Summary
Denne jernrødox-speciationsmetode er baseret på kapillær elektroforese-induktivt koblet plasmamassespektrometri med prøvestabling kombineret med kort analyse i ét løb. Metoden analyserer hurtigt og giver lave kvantificeringsgrænser for jernrødox-arter på tværs af en bred vifte af væv og biofluidprøver.
Abstract
Dyshomeostase af jernmetabolisme er tegnede sig i den patofysiologiske rammer for mange sygdomme, herunder kræft og flere neurodegenerative tilstande. Overdreven jern resulterer i fri redox-aktiv Fe (II) og kan forårsage ødelæggende virkninger i cellen som oxidativstress (OS) og død ved lipidperoxidation kendt som ferroptose (FPT). Derfor er kvantitative målinger af jernholdigt (Fe(II)) og jern (Fe(III)) jern i stedet for total Fe-bestemmelse nøglen til tættere indsigt i disse skadelige processer. Da Fe(II)/(III) bestemmelser kan hæmmes af hurtige redox-state-skift og lave koncentrationer i relevante prøver, som cerebrospinalvæske (CSF), bør der være metoder til rådighed, der hurtigt analyserer og giver lave kvantificeringsgrænser (LOQ). Kapillær elektroforese (CE) giver fordelen ved hurtig Fe(II)/Fe(III) adskillelse og fungerer uden en stationær fase, som kan forstyrre redox-balancen eller forårsage analysandstikning. CE kombineret med induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som detektor giver yderligere forbedring af detektionsfølsomheden og selektiviteten. Den præsenterede metode bruger 20 mM HCl som baggrundselelektrolyt og en spænding på +25 kV. Peak former og koncentration detektion grænser er forbedret ved ledningsevne-pH-stabling. For reduktion på 56[ArO]+blev ICP-MS opereret i den dynamiske reaktionscelletilstand (DRC) med NH3 som reaktionsgas. Metoden opnår en detektionsgrænse på 3 μg/L. På grund af stabling var højere injektionsvolumener mulige uden at hæmme adskillelsen, men forbedre LOD. Kalibreringer relateret til toparealet var lineære op til 150 μg/L. Målepræcisionen var 2,2% (Fe(III)) til 3,5% (Fe(II)). Migrationstid præcision var <3% for begge arter, bestemt i 1:2 fortyndet lysates af humane neuroblastom (SH-SY5Y) celler. Genopretningsforsøg med standard tilsætning viste nøjagtighed på 97% Fe(III) og 105 % Fe(II). I virkelige bioprøver som CSF kan migrationstiden variere alt efter varierende ledningsevne (dvs. saltholdighed). Topidentifikation bekræftes således ved standard tilsætning.
Introduction
I dag er det mest indlysende, at jern-medieret oxidativstress (OS) spiller en afgørende rolle i flere lidelser specifikt i neurodegenerative hjernesygdomme, som Alzheimers og Parkinsons sygdom samt i kræft1,,2,3,4. OS er tæt forbundet med tilstanden og balancen for redox-parret Fe(II)/Fe(III). Mens Fe(III) er redox-inaktiv, genererer Fe(II) kraftigt reaktive iltarter (ROS) ved katalysering H2O2 nedbrydning efterfulgt af hydroxyl radikal produktion og membran lipid peroxidation5,6. På molekylært niveau, Fe (II)-genereret ROS og peroxidiserede fosfolipider er et stærkt angreb på integriteten af proteiner, lipider og DNA7,8. En sådan skadelig cellulær dysfunktion blev påvist at fremkalde mitokondriel dysfunktion med nedsat ATP-indhold9 og kan endda udløse en programmeret nekrotisk celledød, kendt som ferroptosis (FPT)10,11. Derfor er kvantitativ Fe(II)/(III) redox-speciation af stor betydning i et bredt spektrum af rødox-relaterede lidelser.
Kemisk speciation er et veletableret værktøj til undersøgelse af sporstoffer biologiske rolle og stofskifte i almindelighed7,8 samt i neurodegenerative betingelser12,13,14,15,16,17. Metoder til Fe-redox speciation findes i litteraturen er typisk baseret på flydende kromatografi (LC) adskillelse. Noget af litteraturen bruger induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som et element selektiv detektor. Men i rutinemæssige LC arbejde, overdreven udrensning gange var nødvendig mellem kørsler. Endnu mere problematisk, batch-til-batch variation af LC kolonner tvunget re-optimering af elution betingelser efter hver kolonne ændring. Disse problemer hæmmer den høje gennemløbshastighed. Der kræves yderligere tid for at opnå acceptabel pålidelighed og grundigt evaluere metoden igen.
For at omgå disse ulemper præsenteres her en metode for Fe(II)/Fe(III) redox speciation baseret på kapillær elektroforese induktivt koblet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS). CE tilbyder forskellige fordele i forhold til LC18. Kapillærer har ingen stationær fase og derfor afhænger (næsten) ikke af batchidentitet. Når de er ældre eller blokeret, udskiftes de hurtigt og viser normalt uændret ydeevne. Udrensningen og rengøringstrinnene mellem prøverne er effektive og korte, og analysetiden pr. prøve er også kort.
Den præsenterede metode er pålidelig med gode merittal. Som en proof-of-princip, metoden anvendes til human dopaminerge neuroblastoma (SH-SY5Y) celle lysate, en prøve type vigtigt i neurodegeneration samt kræftforskning19.
Protocol
FORSIGTIG: Metoden anvender saltsyre (HCl, start fortyndinger fra ultrapure, koncentration 1 M) og tetramethylammoniumhydroxid (TMAH, start fortyndinger fra ultrapure, koncentration 25%). Begge stoffer er stærkt ætsende. Brug hud- og øjenbeskyttelse.
1. Forberedelse af elektrolytter
- Tilberedning af HCl-elektrolytter: baggrundselelektrolyt (20 mM HCl), udløbselelektrolyt (5 mM HCl) og termemlektrolyt (0,05 mM HCl)
- Der tilberedes 20 mM HCl i en 100 ml kolbe: Rør 2 ml 1 M HCl i kolben, fyldes op til mærket med ultrarent vand og rystes forsigtigt.
- Der tilberedes 5 mM HCl i en 100 ml kolbe: Rør 500 μL μL 1 M HCl i kolben, fyld det op til mærket med ultrarent vand og ryst forsigtigt.
- Forbered 0,05 mM HCl i to trin: Pipette 1 ml 20 mM HCl i en 100 ml kolbe, og derefter fyldes op til mærket med ultrarent vand og ryst forsigtigt. Derefter pipettes 2,5 ml af sidstnævnte opløsning i et 15 ml konisk rør (materialetabel), og der tilsættes 7,5 ml ultrarent vand, og ryst derefter forsigtigt.
- Forberedelse førende elektrolyt 12% TMAH i en 15 ml konisk rør: Pipette 4,8 ml 25% TMAH i røret, tilsæt 5,2 ml ultrarent vand og ryst forsigtigt.
BEMÆRK: 12% TMAH bruges til at rense og rengøre kapillær før hvert løb og som en førende elektrolyt foran den injicerede prøve).
2. Udarbejdelse og opbevaring af standarder og prøver
- Standarder
- For Fe(II) vejes 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O i en 100 ml kolbe og fyldes op til 100 ml-mærket med ultrarent vand i en koncentration på 100 mg Fe(II)/L. Ryst forsigtigt, indtil den er fuldstændig opløsning.
- For Fe(III) vejes 29,04 mg Fe(III)Cl3 i en 100 ml kolbe og fyldes op til 100 ml-mærket med ultrarent vand i en koncentration på 100 mg Fe(III)/L. Ryst forsigtigt, indtil den er fuldstændig opløsning.
- Hver standardopløsning fortyndes i henhold til tabel 1 for at forberede arbejdsstandardopløsningerne.
BEMÆRK: Efter klargøring af de daglige lageropløsninger fra 100 mg/l-lageropløsningen skal denne opbevares frosset. Efter udarbejdelse af de daglige standarder i henhold til tabel 1skal 1 mg/l-lageropløsningen aliquoteres til 1,5 ml volumener og opbevares frosset (bedst uden luft tilbage på toppen) i 1,5 ml rør. For hver ny dag optøes en daglig lagerhætte til udarbejdelse af daglige standarder og trækkes tilbage efter brug.
| Start koncentration | Pipetteringsvolumen | Fyld op med Milli-Q vand | Resulterende koncentration | Endeligt volumen | Brug af opløsning |
| 100 mg/L | 50 μL | 4950 μL | 1 mg/L | 50 mL | Daglig lagerløsning |
| 1 mg/L | 200 μL | 1800 μL | 100 μg/L | 2 ml | Standard |
| 100 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 100 μL | 1900 μL | 50 μg/L | 2 ml | Standard |
| 50 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 50 μL | 1950 μL | 25 μg/L | 2 ml | Standard |
| 25 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 25 μL | 1975μL | 12,5 μg/L | 2 ml | Standard |
| 12,5 μg/l | |||||
| 1 mg/L | 20 μL | 1980μL | 10 μg/L | 2 ml | Standard |
| 10 μg/L | |||||
| 0 | 2000 μL | 0 μg/L | 2 ml | Tom |
Tabel 1: Pipetteringsordning til forberedelse af standarderne.
- SH-SY5Y celle lysate
BEMÆRK: Cellen lysatet (SH-SY5Y) fungerede som Fe(II)/(III)-relevant biomatrix for at vise metodens ydeevne og pålidelighed.- Brug lysate fra tidligere kørende eksperimenter16. Følg denne celle lysate præparat undgå pH-ændringer eller kemikalier, der kan påvirke redox balance. Brug en modificeret radioimmunoprecipitationsanalyse (RIPA) lysis buffer (PBS pH 7.4, 0,5 % natriumdeoxycholate, 1 % NP-40), undgå metalchelatorer (såsom EDTA), reduktionsmidler (f.eks.
- Arbejde under en N2-atmosfærehæmmet oxidation af O2 fra omgivende luft og arbejde på is for at minimere enhver autoxidation, indtil lysatet blev opbevaret så hurtigt som muligt ved -80 °C under nitrogen atmosfæren.
3. Oprettelse af instrumenter til orddeling af CE til ICP-MS
- Sæt kapillær elektroforeseinstrumentet op.
BEMÆRK: I dette afsnit henvises læseren hovedsageligt til manualen for det respektive instrument, der er tilgængeligt i laboratoriet.- Monter en kapillær med en passende længde til at nå fra CE-instrumentets indsugningshætte til ICP-MS's forstøver. Monter kun kapillæren ved indløbssiden, og før den uden for instrumentet mod CE-ICP-MS-grænsefladen.
BEMÆRK: Ved orddeling af CE til ICP-MS blev der i denne protokol installeret en 90 cm smeltet silicakapillær (ID 50 μm) i henhold til den generelle beskrivelse af instrumental opsætning. Typisk vil kapillær størrelser på 70−100 cm være nødvendig, afhængigt af placeringen af instrumenterne i laboratoriet. - Afaktiver udløbsliften af CE-instrumentet i softwaren for at fungere problemfrit, da den ikke er i brug, når kapillæren ledes uden for CE-ICP-MS-grænsefladen.
- Installer et triggerkabel fra CE-instrument trigger-OUT til trigger-IN af ICP-MS-instrumentet.
- Vælg positioner for alle nødvendige opløsninger (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), standarder og prøver i instrumentets prøve- og opløsningsrotor og definer deres positioner i instrumentsoftwaren som sædvanligt (se instrumentets manual).
- Vælg rotor- og kapillærtemperatur for at være identisk ved 20 °C, da den er identisk med den kontrollerede laboratorietemperatur.
BEMÆRK: Der forekommer ingen temperaturgradient til kapillærdelene i og uden for CE-instrumentet.
- Monter en kapillær med en passende længde til at nå fra CE-instrumentets indsugningshætte til ICP-MS's forstøver. Monter kun kapillæren ved indløbssiden, og før den uden for instrumentet mod CE-ICP-MS-grænsefladen.
- Konfigurere ICP-MS-instrumentet
- Optimer ICP-MS-instrumentet i overensstemmelse med de daglige instrumentale standardopsætnings- og driftsprocedurer. Brug producentens protokol.
- Brug dynamisk reaktionscelleteknologi (DRC) med NH3 som DRC-gas med 0,6 ml/min NH3–flowrate og RPq-værdi = 0,45.
BEMÆRK: For jernspeciation er en metode programmeret med 56Fe, som er den mest udbredte Fe isotop (91,754% relativ overflod), men bliver alvorligt forstyrret fra [40Ar16O]+ klynge. En firdobbelt baseret ICP-MS i standardtilstand er praktisk talt blind, og detektoren i overløb ved denne isotop. Med ovenstående indstillinger (se trin 3.2.2) opnås der lave basislinjer og høj følsomhed (for regelmæssig total jernbestemmelse opnås LOD i det lave ng/L-område). - Vælg en dvæle tid indstilling pr isotop på 50 ms for overvågning selv skarpe og korte vises toppe under CE-adskillelse.
- Programmer den ICP-MS-metode, der skal udløses af CE-instrumentet.
- Konfigurere grænsefladen CE-ICP-MS
BEMÆRK: Der er hovedsagelig to muligheder for at forbinde CE-kapillær til ICP-MS. Følg de angivne beskrivelser om opsætning, hvis der bruges en kommerciel grænseflade. Denne protokol bruger en enkel, hjemmelavet grænseflade baseret på en tidligere publikation efter ændringer20. Centrale spørgsmål er en effektiv forstøvning med muligvis mindre fortynding af kapillær efflux bortset fra vedtagelsen af den samlede flowrate til forstøver for bedste forstøvning. Også minimering af en sugestrøm gennem adskillelse kapillær forårsaget af selvforstøver, og den elektriske tilslutning af den jordforbundne stikkontakt elektrode til kapillær ende er obligatoriske.- Valg af forstøver
- Brug en koncentrisk forstøver med lavt selvsugningsvolumen (f.eks. 100 μL/min),der passer ind i et lavvolumen sprøjtekammer.
BEMÆRK: Den lave optagelse vil kun forårsage moderat fortynding af kapillær efflux parallelt med den stadig optimerede forstøvning. Den elektriske tilslutning af udløbselektroden opnås ved hjælp af et elektrolytflow omkring udløbselektroden og omkring kapillærenden. - Brug selvforstøverens selvforstøver til at minimere sugeevnen gennem den adskillende kapillær og til vedtagelse af strømningshastigheden til den optimale værdi, som forstøveren har brug for.
- Forbered følgende dele fra tabel 2 til at montere denne hjemmelavede grænseflade.
- Brug en koncentrisk forstøver med lavt selvsugningsvolumen (f.eks. 100 μL/min),der passer ind i et lavvolumen sprøjtekammer.
- Opsætning af den enkle grænseflade
BEMÆRK: Brug figur 1 til at følge beskrivelsen af delmonteringen for den enkle grænseflade. Tallene i figur 1 og i den følgende tekst henviser til tallene i tabel 2.- Start montering af grænsefladen ved at forbinde de to 3-vejs vis Luer-stik (nr. 3) med et hankeluerstik (nr. 4). Tilslut den nederste 3-vejs Luer-bjælke til det mandlige stik og til den midterste forbindelse af den øverste 3-vejs Luer.
- Sæt et 1 cm rør (nr. 1) over Pt-wiren (nr. 7) og et 1 cm silikonerør (nr. 5) over sidstnævnte og dysen på et hanluerstik (nr. 2). Fastgør samlingen til den midterste tilslutning af det nederste 3-vejs Luer-stik (nr. 3) ved hjælp af luer-typisk skruerotation.
- Skub et 1 cm rør (nr. 1) over udløbsen af CE-kapillæren, og placer det ca. 8-9 cm fra enden.
- Sæt et 1 cm silikonerør (nr. 5) over sidstnævnte og dysen på en hanluerstik (nr. 2).
- Sæt hele samlingen fra venstre gennem baren på det øverste 3-vejs-T-stik, og fastgør det mandlige Luer-stik og venstre ende af det kvindelige 3-vejs Luer-stik (nr. 3) ved luer-typisk skruerotation.
- Fastgør silikonerøret på 25 cm (nr. 5) ved dysen på et hanluerstik (nr. 2), og fastgør hele samlingen i den nederste (højre) ende af baren fra det nederste 3-vejs Luer-stik (nr. 3) ved hjælp af Luer-typisk skruerotation.
- Tag 1 cm silikonerøret (nr. 6) og skub det 5 mm over enden af forstøveren stramt, mens det andet hankekekestik (nr. 4) er sat tæt ind i den fremspringende del af silikonerøret.
- Flyt ovenstående monterede interface del efterfølgende med fremspringende CE kapillær til den mandlige kegle på forstøveren. Sæt CE kapillær omhyggeligt gennem den mandlige kegle og videre gennem den bredere del af forstøver kapillær, indtil sidstnævnte bliver smal. I betragtning af, at kapillærens fremspringende længde blev valgt på passende vis, passer det øverste 3-vejs Luer-stik nu også tæt til den mandlige kegle.
- Længden af den fremspringende kapillær længde korrigeres om nødvendigt ved at flytte kapillæren (frem/tilbage) ved røret (nr. 1), når du går ind i den selvfremstillede grænseflade.
BEMÆRK: Den optimale position af CE kapillær i begyndelsen af forstøver kapillær er ikke for kritisk. Men, skubbe CE kapillær for tæt på den smalle del af forstøver kapillær. Dette kan hindre eller blokere for udløbets elektrolytflow. Dette ville også afbryde den elektriske forbindelse til udløbselektroden og ville øge suget gennem CE kapillær, hvilket resulterer i forstyrret adskillelse. Til gengæld skal du ikke holde CE kapillær ende for langt væk fra forstøver kapillær siden da skarpe adskilte toppe ville blive udvidet og opløsning vil gå tabt. - Brug en linse til at identificere den bedste position.
BEMÆRK: Figur 1 (nederst til højre) viser den optimale position af CE-kapillær inde i forstøveren.
- Valg af forstøver
Figur 1: Skematisk og montering af CE-ICP-MS-grænsefladen. Skematisk identificerer enkeltdelene til trinvis montering af den enkle og billige CE-ICP-MS-grænseflade. Vinduet viser et billede af optimal positionering af CE-kapillær i forstøveren. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Nej. | Del | anvendes til |
| 1 | Slanger (grøn-orange farvekode), 2 x ca. 1 cm | fastgørelse af CE kapillær og udløbselektrode ved Luer-dele og holde tæt |
| 2 | Luer, han, 3 x, egnet til 1,6 mm ID silikoneslange | tilslutning af silikonerør til udløb elektrolyt og som støtte til fastsættelse AF CE kapillær og Pt-wire elektrode |
| 3 | 3-vejs-Luer, kvinde, 2 x | T-stykker til tilslutning af elektrode, kapillær og indsugning udløbsstrøm |
| 4 | Luer kegle, mand, 2 x | forbinder kvindelige Luers til hinanden og til forstøver |
| 5 | Silikonerør, 1,6 mm ID, 0,8 mm væg, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm | a) 1 cm; tætning af CE-kapillær til grænseflade b) 1 cm; stramme Pt-wire til interface c) 25 cm; tilslutning fra udløbsellektrolytkolbe til grænseflade |
| 6 | Silikonerør, 3 mm ID, 1,2 mm væg, ca.1 cm | stramning Luer kegle til forstøver |
| 7 | Platintråd | Udløbselektrode |
Tabel 2: Dele til opbygning af den enkle, selvfremstillede CE-ICP-MS-grænseflade. Tallene henviser også til figur 1 og beskrivelse i teksten.
4. Forberedelse til måling
BEMÆRK: Før måling skal kapillæren skylles med stærk alkalisk opløsning (her: 12% TMAH) til rengøring og derefter fyldes med baggrundselelektrolyt. For forbedret adskillelse er en stablingsbuffersandwich bygget op omkring prøven baseret på ledningsevne og pH-gradienter. Tabel 3 opsummerer kapillærens på hinanden følgende forberedelsestrin, som automatisk behandles af instrumentet efter programmeret metode:
| Trin-Nej | Trin | Kemiske | Betingelse |
| Udarbejdelse af CE-kolonne | |||
| Prep 1 | Kapillær rengøring | 12 % TMAH | 4 bar, 1 min. |
| Prep 2 | Kapillær udrensning med baggrundselelektrolyt | 20 mM HCl | 4 bar, 1 min. |
| Prep 3 | Stabling: førende elektrolyt | 12 % TMAH | 150 mbar, 3 s |
| Prep 4 | Injektion | Prøve | 150 mbar, 3 s |
| Prep 5 | Stabling: afslutning af elektrolyt | 0,05 mM HCl | 150 mbar, 3 s |
Tabel 3: Kapillær forberedelsestrin før måling. Disse trin er programmeret med CE-system software i CE-metode og omfatter trykprøve injektion og opbygning af en "stabling sandwich" omkring prøven.
- Programmer en CE-metode, som udfører trinnene i tabel 3.
- Definer en eksempeltabel og -sekvens i CE-software, og kopier også denne sekvens til ICP-MS-software.
5. Evaluering af målinger og data
- Start metoden på CE-instrumentet. Efter den programmerede klargøring og påfyldning af kapillæren starter målingen automatisk, så snart indsugningshætteglasset, der indeholder 20 mM HCl, er på plads ved kapillærindtag. "Start-trigger" sendes til ICP-MS, som starter onlineovervågningen af fe-isotoper.
BEMÆRK: Adskillelsen bruger en spænding på +25 kV. Kapillærens forlængede længde, som er nødvendig for at forbinde CE-instrumentet med ICP-MS, medfører, at separationstiden øges unødigt. Derfor understøttes adskillelsen af et lavtryk på 250 mbar ved indløb. Den selvopsugede elektrolyt ved udgangen er 5 mM HCl. Den samlede analyse varer 3 minutter for prøver med moderat ledningsevne. I signalvinduet i ICP-MS-softwaren kan elektroferogrammet observeres under kørslen. I slutningen af hver prøve genereres der automatisk to datafiler, en kun tilgængelig fra instrumentsoftware fra intern databank, en anden i eksportmappen som formatet ".xl" eller ".txt", der er tilgængeligt ved importfunktion fra almindelig kromatografisoftware. - Se softwaremanualen for ICP-MS-instrumentet til eksport af filerne til kromatografisoftware.
Representative Results
Målinger af standarder og kalibrering
Migrationstiderne blev belyst ved enkelt standardinjekt injektioner: Fe(III)-standarden blev overvåget ved 118 s migrationstid og Fe(II)-standarden ved 136 s migrationstid. De påvisningsgrænser blev beregnet ved hjælp af 3σ kriterium baseret på basisstøj, og en standardkoncentration på 50 μg/L. LOD(Fe(II) var 3,1 μg/L,og LOD (Fe(III) var 3,2 μg/L. Kalibrering i topområde for begge jernarter var lineær fra LOD til 150 μg/L. Mens linearitet fe(III) også blev påvist for højere koncentration, faldt kalibreringskurvens hældning for Fe(II). En øvre koncentrationsgrænse på 150 μg/l blev anset for at være tilstrækkelig, da bioprøver, der er relevante for Fe(II)/(III)-bestemmelsen, typisk har lavere Fe-koncentration. I tilfælde af højere koncentration kan prøverne fortyndes i overensstemmelse hermed. Kalibrering i spidshøjde blev kontrolleret op til 600 μg/l og udviste linearitet over hele det testede område. Dette er vist i figur 2.
Figur 2: Kalibreringskurver (tophøjde) af Fe(III) og Fe(II). Peak højde-relaterede kalibreringer af begge Fe redox arter er lineære med en hældning på ca. 161 * X Klik her for at se en større version af dette tal.
Analyse af SH-SY5Y celle lysate
Analysen af SH-SY5Y celle lysatet viste en lidt langsommere migration for jernrødox arter på grund af den noget højere ledningsevne. Fe(III) blev overvåget ved 124 s migrationstid, Fe(II) ved 158 s migrationstid. Migrationstidspræcision i SH-SY5Y cellelysat var 2% for Fe(III) og 3% for Fe(II). Kvantitative Fe(II) og Fe(III) målinger ved hjælp af denne metode viste Fe(III) koncentration på 330 μg/l og Fe(II) koncentration 84 μg/L, begge resulterer i et Fe(II)/Fe(III) forhold på 0,25. Det respektive 56feselektive elektroferogram er vist i figur 3.
Figur 3: 56Fe-specifikt elektroferogram af SH-SY5Y celle lysat. Fe(III) overvåges ved 123 s nå 58025 cps peak højde, er klart adskilt fra Fe (II) på 158 s, nå 22800 cps Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Da jern spiller en fremtrædende rolle i OS progression, hvilket letter mitokondriel dysfunktion eller FTP, en alsidig CE-ICP-MS baseret kvantitativ metode til samtidig Fe (II)/Fe (III) speciation præsenteres i denne artikel, og dens anvendelse er eksemplarisk påvist i celle lysater. Metoden gav kort analysetid, og tallene for fortjeneste (LOQ, præcision, restitution) er velegnede til prøver, der er relevante for jernrødox-speciation specifikt i neurodegenerativ forskning og kræftforskning. Sammenlignet med tidligere metoder baseret på LC er denne CE-baserede metode praktisk taget uafhængig af kolonnebats partier og tidligere observerede reproducerbarhedsproblemer efter LC-kolonneændring. Kapillær forberedelse før hvert løb er <4 minutter og analysetid pr. prøve med moderat saltholdighed op til 3 min. Bortset fra molekyleladning og størrelse afhænger migrationstiden i CZE af ledningsevne ved prøvestikket, hvilket forårsager migrationstidsvariation eller skift, når prøverne selv påvirker ledningsevnen betydeligt. Sådanne ændringer i migrationstiden er velkendte i kapillær elektroforese. Dette er en CZE-immanent problem, kendt fra litteratur21,,22. Standarder og SH-SY5Y cellelysater havde moderat og homogen ledningsevne. Derfor viste migrationstider kun små ændringer med god præcision. For prøver med høj ledningsevne kan der dog observeres længere migrationstider på op til 5 min. Derfor anbefales standard tilføjelser til klar artsidentifikation.
Et kritisk spørgsmål i forbindelse med rødox-præsidation af jern er artsstabilitet (dvs. opretholdelse af Fe(II)/(III) ligevægt) under prøvepræparatet8,13. Uhensigtsmæssige pH- eller chelaterende kemikalier samt uhensigtsmæssige opbevaringsforhold såsom ilt (luft) i kontakt med prøve eller brud på dybfrosset opbevaring kan nemt ændre Fe(II)/(III)-balancen. Til fremstilling af SH-SY5Y-cellelysater blev der derfor valgt en lysisbuffer uden chelaterende kemikalier, fysiologisk pH, men inert gasoverlejring under prøvepræparatet blev der anvendt en lysisbuffer for disse prøver.
I litteraturen kan man finde semi-kvantitative tilgange til at overvåge Fe(II). For bedre forståelse af jern's rolle i oxidativstress, flere forskergrupper udviklet Fe (II)-specifikke sonder til semi-kvantitativt overvåge og visualisere afvigende højde af jernholdige jern in vitro. Men vigtigt at bemærke, sådanne sonder ikke overveje Fe (III) og ikke kvantificere, men rapporterer bare "mere" eller "mindre" Fe(II)). Til dato er der kun få biomarkører til rådighed til bestemmelse af OS og FPT, fordi der ikke findes pålidelige metoder til samtidig kvantificering af Fe(II)/Fe(III) redox-arterne23,24. Med dette in mente kan den præsenterede metode - der letter hurtig kvantificering af både Fe(III) og Fe(II) i ét løb - blive et lovende redskab til at uddybe indsigten i jernafhængige molekylære processer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
VV blev støttet af det intramurale forskningstilskud (Forschungsförderung) fra University Medical Center Göttingen og Else Kröners forskningsprogram under Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
| Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
| Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
| Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
| Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
| Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
| Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
| TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |
References
- Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
- Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
- Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
- Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
- Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
- Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
- Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
- Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
- Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
- Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
- Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
- Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
- Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
- Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
- Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
- Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
- Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
- Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
- Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).
