Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोयलाइटिस के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लिम्फोसाइट घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Published: November 17, 2020 doi: 10.3791/61050
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 3
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

यह पांडुलिपि चूहों में सक्रिय प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक विधि यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत की जाती है कि सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं।

Abstract

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) पर्यावरणीय कारकों और अतिसंवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संयोजन के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक ऑटोइम्यून रोग है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) एमएस का एक विशिष्ट रोग मॉडल है जिसका व्यापक रूप से रोगजनकता की जांच के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें माइलिन एंटीजन के लिए विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स सीएनएस में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं। यह आकलन करना बहुत महत्वपूर्ण है कि सीएनएस में लिम्फोसाइट्स रोग के विकास को कैसे विनियमित करते हैं। हालांकि, सीएनएस में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स की मात्रा और गुणवत्ता को मापने के लिए दृष्टिकोण मस्तिष्क से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स को अलग करने और उनका पता लगाने में कठिनाइयों के कारण बहुत सीमित है। यह पांडुलिपि सीएनएस से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव, पहचान और लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी है और सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं, इसकी हमारी समझ के लिए उपयोगी होगी।

Introduction

सीएनएस की एक पुरानी डिमीलिनिंग बीमारी के रूप में, एमएस दुनिया भर में लगभग 2.5 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है और उपचारात्मक उपचार1का अभाव है। इसे एक ऑटोइम्यून बीमारी भी माना जाता है, जिसमें मायलिन एंटीजन विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं और सीएनएस 2 में डिमाइलेशन और एक्सोनल चोट का कारणबनतेहैं। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) का व्यापक रूप से सीएनएस3में एक क्लासिक ऑटोइम्यून डेमिलेशन रोग मॉडल के रूप में एमएस के रोगजनक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। ईएई को प्रेरित करने के दो तरीके हैं: एक यह है कि एनीमलिन घटकों के साथ जानवरों को प्रतिरक्षित करके सक्रिय रूप से ईएई को प्रेरित किया जाए, दूसरा एंसेप्लिनिक टी कोशिकाओं को,रिसेप्टर2,,4,5में स्थानांतरित करके दत्तक अंतरण है। ईएई के लिए संवेदनशीलता विभिन्न जानवरों के उपभेदों में भिन्न होती है6. C57BL/6 चूहों में, मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) 35-55 चैलेंज सीएनएस में व्यापक जनसांख्यिकी और सूजन के साथ एक मोनोफैसिक रोग को प्रेरित करता है, जो अक्सर जीन-लक्षित चूहों 7 के साथ प्रयोगों में उपयोग कियाजाताहै।

ईएई में रोग की घटना और विकास के लिए मायलिन-विशिष्ट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की पीढ़ी आवश्यक है और ईएई और एमएस दोनों का एक इम्यूनोलॉजिकल संकेत है। सक्रिय ऑटोरिएक्टिव टी लिम्फोसाइट्स स्वस्थ सीएनएस में रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार करते हैं और ईएई रोग शुरू करते हैं। जब एमओजी 35-55 एजी का सामना करना पड़ता है, तो ये टी लिम्फोसाइट्स सूजन और सीएनएस में प्रभावक कोशिकाओं की भर्ती को प्रेरित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिमाइलेशन और एक्सोन विनाश8,,9होता है। ईएई मॉडल में, इस बात के पर्याप्त सबूत हैं कि न्यूरोएंटीजेन-विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाएं न्यूरोइंफ्लेमेशन और पैथोलॉजी3,,10को शुरू और बनाए रख सकती हैं। उत्पादित प्रमुख साइटोकिन्स के आधार पर, सीडी 4+ टी लिम्फोसाइट्स को विभिन्न सबसेट में वर्गीकृत किया गया है: Th1 (इंटरफेरॉन-γ के उत्पादन की विशेषता), Th2 (इंटरल्यूकिन 4 के उत्पादन की विशेषता), और Th17 (इंटरल्यूकिन 17 के उत्पादन की विशेषता)। यह माना जाता है कि Th1 और Th17 कोशिकाओं की सक्रियता 11 घावों में तेजी लाने के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करने और भड़काऊ साइटों पर न्यूट्रोफिल की भर्ती करने में सक्षम हैं, जो प्रभावक साइटोकिन्स आईएफएन-γ और आईएल-17 को स्रावित करके ईएई और एमएस में भड़काऊ डिमिटिलेशन के प्रेरण, रखरखाव और विनियमन में योगदान देतीहै।

क्योंकि ऑटोरेक्टिव टी कोशिकाएं बीबीबी को सीएनएस में पार करती हैं और एमएस और ईएई में बीमारी के विकास को प्रेरित करती हैं, इसलिए सीएनएस में टी कोशिकाओं का विश्लेषण करना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, सीएनएस12से लिम्फोसाइट्स के अलगाव के लिए बहुत कम स्थापित प्रोटोकॉल हैं। इसलिए, मस्तिष्क से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मार्कर सीडी 45, सीडी 11बी, सीडी 3, सीडी 4, आईएनएफ-जी और आईएल-17 के साथ टी लिम्फोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित एक विधि विकसित की गई थी। इस विधि में चूहों में ईएई के सक्रिय प्रतिरक्षण मॉडल को प्रेरित करने के लिए MOG35-55 adjuvant Mycobacterium तपेदिक H37 Ra और Pertussis विष कार्य समाधान (PTX) का उपयोग करता है । फिर, सीएनएस मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए यांत्रिक पृथक्करण और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधियों का उपयोग किया जाता है। अंत में, एक अनुकूलित प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति का उपयोग कई मार्कर को धुंधला करके मस्तिष्क से टी लिम्फोसाइट्स और सबसेट की पहचान करने के लिए किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को स्कूल ऑफ बेसिक मेडिकल साइंसेज, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी की एनिमल कमेटी ने मंजूरी दे दी है ।

1. सामग्री की तैयारी

  1. वाणिज्यिक स्रोतों से ल्योफिलीकृत पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए MOG35-55 के MEVGWYRSPFSVVHLYRNGK अनुक्रम का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि पेप्टाइड की शुद्धता >95% है। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 10 मिलीग्राम/एमएल एमओजी स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  2. एम तपेदिक H37 Ra के एक 100 मिलीग्राम ट्यूब को पूर्ण फ्रायंड के एडजुवेंट (सीएफए) और मिश्रण के 25 एमएल में डालकर एम तपेदिक एच37 रा का 4 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें। स्टॉक समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पीबीएस के 50 एमएल में 50 माइक्रोन पीएचएक्स जोड़कर 1 एनजी/माइक्रोन पर्टुसिस टॉक्सिन वर्किंग सॉल्यूशन (पीटीएक्स) तैयार करें। काम समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. सभी एंटीबॉडी (यानी, फिटसी एंटी-माउस सीडी 3, पीई/Cy7 एंटी-माउस सीडी 4, PerCP/Cy5.5 एंटी-माउस सीडी11बी, एलेक्सा Fluor700 एंटी माउस सीडी 45.2, पीई एंटी-माउस आईएल-17A, और एपीसी एंटी-माउस आईएफएन-γ) को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  5. 2 एमएम एथिलीन डायामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) और 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को पीबीएस के 500 मिलीएल में जोड़कर फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग (एफसीएस) बफर बनाएं।

2. C57BL/6 चूहों के आवास

  1. 8-12 सप्ताह की उम्र में मादा C57BL/6 चूहों का उपयोग करें।
  2. इंजेक्शन से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए Acclimate C57BL/6J चूहों।
  3. 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र में निरंतर तापमान और आर्द्रता पर रोगजनक मुक्त स्थितियों के तहत एक पशु सुविधा में घर चूहों और पानी और मानक गोली भोजन के लिए मुफ्त पहुंच प्रदान करते हैं ।

3. C57BL/6 चूहों का प्रतिरक्षण

  1. पूर्ण रिहाइड्रेशन सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए सभी स्टॉक समाधान छोड़ दें।
  2. 3 मिलीग्राम/एमएल कार्य समाधान तैयार करने के लिए पीबीएस के 700 माइक्रोन के साथ एमओजी-पेप्टाइड स्टॉक समाधान के 300 माइक्रोन को पतला करें।
  3. एम तपेदिक H37 Ra स्टॉक समाधान के 1 मिलीएल और MOG35-55 पेप्टाइड्स काम समाधान के 1 मिलीएल अलग 10 मिलीएल सीरिंज में रखो, तो एक चार तरह से बंद मुर्गा का उपयोग करने के लिए कम से 10 मिनट के लिए पायस । इंजेक्शन से पहले पूर्ण पायस का अनुकरण सुनिश्चित करें।
  4. 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ ईएई के चरम पर चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  5. एक 1 मिलीएल सिरिंज के साथ, चमड़े के नीचे एक MOG 35-55/CFA पायल (३०० μg/200 μL) के १०० μL के साथ चूहों सुई, दोनों गर्दन के पास पीठ पर । पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ नियंत्रण चूहों को चमड़े से इंजेक्ट करें।
  6. उसी दिन (दिन 0) और दिन 2 पोस्ट प्रतिरक्षण (पीआई) पर, इंट्रापेरिटोनेली 1 एनजी/μL PTX कार्य समाधान के 200 μL के साथ चूहों को इंजेक्ट करें। इंट्रापेरिटोनली पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ नियंत्रण चूहों को इंजेक्ट करें।
  7. एक वार्मिंग पैड के साथ अपने घर पिंजरे के लिए चूहों हस्तांतरण।
  8. टेबल 1 11,13,13में दिखाए गए न्यूरोलॉजिकल संकेतों के लिए अंधे तरीके से इंजेक्शन के बाद हर दिन सभी चूहों की जांच और ग्रेड करें। यदि स्कोर ग्रेड 4 से भी बदतर हैं तो जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
  9. रोग पाठ्यक्रम के दौरान वजन में परिवर्तन रिकॉर्ड करें। यह ईएई मॉडल11 , 13,13में रोग गतिविधि के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त उपाय है ।
  10. व्यक्तिगत चूहों के लिए नैदानिक संकेतों के पहले दिन जोड़ें और समूह में चूहों की संख्या से विभाजित; परिणाम शुरुआत है। व्यक्तिगत चूहों के लिए अधिकतम EAE स्कोर के पहले दिन जोड़ें और समूह में चूहों की संख्या से विभाजित; परिणाम चोटी है।

4. मस्तिष्क से एकल कोशिका निलंबन तैयारी

  1. अंतिम 100% समाधान प्राप्त करने के लिए 15 एमएल शंकु नली में पीबीएस के साथ 9:1 अनुपात में पतला घनत्व ढाल माध्यम।
  2. ईएई के चरम पर चूहों को 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज करें और बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 20 एमएल के साथ इंट्राफेक्टोरियल इंजेक्शन के साथ। धीरे-धीरे और तेजी से 20 एमएल सिरिंज का उपयोग कर दिल के बाएं वेंट्रिकल में पीबीएस इंजेक्शन और सही आलिंद खोलने से इसे प्राप्त करें।
  3. नाक से गर्दन तक सावधानी से कपाल काटें, फिर कपाल बॉक्स से मस्तिष्क को 50 एमएल शंकु नलियों में आरपीएमआई के 10 एमएल में निकाल दें। अनुयायी लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। फिर आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दें और आरपीएमआई के 10 एमएल जोड़ें।
  4. दिमाग और मीडियम को 100 एमएम डिश में रखें। एक रेजर ब्लेड के साथ बारीक काट लें।
  5. डिश से 6 एमएल को एक बर्फ-ठंड 7 एमएल सिंटर ग्लास होमोजेनाइजर को साफ पिपेट के साथ ट्रांसफर करें। पिपेट में बड़ी मात्रा में टिश्यू छोड़ने से बचें। एक छोटी राशि अपरिहार्य है।
  6. पहले मूसल के "ढीले" प्लंजर का उपयोग करके मस्तिष्क को पीसें, फिर निलंबन सजातीय होने तक "तंग" प्लंजर का उपयोग करें, और एक पूर्वनिर्धारण 15 एमएल शंकु नली में डालें और बर्फ पर रखें।
  7. सभी नमूनों के समरूप होने के बाद, मात्रा का अनुमान लगाएं। आरपीएमआई के साथ वॉल्यूम को 7 एमएल में एडजस्ट करें। फिर 3 एमएल बर्फ-ठंडे 100% बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को ठंडा 15 एमएल शंकुकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और अंतिम 30% घनत्व ढाल माध्यम उपज के लिए मस्तिष्क समरूप के 7 एमएल जोड़ें। एक-दो बार उलटा करके मिलाएं। भंवर न करें।
  8. एक तेज इंटरफ़ेस सुनिश्चित करने के लिए, ध्यान से और धीरे-धीरे 3 एमएल पिपेट के साथ आरपीएमआई में 70% अंडरले घनत्व ढाल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर केवल 20 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। त्वरण को 1 और मंदी को 0 सेट करें। अपकेंद्रित्र के बाद, लगभग सभी शीर्ष चरण को आकांक्षी करें, शीर्ष पर मायलिन को पूरी तरह से हटाने के लिए सावधान रहें(चित्रा 1)।
  10. एक नई 15 अपकेंद्रित्र ट्यूब में इंटरफेस निकालें। आरपीएमआई के साथ वॉल्यूम को 10 एमएल में एडजस्ट करें।
  11. 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। प्रवाह साइटोमेट्री स्टेनिंग (एफएससी) बफर के ~ 200 माइक्रोल में गोली को फिर से रीसस्ट करें। इसके बाद छर्रों को FACS के लिए दाग लगाने के लिए तैयार किया जाता है ।

