Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

doi: 10.3791/61055 Published: May 4, 2020

Summary

שיטת הדגימה של רדוקס ברזל מבוססת על ספקטרומטריה של מסת פלזמה בשילוב עם דגימה בשילוב עם ניתוח קצר בריצה אחת. השיטה מנתחת במהירות ומספקת מגבלות נמוכות של כימות עבור מיני רדוקס ברזל על פני מגוון רחב של רקמות ודגימות נוזל ביולוגי.

Abstract

Dyshomeostasis של חילוף החומרים ברזל הוא בחשבון במסגרת פתופיזיולוגית של מחלות רבות, כולל סרטן ומספר מצבים ניווניות. ברזל מוגזם תוצאות Fe(II) redox-פעיל חינם והוא יכול לגרום להשפעות הרסניות בתוך התא כמו סטרס חמצוני (OS) ומוות על ידי חמצון שומנים המכונה ferroptosis (FPT). לכן, מדידות כמותיות של ברזל ברזל ברזל (Fe(II) ו ferric (Fe(III) ולא נחישות Fe מוחלטת היא המפתח לתובנה קרובה יותר לתוך תהליכים מזיקים אלה. מאז Fe(II)/(III) החלטות יכול להיות מעוכב על ידי משמרות מצב redox מהירה וריכוזים נמוכים בדגימות רלוונטיות, כמו נוזל מוחי שדרתי (CSF), שיטות צריך להיות זמין לנתח במהירות ולספק מגבלות נמוכות של כימות (LOQ). אלקטרופורזה נימה (CE) מציעה את היתרון של הפרדה מהירה Fe(II)/Fe(III) ועובדת ללא שלב נייח, מה שעלול להפריע לאיזון הרדוקס או לגרום להידבקות אנליטית. CE בשילוב עם ספקטרומטריה מסת פלזמה בשילוב השראתי (ICP-MS) כמו גלאי מציע שיפור נוסף של רגישות זיהוי וסלקטיביות. השיטה המוצגת משתמשת ב-20 mM HCl כאלקטרוליט רקע ולחץ של +25 kV. צורות שיא ומגבלות זיהוי ריכוז משופרות על-ידי מוליכות-pH-סידור בערימה. להפחתת 56[ArO]+, ICP-MS הופעל במצב תא תגובה דינמי (DRC) עם NH3 כגז תגובה. השיטה משיגה מגבלה של זיהוי (LOD) של 3 μg / L. עקב סידור בערימה, נפחי הזרקה גבוהים יותר היו אפשריים מבלי לפגוע בהפרדה אלא לשפר את LOD. כיולים הקשורים לאזור השיא היו ליניאריים עד 150 μg / L. דיוק מדידה היה 2.2% (Fe(III)) כדי 3.5% (Fe(II).). דיוק זמן הנדידה היה <3% עבור שני המינים, נקבע 1:2 lysates מדולל של תאי נוירובלסטומה אנושית (SH-SY5Y). ניסויי התאוששות עם תוספת סטנדרטית חשפו דיוק של 97% Fe(III) ו 105 % Fe(II). בדגימות ביולוגיות בחיים האמיתיים כמו CSF, זמן הנדידה יכול להשתנות בהתאם ל מוליכות משתנה (כלומר, ממליות). לפיכך, זיהוי שיא מאושר על ידי תוספת סטנדרטית.

Introduction

כיום, זה ברור ביותר כי סטרס חמצוני בתיווך ברזל (OS) ממלא תפקיד מכריע בהפרעות מרובות במיוחד בהפרעות מוחיות ניווניות, כמו אלצהיימר ומחלת פרקינסון, כמוגם בסרטן 1,,2,,3,,4. מערכת ההפעלה קשורה קשר הדוק למצב ולאיזון של הזוג הרדוקס Fe(II)/Fe(III). בעוד Fe(III) הוא redox-לא פעיל, Fe(II) מייצרת בעוצמה מינים חמצן תגובתי (ROS) על ידי פירוק H2O2 פירוק ואחריו ייצור רדיקלי hydroxyl ו peroxidation שומנים קרום5,,6. ברמה המולקולרית, FE(II)שנוצר ROS ו פוספוליפידים peroxidized הם התקפה חזקה לשלמות של חלבונים, שומנים ו-DNA7,,8. תפקוד תאי מזיק כזה הוכח כדי לגרום לתפקוד מיטוכונדריאלי עם ירידה ATP-תוכן9 ואפילו יכול לעורר מוות מתוכנת של תא נמק, המכונה פרופטוזיס (FPT)10,,11. לכן, ספקטורציה כמותית Fe(II)/(III) redox היא בעלת חשיבות רבה בספקטרום רחב של הפרעות הקשורות רדוקס.

ספקולציה כימית היא כלי מבוסס היטב לחקר של עקבות אלמנטים תפקיד ביולוגי וחילוףחומרים בכלל 7,,8, כמו גם בתנאים ניווניות12,13,,14,,15,16,17., שיטות לתווה Fe-redox שנמצאו בספרות מבוססות בדרך כלל על הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית (LC). חלק מהספרות משתמשות בספקטרומטריה של מסת פלזמה (ICP-MS) כגלאי סלקטיבי של אלמנט. עם זאת, בעבודה שגרתית LC, זמני טיהור מוגזמים היו נחוצים בין ריצות. וריאציה בעייתית אף יותר של עמודות LC כפתה מיטוב מחדש של תנאי ההתעלות לאחר כל שינוי עמודה. בעיות אלה פוגעות בתפוקה גבוהה. זמן נוסף נדרש כדי להשיג אמינות קבילה ולהעריך ביסודיות את השיטה שוב.

כדי לעקוף חסרונות אלה, שיטה מוצגת כאן עבור Fe(II)/Fe(III) ספקולציה redox המבוססת על אלקטרופורזה נימה בשילוב ספקטרומטריה מסת פלזמה (CE-ICP-MS). CE מציעה יתרונות שונים בהשוואה ל-LC18. נימים אין שלב נייח ולכן תלוי (כמעט) לא על זהות אצווה. כאשר הם מזדקנים או חסומים, הם מוחלפים במהירות, ובדרך כלל מציגים ביצועים ללא שינוי. שלבי הטיהור והניקוי בין הדגימות יעילים וקצרים, וזמן הניתוח לכל דגימה הוא קצר גם כן.

השיטה המוצגת אמינה עם דמויות טובות של כשרון. כהוכחה של עיקרון, השיטה מוחלת על נוירובלסטומה דופאמין אנושי (SH-SY5Y) תא lysate, סוג מדגם חשוב ניוון עצבי, כמוגם מחקר סרטן 19.

Protocol

התראה: השיטה משתמשת בחומצה הידרוכלורית (HCl, החל דילולים מ אולטרה-תכליתי, ריכוז 1 M) ו tetramethylammoniumhydroxide (TMAH, החל דילולים מ אולטרה פורה, ריכוז 25%). שני החומרים מאוד קורוזיביים. השתמש בהגנה על העור והעין.

1. הכנת אלקטרוליטים

  1. הכנת אלקטרוליטים HCl: אלקטרוליט רקע (20 mM HCl), אלקטרוליט שקע (5 mM HCl) וסיום אלקטרוליט (0.05 mM HCl)
    1. הכן 20 mM HCl בקבוקון 100 מ"ל: פיפטה 2 מ"ל של 1 M HCl לתוך הבקבוקון, למלא עד הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות.
    2. הכן 5 mM HCl בקבוקון 100 מ"ל: פיפטה 500 μL של 1 M HCl לתוך הבקבוקון, למלא את הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות.
    3. הכן 0.05 mM HCl בשני שלבים: פיפטה 1 מ"ל של 20 mM HCl לתוך בקבוקון 100 מ"ל, ולאחר מכן למלא את הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות. לאחר מכן, פיפטה 2.5 מ"ל של הפתרון האחרון לתוך צינור חורט 15 מ"ל(טבלת חומרים)ולהוסיף 7.5 מ"ל של מים אולטרה פוריים, ואז לנער בעדינות.
  2. הכנת אלקטרוליט מוביל 12% TMAH בצינור חורט 15 מ"ל: פיפטה 4.8 מ"ל של 25% TMAH לתוך הצינור, להוסיף 5.2 מ"ל של מים אולטרה פורים ולנער בעדינות.
    הערה: 12% TMAH משמש כדי לטהר ולנקות את הנחם לפני כל ריצה וכאלקטרוליט מוביל מול המדגם המוזרק).

2. הכנה ואחסון של תקנים ודוגמאות

  1. סטנדרטים
    1. עבור Fe(II), לשקול 35.61 מ"ג של Fe(II)Cl2·4H2O לתוך בקבוקון 100 מ"ל ולמלא עד סימן 100 מ"ל עם מים אולטרה פורים עבור 100 מ"ג Fe(II)/ L ריכוז מניות. לנער בעדינות עד פירוק מלא.
    2. עבור Fe(III), לשקול 29.04 מ"ג של Fe(III)Cl3 לתוך בקבוקון 100 מ"ל ולמלא עד סימן 100 מ"ל עם מים אולטרה פורים עבור 100 מ"ג Fe(III)/ L ריכוז מניות. לנער בעדינות עד פירוק מלא.
    3. תדלל כל פתרון סטנדרטי לפי טבלה 1 כדי להכין את הפתרונות הסטנדרטיים בעבודה.
      הערה: לאחר הכנת פתרונות המלאי היומיים מפתרון המניות 100 מ"ג/L, יש לאחסן את האחרון קפוא. לאחר הכנת הסטנדרטים היומיים על פי טבלה 1, פתרון מניות 1 מ"ג / L חייב להיות aliquoted לתוך 1.5 מ"ל כרכים ומאוחסנים קפוא (הטוב ביותר ללא אוויר עזב על גבי) בצינורות 1.5 מ"ל. עבור כל יום חדש, שווי מניות יומי אחד מפשיר להכנת סטנדרטים יומיים ונסוג לאחר השימוש.
ריכוז התחלתי עוצמת צנרת תתמלא במים מילי-קיו ריכוז שנוצר כרך סופי שימוש בפתרון
100 מ"ג/ל' 50 μL 4950 μL 1 מ"ג/L 50 מ"ל פתרון מניות יומי
1 מ"ג/L 200 μL 1800 μL 100 μg/ L 2 מ"ל סטנדרטי
100 μg/ L
1 מ"ג/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 מ"ל סטנדרטי
50 μg/L
1 מ"ג/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 מ"ל סטנדרטי
25 μg/L
1 מ"ג/L 25 μL בת אלון בן-4 12.5μg / L 2 מ"ל סטנדרטי
12.5 μg/ l
1 מ"ג/L 20 μL בת אלון בן-19 10 μg/ L 2 מ"ל סטנדרטי
10 μg/ L
0 2000 μL 0 μg/L 2 מ"ל ריק

טבלה 1: ערכת Pipetting להכנת הסטנדרטים.

  1. תא SH-SY5Y
    הערה: תא ליזל (SH-SY5Y) שימש Fe(II)/(III)-רלוונטי ביו-מטריצה כדי להראות את הביצועים והאמינות של השיטה.
    1. השתמשו בניסויים שהריץ בעבר16. בצע את התא הזה lysate הכנה הימנעות שינויי pH או כימיקלים שעשויים להשפיע על יתרת redox. השתמש במאגר פירוק פירוק רדיומונו-ערך (RIPA) ששונה (PBS pH 7.4, 0.5% נתרן deoxycholate, 1% NP-40), הימנעות מכלאטורים מתכת (כגון EDTA), הפחתת סוכנים (כגון DTT, 2-Mercaptoethanol) וחומרי ניקוי פעילי שטח אניוניים וסוכני תסביך מתכת (כגון SDS) למזעור שינויים שלאחר איסוף של Fe(II)/ Fe(III).
    2. לעבוד תחת N2 -אטמוספרהמעכבת חמצון על ידי O2 מאוויר הסביבה ולעבוד על קרח כדי למזער כל autoxidation עד lysate אוחסן בהקדם האפשרי ב -80 ° C תחת אטמוספרה חנקן.

