Summary
Denna järn redox speciation metod är baserad på kapillärelektrofores-induktivt kopplade plasma masspektrometri med provstapling kombinerat med kort analys i en körning. Metoden analyserar och ger snabbt låga kvantifieringsgränser för järn redox arter över ett varierat spektrum av vävnader och biofluidprover.
Abstract
Dyshomeosasis av järn metabolism redovisas i den patofysiologiska ramen för ett flertal sjukdomar, inklusive cancer och flera neurodegenerativa tillstånd. Överdriven järn resulterar i fri redox-aktiv Fe(II) och kan orsaka förödande effekter inom cellen som oxidativ stress (OS) och död genom lipid peroxidation kallas ferroptos (FPT). Därför är kvantitativa mätningar av järn (Fe(II)) och järnjärn (Ferc(III)) snarare än total Fe-bestämning nyckeln för närmare insikt i dessa skadliga processer. Eftersom Fe(II)/(III) bestämningar kan hämmas av snabba redox-state-skift och låga koncentrationer i relevanta prover, som ryggmärgsvätskan (CSF), bör metoder finnas tillgängliga som analyserar snabbt och ger låga kvantifieringsgränser (LOQ). Kapillärelektrofores (CE) erbjuder fördelen av snabb Fe(II)/Fe(III) separation och fungerar utan en stationär fas, vilket skulle kunna störa redoxbalansen eller orsaka analyt fastnar. CE kombinerat med induktivt kopplade plasma masspektrometri (ICP-MS) som en detektor erbjuder ytterligare förbättring av detektionskänslighet och selektivitet. Den presenterade metoden använder 20 mM HCl som bakgrundselektrolyt och en spänning på +25 kV. Toppformer och koncentrationsdetekteringsgränser förbättras genom konduktivitet-pH-stapling. För reduktion på 56[ArO]+,opererades ICP-MS i läget dynamic reaction cell (DRC) med NH3 som reaktionsgas. Metoden uppnår en gräns för detektion (LOD) på 3 μg/L. På grund av stapling var högre injektionsvolymer möjliga utan att hämma separationen men förbättra LOD. Kalibreringar relaterade till topparea var linjära upp till 150 μg/L. Mätprecisionen var 2,2% (Fe(III)) till 3,5% (Fe(II)). Migration tid precision var <3% för båda arterna, bestäms i 1:2 utspädda lysater av mänskliga neuroblastom (SH-SY5Y) celler. Återhämtningsexperiment med standardtillsats visade på noggrannhet på 97% Fe(III) och 105 % Fe(II). I verkliga bio-prover som CSF, migrationstiden kan variera beroende på varierande ledningsförmåga (dvs salthalt). Således bekräftas toppidentifiering genom standardtillsats.
Introduction
Idag är det tydligast att järnmedierad oxidativ stress (OS) spelar en avgörande roll i flera störningar specifikt i neurodegenerativa hjärnsjukdomar, som Alzheimers och Parkinsons sjukdom samt i cancer1,2,3,4. OS är nära besläktad med tillståndet och balansen i redox-paret Fe(II)/Fe(III). Medan Fe(III) är redox-inaktiv, Fe(II) potent genererar reaktiva syrearter (ROS) genom att katalysera H2O2 sönderdelning följt av hydroxylradikala produktion och membranlipidperoxidation5,6. På molekylär nivå, Fe(II)-genererade ROS och peroxiderade fosfolipider är en stark attack mot integriteten hos proteiner, lipider och DNA7,8. Sådan skadlig cellulär dysfunktion visades att framkalla mitokondriell dysfunktion med minskad ATP-innehåll9 och kan även utlösa en programmerad nekrotisk celldöd, känd som ferroptos (FPT)10,11. Därför kvantitativa Fe(II)/(III) redox speciation är av eminent betydelse i ett brett spektrum av redox-relaterade störningar.
Kemisk speciation är ett väletablerat verktyg för studier av spårämnen biologisk roll och metabolism i allmänhet7,8 samt vid neurodegenerativa tillstånd12,13,14,15,16,17. Metoder för Fe-redox speciation finns i litteraturen är vanligtvis baserade på flytande kromatografi (LC) separation. En del av litteraturen använder induktivt kopplade plasma masspektrometri (ICP-MS) som ett element selektiv detektor. Men i rutin LC arbete, behövdes överdriven utrensning gånger mellan körningar. Ännu mer problematiska, batch-till-batch-variation av LC-kolumner tvingade re-optimering av elution villkor efter varje kolumn förändring. Dessa problem hämmar hög genomströmning. Ytterligare tid krävs för att få acceptabel tillförlitlighet och grundligt utvärdera metoden igen.
För att kringgå dessa nackdelar presenteras här en metod för Fe(II)/Fe(III) redoxspeciering baserad på kapillärelektrofores induktivt kopplade plasma masspektrometri (CE-ICP-MS). CE erbjuder olika fördelar jämfört med LC18. Kapillärer har ingen stationär fas och därmed beror (nästan) inte på satsidentitet. När de åldras eller blockeras, ersätts de snabbt, visar vanligtvis oförändrad prestanda. Utrensnings- och rengöringsstegen mellan proverna är effektiva och korta, och analystiden per prov är också kort.
Den presenterade metoden är tillförlitlig med goda siffror av meriter. Som ett proof-of-princip, är metoden tillämpas på mänskliga dopaminerga neuroblastom (SH-SY5Y) cell lysate, ett prov typ viktigt i neurodegeneration samt cancerforskning19.
Protocol
FÖRSIKTIGHET: Metoden använder saltsyra (HCl, utgångsutspädningar från ultrapure, koncentration 1 M) och tetrametylammoniumhydroxid (TMAH, startutspädningar från ultrapure, koncentration 25%). Båda ämnena är starkt frätande. Använd hud- och ögonskydd.
1. Förbereda elektrolyter
- Förbereda HCl-elektrolyter: elektrolyt i bakgrunden (20 mM HCl), utloppselektrolyt (5 mM HCl) och avslutande elektrolyt (0,05 mM HCl)
- Förbered 20 mM HCl i en 100 mL-kolv: Pipett 2 mL på 1 M HCl i kolven, fyll upp till märket med ultrarent vatten och skaka försiktigt.
- Förbered 5 mM HCl i en 100 mL-kolv: Pipett 500 μL av 1 M HCl i kolven, fyll upp till märket med ultrapurevatten och skaka försiktigt.
- Förbered 0,05 mM HCl i två steg: Pipett 1 mL på 20 mM HCl i en 100 mL-kolv, och fyll sedan upp till märket med ultrarent vatten och skaka försiktigt. Därefter pipetteras 2,5 mL av den senare lösningen i ett 15 mL koniskt rör (Tabell of Materials) och tillsätt 7,5 mL ultrapure vatten, skaka sedan försiktigt.
- Förbereda ledande elektrolyt 12% TMAH i ett 15 mL koniskt rör: Pipett 4,8 mL av 25% TMAH i röret, tillsätt 5,2 mL ultrapure vatten och skaka försiktigt.
OBS: TMAH:en på 12 % används för att rensa ut och rengöra kapillären före varje körning och som en ledande elektrolyt framför det injicerade provet).
2. Beredning och förvaring av standarder och prover
- Standarder
- För Fe(II), väga 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O i en 100 mL-kolv och fyll upp till 100 mL-märket med ultrarent vatten för en 100 mg Fe(II)/L-lagerkoncentration. Skaka försiktigt tills fullständig upplösning.
- För Fe(III), väga 29,04 mg Fe(III)Cl3 till en 100 mL-kolv och fyll upp till 100 mL-märket med ultrarent vatten för en 100 mg Fe(III)/L-lagerkoncentration. Skaka försiktigt tills fullständig upplösning.
- Späd varje standardlösning enligt tabell 1 för att bereda arbetsstandardlösningarna.
OBS: Efter att ha förberett de dagliga stamlösningarna från stamlösningen 100 mg/L måste den senare förvaras fryst. Efter att ha förberett dygnsnormerna enligt tabell 1måste stamlösningen på 1 mg/L alikvotsbeläggas till 1,5 mL-volymer och förvaras fryst (bäst utan luft kvar på toppen) i 1,5 mL-rör. För varje ny dag tinas en daglig lagermössa för förberedelse av dagliga standarder och dras tillbaka efter användning.
| Startkoncentration | Pipetting volym | Fyll på med Milli-Q vatten | Resulterande koncentration | Slutlig volym | Användning av lösning |
| 100 mg/L | 50 μL | 4950 μL | 1 mg/L | 50 mL | Daglig lagerlösning |
| 1 mg/L | 200 μL | 1800 μL | 100 μg/L | 2 mL | Standard |
| 100 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 100 μL | 1900 μL | 50 μg/L | 2 mL | Standard |
| 50 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 50 μL | 1950 μL | 25 μg/L | 2 mL | Standard |
| 25 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 25 μL | 1975μL | 12,5μg/L | 2 mL | Standard |
| 12,5 μg/l | |||||
| 1 mg/L | 20 μL | 1980μL | 10 μg/L | 2 mL | Standard |
| 10 μg/L | |||||
| 0 | 2000 μL | 0 μg/L | 2 mL | Tom |
Tabell 1: Pipetting-ordningen för att förbereda normerna.
- SH-SY5Y cell lysate
OBS: Cellen lysate (SH-SY5Y) fungerade som Fe(II)/(III)-relevant bio-matris för att visa prestanda och tillförlitlighet av metoden.- Använd lysate från tidigare kör experiment16. Följ denna cell lysate preparat undvika pH-förändringar eller kemikalier som kan påverka redox balans. Använd en modifierad radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA) lysbuffert (PBS pH 7.4, 0,5 % natriumdeoxicholat, 1% NP-40), undvika metallkelatatorer (såsom EDTA), reduktionsmedel (såsom DTT, 2-Mercaptoethanol) och anjonbehandlade ytaktiva rengöringsmedel och metallkomplexmedel (såsom SDS) för att minimera ändringar efter insamling av fe(II)/Fe(III).
- Arbete under en N2-atmosfär hämmad oxidation av O2 från omgivningsluft och arbeta på is för att minimera eventuell autoxidation tills lysaten lagrades så snart som möjligt vid -80 °C under kväveatmosfären.
3. Ställa in instrument för avstavning av CE till ICP-MS
- Ställ in kapillärelektroforesinstrumentet.
OBS: För detta avsnitt hänvisas läsaren huvudsakligen till manualen för respektive instrument som finns i laboratoriet.- Installera en kapillär med lämplig längd att nå från inloppsflaskan till CE-instrumentet till nebulisatorn av ICP-MS. Installera kapillären endast vid inloppssidan och led den utanför instrumentet mot CE-ICP-MS-gränssnitt.
OBS: För avstavning CE till ICP-MS, i detta protokoll en 90 cm smält kiseldioxid kapillär (ID 50 μm) installerades enligt den allmänna instrumentala setup beskrivning. Typiskt kommer kapillärstorlekar på 70−100 cm att behövas, beroende på instrumentens placering i laboratoriet. - Avaktivera CE-instrumentets utloppshiss i programvaran för smidig drift eftersom den inte används när kapillären riktas utanför till CE-ICP-MS-gränssnittet.
- Installera en utlösarkabel från CE-instrument trigger-OUT till trigger-IN av ICP-MS-instrumentet.
- Välj positioner för alla nödvändiga lösningar (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), standarder och prover i provet & lösningar rotor av instrumentet och definiera sina positioner i instrumentet programvara som vanligt (hänvisa till handboken för instrumentet).
- Välj rotor och kapillärtemperatur som skall vara identiska vid 20 °C, som att vara identiska med den kontrollerade laboratorietemperaturen.
OBS: Ingen temperaturgradient till kapillärdelarna inuti och utanför CE-instrumentet förekommer.
- Installera en kapillär med lämplig längd att nå från inloppsflaskan till CE-instrumentet till nebulisatorn av ICP-MS. Installera kapillären endast vid inloppssidan och led den utanför instrumentet mot CE-ICP-MS-gränssnitt.
- Ställ in ICP-MS-instrumentet
- Optimera ICP-MS-instrumentet enligt de dagliga instrumentella standardinställnings- och driftprocedurerna. Använd tillverkarens protokoll.
- Använd DRC-teknik (Dynamic Reaction Cell) med NH3 som DRC-gas, med 0,6 mL/min NH3–flödes- och RPq-värde = 0,45.
OBS: För järnspeciation programmeras en metod med 56Fe, och är den mest förekommande Fe-isotopen (91,754% relativ förekomst), dock är allvarligt störd från den [40Ar16O]+ klustret. En quadrupole baserad ICP-MS i standardläge är praktiskt taget blind och detektorn i överflöd vid denna isotop. Med inställningarna ovan (se steg 3.2.2) uppnås låga baslinjer och hög känslighet (för regelbunden total järnbestämning LOD i det låga ng/L-intervallet uppnås). - Välj en dwell tidsinställning per isotop vid 50 ms för övervakning även skarpa och korta visas toppar under CE-separation.
- Programmera ICP-MS-metoden som ska utlösas av CE-instrumentet.
- Konfigurera CE-ICP-MS-gränssnittet
OBS: Det finns huvudsakligen två alternativ för att ansluta CE-kapillären till ICP-MS. Följ de tillhandahållna beskrivningarna om inställning om ett kommersiellt gränssnitt används. Detta protokoll använder ett enkelt, hemmagjort gränssnitt baserat på en tidigare publikation efter ändringar20. Nyckelfrågor är en effektiv nebulisering med möjligen mindre utspädning av kapillären efflux bortsett från antagandet av den totala flödeshastigheten till nebulisator för bästa nebulisering. Även minimering av ett sugflöde genom separerande kapillär orsakas av själv-aspiration från nebulisator, och den elektriska anslutningen av jordad utloppselektrod till kapilläränden är obligatoriska.- Nebulizer val
- Använd en koncentrisk nebulisator med låg självsspirarerande volym (t.ex. 100 μL/min) som passar in i en spraykammare med låg volym.
OBS: Det låga upptaget kommer att orsaka endast måttlig utspädning av kapillärs efflux parallellt med den fortfarande optimerade nebuliseringen. Elektrisk anslutning av uttagelektroden är fulländad vid en electrolyteflöde runt om uttagelektroden och runt om capillaryen avslutar. - Använd själv-aspirationen av nebulisatorn för att minimera suget genom den separerande kapillären och för antagande av flödeshastigheten till det optimala värde som nebulisatorn behöver.
- Förbered följande delar från tabell 2 för att montera detta hemmabyggda gränssnitt.
- Använd en koncentrisk nebulisator med låg självsspirarerande volym (t.ex. 100 μL/min) som passar in i en spraykammare med låg volym.
- Inställning av det enkla gränssnittet
OBS: Använd figur 1 för att följa beskrivningen av delmontering för det enkla gränssnittet. Siffrorna i figur 1 och i följande text hänvisar till talen i tabell 2.- Börja montera gränssnittet genom att ansluta de två 3-vägs kvinnliga Luer-kontakterna (nr 3) med en hankonLuer-kontakt (nr 4). Anslut den vänstra änden av den nedre 3-vägs Luer bar till hankontakten och att till den mellersta anslutningen av den övre 3-vägs Luer.
- Sätt ett 1 cm rör (nr 1) över Pt-tråd (nr 7) och en 1 cm silikonrör (nr 5) över den senare och munstycket på en manlig Luer-kontakt (nr 2). Fixera monteringen till den nedre 3-vägs Luer-kontaktens mittanslutning (nr 3) genom Luertypiska skruvrotation.
- Tryck ett 1 cm rör (nr.1) över utloppsänden på CE-kapillären och placera den ca 8-9 cm från änden.
- Sätt en 1 cm silikonrör (nr 5) över den senare och munstycket på en manlig Luer-kontakt (nr 2).
- Sätt hela monteringen från vänster genom baren på övre 3-vägs-T-kontakten och fixera den manliga Luer-kontakten och vänstra änden av den kvinnliga 3-vägs Luer-kontakten (nr 3) av Luer-typisk skruvrotation.
- Fixera 25 cm silikonröret (nr 5) vid munstycket på en hanluerkontakt (nr 2) och fixera hela monteringen vid den nedre (högra) änden av stången från den nedre 3-vägs Luer-kontakten (Nr.3) genom Luer-typisk skruvrotation.
- Ta 1 cm silikonröret (Nr.6) och tryck det 5 mm över änden av nebulisatorn tätt medan den andra manliga Luer kon kontakten (nr 4) är ansluten tätt i den utskjutande delen av silikonröret.
- Flytta ovanstående monterade gränssnittsdelen därefter med den utskjutande CE-kapillären till hanstrutten vid nebulisatorn. Sätt in CE kapillären försiktigt genom hanstrutten och vidare genom den bredare delen av nebulisatorns kapillär tills den senare blir smal. Med tanke på att den utskjutande längden på kapillären valdes på lämpligt sätt, passar nu den övre kvinnliga 3-vägs Luer-kontakten också tätt till den manliga konen.
- Korrigera längden på den utskjutande kapillärlängden om så behövs, genom att flytta kapillären (framåt/bakåt) vid röret (nr 1) där man går in i det självtillverkade gränssnittet.
OBS: CE-kapillärens optimala läge i början av nebulisatorkasillären är inte alltför kritiskt. Tryck dock inte CE kapillären för nära den smala delen av nebulisator kapillär. Detta kan hindra eller blockera utloppselektrolytflödet. Också, Detta skulle avbryta den elektriska anslutningen till utloppselektroden och skulle öka sug genom CE kapillär, vilket resulterar i störd separation. I sin tur inte hålla CE kapilläränden för långt bort från nebulisator kapillär sedan dess skarpa separerade toppar skulle breddas och upplösning kommer att gå förlorad. - Använd en lins för att identifiera den bästa positionen.
OBS: Bild 1 (nere till höger) visar det optimala läget för CE-kapillären inuti nebulisatorn.
- Nebulizer val
Bild 1: Schematisk och montering av CE-ICP-MS-gränssnittet. Schemat identifierar de enstaka delarna för stegvis montering av det enkla och billiga CE-ICP-MS-gränssnittet. Fönstret visar ett foto av optimal positionering av CE-kapillären i nebulisatorn. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Nej. | Del | används för |
| 1 | Slang (grön-orange färgkod), 2 x ca. 1 cm | fixering ce kapillär och utloppselektrod vid Luer-delar och hålla tätt |
| 2 | Luer, hane, 3 x, lämplig för 1,6 mm ID silikonrör | anslutning av silikonrör till utloppselektrolyt och som hjälpmedel för fixering av CE-kapillär och Pt-wire-elektrod |
| 3 | 3-vägs-Luer, hona, 2 x | T-bitar för att koppla elektrod, kapillär och aspirerat utloppsflöde |
| 4 | Luerkon, hane, 2 x | ansluta kvinnliga Luers till varandra och till nebulisator |
| 5 | Silikonrör, 1,6 mm ID, 0,8 mm vägg, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm | a) 1cm; straming CE kapillär till gränssnitt, b) 1cm; tätting Pt-tråd till gränssnitt c) 25 cm; anslutning från elektrolytkolv för utlopp till gränssnitt |
| 6 | Silikonrör, 3 mm ID, 1,2 mm vägg, ca.1 cm | tätting Luer kon till nebulisator |
| 7 | Platinatråd | Utloppselektrod |
Tabell 2: Delar för att bygga det enkla, egentillverkade CE-ICP-MS-gränssnittet. Siffrorna avser även bild 1 och beskrivning i texten.
4. Förberedelse för mätning
OBS: Före mätning ska kapillären spolas med stark alkalisk lösning (här: 12% TMAH) för rengöring och sedan fyllas med bakgrundselektrolyt. För förbättrad separation en stapling buffert smörgås är uppbyggd kring provet baserat på ledningsförmåga och pH-lutningar. Tabell 3 sammanfattar kapillärens på varandra följande förberedelsesteg, som bearbetas automatiskt av instrumentet enligt programmerad metod:
| Steg-nej | Steg | Kemiska | Villkor |
| Beredning av CE-kolonn | |||
| Förberedelser 1 | Kapillär rengöring | 12 % TMAH | 4 bar, 1 min. |
| Förberedelser 2 | Kapillärrening med bakgrundselektrolyt | 20 mM HCl | 4 bar, 1 min. |
| Förberedelser 3 | Stapling: ledande elektrolyt | 12 % TMAH | 150 mbar, 3 s |
| Förberedelser 4 | Injektion | Prov | 150 mbar, 3 s |
| Förberedelser 5 | Stapling: avslutande elektrolyt | 0,05 mM HCl | 150 mbar, 3 s |
Tabell 3: Kapillärberedningssteg före mätning. Dessa steg är programmerade med CE-systemets programvara i CE-metoden och inkluderar trycksatt provinsprutning och uppbyggnaden av en "stapling sandwich" runt provet.
- Programmera en CE-metod, som verkställer i följd de steg som anges i tabell 3.
- Definiera en exempeltabell och sekvens i CE-programvara och kopiera denna sekvens även till ICP-MS-programvara.
5. Mätning och datautvärdering
- Starta metoden vid CE-instrument. Efter den programmerade beredningen och påfyllningen av kapillären startar mätningen automatiskt så snart inloppsflaskan, som innehåller 20 mM HCl, är i position vid kapillärinlopp. "Start-trigger" skickas till ICP-MS, som startar on-line övervakning av Fe-isotoper.
OBS: Separationen använder en spänning på +25 kV. Kapillärens utsträckta längd, som är nödvändig för att ansluta CE-instrumentet till ICP-MS, gör att separationstiden ökar i onödan. Därför stöds separationen av ett lågt tryck på 250 mbar vid inloppet. Den självsysslade elektrolyten vid utlopp är 5 mM HCl. Totalanalysen varar 3 minuter för prover med måttlig konduktivitet. I signalfönstret i ICP-MS-programvaran kan elektroferogrammet observeras under körningen. I slutet av varje prov genereras automatiskt två datafiler, en endast åtkomlig från instrumentprogramvara från intern databank, en andra i exportmappen som ".xl" eller ".txt"-format, åtkomliga genom importfunktion från vanlig kromatografiprogramvara. - Se i programvaruhandboken till ICP-MS-instrumentet för export av filerna till kromatografiprogramvara.
Representative Results
Mätningar av standarder och kalibrering
Migrationstider var klarlagt genom enstaka standardinjektioner: Fe(III) standarden övervakades vid 118 s av migrationstid och Fe(II) standarden på 136 s av migrationstid. Detektionsgränser beräknades med hjälp av 3σ-kriterium med hänvisning till basvärdesbuller och en standardkoncentration på 50 μg/L. LOD(Fe(II) var 3,1 μg/L och LOD(Fe(III) var 3,2 μg/L. Toppområdesbaserad kalibrering för båda järnarterna var linjär från LOD till 150 μg/L. Stunden linjärity av Fe(III) bevisades också för högre koncentration, lutningen av kalibreringskurvan för Fe(II) minskat. En övre koncentrationsgräns på 150 μg/L ansågs vara tillräcklig eftersom bioprover som är relevanta för Fe(II)/(III) bestämning typisktvis har lägre Fe-koncentration. Vid högre koncentration kan prov spädas ut i motsvarande grad. Kalibrering med topphöjd kontrollerades upp till 600 μg/L och visade linjäritet över hela det testade området. Detta framgår av bild 2.
Bild 2: Kalibreringskurvor (topphöjd) på Fe(III) och Fe(II). Topphöjdsrelaterade kalibreringar av båda Fe redox-arterna är linjära med en lutning på ca. 161 *X Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Analys av SH-SY5Y cell lysate
Analysen av cellen SH-SY5Y-cellen lysate visade en något långsammare flyttning för järn redox arter på grund av den något högre ledningsförmåga. Fe(III) övervakades vid 124 s av migrationstid, Fe(II) vid 158 s av migrationstid. Migrationstidsprecision i SH-SY5Y cell lysate var 2% för Fe(III) och 3% för Fe(II). Kvantitativa fe(II) och fe(III)-mätningar med denna metod visade fe(III)-koncentration på 330 μg/L- och Fe(II)-koncentration 84 μg/L, båda med ett Fe(II)/Fe(III)förhållande på 0,25. Respektive 56Fe-selektivt elektroferogram visas i figur 3.
Figur 3: 56Fe-specifikt elektroferogram av SH-SY5Y cell lysate. Fe(III) övervakas vid 123 s når 58025 cps topphöjd, är klart åtskilda från Fe(II) på 158 s, når 22800 cps Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Eftersom järn spelar en framträdande roll i OS progression, därmed underlätta mitokondriell dysfunktion eller FTP, en mångsidig CE-ICP-MS baserad kvantitativ metod för samtidig Fe(II)/Fe(III) speciation presenteras i denna artikel och dess tillämpning är exemplariskt visat i cell lysates. Metoden som kort analystid och siffrorna för meriter (LOQ, precision, återhämtning) är lämpliga för prover som är relevanta för järn redox speciation specifikt i neurodegenerativa och cancerforskning. Jämfört med tidigare metoder baserade på LC är denna CE-baserade metod praktiskt taget oberoende av kolumnbates och tidigare observerade reproducerbarhetsproblem efter LC-kolumnbyte. Kapillärpreparering före varje körning är <4 minuter och analystid per prov med måttlig salthalt upp till 3 min. Bortsett från molekylladdning och storlek beror migrationstiden i CZE på konduktivitet vid provpluggen, vilket orsakar variation i migrationstid eller skiftningar när proverna själva påverkar konduktiviteten avsevärt. Sådana förändringar i migrationstiden är välkända i kapillärelektrofores. Detta är en CZE-immanent problem, känd frånlitteraturen 21,22. Standarder och SH-SY5Y cell lysates hade måttlig och homogen ledningsförmåga. Följaktligen visade migrationstider endast små förändringar med god precision. För prover med hög ledningsförmåga kan dock förlängda migrationstider observeras upp till 5 min. Därför rekommenderas standardtillbeslag för klar artidentifiering.
En kritisk fråga i järn redox-artbildning är artstabilitet (dvs. upprätthållande av Fe(II)/(III) jämvikt) underprovberedning 8,13. Olämpliga pH- eller kelatkemikalier samt olämpliga lagringsförhållanden som syre (luft) som kommer i kontakt med prov eller ett avbrott i djupfryst lagring kan lätt ändra Fe(II)/(III)balansen. Därför valdes för beredning av SH-SY5Y cell lysates, en lys buffert utan några kelaterande kemikalier, fysiologiska pH, men inert gas överlagring under provberedning, i prov behållare och omedelbar djup frysning tillämpades för dessa prover.
I litteraturen kan man hitta semi-kvantitativa tillvägagångssätt för att övervaka Fe(II). För förbättrad förståelse av järn roll i oxidativ stress, flera forskargrupper utvecklat Fe(II)-specifika sonder att semi-kvantitativt övervaka och visualisera avvikande höjd av järn järn in vitro. Men viktigt att notera, sådana sonder inte anser Fe(III) och inte kvantifiera utan rapportera bara "mer" eller "mindre" Fe(II)). Hittills har endast ett fåtal biomarkörer finns tillgängliga för att bestämma OS och FPT, som beror på bristen på tillförlitliga metoder för att samtidigt kvantifiera Fe(II)/Fe(III) redox art23,24. Med detta i åtanke, den presenterade metoden - underlätta snabb kvantifiering av båda, Fe(III) och Fe(II) i en körning - kan bli ett lovande verktyg för att fördjupa insikten i järn-beroende molekylära processer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
VV stöddes av det intramurala forskningsanslaget (Forschungsförderung) vid University Medical Center Göttingen och Else Kröner forskningsprogram av Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
| Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
| Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
| Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
| Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
| Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
| Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
| TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |
References
- Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
- Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
- Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
- Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
- Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
- Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
- Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
- Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
- Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
- Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
- Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
- Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
- Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
- Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
- Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
- Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
- Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
- Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
- Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).