5. मस्तिष्क से एकल कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. कोशिकाओं की गिनती के लिए हीमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें। कोशिकाओं के 10 माइक्रोन को ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और कोशिकाओं को गिनने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर पर 10 माइक्रोन रखें। फिर एक उल्टे माइक्रोस्कोप (जैसे, ओलंपस उल्टे माइक्रोस्कोप) के तहत प्रति माइक्रोलीटर लाइव कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  2. Aliquot लगभग 2 x 106 आरपीएमआई में कोशिकाओं के एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक ही कुएं में.
  3. कुओं में 500x सेल उत्तेजना कॉकटेल प्लस प्रोटीन परिवहन अवरोधक जोड़ें।
  4. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. आर टी में 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें और एफसीएस बफर के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  6. गैर-विशिष्ट एफसी-मध्यस्थता इंटरैक्शन को ब्लॉक करने के लिए धुंधला होने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एंटी-माउस सीडी 16/सीडी 32 एफसी ब्लॉक (1:33) के साथ कोशिकाओं को प्रीइनक्यूबेट करें।
  7. बिना धोने के दाग कोशिका सतह मार्कर। एंटी-माउस सीडी 45.2 (1:200), एंटी-माउस सीडी 11बी (1:200), एंटी-माउस सीडी 3 (1:200), और एंटी-माउस सीडी 4 (1:200) एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: सकारात्मक और नकारात्मक फाटकों का निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक रंग के लिए एक फ्लोरेसेंस माइनस एक (एफएमओ) और एक आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी दाग दिया जाना चाहिए।
  8. प्लेट को कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर इनक्यूबेट करें। प्रकाश से रक्षा करें।
  9. एफसीएस बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। माइक्रोटिटर प्लेटों के लिए 200 μL/well का उपयोग करें। आरटी में 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को छोड़ें।
  10. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रत्येक कुएं में इंट्रासेल्युलर (आईसी) निर्धारण बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समाधान में पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया है।
  11. आरटी में 30-60 मिनट इनक्यूबेट करें। प्रकाश से बचाते हैं।
  12. 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x g पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  13. प्रत्येक कुएं में 1x पर्मेबिलाइजेशन बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x ग्राम पर नमूनों को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  14. अवशिष्ट मात्रा में गोली को फिर से रखें और 1x परमेबिलाइजेशन बफर के साथ वॉल्यूम को लगभग 100 माइक्रोन में समायोजित करें।
  15. कोशिकाओं को इंट्रासेलुलर एंटीजन का पता लगाने के लिए एंटी-माउस आईएल-17A (1:200) और एंटी-माउस आईएफएन-जी (1:200) एंटीबॉडी जोड़ें।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। प्रकाश से रक्षा करें।
  17. प्रत्येक कुएं में 1x पर्मेबिलाइजेशन बफर का 100 माइक्रोन जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x ग्राम पर नमूनों को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  18. फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर के 100 माइक्रोल में दाग कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ट करें।
  19. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
    नोट: प्रवाह साइटोमीटर पर लेजर और मुआवजा सेटिंग्स समायोजित कर रहे हैं, नमूनों साइटोमीटर पर रखा जाता है, और सभी घटनाओं निर्माता की सिफारिशों के अनुसार दर्ज कर रहे हैं ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच और एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच का उपयोग करके गेट सिंगल्स ।
  2. आकार के आधार पर एफएससी-ए और एसएससी-ए का उपयोग करके गेट लाइव सेल।
  3. इसके बाद, सीडी 45+ सीडी 11बी- कोशिकाओं पर गेटिंग करके मोनोसाइट्स को छोड़कर ल्यूकोसाइट्स की पहचान करें।
  4. फिर, CD3 + CD4 + कोशिकाओं पर गेटिंग करके सीडी 4 टी लिम्फोसाइट्स की पहचान करें।
  5. अंत में, आईएफएन-γ + कोशिकाओं और आईएल-17 + कोशिकाओं पर अलग से गेटिंग करके Th1 और Th17 सबसेट की पहचान करें, और आइसोटाइप नियंत्रण और एफएमओ का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का निर्धारण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C57BL/6 चूहों के प्रतिरक्षण के बाद, सभी चूहों को तौला गया, जांच की गई और न्यूरोलॉजिकल संकेतों के लिए दैनिक वर्गीकृत किया गया । ईएई के प्रतिनिधि नैदानिक पाठ्यक्रम के परिणामस्वरूप एक रोग वक्र होना चाहिए जैसा कि चित्रा 2 ए में प्रस्तुत किया गया है और माउस में शरीर के वजन में परिवर्तन होना चाहिए जैसा कि चित्रा 2 बीमें प्रस्तुत किया गया है। C57BL/6 चूहों MOG35-55 के साथ प्रतिरक्षित आमतौर पर 10-12 दिन के आसपास रोग के लक्षण विकसित करने के लिए शुरू कर दिया और सक्रिय प्रतिरक्षण(चित्रा 2A)के बाद 15-21 दिन के आसपास रोग की चोटी हासिल की । वजन परिवर्तन EAE मॉडल में एक मूल्यवान संकेतक था । रोग की शुरुआत से पहले, प्रतिरक्षित चूहों के शरीर का वजन धीरे-धीरे बढ़ गया, फिर आम तौर पर बढ़ती बीमारी के लक्षणों से सहसंबद्ध कम हो गया। EAE के चरम पर, चूहों ने शरीर का सबसे कम वजन(चित्रा 2B) भी दिखाया। फिर नैदानिक लक्षणों में कमी के रूप में शरीर का वजन थोड़ा बरामद हुआ। हालांकि, चूहे आमतौर पर पूरी तरह से ठीक नहीं होते थे। C57BL/6 चूहों ने MOG35-55 चैलेंज(चित्रा 2A)पर एक मोनोफेसिक क्रोनिक डिजीज पैथोलॉजी विकसित की ।