3. הגדרת מכשירים למיקוף של CE ל- ICP-MS

  1. תארגן את מכשיר האלקטרופורזה של נימה.
    הערה: עבור סעיף זה, הקורא מופנה בעיקר למדריך של המכשיר המתאים הזמין במעבדה.
    1. התקן נימים עם אורך מתאים להגיע ממבען תפונת המקצה של מכשיר CE לערפילית של ICP-MS. התקן את נמק רק בצד היכנס ולהוביל אותו מחוץ למכשיר לכיוון ממשק CE-ICP-MS.
      הערה: עבור מיקוף CE ל- ICP-MS, בפרוטוקול זה הותקן נערך סיליקה מותך 90 ס"מ (מזהה 50 μm) בהתאם לתיאור ההתקנה האינסטרומנטלית הכללית. בדרך כלל, יש צורך בגדלים ננים של 70-100 ס"מ, בהתאם למיקום המכשירים במעבדה.
    2. תסיר את הפעלת המעלית של מכשיר CE בתוכנה לפעולה חלקה מכיוון שהוא אינו בשימוש כאשר נימים מופנים החוצה לממשק CE-ICP-MS.
    3. התקן כבל הדק מ- CE-instrument trigger-OUT כדי להפעיל-IN של מכשיר ICP-MS.
    4. בחר עמדות לכל הפתרונות הדרושים (20 mM HCl, 0.05 mM HCl, 12% TMAH), תקנים ודוגמאות בדגימה ופתרונות רוטור של המכשיר ולהגדיר את מיקומם בתוכנה המכשיר כרגיל (עיין במדריך של המכשיר).
    5. בחר את טמפרטורת הרוטור והנימי להיות זהים ב- 20 °C, כמו להיות זהה לטמפרטורת המעבדה המבוקרת.
      הערה: לא מתרחש מעבר צבע טמפרטורה לחלקי נימו בתוך ומחוץ למכשיר CE.
  2. הגדרת מכשיר ICP-MS
    1. מטב את מכשיר ICP-MS בהתאם להליכי ההתקנה והתפעול הסטנדרטיים האינסטרומנטליים היומיים. השתמש בפרוטוקול היצרן.
    2. השתמש בטכנולוגיית תא תגובה דינמית (DRC) עם NH3 כגז DRC, עם 0.6 מ"ל/דקה NH3–flowrate וערך RPq = 0.45.
      הערה: עבור ספקולנטיות ברזל, שיטה מתוכנתת עם 56Fe, להיות איזוטופ Fe הנפוץ ביותר (91.754% שפע יחסי), עם זאת, להיות מפריע באופן חמור מן [40Ar16O]+ אשכול. ICP-MS מבוסס quadrupole במצב סטנדרטי הוא כמעט עיוור ואת הגלאי בגלישה איזוטופ זה. עם ההגדרות לעיל (ראה שלב 3.2.2), תוכניות בסיסיות נמוכות ורגישות גבוהה מושגות (עבור קביעת ברזל כוללת רגילה LOD בטווח ng/L נמוך מושגת).
    3. בחר הגדרת זמן שהייה לכל איזוטופ ב 50 ms לניטור אפילו חדה וקצרה מופיעה פסגות במהלך CE-הפרדת.
    4. תכנת את שיטת ICP-MS לפעלת גורם מפעיל על-ידי מכשיר CE.
  3. הגדרת ממשק CE-ICP-MS
    הערה: קיימות בעיקר שתי אפשרויות לחיבור נימו CE ל- ICP-MS. בצע את התיאורים שסופקו אודות תוכנית ההתקנה אם נעשה שימוש בממשק מסחרי. פרוטוקול זה משתמש בממשק ביתי פשוט המבוסס על פרסום קודם לאחר שינויים20. בעיות מפתח הן ערפילית יעילה עם אולי פחות דילול של efflux הנימי מלבד אימוץ של flowrate הכולל לערפילית עבור ערפילית הטובה ביותר. כמו כן, מזעור זרימת יניקה באמצעות הפרדת הנימי שנגרם על ידי השאיפה העצמית מערפילית, ואת החיבור החשמלי של אלקטרודה שקע מקורקע לסוף הנימי הם חובה.
    1. בחירת ערפילית
      1. השתמש בערפילית קונצנטרית עם נפח נמוך לשאף עצמי (למשל, 100 μL/min) שמתאים לתא ספריי בנפח נמוך.
        הערה: הספיגה הנמוכה תגרום רק דילול מתון של efflux נימו במקביל ערפילית עדיין אופטימיזציה. חיבור חשמלי של אלקטרודה שקע מושגת על ידי זרימת אלקטרוליט סביב אלקטרודה שקע וסביב הקצה נימי.
      2. השתמש בשאיפה העצמית של הערפילית כדי למזער את היניקה באמצעות הנימי המפריד ולאימוץ קצב הזרימה לערך האופטימלי הדרוש לערפילית.
      3. הכן את החלקים הבאים מטבלה 2 כדי לטעון ממשק זה מרכב ביתי.
    2. הגדרת הממשק הפשוט
      הערה: השתמש באות 1 כדי לעקוב אחר התיאור של הרכבה חלקית עבור הממשק הפשוט. המספרים באות 1 ובטקסט הבא מתייחסים למספרים בטבלה 2.
      1. התחל להרכיב את הממשק על-ידי חיבור שני מחברי Luer נקבה תלת-כיוון (מס' 3) עם מחבר קונוס Luer זכר (מס' 4). חבר את הקצה השמאלי של סרגל Luer התחתון ל-3 כיוון למחבר הגברי ואת החיבור האמצעי של Luer 3-way העליון.
      2. שים שפופרת 1 ס"מ (מס' 1) מעל חוט ה-Pt (מס' 7) וצינור סיליקון של 1 ס"מ (מס' 5) מעל האחרון ועל זרבובית מחבר Luer זכר (מס' 2). תקן את ההרכבה לחיבור האמצעי של מחבר Luer התחתון (מס' 3) באמצעות סיבוב בורג אופייני ל-Luer.
      3. דחוף צינור 1 ס"מ (מס '1) מעל קצה שקע של נמת CE ולמקם אותו על 8-9 ס"מ מהסוף.
      4. שים צינור סיליקון 1 ס"מ (מס ' 5) על האחרון ואת זרבובית של מחבר Luer זכר (מס '2).
      5. מקם את כל ההרכבה משמאל דרך פס המחבר העליון של 3-way-T ותקן את מחבר Luer זכר ואת הקצה השמאלי של מחבר Luer 3-way נקבה (מס ' 3) על-ידי סיבוב בורג טיפוסי Luer.
      6. תקן את צינור הסיליקון ב-25 ס"מ (מס' 5) בזרבובית של מחבר Luer זכר (מס' 2) ותקן את כל ההרכבה בקצה התחתון (מימין) של הרף ממחבר Luer התחתון (מס' 3) על-ידי סיבוב ברגים טיפוסי של Luer.
      7. קח את צינור סיליקון 1 ס"מ (מס '6) ולדחוף אותו 5 מ"מ על קצה הערפילית בחוזקה בעוד מחבר קונוס Luer זכר השני (מס '4) מחובר בחוזקה לחלק הבולט של צינור הסיליקון.
      8. להעביר את חלק הממשק רכוב לעיל לאחר מכן עם נערך CE בולט לקונוס זכר בערפילית. הכנס את הנמת CE בזהירות דרך הקונוס הזכר והמשך דרך החלק הרחב יותר של הנימוי הערפילי עד האחרון מקבל צר. בהתחשב בכך שהאורך הבולט של נימים נבחר כראוי, מחבר Luer 3-way הנשי העליון עכשיו גם מתאים בחוזקה לקונוס זכר.
      9. תקן את אורך אורך הניים הבולט במידת הצורך, על-ידי הזזת הניח (קדימה/אחורה) בצינור (מס' 1) שבו נכנס לממשק מ-Self-Made.
        הערה: המיקום האופטימלי של הנימום CE בתחילת נימוי הערפילית אינו קריטי מדי. עם זאת, אל תדחוף את הנים CE קרוב מדי לחלק הצר של נימוי הערפילית. זה יכול לעכב או לחסום את זרימת האלקטרוליט של שקע. כמו כן, זה יפריע לחיבור החשמלי לאלקטרודת השקעים ויגדיל את היניקה באמצעות נמת CE, וכתוצאה מכך הפרדה מופרעת. בתורו, לא לשמור על קצה הנימוי CE רחוק מדי מן הנימוי הערפילי מאז פסגות מופרדות חדות יורחב ורזולוציה תאבד.
      10. השתמש בעדשה כדי לזהות את המיקום הטוב ביותר.
        הערה: איור 1 (מימין למטה) מציג את המיקום האופטימלי של CE-נמת בתוך הערפילית.

Figure 1
איור 1: סכמטי והרכבה של ממשק CE-ICP-MS. השרטוט מזהה את החלקים הבודדים להרכבה צעדית של ממשק CE-ICP-MS הפשוט והזול. החלון מציג תמונה של מיקום אופטימלי של הניח CE בערפילית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

לא. חלק משמש עבור
1 צינורות (קוד צבע ירוק-כתום), 2 x ca. 1 ס"מ תיקון נערך CE ואלקטרודה שקע בחלקי Luer ולשמור הדוק
2 Luer, זכר, 3 x, מתאים 1.6 מ"מ צינורות סיליקון מזהה חיבור של צינור סיליקון לשקע אלקטרוליט וכסיוע לתיקון נערך CE ואלקטרודה חוט Pt
3 3-way-Luer, נקבה, 2 x T-pieces לחיבור אלקטרודה, נימי וזרימת שקע שאף
4 קונוס Luer, זכר, 2 x חיבור לוארס נקבה זה לזה ולערפילית
5 צינור סיליקון, מזהה 1.6 מ"מ, קיר 0.8 מ"מ, 2 x 1 ס"מ, 1x ca. 25 ס"מ א) 1 ס"מ; נמת CE הדוקינג לממשק,
ב) 1 ס"מ; ההחזקה של חוט Pt לממשק
ג) 25 ס"מ; חיבור מבוקון אלקטרוליט שקע לממשק
6 צינור סיליקון, מזהה 3 מ"מ, קיר 1.2 מ"מ, ca.1 ס"מ הדוקינג קונוס לור לערפילית
7 חוט פלטינה אלקטרודה לשקעים

טבלה 2: חלקים לבניית ממשק CE-ICP-MS הפשוט מ-2. המספרים מתייחסים גם לא איור 1 ולתיאור בטקסט.

4. הכנה למדידה

הערה: לפני המדידה, יש לשטוף את הנחם בתמיסת אלקליין חזקה (כאן: 12% TMAH) לניקוי ולאחר מכן למלא אותה באלקטרוליט רקע. להפרדה משופרת נבנה כריך מאגר הערימה סביב המדגם בהתבסס על מוליכות ושוני צבע של pH. טבלה 3 מסכמת את שלבי ההכנה הרצופים של נמת הים, המעובדים באופן אוטומטי על-ידי הכלי בהתאם לשיטה מתוכנתת:

שלב-לא שלב כימי תנאי
  הכנת עמודת CE
הכנה 1 ניקוי ננים 12% TMAH 4 בר, 1 דקות
הכנה 2 טיהור נערך עם אלקטרוליט רקע 20 מ', ה.א.ל. 4 בר, 1 דקות
הכנה 3 סידור בערימה: אלקטרוליט מוביל 12% TMAH 150 mbar, 3 שניות
הכנה 4 הזרקת לדוגמה 150 mbar, 3 שניות
הכנה 5 סידור בערימה: הפסקת אלקטרוליט 0.05 מ" HCl 150 mbar, 3 שניות

טבלה 3: שלבי הכנה ננים לפני המדידה. שלבים אלה מתוכנתים עם תוכנת CE-system בשיטת CE וכוללים הזרקת מדגם בלחץ והצטברות של "כריך סידור בערימה" סביב הדגימה.

  1. תכנת שיטת CE, אשר מבצעת ברצף את השלבים שניתנו בטבלה 3.
  2. הגדר טבלה ורצף לדוגמה בתוכנה CE והעתק רצף זה גם לתוכנת ICP-MS.

5. מדידה והערכת נתונים

  1. הפעל את השיטה בכלי CE. לאחר ההכנה והמילוי המתוכנתים של נימות, המדידה מתחילה באופן אוטומטי ברגע שמבען המיקום, המכיל 20 מ"ר HCl, נמצא במיקום במקלט נימות. "הפעלת ההדק" נשלחת ל-ICP-MS, המפעילה את הניטור התוך-ליין של איזוטופים.
    הערה: ההפרדה משתמשת במתח של +25 kV. האורך המורחב של הניח, הנחוץ לחיבור מכשיר CE ל- ICP-MS, גורם להארכת זמן ההפרדה שלא לצורך. לכן, ההפרדה נתמכת על ידי לחץ נמוך של 250 mbar בהכנסה. האלקטרוליט המושאף העצמי בשקע הוא 5 מ"מ HCl. הניתוח הכולל נמשך 3 דקות עבור דגימות עם מוליכות מתונה. בחלון האות של תוכנת ICP-MS ניתן לצפות אלקטרו פרוגרם במהלך הריצה. בסוף כל מדגם, שני קבצי נתונים נוצרים באופן אוטומטי, אחד נגיש רק מתוכנה מכשיר מבנק נתונים פנימי, השני בתיקיית הייצוא כמו ".xl" או ".txt" פורמט, נגיש על ידי פונקציית ייבוא מתוכנה כרומטוגרפיה רגילה.
  2. עיין במדריך התוכנה של מכשיר ICP-MS לייצוא הקבצים לתוכנת כרומטוגרפיה.

Representative Results

מדידות של תקנים ו כיול
זמני ההעברה הוברעו על-ידי זריקות סטנדרטיות בודדות: תקן Fe(III) היה במעקב ב- 118 שניות של זמן העברה ותקן Fe(II) ב- 136 שניות של זמן העברה. מגבלות הזיהוי חושבו באמצעות קריטריון 3大 המתייחס לרעש בסיסי וריכוז סטנדרטי של 50 μg/L. LOD(Fe(II) היה 3.1 μg/ L ו LOD(Fe(III) היה 3.2 μg / L. אזור שיא מבוסס כיול עבור שני מיני ברזל היה ליניארי מ LOD ל 150 μg / L. בעוד הליניאריות של Fe(III) הוכח גם עבור ריכוז גבוה יותר, השיפוע של עקומת כיול עבור Fe(II) ירד. מגבלת ריכוז עליון של 150 μg / L נחשב מספיק מאז דגימות ביולוגיות רלוונטי Fe(II)/(III) קביעה בדרך כלל יש ריכוז Fe נמוך יותר. במקרה של ריכוז גבוה יותר, דגימות עשויות להיות מדוללות בהתאם. כיול גובה שיא נבדק עד 600 μg / L והראה ליניאריות על פני כל הטווח שנבדק. פעולה זו מוצגת באות 2.

Figure 2
איור 2: עקומות כיול (גובה שיא) של Fe(III) ו- Fe(II). כיול שיא הקשור לגובה של שני מיני Fe redox הם ליניאריים עם מדרון של ca. 161 *X אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח של תאי SH-SY5Y
הניתוח של תאי SH-SY5Y הראה נדידה מעט איטית יותר עבור מיני רדוקס ברזל בשל מוליכות גבוהה במקצת. Fe(III) היה במעקב ב- 124 s של זמן העברה, Fe(II) ב 158 s של זמן העברה. דיוק זמן ההעברה בתא SH-SY5Y היה 2% עבור Fe(III) ו-3% עבור Fe(II). מדידות כמותיות Fe(II) ו-Fe(III) בשיטה זו חשפו ריכוז Fe(III) של ריכוז 330 μg/L ו-Fe(II) 84 μg/L, שניהם וכתוצאה מכך יחס Fe(II)/Fe(III) של 0.25. 56אלקטרופירוגרמה Fe סלקטיבית בהתאמה מדגים איור 3.

Figure 3
איור 3: 56אלקטרו-פרוגרמה ספציפית ל-FE של תאי SH-SY5Y. Fe(III) מנוטרת ב 123 s להגיע 58025 cps שיא גובה, להיות מופרד בבירור Fe(II) ב 158 s, להגיע 22800 cps אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מאז ברזל ממלא תפקיד בולט בהתקדמות מערכת ההפעלה, ובכך להקל על תפקוד מיטוכונדריאלי או FTP, שיטה כמותית מבוססת CE-ICP-MS רב-תכליתי עבור Fe(II)/Fe(III) הדגימה בו זמנית מוצג במאמר זה והיישום שלה מוצג למופת בתא lysates. השיטה סיפקה זמן ניתוח קצר ואת הנתונים של כשרון (LOQ, דיוק, התאוששות) מתאימים דגימות להיות רלוונטי עבור דגימה רדוקס ברזל במיוחד במחקר ניווניות וסרטן. בהשוואה לשיטות קודמות המבוססות על LC, שיטה זו מבוססת CE אינה תלויה כמעט בקבוצות עמודות ובעיות רבייה שנצפו בעבר לאחר שינוי עמודות LC. הכנת נימה לפני כל ריצה היא <4 דקות וזמן ניתוח לכל מדגם עם ממליוח מתון עד 3 דקות. מלבד טעינה וגודל מולקולה, זמן ההעברה ב- CZE תלוי מוליכות בתקע המדגם, אשר גורם וריאציה זמן העברה או משמרות כאשר דגימות עצמם להשפיע על מוליכות במידה ניכרת. שינויים כאלה בזמן הנדידה ידועים היטב באלקטרופורזה נימה. זוהי בעיה CZE-immanent, ידוע הספרות21,22. לסטנדרטים ולתאי SH-SY5Y הייתה מוליכות מתונה והומוגנית. כתוצאה מכך, זמני ההעברה הראו רק שינויים קטנים בדיוק טוב. עם זאת, עבור דגימות עם מוליכות גבוהה, ניתן לצפות זמני הגירה ממושכים עד 5 דקות. לכן, תוספות סטנדרטיות מומלצות לזיהוי מינים ברורים.

בעיה קריטית במפרט redox ברזל היא יציבות מינים (כלומר, תחזוקה של Fe(II)/(III) equilibria)במהלך הכנת מדגם 8,,13. כימיקלים לא הולמים מסוג pH או chelating, כמו גם תנאי אחסון בלתי הולמים כגון חמצן (אוויר) במגע עם מדגם או הפסקה באחסון קפוא עמוק, יכולים לשנות בקלות את יתרת Fe(II)/(III). לכן, להכנת תאי SH-SY5Y, נבחר מאגר ליסיס ללא כל כימיקלים, pH פיזיולוגי, אבל כיסוי גז אינרטי במהלך הכנת מדגם, במכולות מדגם והקפאה עמוקה מיידית הוחל עבור דגימות אלה.

בספרות, ניתן למצוא גישות חצי כמותיות כדי לפקח על Fe(II). להבנה משופרת של תפקידו של ברזל ב סטרס חמצוני, מספר קבוצות מחקר פיתחו Fe(II)בדיקות ספציפיות כדי לפקח חצי כמותית ולדמיין גובה חריג של ברזל ברזל ברזל במבחנה. עם זאת, חשוב לציין, בדיקות כאלה אינן מחשיבות את Fe(III) ולא מכמתות אלא מדווחות רק על "יותר" או "פחות" Fe(II). עד כה, רק כמה סמנים ביולוגיים זמינים כדי לקבוע מערכת ההפעלה ו- FPT, בשל היעדר שיטות אמינות כדי לכמת בו זמנית את Fe(II)/Fe(III) redoxמינים 23,24. לאחר שכך, השיטה המוצגת - הקלה על כימות מהיר של שניהם, Fe(III) ו-Fe(II) בריצה אחת - עשויה להפוך לכלי מבטיח להעמיק את התובנה בתהליכים מולקולריים תלויי ברזל.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

VV נתמך על ידי מענק המחקר התוך-מוראלי (Forschungsförderung) של המרכז הרפואי האוניברסיטאי גטינגן ותכנית המחקר Else Kröner של אלז קרונר-פרסניוס-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CE capillary CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany 105180-25
CE system PrinCe technolgies 0005.263 model PrinCe 760
Conical Superclear Tubes 15 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777704
Conical Superclear Tubes 50 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777694
FeCl2 * 4H2O Merck 103861
FeCl3 Merck 803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch ProLiquid 4001106HG
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm Chromatographie Service GmbH 105180-25
hydrochloric acid, 1 M Merck 1101652500 corrosive
ICP-MS Perkin Elmer N814003
Luer, 3-way female BioRad 7318229
Luer, cone male neoLab Migge 2-1895
Luer, male neoLab Migge 2-1880
Peakfit peak evaluation software Systat PeakFit 4.12
Pt-wire Carl Roth 0737.1
PVC tube ProLiquid 6000002
RIPA buffer Abcam ab156034
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % Merck 814748 corrosive
TYGON-tube R-3607 ProLiquid 3700203A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11, (9), 536-544 (2015).
  2. Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
  3. Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2, (2), 144-156 (2018).
  4. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13, (5), 342-355 (2013).
  5. Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149, (1), 43-50 (2000).
  6. Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482, (3), 419-425 (2017).
  7. Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11, (5), 939-954 (2009).
  8. Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
  9. Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26, (12), 1414-1423 (2015).
  10. Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, (5), 1060-1072 (2012).
  11. Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171, (2), 273-285 (2017).
  12. Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28, (9), 1380-1386 (2007).
  13. Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6, (4), 921-931 (2014).
  14. Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
  15. Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10, (9), (2015).
  16. Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147, (6), 831-848 (2018).
  17. Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
  18. Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
  19. Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, (147), (2012).
  20. Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050, (1), 69-76 (2004).
  21. Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
  22. Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716, (1-2), 323-329 (1995).
  23. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, (1-2), 317-331 (2014).
  24. Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23, (2), 225-235 (2016).
התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).More

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter