CZS te analyseren. Er zijn echter zeer weinig protocollen voor de isolatie van lymfocyten uit het CNS12. Daarom is een methode ontwikkeld die is geoptimaliseerd voor het isoleren van mononucleaire cellen uit de hersenen en het analyseren van T-lymfocyten met markers CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g en IL-17 voor flow cytometrie. De methode maakt gebruik van MOG35–55 adjuvans Mycobacterium tuberculosis H37 Ra en Pertussis Toxine Working Solution (PTX) om een actief immunisatiemodel van EAE bij muizen te induceren. Vervolgens worden mechanische scheidings- en dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethoden gebruikt voor de isolatie van CNS mononucleaire cellen. Ten slotte wordt een geoptimaliseerde flow cytometrie gating strategie gebruikt om T lymfocyten en subsets uit de hersenen te identificeren door meerdere markers te beitsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het comité voor dieren van de School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Bereiding van de materialen
- Gebruik de MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK sequentie van MOG35–55 om het gelyofilifiiseerde peptide uit commerciële bronnen te verkrijgen. Zorg ervoor dat de zuiverheid van het peptide is >95%. Bereid 10 mg/mL MOG voorraadoplossing voor in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij -20 °C.
- Bereid een 4 mg/mL voorraadoplossing van M. tuberculose H37 Ra door een 100 mg buis van M. tuberculose H37 Ra in 25 mL van Complete Freund's Adjuvant (CFA) en mengen. Bewaar de voorraadoplossing op -20 °C.
- Bereid 1 ng/μL Pertussis Toxine Werkende Oplossing (PTX) voor door 50 μg PTX toe te voegen aan 50 mL PBS. Bewaar de werkoplossing op -20 °C.
- Bewaar alle antilichamen (d.w.z. FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A en APC anti-mouse IFN-γ) bij 4 °C.
- Maak de Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer door 2 mM ethyleendiamine tetraatisch zuur (EDTA) en 1% foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 500 mL PBS.
2. Huisvesting van C57BL/6 muizen
- Gebruik vrouwelijke C57BL/6 muizen op 8-12 weken oud.
- Acclimatiseren C57BL/6J muizen gedurende ten minste 7 dagen voorafgaand aan de injectie.
- Huismuizen in een dierenfaciliteit onder pathogene-vrije omstandigheden bij constante temperatuur en vochtigheid in een 12 h licht/donker cyclus en verstrekken vrije toegang tot water en standaard korrelvoedsel.
3. Immunisatie van C57BL/6 muizen
- Laat alle voorraadoplossingen 15 minuten op kamertemperatuur (RT) achter om volledige rehydratie te garanderen.
- Verdun 300 μL MOG-peptide stock oplossing met 700 μL PBS voor het bereiden van 3 mg/mL werkoplossing.
- Zet 1 mL van M. tuberculose H37 Ra voorraadoplossing en 1 mL van MOG35-55 peptiden werkoplossing in afzonderlijke 10 mL spuiten, gebruik dan een vier-weg stop haan te emulgeren voor ten minste 10 min. Zorg voor volledige emulsificatie voor de injectie.
- Verdoven muizen op het hoogtepunt van EAE met een intraperitoniale injectie van 1% natriumpentobarbital (50 mg/kg).
- Met een spuit van 1 mL injecteer je onderhuids muizen met 100 μL van een MOG 35–55/CFA emulsie (300 μg/200 μL) op twee locaties, beide aan de achterkant in de buurt van de nek. Onderhuids injecteer bestrijdingsmuizen met 200 μL PBS.
- Op dezelfde dag (dag 0) en op dag 2 na immunisatie (PI) injecteer intraperitoneally muizen met 200 μL van 1 ng/μL PTX werkende oplossing. Intraperitoneally injecteer controlemuizen met 200 μL PBS.
- Breng de muizen naar hun kooi met een warm stootkussen.
- Bestudeer en beoordeel alle muizen elke dag na de injectie op een geblindeerde manier op de neurologische symptomen in tabel 111,13. Euthanaseer de dieren als de scores slechter zijn dan graad 4.
- Nota van de gewichtsveranderingen tijdens het ziekteverloop. Dit is een waardevolle aanvullende maatregel voor ziekteactiviteit in het EAE-model11,13.
- Voeg de eerste dag van klinische symptomen voor individuele muizen toe en deel door het aantal muizen in de groep; het resultaat is het begin. Voeg de eerste dag van de maximale EAE-score voor individuele muizen toe en deel door het aantal muizen in de groep; het resultaat is de piek.
4. Eencellige suspensie voorbereiding van de hersenen
- Verdun het dichtheidsgradiëntmedium in 9:1-verhouding met PBS in een conische buis van 15 mL om een uiteindelijke 100% oplossing op te leveren.
- Verdoven muizen op het hoogtepunt van EAE met een intraperitoniale injectie van 1% natriumpentobarbital (50 mg/kg) en intracardiaal doorslis met 20 mL steriele ijskoude PBS. Bereik dit door pbs langzaam en gestaag in de linker hartkamer van het hart te injecteren met behulp van een spuit van 20 mL en het openen van het rechteratrium.
- Snijd de schedel voorzichtig van de neus naar de nek en verwijder vervolgens de hersenen uit de schedelbox in 10 mL RPMI in 50 mL conische buizen. Meng goed om aanhangende rode bloedcellen te verwijderen. Verwijder vervolgens het medium door aspiratie en voeg 10 mL RPMI toe.
- Plaats de hersenen en het medium in een schaal van 100 mm. Hak fijn met een scheermesje.
- Breng 6 mL van de schotel naar een ijskoude 7 mL gesinterde glazen homogenisator met een schone pipet. Vermijd het verlaten van grote hoeveelheden weefsel in de pipet. Een klein bedrag is onvermijdelijk.
- Maal de hersenen met behulp van de "losse" zuiger van de stamper eerst, gebruik dan de "strakke" zuiger totdat de suspensie homogeen is, en giet in een gepoogde 15 mL conische buis en houd op ijs.
- Nadat alle monsters zijn gehomogeniseerd, schat u het volume. Pas het volume aan met RPMI op 7 mL. Plaats vervolgens 3 mL ijskoude 100% keldermembraanmatrix in een gekoelde kegelvormige centrifugebuis van 15 mL en voeg 7 mL van het hersenhomogenaat toe om een laatste 30% dichtheidsgradiënt medium op te leveren. Mix door inversie een paar keer. Niet vortex.
- Om een scherpe interface te garanderen, voegt u voorzichtig en langzaam 1 mL van 70% underlay-dichtheidsgradiëntmedium toe in RPMI met een pipet van 3 mL.
- Centrifuge bij 800 x g gedurende slechts 20 minuten bij 4 °C. Stel de acceleratie in op 1 en vertraging op 0. Na centrifugatie, aspirate bijna alle van de bovenste fase, voorzichtig om volledig te verwijderen van de myeline aan de bovenkant (Figuur 1).
- Verwijder de interface in een nieuwe 15 centrifuge buis. Pas het volume aan op 10 mL met RPMI.
- Centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten. Na centrifugatie, aspirate de supernatant. Resuspend de pellet in ~ 200 μL van de stroom cytometrie kleuring (FSC) buffer. De pellets zijn dan klaar om te vlekken voor FACS.
5. Flow cytometrische analyse van enkele cellen uit de hersenen
- Gebruik een hemocytometer en microscoop om de cellen te tellen. Voeg 10 μL van de cellen toe aan 10 μL trypanblauw, meng goed en plaats 10 μL op een hemocytometer om de cellen te tellen. Bereken vervolgens het aantal levende cellen per microliter onder een omgekeerde microscoop (bijvoorbeeld Olympus Inverted microscope).
- Aliquot ongeveer 2 x 106 van cellen in RPMI in een enkele put van een 96 put plaat.
- Voeg 500x celstimulatiecocktail plus eiwittransportremmers toe aan de putten.
- Incubeer de plaat in de couveuse bij 37 °C gedurende 4 uur.
- Centrifugeren de cellen op 400 x g gedurende 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg en resuspend de cellen in 100 μL van FCS Buffer.
- Preincubate de cellen met anti-muis CD16/CD32 Fc blok (1:33) gedurende 10 min bij 4 °C voordat het vlekken om niet-specifieke Fc-gemedieerde interacties te blokkeren.
- Vlek cel oppervlak markers zonder wassen. Voeg anti-muis CD45.2 (1:200), anti-muis CD11b (1:200), anti-mouse CD3 (1:200) en anti-mouse CD4 (1:200) antilichamen toe.
OPMERKING: Om positieve en negatieve poorten te bepalen, moet een fluorescentie minus één (FMO) voor elke kleur en een isotype controleantilichaam worden gekleurd. - De plaat minstens 30 minuten bij 4 °C of op ijs uitbroeden. Bescherm tegen licht.
- Was de cellen door FCS Buffer toe te voegen. Gebruik 200 μL/put voor microtiterplaten. Centrifuge op 400 x g gedurende 5 minuten op RT. Gooi de supernatant.
- Voeg 200 μL intracellulaire (IC) fixatiebuffer toe aan elke put om de cellen te fixeren. Zorg ervoor dat de cellen volledig opnieuw worden opgespend in de oplossing.
- Incubeer 30-60 min bij RT. Bescherm tegen licht.
- Centrifugeren de monsters op 400 x g op RT gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke put en centrifuge de monsters bij 400 x g bij RT gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg.
- Resuspend de pellet in restvolume en pas het volume aan op ongeveer 100 μL met 1x permeabilisatiebuffer.
- Voeg anti-muis IL-17A (1:200) en anti-muis IFN-g (1:200) antilichamen toe voor detectie van intracellulaire antigenen aan cellen.
- Incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 4 °C. Bescherm tegen licht.
- Voeg 100 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke put en centrifuge de monsters bij 400 x g bij RT gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg.
- De gekleurde cellen opnieuw opsluiten in 100 μL stroom cytometriekleuringsbuffer.
- Analyseer op stroom cytometrie.
OPMERKING: De laser- en compensatieinstellingen op de stroomcytometer worden aangepast, de monsters worden op de cytometer geplaatst en alle gebeurtenissen worden geregistreerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
6. Gegevensanalyse
- Gate singlets met FSC-A vs. FSC-H en SSC-A vs. SSC-H.
- Gate live cellen met FSC-A en SSC-A op basis van grootte.
- Identificeer vervolgens de leukocyten, met uitzondering van de monocyten, door te gating op CD45+ CD11b- cellen.
- Identificeer vervolgens de CD4 T-lymfocyten door gating op CD3+CD4+ cellen.
- Ten slotte moet u de Th1- en Th17-subsets afzonderlijk identificeren door op IFN-γ+ cellen en IL-17+-cellen te gaan, en de positieve en negatieve populaties te bepalen met behulp van isotypecontroles en FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na vaccinatie van C57BL/6 muizen werden alle muizen gewogen, onderzocht en dagelijks beoordeeld op neurologische verschijnselen. Het representatieve klinische verloop van de EAE moet resulteren in een ziektecurve zoals gepresenteerd in figuur 2A en een verandering van lichaamsgewicht in de muis zoals gepresenteerd in figuur 2B. C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOG35-55 meestal begonnen met het ontwikkelen van symptomen van de ziekte rond dag 10-12 en bereikte de piek van de ziekte rond dag 15-21 na actieve vaccinatie (Figuur 2A). Gewichtsverandering was een waardevolle indicator in het EAE-model. Vóór het begin van de ziekte nam het lichaamsgewicht van geïmmuniseerde muizen geleidelijk toe, waarna het doorgaans afnam van de toenemende symptomen van de ziekte. Op het hoogtepunt van EAE vertoonden muizen ook het laagste lichaamsgewicht(figuur 2B). Vervolgens herstelde het lichaamsgewicht lichtjes aangezien de klinische symptomen verminderden. Echter, de muizen meestal niet volledig herstellen. C57BL/6 muizen ontwikkelden een monofasische chronische ziektepathologie op MOG35–55 challenge(figuur 2A).
De klinische ernst van EAE wordt direct geassocieerd met automatisch reageren op T-celactivering 14. Neuroantigen-specifieke CD4+ T-cellen zijn in staat om neuro-inflammatie en pathologie in EAE3te initiëren en te ondersteunen. De typische kenmerken van CD4+T-cellen in de piek van EAE worden weergegeven in figuur 3. Verder werd het aandeel van Th1- en Th17-subsets in encefalogene cellen, de belangrijkste pathogene cellen die EAE bemiddelen, geanalyseerd door stromingscytometrie. Na de scheiding van een eencellige suspensie uit de hersenen, werden de cellen gekleurd met CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ en IL-17 antilichamen, die worden uitgedrukt door T-lymfocyten. FSC-A vs. FSC-H en SSC-A vs. SSC-H werden gebruikt om singlets te gateen (Figuur 3A, B), vervolgens werden FSC-A vs. SSC-A gebruikt om levende cellen te poort op basis van grootte en granulariteit(figuur 3C). Na CD45+ CD11b- cellen werden gated om leukocyten met uitzondering van monocyten te identificeren (Figuur 3D). Vervolgens werd de poort ingesteld op CD3+CD4+ om CD4+ T lymfocyten(figuur 3E)te identificeren. Ten slotte werden IFN-γ en IL-17 gebruikt om th1- en Th17-subsets te identificeren en het functionele effect te beoordelen op basis van effectorcytokines (figuur 3F). Volgens de klinische ernst van de ziekte toonden representatieve resultaten aan dat IFN-γ-producerende Th1- en IL-17-producerende Th17-cellen aanzienlijk toenamen in de encefalogene cellen van EAE-muizen.
| Rang | Klinisch teken |
| 0 | geen ziekte |
| 1 | verminderde staarttoon of licht onhandige gang |
| 2 | staart atony en matig onhandig gang en / of slechte righting vermogen |
| 3 | zwakte van ledematen |
| 4 | verlamming van de ledematen |
| 5 | stervende staat. |
Tabel 1: Klinisch scoresysteem. C57BL/6 muizen werden geïmmuniseerd met het MOG35–55 peptide. Vervolgens werden neurologische symptomen geregistreerd. Een 5-punts scoresysteem werd gebruikt om de ernst van EAE te beoordelen.
Figuur 1: Schematisch van de Percoll-gradiëntinstelling voor isolatie van mononucleaire cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve cursus van EAE. EAE werd geïnduceerd in C57BL/6 muizen door injectie van MOG35–55 zoals beschreven in het protocol. De klinische score(A) en verandering van lichaamsgewicht(B)werden bepaald bij deze muizen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM; n = 8 voor elke groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve stromingscytometrieanalyse van lymfocyten in de hersenen. Een eencellige suspensie werd geïsoleerd van de hersenen in de piek van EAE. De gating strategie van T lymfocyten wordt getoond. Singlets werden afgesloten als FSC-A vs. FSC-H en SSC-A vs. SSC-H (A,B). Levende cellen werden afgesloten als FSC-A vs. SSC-A(C). Leukocyten exclusief monocyten werden afgesloten als CD45+ CD11b- (D). CD4+ T lymfocyten werden afgesloten als CD3+CD4+ (E). Th1 en Th17 subsets werden afgesloten als IFN-γ+ en IL-17+ (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie presenteert een protocol voor het induceren en monitoren van EAE met behulp van MOG35-55 in C57BL/6 muizen, die worden beschouwd als een typisch neuroimmunologisch experimenteel diermodel van MS. EAE kan worden geïnduceerd variërend van de muizenstammen of het type eiwit dat wordt gebruikt voor inductie volgens het doel van de studie. Bijvoorbeeld, met behulp van PLP139-151 peptide bij SJL muizen kan leiden tot een relapsing-remitting EAE ziekte cursus die vooral goed geschikt is voor het beoordelen van therapeutische effecten op recidieven15. De hier beschreven experimentele procedure kan ook worden toegepast op andere EAE-protocollen7. In dit model worden C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOG35–55 peptide en ontwikkelen ze een monofasische ziekte. Een 5-punts scoresysteem wordt gebruikt om de ernst van EAE te beoordelen. Hoewel verschillende scoresystemen, variërend van 0-3 punten of 0-10 punten worden gebruikt om de ernst van de ziekte te scoren7,16,17, tonen deze resultaten aan dat een 5-punts scoresysteem in staat is om statistisch significante verschillen in ziektescores tussen groepen en andere EAE-scoresystemen te bepalen, niet leiden tot duidelijke verbetering.
De ernst van eae wordt over het algemeen geëvalueerd door een klinische eAE-score, rekening houdend met de ernst van neurologische disfunctie11,13. Om de vergelijkbaarheid van het experiment voor alle muizen te waarborgen, is het belangrijk om ze onder dezelfde omstandigheden te houden, waaronder veranderingen in de kooi, toediening van voedsel en water, en vooral de omstandigheden in de muizenhuisvesting. Bovendien moet kruisvaccinatie ook worden uitgevoerd om kooispecifieke verschijnselen die door de onderzoeker worden geïnduceerd, te voorkomen.
Deze studie biedt een methode om mononucleaire cellen te scheiden van het CZS dat geschikt is voor FACS-analyse of functionele studie. Om ervoor te zorgen dat het bloed uit het CNS-weefsel wordt verwijderd, moeten de muizen worden doorgesijfd voordat het weefsel wordt gescheiden. De zuivering van de mononucleaire cellen op een dichtheidsgradiëntcentrifugatie is een belangrijke stap in de isolatie. Om een scheidingseffect te garanderen, moet de versnelling en vertraging van de centrifuge worden ingesteld op respectievelijk 1 en 0. Met behulp van deze methode, de eencellige opbrengsten zijn meestal laag van normale hersenen, maar hoger van zieke hersenen met EAE. Representatieve resultaten tonen aan dat er een duidelijke toename is in CD3+CD4+ T lymfocyten, met name de IFN-γ producerende cellen en IL-17 producerende cellen, die worden beschouwd als een bijdrage aan de verergerde ziekte.
Er zijn enkele beperkingen van dit protocol. Het EAE-model, geïnduceerd met MOG35–55, toont voornamelijk een CD4+ T-celgestuurde immunologische respons. Als de rol van CD8+ T-cellen en B-cellen moet worden geanalyseerd, moeten alternatieve protocollen worden overwogen. Als een CNS ontstekingsziekte wordt in het EAE-model ook een ernstig pathologisch fenotype gevonden. Echter, als gevolg van de aanwezigheid van grote hoeveelheden myeline, is het moeilijk om genoeg enkele cellen te krijgen van het ruggenmerg voor FACS-analyse. In dat geval is het gebruik van immunohistochemie of immunofluorescentie nodig om ruggenmergweefsel te analyseren. Er zijn ook onderzoekers die de hersenen en het ruggenmerg samen te scheiden mononucleaire cellen voor FACS analyse12. Dit protocol scheidt enkele cellen van de hersenen voor FACS-analyse en ruggenmergweefsel voor immunohistochemie en immunofluorescentieanalyse.
Het belang van T-lymfocyten in immuun regulatie van MS en EAE heeft de laatste tijd steeds meer aandacht gekregen. Veel van de gepubliceerde literatuur richt zich op milt en lymfeklieren11; lymfocyten worden echter gevonden in het CZS van EAE-muizen en dus is de karakteristieke analyse van T-lymfocyten in het CZS noodzakelijk. Immunohistologische kleuring van secties kan infiltrerende cellen in het CZS identificeren. Echter, fenotypische en functionele analyse is beperkt. Na isolatie van de immuuncellen van het CZS van normale of zieke muizen, wordt de analyse van meer gedetailleerde fenotypes mogelijk. Met deze methode kunnen T-lymfocyten in de hersenen per cel worden bestudeerd en kan de expressie van verschillende oppervlaktemarkers, cytokines, chemokines en transcriptiefactoren (bijvoorbeeld intracellulaire eiwitten) beter worden geanalyseerd. Het protocol zal nuttig zijn voor toekomstige studies om het fenotype en de functie van T-lymfocyten in de hersenen in de loop van MS en EAE te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door De Nationale Toekenning van de Wetenschap van China (31570921 aan ZJ, 81571533 aan LS), De Gemeentelijke Commissie van Shanghai van Gezondheid, en De Planning van de familie (201540206 aan ZJ), Het onderzoekstoelage van het Ziekenhuis Ruijin Noord (2017ZX01 aan ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