ईएई की नैदानिक गंभीरता सीधे ऑटोरिएक्टिव टी सेल एक्टिवेशन14से जुड़ी हुई है । न्यूरोएंटीजेन-विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाएं ईएई3में न्यूरोइंफ्लेमेशन और पैथोलॉजी को शुरू करने और बनाए रखने में सक्षम हैं। ईएई के शिखर में सीडी 4+टी कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताओं को चित्र 3 में दिखाया गयाहै । इसके अलावा, एंसेफलिटोजेनिक कोशिकाओं में Th1 और Th17 सबसेट के अनुपात, जो EAE मध्यस्थता प्रमुख रोगजनक कोशिकाओं रहे हैं, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था । मस्तिष्क से एक एकल कोशिका निलंबन के अलगाव के बाद, कोशिकाओं CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ, और आईएल-17 एंटीबॉडी, जो टी लिम्फोसाइट्स द्वारा व्यक्त कर रहे है के साथ दाग थे । एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच और एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच का उपयोग सिंगल्स(चित्रा 3 ए, बी)के गेट पर किया जाता था, फिर एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग आकार और दानेदारता(चित्रा 3सी)के आधार पर लाइव कोशिकाओं को गेट करने के लिए किया जाता था। इसके बाद, सीडी 45+ सीडी 11बी- कोशिकाओं को मोनोसाइट्स(चित्रा 3 डी)को छोड़कर ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए गेट किया गया था। फिर, सीडी 4+ टीलिम्फोसाइट्स(चित्रा 3E)की पहचान करने के लिए सीडी 3+ सीडी 4+ पर गेट सेट किया गया था। अंत में, IFN-γ और आईएल-17 का उपयोग Th1 और Th17 सबसेट की पहचान करने और प्रभावक साइटोकिन्स(चित्रा 3F)के अनुसार कार्यात्मक प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था। रोग की नैदानिक गंभीरता के अनुसार, प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है कि IFN-γ-उत्पादन Th1 और आईएल-17-उत्पादन Th17 कोशिकाओं में काफी EAE चूहों से encephalitogenic कोशिकाओं में वृद्धि हुई ।

श्रेणीकरण नैदानिक हस्ताक्षर
0 कोई बीमारी नहीं
1 कम पूंछ टोन या थोड़ा अनाड़ी चाल
2 पूंछ atony और मामूली अनाड़ी चाल और/
3 अंग की कमजोरी
4 अंग पक्षाघात
5 मोरण्ण अवस्था।

तालिका 1: नैदानिक स्कोरिंग सिस्टम। C57BL/6 चूहों MOG35-55 पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित किया गया । फिर, न्यूरोलॉजिकल संकेत दर्ज किए गए। ईएई की गंभीरता का आकलन करने के लिए 5 सूत्री स्कोरिंग सिस्टम का इस्तेमाल किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए परकोल ढाल सेटअप की योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: EAE के प्रतिनिधि पाठ्यक्रम। EAE C57BL/6 चूहों में MOG35-55 के इंजेक्शन के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित द्वारा प्रेरित किया गया था । इन चूहों में क्लीनिकल स्कोर(ए)और शरीर के वजन(बी)का परिवर्तन निर्धारित किया गया था। डेटा को एसईएम के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; n प्रत्येक समूह के लिए = 8। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मस्तिष्क में लिम्फोसाइट्स का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। एक एकल कोशिका निलंबन EAE के शिखर में मस्तिष्क से अलग था । टी लिम्फोसाइट्स की गेटिंग रणनीति दिखाई गई है। सिंगल्स को एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच और एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच(ए,बी)के रूप में गेटेड किया गया था । लाइव कोशिकाओं को एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए(सी)के रूप में गेट किया गया था। मोनोसाइट्स को छोड़कर ल्यूकोसाइट्स को CD45+ CD11b- (D)के रूप में गेट किया गया था। CD4+ T lymphocytes CD3+CD4+ (ई)के रूप में gated थे । Th1 और Th17 सबसेट IFN-γ+ और आईएल-17+ (एफ)के रूप में gated थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह अध्ययन C57BL/6 चूहों में MOG35-55 का उपयोग करके EAE को प्रेरित करने और निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसे एमएस के एक विशिष्ट न्यूरोइम्यूनोलॉजिकल प्रायोगिक पशु मॉडल माना जाता है। EAE को चूहों के उपभेदों या अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन के प्रकार को प्रेरित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एसजेएल चूहों में पीएलपी 139-151 पेप्टाइड का उपयोग करके एक रिलेप्सिंग-प्रेषण ईएई रोग पाठ्यक्रम को प्रेरित कर सकता है जो विशेष रूप से रिलेप्स15पर चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां उल्लिखित प्रायोगिक प्रक्रिया को अन्य ईएई प्रोटोकॉल7पर भी लागू किया जा सकता है । इस मॉडल में, C57BL/6 चूहों को MOG35-55 पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है और एक मोनोफेसिक रोग विकसित किया जाता है। EAE की गंभीरता का आकलन करने के लिए 5-पॉइंट स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है। यद्यपि 0-3 अंक या 0-10 अंकों से लेकर कई स्कोरिंग,सिस्टम रोग गंभीरता7, 16, 17,16स्कोर करने के लिएनियोजितहैं, इन परिणामों से पता चलता है कि एक 5 सूत्री स्कोरिंग प्रणाली समूहों और अन्य EAE स्कोरिंग सिस्टम के बीच रोग स्कोर में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने में सक्षम है स्पष्ट सुधार करने के लिए नेतृत्व नहीं करते हैं ।

ईएई गंभीरता का मूल्यांकन आम तौर पर आईएई नैदानिक स्कोर द्वारा किया जाता है, जिसमें न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन11,13की गंभीरता को ध्यान में रखा जाता है । सभी चूहों के लिए प्रयोग की तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए, उन्हें एक ही शर्तों के तहत रखना महत्वपूर्ण है, जिसमें पिंजरे के परिवर्तन, भोजन और पानी का प्रशासन और विशेष रूप से माउस आवास की स्थिति शामिल है। इसके अलावा, अन्वेषक द्वारा प्रेरित पिंजरे-विशिष्ट घटनाओं से बचने के लिए क्रॉस-प्रतिरक्षण भी किया जाना चाहिए।

यह अध्ययन सीएनएस से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने की एक विधि प्रदान करता है जो FACS विश्लेषण या कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सीएनएस ऊतक से रक्त हटा दिया जाता है, चूहों को ऊतक को अलग करने से पहले घेर लिया जाना चाहिए। घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र पर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की शुद्धि अलगाव में एक महत्वपूर्ण कदम है। एक जुदाई प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए, अपकेंद्रित्र के त्वरण और मंदी क्रमशः 1 और 0 के लिए सेट किया जाना चाहिए । इस विधि का उपयोग करना, एकल कोशिका पैदावार आमतौर पर सामान्य मस्तिष्क से कम होती है, लेकिन ईएई के साथ रोगग्रस्त मस्तिष्क से अधिक होती है। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि सीडी 3+सीडी 4+ टी लिम्फोसाइट्स में एक स्पष्ट वृद्धि हुई है, विशेष रूप से आईएफएन-γ उत्पादन कोशिकाओं और आईएल-17 उत्पादक कोशिकाओं, जो बिगड़ी हुई बीमारी में योगदान करने के लिए माना जाता है ।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। MOG35-55 के साथ प्रेरित EAE मॉडल मुख्य रूप से एक सीडी 4+ टी सेल संचालित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दिखाता है । यदि सीडी8+ टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की भूमिका का विश्लेषण करने की आवश्यकता है, तो वैकल्पिक प्रोटोकॉल पर विचार किया जाना चाहिए। सीएनएस भड़काऊ बीमारी के रूप में, ईएई मॉडल में रीढ़ की हड्डी में एक गंभीर रोग फेनोटाइप भी पाया जाता है। हालांकि, मायलिन की बड़ी मात्रा की उपस्थिति के कारण, FACS विश्लेषण के लिए रीढ़ की हड्डी से पर्याप्त एकल कोशिकाओं को प्राप्त करना मुश्किल है। उस मामले में, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की आवश्यकता है। ऐसे शोधकर्ता भी हैं जो मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को एक साथ रखने के लिए FACS विश्लेषण के लिए मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने के लिए12. यह प्रोटोकॉल ओएफएस विश्लेषण और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए मस्तिष्क से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं को अलग करता है।

एमएस और ईएई के प्रतिरक्षा विनियमन में टी लिम्फोसाइट्स के महत्व को हाल ही में अधिक से अधिक ध्यान प्राप्त हुआ है। अधिकांश प्रकाशित साहित्य तिल्ली और लिम्फ नोड्स11पर केंद्रित है ; हालांकि, लिम्फोसाइट्स ईएई चूहों के सीएनएस में पाए जाते हैं और इस प्रकार, सीएनएस में टी लिम्फोसाइट्स का विशिष्ट विश्लेषण आवश्यक है। वर्गों के इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल धुंधला सीएनएस में घुसपैठ कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं। हालांकि, फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विश्लेषण सीमित है। सामान्य या रोगग्रस्त चूहों के सीएनएस से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के बाद, अधिक विस्तृत फेनोटाइप का विश्लेषण संभव हो जाता है। इस विधि के साथ, मस्तिष्क में टी लिम्फोसाइट्स का सेल-बाय-सेल आधार पर अध्ययन किया जा सकता है, और विभिन्न सतह मार्कर, साइटोकिन्स, केमोकिन्स और ट्रांसक्रिप्शन कारकों (जैसे, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन) की अभिव्यक्ति का बेहतर विश्लेषण किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एमएस और ईएई के दौरान मस्तिष्क में टी लिम्फोसाइट्स के फेनोटाइप और कार्य का आकलन करने के लिए भविष्य के अध्ययनों के लिए उपयोगी होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना ग्रांट (31570921 से जेडजे, 81571533 को एलएस), शंघाई म्यूनिसिपल कमीशन ऑफ हेल्थ, एंड फैमिली प्लानिंग (201540206 से जेडजे), रुइजिन हॉस्पिटल नॉर्थ रिसर्च ग्रांट (2017ZX01 से जेडजे) को सपोर्ट मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 165 मल्टीपल स्क्लेरोसिस एमएस प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोमाइलाइटिस ईएई ऑटोइम्यून रोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सीएनएस टी लिम्फोसाइट फ्लो साइटोमेट्री
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोयलाइटिस के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लिम्फोसाइट घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., … More

Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter