Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))

doi: 10.3791/61055 Published: May 4, 2020

Summary

ويستند هذا الأسلوب مضبوط الحديد على القياس الطيفي كتلة البلازما ذات شكلي كهربائي الشعيرية مع التراص العينة جنبا إلى جنب مع تحليل قصير في شوط واحد. هذه الطريقة بسرعة تحليل وتوفير حدود منخفضة من الكم لأنواع الأكسدة الحديد عبر مجموعة متنوعة من الأنسجة وعينات بيوفلورويد.

Abstract

يتم حساب خلل التوازن في الحديد في الإطار الفسيولوجية للعديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان والعديد من الظروف العصبية. الحديد المفرط النتائج في الحرة الأكسدة النشطة Fe(II) ويمكن أن يسبب آثارا مدمرة داخل الخلية مثل الأكسدة (OS) والموت عن طريق بيروكسيد الدهون المعروفة باسم ferroptosis (FPT). ولذلك، فإن القياسات الكمية للحديد (Fe(II)) والحديد الحديدي (Fe(III)) بدلاً من تحديد Fe الكلي هي المفتاح لنظرة أعمق إلى هذه العمليات الضارة. منذ Fe(II)/(III) يمكن أن يعوقها التحولات السريعة الدولة الأكسدة وتركيزات منخفضة في العينات ذات الصلة, مثل السائل النخاعي (CSF), ينبغي أن تكون الأساليب المتاحة التي تحلل بسرعة وتوفير حدود منخفضة من الكم (LOQ). الشعيرات الدموية الكهربائية (CE) يوفر ميزة سريع Fe(II) / Fe(III) الفصل ويعمل دون مرحلة ثابتة، والتي يمكن أن تتداخل مع التوازن redox أو يسبب الالتصاق التحليل. CE جنبا إلى جنب مع قياس الطيف كتلة البلازما جنبا إلى جنب مع الاستقراء (ICP-MS) ككاشف يوفر المزيد من التحسن في حساسية الكشف والانتقائية. الأسلوب المقدم يستخدم 20 M HCl ككهربا خلفية والجهد من +25 كيلو فولت. يتم تحسين أشكال الذروة وحدود الكشف عن التركيز عن طريق التراص الموصلية-درجة الH.0.0. للحد من 56[ArO]+، ICP -MS تم تشغيلها في وضع خلية التفاعل الديناميكي (DRC) مع NH3 كغاز تفاعل. تحقق هذه الطريقة حدًا من الاكتشاف (LOD) يبلغ 3 ميكروغرام /ل. بسبب التراص ، كان من الممكن استخدام كميات حقن أعلى دون إعاقة الفصل ولكن تحسين LOD. وكانت المعايرات المتعلقة بمساحة الذروة خطية تصل إلى 150 ميكروغرام/لتر. وكانت دقة وقت الهجرة < 3٪ لكلا النوعين، في 1:2 lysates المخفف من الخلايا الأرومية العصبية البشرية (SH-SY5Y). وكشفت تجارب الاسترداد مع إضافة القياسية دقة 97٪ Fe (III) و 105 ٪ Fe(II). في العينات الحيوية الواقعية مثل CSF، يمكن أن يختلف وقت الترحيل وفقًا لموصلية مختلفة (أي الملوحة). وهكذا، يتم تأكيد تحديد الذروة من خلال إضافة قياسية.

Introduction

اليوم، فمن الواضح أن الإجهاد التأكيدي بوساطة الحديد (OS) يلعب دورا حاسما في اضطرابات متعددة على وجه التحديد في اضطرابات الدماغ العصبية، مثل مرض الزهايمر وباركنسون وكذلك في السرطان1،2،3،4. نظام التشغيل يرتبط ارتباطا وثيقا للدولة والتوازن من زوجين redox Fe (الثاني)/Fe (الثالث). في حين Fe (III) هو الأكسدة غير النشطة، Fe (II) يولد بقوة أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) عن طريق تحفيز H2O2 التحلل تليها من إنتاج هيدروكسل الجذرية والغشاء بيروكسيديشن الدهون5،6. على المستوى الجزيئي، Fe (II) ولدت روس والفوسفوليبيدات بيروكسيدسيدات هي هجوم قوي على سلامة البروتينات والدهون والحمض النووي7،8. وقد ثبت هذا الخلل الخلوي الضارة للحث على خلل الميتوكوندريا مع انخفاض ATP-المحتوى9 ويمكن أن تؤدي حتى موت الخلايا النخرية المبرمجة، والمعروفة باسم ferroptosis (FPT)10،11. ولذلك، الكمية Fe(II)/(III) اكاسة الأكسدة ذات أهمية بارزة في مجموعة واسعة من الاضطرابات ذات الصلة الأكسدة.

اال speciation الكيميائية هي أداة راسخة لدراسة العناصر النزرة الدور البيولوجي والتمثيل الغذائي في عام7،8 وكذلك في الظروف العصبية12،13،14،15،16،17. تعتمد طرق تحديد المواصفات في الـ Fe-redox الموجودة في المؤلفات عادة على فصل اللوني السائل (LC). بعض المؤلفات استخدام البلازما يقترن الاستقرائي الطيف الكتلي (ICP-MS) كعنصر للكشف الانتقائي. ومع ذلك، في العمل LC الروتينية، كانت هناك حاجة إلى أوقات التطهير المفرطة بين التشغيل. حتى أكثر إشكالية ، دفعة إلى دفعة الاختلاف من أعمدة LC القسري إعادة تحسين ظروف elution بعد كل تغيير العمود. هذه المشاكل تعوق الإنتاجية العالية. مطلوب وقت إضافي للحصول على موثوقية مقبولة وتقييم الأسلوب بدقة مرة أخرى.

للتحايل على هذه العيوب، يتم تقديم طريقة هنا لFe(II)/Fe(III) مضد اخصائيات الأكسدة على أساس الكهربائي الشعرية يقترن INDUCTIVELY البلازما الطيف الكتل (CE-ICP-MS). تقدم CE مزايا مختلفة مقارنة بـ LC18. الشعيرات الدموية ليس لها مرحلة ثابتة، وبالتالي تعتمد (تقريبا) لا على هوية دفعة. عندما يبلغ من العمر أو المحظورة، يتم استبدالها بسرعة، وتظهر عادة أداء لم يتغير. خطوات التطهير والتنظيف بين العينات فعالة وقصيرة، ووقت التحليل لكل عينة قصير أيضاً.

الطريقة المقدمة هي موثوقة مع أرقام جيدة من الجدارة. كدليل على المبدأ، يتم تطبيق الأسلوب على الإنسان الدوبامين الورم الأرومي العصبي (SH-SY5Y) الخلية lysate، وهو نوع عينة مهمة في التنكس العصبي وكذلك أبحاث السرطان19.

Protocol

تنبيه: تستخدم الطريقة حمض الهيدروكلوريك (HCl، بدءاً من التخفيفات من ultrapure، والتركيز 1 M) و tetramethylammonydroxide (TMAH، بدءا من التخفيفات ultrapure، تركيز 25٪). كلا المواد هي تآكل بقوة. استخدم حماية الجلد والعين.

1. إعداد الشوارد

  1. إعداد الشوارد الكهربائية HCl: الشوارد الخلفية (20 mM HCl)، المنحل بالكهرباء منفذ (5 mM HCl) وتكهر إنهاء (0.05 mM HCl)
    1. إعداد 20 M HCl في قارورة 100 مل: Pipette 2 مل من 1 M HCl في القارورة، وملء ما يصل إلى علامة مع الماء فائقة السخ وتهز بلطف.
    2. إعداد 5 M HCl في قارورة 100 مل: الماصات 500 ميكرولتر من 1 M HCl في القارورة، وملء ما يصل إلى علامة مع الماء فائقة السخ ويهز بلطف.
    3. إعداد 0.05 mM HCl في خطوتين: الماصات 1 مل من 20 M HCl في قارورة 100 مل، ثم ملء ما يصل إلى علامة مع الماء فائقة السخ وتهز بلطف. في وقت لاحق، ماصة 2.5 مل من الحل الأخير في أنبوب مخروطي 15 مل(جدول المواد)وإضافة 7.5 مل من الماء فائقة الخطورة، ثم يهز بلطف.
  2. إعداد الشوارد الرائدة 12٪ TMAH في أنبوب مخروطي 15 مل: الماصات 4.8 مل من 25٪ TMAH في الأنبوب، إضافة 5.2 مل من الماء فائقة الpure ويهز بلطف.
    ملاحظة: يتم استخدام 12% TMAH لتطهير وتنظيف الشعيرات الدموية قبل كل تشغيل وككهرة رائدة أمام العينة المحقونة).

2- إعداد المعايير والعينات وتخزينها

  1. المعايير
    1. لFe (الثاني), تزن 35.61 ملغ من Fe(II)Cl2·4H2O في قارورة 100 مل وملء ما يصل إلى علامة 100 مل مع المياه فائقة السخاء ل100 ملغ Fe (II)/L تركيز المخزون. يهز بلطف حتى حل كامل.
    2. لFe (III), تزن 29.04 ملغ من Fe(III)Cl3 في قارورة 100 مل وملء ما يصل إلى علامة 100 مل مع الماء فائقة السخاء ل100 ملغ Fe (III)/L تركيز المخزون. يهز بلطف حتى حل كامل.
    3. تخفيف كل حل قياسي وفقا للجدول 1 لإعداد حلول معيار العمل.
      ملاحظة: بعد إعداد حلول الأسهم اليومية من 100 ملغ / ل حل الأسهم، يجب أن يتم تخزين هذا الأخير المجمدة. بعد إعداد المعايير اليومية وفقا للجدول 1، يجب أن يكون على سعر 1 ملغ / ل حل الأسهم في 1.5 مل المجلدات وتخزينها المجمدة (أفضل مع عدم وجود الهواء اليسار على القمة) في أنابيب 1.5 مل. في كل يوم جديد، يتم إذابة سقف واحد يومي لإعداد المعايير اليومية وسحبها بعد الاستخدام.
بداية التركيز حجم الأنابيب ملء مع المياه ميلي-Q التركيز الناتج المجلد النهائي استخدام الحل
100 ملغ / لتر 50 ميكرولتر 4950 ميكرولتر 1 ملغ / لتر 50 مل حل الأسهم اليومية
1 ملغ / لتر 200 ميكرولتر 1800 ميكرولتر 100 ميكروغرام/لتر 2 مل القياسيه
100 ميكروغرام/لتر
1 ملغ / لتر 100 ميكرولتر 1900 ميكرولتر 50 ميكروغرام/لتر 2 مل القياسيه
50 ميكروغرام/لتر
1 ملغ / لتر 50 ميكرولتر 1950 ميكرولتر 25 ميكروغرام/لتر 2 مل القياسيه
25 ميكروغرام/لتر
1 ملغ / لتر 25 ميكرولتر 1975μL 12.5μg / لتر 2 مل القياسيه
12.5 ميكروغرام/لتر
1 ملغ / لتر 20 ميكرولتر 1980μL 10 ميكروغرام/لتر 2 مل القياسيه
10 ميكروغرام/لتر
0 2000 ميكرولتر 0 ميكروغرام/لتر 2 مل فارغه

الجدول 1: مخطط التنقيط لإعداد المعايير.

  1. lysate خلية SH-SY5Y
    ملاحظة: الخلية lysate (SH-SY5Y) بمثابة Fe(II)/(III)-المصفوفة الحيوية ذات الصلة لإظهار الأداء ووثوقية الأسلوب.
    1. استخدام lysate من التجارب قيد التشغيل سابقا16. اتبع هذا إعداد الخلية lysate تجنب التغيرات في مادة الH أو المواد الكيميائية التي قد تؤثر على توازن الأكسدة. استخدام معدلة فحص المناعة المشعة (RIPA) تحلل العازلة (PBS pH 7.4، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم، 1٪ NP-40)، وتجنب chelators المعادن (مثل EDTA)، والحد من العوامل (مثل DTT، 2-Mercaptoethanol) والمنظفات الراكدة anionic وكلاء المعقدة المعدنية (مثل SDS) للتقليل من التعديلات بعد جمع نسبة Fe (II) / Fe(III).
    2. عمل تحت N2-الغلاف الجوي منعت الأكسدة من قبل O2 من الهواء المحيط والعمل على الجليد لتقليل أي autoxidation حتى تم تخزين lysate في أقرب وقت ممكن في -80 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي النيتروجين.

3- إعداد أدوات لوصلة الواصلة من CE إلى ICP-MS

  1. إعداد أداة الكهرباء الشعرية.
    ملاحظة: بالنسبة لهذا القسم، يُشار القارئ بشكل رئيسي إلى دليل الأداة الخاصة بها المتاحة في المختبر.
    1. تثبيت شعري مع طول مناسب للوصول من قارورة مدخل صك CE إلى البخاخات من ICP-MS. تثبيت الشعرية فقط في الجانب مدخل ويؤدي خارج الصك نحو واجهة CE-ICP-MS.
      ملاحظة: بالنسبة للواصلة CE إلى ICP-MS، في هذا البروتوكول تم تثبيت شعري سيليكا المصهر 90 سم (ID 50 ميكرومتر) وفقاً لوصف الإعداد الفعال العام. عادة، سوف تكون هناك حاجة إلى أحجام الشعيرات الدموية من 70-100 سم، اعتمادا على موقف الأجهزة في المختبر.
    2. فك من تفعيل مخرج رفع الصك CE في البرنامج لتشغيل سلس كما أنها ليست قيد الاستخدام عندما يتم توجيه الشعيرات الدموية خارج إلى واجهة CE-ICP-MS.
    3. قم بتثبيت كبل المشغل من مشغل CE-أداة OUT إلى مشغل في أداة ICP-MS.
    4. حدد المواقف لجميع الحلول اللازمة (20 M HCl، 0.05 M HCl، 12٪ TMAH)، والمعايير والعينات في عينة وحلول الدوار من الصك وتحديد مواقعها في برنامج الصك كالمعتاد (الرجوع إلى دليل الصك).
    5. حدد درجة حرارة الدوار والشعيرات الدموية لتكون متطابقة عند 20 درجة مئوية، كما أنها مطابقة لدرجة حرارة المختبر الخاضعة للرقابة.
      ملاحظة: لا يحدث تدرج درجة الحرارة إلى أجزاء الشعيرات الدموية داخل وخارج أداة CE.
  2. إعداد أداة ICP-MS
    1. تحسين أداة ICP-MS وفقًا لإجراءات الإعداد والتشغيل القياسية اليومية. استخدم بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. استخدم تقنية خلايا التفاعل الديناميكي (DRC) مع NH3 كغاز DRC، مع 0.6 مل/دقيقة NH3- معدل التدفق وقيمة RPq = 0.45.
      ملاحظة: بالنسبة ل speciation الحديد، تتم برمجة طريقة مع 56Fe، كونها النظير Fe الأكثر وفرة (91.754٪ وفرة نسبية)، ومع ذلك، يجري تدخل شديد من [40Ar16O]+ الكتلة. و QUADrupole على أساس ICP-MS في الوضع القياسي هو عمليا أعمى وكاشف في تجاوز في هذا النظير. مع الإعدادات أعلاه (انظر الخطوة 3.2.2)، يتم تحقيق خطوط الأساس المنخفضة وحساسية عالية (لتحديد إجمالي الحديد العادية LOD في نطاق نانوغرام/لتر منخفض يتحقق).
    3. اختيار وقت الإقامة الإعداد لكل نظير في 50 مللي ثانية لرصد حتى قمم حادة وقصيرة الظهور خلال فصل CE.
    4. برنامج الأسلوب ICP-MS إلى تشغيل تشغيل بواسطة CE-أداة.
  3. إعداد واجهة CE-ICP-MS
    ملاحظة: هناك خيارين بشكل رئيسي لتوصيل الشعيرات الدموية CE إلى ICP-MS. اتبع الأوصاف المتوفرة حول الإعداد إذا تم استخدام واجهة تجارية. يستخدم هذا البروتوكول واجهة بسيطة محلية الصنع استناداً إلى منشور سابق بعد التعديلات20. القضايا الرئيسية هي البخاخة كفاءة مع تخفيف ربما أقل من efflux الشعرية جانبا من اعتماد معدل التدفق الكلي إلى البخاخات للحصول على أفضل البخاخات. أيضا، فإن تقليل تدفق الشفط من خلال فصل الشعيرات الدموية الناجمة عن التطلع الذاتي من البخاخات، والاتصال الكهربائي من القطب منفذ على أساس إلى نهاية شعرية إلزامية.
    1. تحديد البخاخات
      1. استخدم جهاز ابخاز متحدة المركز مع انخفاض حجم التعرق الذاتي (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر/دقيقة) الذي يتناسب مع غرفة رش منخفضة الحجم.
        ملاحظة: سوف يؤدي انخفاض امتصاص فقط تخفيف معتدلة من efflux الشعرية موازية من البخاز لا يزال الأمثل. يتم إنجاز الاتصال الكهربائي من القطب منفذ بواسطة تدفق المنحل بالكهرباء حول القطب منفذ وحول نهاية الشعرية.
      2. استخدام التطلع الذاتي للبخاخات لتقليل الشفط من خلال فصل الشعرية واعتماد معدل التدفق إلى القيمة المثلى التي يحتاجها البخاخات.
      3. تحضير الأجزاء التالية من الجدول 2 لتحميل هذه الواجهة المنزلية الصنع.
    2. إعداد واجهة بسيطة
      ملاحظة: استخدام الشكل 1 لمتابعة وصف الجزء تصاعد واجهة بسيطة. وتشير الأرقام الواردة في الشكل 1 وفي النص التالي إلى الأرقام الواردة في الجدول 2.
      1. بدء تركيب واجهة عن طريق ربط اثنين من 3-way الإناث Luer الموصلات (رقم 3) مع موصل مخروط لوبر ذكر (رقم 4). قم بتوصيل الطرف الأيسر من شريط Luer 3-way السفلي إلى موصل الذكور وذلك إلى الاتصال الأوسط لـ Luer 3-way العلوي.
      2. وضع أنبوب 1 سم (رقم 1) على سلك Pt (رقم 7) وأنبوب سيليكون 1 سم (رقم 5) على الأخير، فوهة موصل Luer ذكر (رقم 2). إصلاح التجميع إلى الاتصال الأوسط من الرابط Luer 3-way السفلي (رقم 3) بواسطة دوران المسمار Luer-typical.
      3. دفع أنبوب 1 سم (No.1) على الطرف منفذ من الشعرية CE ووضعها حوالي 8-9 سم من نهاية.
      4. وضع أنبوب سيليكون 1 سم (رقم 5) على الأخير ووهة موصل Luer ذكر (رقم 2).
      5. وضع الجمعية بأكملها من اليسار من خلال شريط العلوي من موصل 3-way-T العلوي وإصلاح موصل Luer الذكور والنهاية اليسرى من أنثى 3-way Luer موصل (رقم 3) بواسطة دوران المسمار luer-نموذجي.
      6. إصلاح أنبوب سيليكون 25 سم (رقم 5) في فوهة موصل Luer ذكر (رقم 2) وإصلاح التجميع بأكمله في نهاية أسفل (يمين) شريط من أقل 3-way Luer موصل (No.3) بواسطة دوران لوير نموذجي.
      7. اتخاذ أنبوب السيليكون 1 سم (No.6) ودفعه 5 ملم على نهاية البخاخة بإحكام في حين يتم توصيل الثاني مخروط Luer الذكور (رقم 4) بإحكام في الجزء جاحظ من أنبوب السيليكون.
      8. نقل الجزء أعلاه واجهة شنت في وقت لاحق مع جاحظ CE الشعرية إلى مخروط الذكور في البخاخات. إدراج الشعيرية CE بعناية من خلال مخروط الذكور والمزيد من خلال الجزء الأوسع من الشعيرات الدموية البخاخة حتى يحصل هذا الأخير ضيقة. وبالنظر إلى أن طول جاحظ من الشعرية تم اختيار مناسب، والإناث العلوي 3-way Luer موصل الآن يناسب أيضا بإحكام إلى مخروط الذكور.
      9. قم بتصحيح طول الشعر الشعري الناسج إذا لزم الأمر، عن طريق تحريك الشعيرات الدموية (إلى الأمام/الخلف) عند الأنبوب (رقم 1) حيث يدخل الواجهة الذاتية الصنع.
        ملاحظة: إن الموضع الأمثل للربعية CE في بداية الشعيرات الدموية البخاخة ليس بالغ الأهمية. ومع ذلك، لا تدفع الشعيرية CE قريبة جداً من الجزء الضيق من الشعيرات الدموية البخاز. وهذا يمكن أن يعوق أو يمنع تدفق المنحل بالكهرباء منفذ. أيضا، وهذا من شأنه أن يقطع الاتصال الكهربائي إلى القطب منفذ وزيادة الشفط من خلال CE الشعرية، مما أدى إلى فصل بالانزعاج. بدورها، لا تبقي نهاية الشعيرية CE بعيدا جدا عن الشعيرات الدموية المرذاذ منذ ذلك الحين قمم حادة فصل سيتم توسيعها وسيتم فقدان القرار.
      10. استخدام عدسة لتحديد أفضل موقف.
        ملاحظة: يظهر الشكل 1 (أسفل اليمين) الموضع الأمثل لـ CE-الشعرية داخل البخاخات.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي وتركيب واجهة CE-ICP-MS. ويحدد التخطيطي الأجزاء الفردية لتركيب متدرج من واجهة CE-ICP-MS البسيطة والرخيصة. تظهر النافذة صورة لتحديد الموضع الأمثل للربع الشعري في البخاخات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا. جزء تستخدم ل
1 أنابيب (الأخضر والبرتقالي رمز اللون)، 2 س س 1 سم تحديد الشعيرات الدموية وكهربية منفذ في أجزاء Luer والحفاظ على ضيق
2 Luer, ذكر, 3 x, مناسبة لمعرف 1.6 مم أنابيب السيليكون اتصال أنبوب سيليكون إلى منفذ المنحل بالكهرباء والمعونة لتحديد CE الشعرية وPt-سلك القطب
3 3-way-Luer, أنثى, 2 x T-قطعة لتوصيل القطب، الشعيرات الدموية وتدفق منفذ يستنشق
4 مخروط لوير، ذكر، 2 x ربط Luers الإناث إلى بعضها البعض وإلى البخاخات
5 أنبوب سيليكون، معرف 1.6 مم، جدار 0.8 مم، 2 × 1 سم، 1x ca. 25 سم أ) 1cm؛ اضيق CE الشعرية إلى واجهة،
ب) 1cm؛ إحكام Pt-الأسلاك إلى واجهة
ج) 25 سم؛ اتصال من قارورة المنحل بالكهرباء للمنفذ إلى واجهة
6 أنبوب سيليكون، ID 3 مم، جدار 1.2 مم، ca.1 سم إحكام مخروط Luer إلى البخاخات
7 سلك بلاتيني منفذ كهربائي

الجدول 2: أجزاء لبناء واجهة بسيطة، عصامي CE-ICP-MS. وتشير الأرقام أيضاً إلى الشكل 1 والوصف في النص.

4- التحضير للقياس

ملاحظة: قبل القياس، يجب مسح الشعيرات الدموية بمحلول قلوي قوي (هنا: 12% TMAH) للتنظيف ثم تعبئة بالكهرباء الخلفية. لتحسين فصل بنيت ساندويتش التخزين المؤقت التراص حول العينة على أساس الموصلية والتدرجات pH. يلخص الجدول 3 خطوات التحضير المتتالية للشعر الشعري ، والتي يتم معالجتها تلقائيًا بواسطة الأداة وفقًا للطريقة المبرمجة:

الخطوة-لا خطوه الكيميائيه حاله
  إعداد عمود CE
الإعدادية 1 تنظيف الشعيرات الدموية 12 % TMAH 4 بار، 1 دقيقة.
الإعدادية 2 الشعيرات الدموية تطهير مع الكهارل الخلفية 20 mM HCl 4 بار، 1 دقيقة.
الإعدادية 3 التراص: الشوارد الرائدة 12 % TMAH 150 مبار، 3 s
الإعدادية 4 حقن عينه 150 مبار، 3 s
الإعدادية 5 التراص: إنهاء المنحل بالكهرباء 0.05 م م HCl 150 مبار، 3 s

الجدول 3: خطوات إعداد الشعيرات الدموية قبل القياس. تتم برمجة هذه الخطوات مع برنامج نظام CE في طريقة CE وتشمل حقن العينة المضغوطة وبناء "ساندويتش التراص" حول العينة.

  1. برنامج أسلوب CE، الذي يتم تنفيذ على التوالي الخطوات الواردة في الجدول 3.
  2. تعريف جدول نموذج وتسلسل في برنامج CE ونسخ هذا التسلسل أيضا في برنامج ICP-MS.

5 - القياس وتقييم البيانات

  1. بدء تشغيل الأسلوب في صك CE. بعد الإعداد المبرمج وملء الشعيرات الدموية، يبدأ القياس تلقائيا بمجرد أن تكون قارورة المدخل، التي تحتوي على 20 mM HCl، في وضعية مدخل الشعيرات الدموية. يتم إرسال "بدء الزناد" إلى ICP-MS، الذي يبدأ الرصد على الخط من نظائر Fe.
    ملاحظة: يستخدم الفصل جهدًا جهدًا 25 كيلو فولت. طول المدة الموسعة من الشعرية، اللازمة لربط CE-الصك إلى ICP-MS، يسبب وقت الانفصال لزيادة دون داع. لذلك، يتم دعم الفصل من قبل ضغط منخفض من 250 mbar في مدخل. والكهرباء الذاتي يستنشق في منفذ هو 5 M HCl. يستمر التحليل الكلي 3 دقائق للعينات ذات الموصلية المعتدلة. في إطار إشارة برنامج ICP-MS يمكن ملاحظة المخطط الكهربائي أثناء الركض. وفي نهاية كل عينة، يتم تلقائياً إنشاء ملفين للبيانات، يمكن الوصول أحدهما من برنامجيات الصكوك فقط من مصرف البيانات الداخلي، والثاني في مجلد التصدير بصيغة "xl" أو "txt"، ويمكن الوصول إليها بواسطة وظيفة الاستيراد من برنامج كروماتوغرافي منتظم.
  2. الرجوع إلى دليل البرامج من صك ICP-MS لتصدير الملفات إلى برامج الكروماتوغرافيا.

Representative Results

قياسات المعايير والمعايرة
تم توضيح أوقات الهجرة عن طريق الحقن القياسية الفردية: تم رصد معيار Fe (III) في 118 s من وقت الهجرة ومعيار Fe (II) في 136 s من وقت الهجرة. وحُسبت حدود الكشف باستخدام معيار 3 σ الذي يشير إلى الضوضاء الأساسية، وكان التركيز القياسي لـ 50 ميكروغرام/ل. ل. ل. لود(Fe(II) 3.1 ميكروغرام/لتر وكان اللد(Fe(III) 3.2 ميكروغرام/ل. كانت معايرة منطقة الذروة لكل من أنواع الحديد خطية من LOD إلى 150 ميكروغرام/لتر. بينما ثبت الخطية من Fe (III) أيضاً لتركيز أعلى، فانقص ميل منحنى المعايرة لـ Fe(II). واعتبر حد تركيز أعلى 150 ميكروغرام/لتر كافياً لأن العينات الأحيائية ذات الصلة بتحديد Fe(II)/(III) عادة ما يكون تركيز Fe أقل. في حالة التركيز الأعلى، قد تضعف العينات وفقا لذلك. تم فحص معايرة ذروة الارتفاع حتى 600 ميكروغرام/لتر وأظهرت خطية على النطاق الذي تم اختباره بأكمله. وهذا ما يظهر في الشكل 2.

Figure 2
الشكل 2: منحنيات المعايرة (ذروة الارتفاع) من Fe(III) و Fe(II). ذروة ارتفاع المعايرة ذات الصلة من كل من الأنواع الحمراء Fe خطية مع منحدر من ca. 161 * س الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل لـ SH-SY5Y خلية lysate
أظهر تحليل الخلية SH-SY5Y هجرة أبطأ قليلاً لأنواع الأكسدة الحمراء الحديدية بسبب الموصلية الأعلى إلى حد ما. Fe(III) تم رصدها في 124 s من وقت الهجرة، Fe(II) في 158 s وقت الهجرة. وكان الوقت هجرة الدقة في SH-SY5Y خلية lysate 2% ل Fe (III) و 3% ل Fe (II). وكشفت القياسات الكمية Fe (II) و Fe(III) باستخدام هذه الطريقة عن تركيز Fe(III) البالغ 330 ميكروغرام/لتر وتركيز Fe(II) 84 ميكروغرام/لتر، مما أدى إلى نسبة Fe(II)/Fe(III) قدرها 0.25. وقد ثبت في الشكل 3 56منتقاة Fe كهربية انتقائية في الشكل 3.

Figure 3
الشكل 3: 56مخطط كهربي خاص بـ FE لخلية SH-SY5Y. Fe(III) هو رصد في 123 s تصل إلى 58025 58025 افصل 5825 افصل بوضوح عن Fe(II) في 158 s، تصل إلى 22800 cps الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

منذ الحديد يلعب دورا بارزا في تطور نظام التشغيل، وبالتالي تسهيل الخلل الميتوكوندريا أو FTP، يتم عرض طريقة متعددة الاستخدامات CE-ICP-MS الكمية ل Fe(II) / FE (III) في هذه المقالة وتطبيقها بشكل مثالي في lysates الخلية. الطريقة المقدمة وقت التحليل القصير وأرقام الجدارة (LOQ، الدقة، الانتعاش) هي مناسبة للعينات كونها ذات الصلة ل speciation الأكسدة الحديد على وجه التحديد في البحوث العصبية والسرطان. مقارنة بالأساليب السابقة استناداً إلى LC، هذا الأسلوب المستند إلى CE هو عملياً مستقلة عن دفعات العمود والمشاكل إعادة إنتاج لوحظت سابقاً بعد تغيير عمود LC. تحضير الشعيرات الدموية قبل كل شوط هو < 4 دقائق ووقت التحليل لكل عينة مع ملوحة معتدلة تصل إلى 3 دقائق. وبصرف النظر عن تهمة الجزيء وحجمه، فإن وقت الهجرة في CZE يعتمد على التوصيلية في المكونات العينة، مما يسبب اختلاف وقت الهجرة أو التحولات عندما تؤثر العينات نفسها على الموصلية بشكل كبير. ومثل هذه التحولات في وقت الهجرة معروفة جيدا في الكهرباء الشعرية. هذه هي مشكلة CZE-immanent، والمعروفة من الأدب21،22. وكان المعايير وSSH-SY5Y lysates الخلية الموصلية المعتدلة ومتجانسة. وبالتالي، لم تظهر سوى تغييرات قليلة في أوقات الهجرة بدقة جيدة. بالنسبة للعينات ذات الموصلية العالية ، ومع ذلك ، يمكن ملاحظة أوقات الهجرة المطولة تصل إلى 5 دقائق. ولذلك، يوصى بإضافات قياسية لتحديد الأنواع بوضوح.

وهناك قضية حرجة في أطياف الأكسدة الحديد هو استقرار الأنواع (أي، صيانة Fe(II)/(III) التوازن) أثناء إعداد العينة8،13. يمكن أن تغير بسهولة درجة الأس الهيدروجيني غير الملائمة أو المواد الكيميائية الخيّرة وكذلك ظروف التخزين غير الملائمة مثل الأكسجين (الهواء) في ملامسة العينة أو كسر في التخزين العميق المجمدة توازن Fe(II)/(III). لذلك ، لإعداد lysates الخلية SH -SY5Y ، تم اختيار عازلة التحلل دون أي المواد الكيميائية chelating ، الأسي الفيزيولوجي ، ولكن تراكب الغاز الخامل أثناء إعداد العينة ، في حاويات العينة والتجميد العميق الفوري تم تطبيقه على هذه العينات.

في الأدب, واحدة يستطيع وجدت نُهُج شبه كميّة أن يراقب [فّيّ([2].. لتحسين فهم دور الحديد في الإجهاد التأكيدي، وضعت العديد من مجموعات البحث تحقيقات Fe (II) محددة لرصد شبه كمي وتصور الارتفاع الشاذ من الحديد الحديدي في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ ، مثل هذه التحقيقات لا تنظر Fe (III) ولا كمية ولكن الإبلاغ فقط "أكثر" أو "أقل" Fe (II)). حتى الآن، تتوفر مؤشرات حيوية قليلة فقط لتحديد نظام التشغيل و FPT، نظرا لعدم وجود طرق موثوقة لقياس في وقت واحد من الأنواع الحمراء Fe(II)/Fe(III)23،24. بعد أن كان هذا في الاعتبار ، فإن الطريقة المقدمة - تسهيل التحديد الكمي السريع لكل من Fe (III) و Fe(II) في شوط واحد - قد تصبح أداة واعدة لتعميق البصيرة في العمليات الجزيئية المعتمدة على الحديد.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم VV من خلال منحة البحوث داخل الأمعاء (Forschungsförderung) من المركز الطبي الجامعي غوتنغن وبرنامج أبحاث Kröner Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CE capillary CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany 105180-25
CE system PrinCe technolgies 0005.263 model PrinCe 760
Conical Superclear Tubes 15 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777704
Conical Superclear Tubes 50 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777694
FeCl2 * 4H2O Merck 103861
FeCl3 Merck 803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch ProLiquid 4001106HG
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm Chromatographie Service GmbH 105180-25
hydrochloric acid, 1 M Merck 1101652500 corrosive
ICP-MS Perkin Elmer N814003
Luer, 3-way female BioRad 7318229
Luer, cone male neoLab Migge 2-1895
Luer, male neoLab Migge 2-1880
Peakfit peak evaluation software Systat PeakFit 4.12
Pt-wire Carl Roth 0737.1
PVC tube ProLiquid 6000002
RIPA buffer Abcam ab156034
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % Merck 814748 corrosive
TYGON-tube R-3607 ProLiquid 3700203A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11, (9), 536-544 (2015).
  2. Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
  3. Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2, (2), 144-156 (2018).
  4. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13, (5), 342-355 (2013).
  5. Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149, (1), 43-50 (2000).
  6. Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482, (3), 419-425 (2017).
  7. Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11, (5), 939-954 (2009).
  8. Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
  9. Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26, (12), 1414-1423 (2015).
  10. Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, (5), 1060-1072 (2012).
  11. Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171, (2), 273-285 (2017).
  12. Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28, (9), 1380-1386 (2007).
  13. Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6, (4), 921-931 (2014).
  14. Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
  15. Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10, (9), (2015).
  16. Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147, (6), 831-848 (2018).
  17. Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
  18. Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
  19. Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, (147), (2012).
  20. Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050, (1), 69-76 (2004).
  21. Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
  22. Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716, (1-2), 323-329 (1995).
  23. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, (1-2), 317-331 (2014).
  24. Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23, (2), 225-235 (2016).
إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).More

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter