Summary
Denne metoden beskriver fremgangsmåten for å forbedre kvaliteten og antallet sekvensdata som kan hentes fra formalin-faste parafin-innebygde (FFPE) RNA-prøver. Vi beskriver metodikken for å mer nøyaktig vurdere kvaliteten på FFPE-RNA-prøver, utarbeide sekvenseringsbiblioteker og analysere dataene fra FFPE-RNA-prøver.
Abstract
Genuttrykksanalyse ved RNA-sekvensering (RNA-seq) muliggjør unik innsikt i kliniske prøver som potensielt kan føre til mekanistisk forståelse av grunnlaget for ulike sykdommer, samt resistens- og/eller mottakelighetsmekanismer. FFPE-vev, som representerer den vanligste metoden for å bevare vevmorfologi i kliniske prøver, er imidlertid ikke de beste kildene til genuttrykkprofileringsanalyse. RNA hentet fra slike prøver er ofte degradert, fragmentert, og kjemisk modifisert, noe som fører til suboptimale sekvensering biblioteker. I sin tur genererer disse sekvensdata av dårlig kvalitet som kanskje ikke er pålitelige for genuttrykksanalyse og mutasjonsoppdagelse. For å få mest mulig ut av FFPE-prøver og få best mulig data fra prøver av lav kvalitet, er det viktig å ta visse forholdsregler mens du planlegger eksperimentell design, forbereder sekvenseringsbiblioteker og under dataanalyse. Dette inkluderer bruk av passende beregninger for nøyaktig prøvekvalitetskontroll (QC), identifisere de beste metodene for ulike trinn under sekvenseringsbibliotekgenerering, og forsiktig bibliotek QC. I tillegg er bruk av riktige programvareverktøy og parametere for sekvensdataanalyse avgjørende for å identifisere artefakter i RNA-seq-data, filtrere ut forurensning og lav kvalitet, vurdere ensartethet av gendekning og måle reproduserbarheten til genuttrykksprofiler blant biologiske replikere. Disse trinnene kan sikre høy nøyaktighet og reproduserbarhet for profilering av svært heterogene RNA-prøver. Her beskriver vi de ulike trinnene for prøve QC, bibliotekforberedelse og QC, sekvensering og dataanalyse som kan bidra til å øke mengden nyttige data hentet fra lav kvalitet RNA, slik som det er hentet fra FFPE-RNA vev.
Introduction
Bruk av neste generasjons sekvenseringsmetoder har gjort oss i stand til å hente et vell av informasjon fra ulike typer prøver. Imidlertid forblir gamle og dårlig bevarte prøver ubrukelige for de vanlige metodene for å generere sekvensdata og krever ofte endringer i veletablerte protokoller. FFPE vev representerer en slik prøvetype som har blitt mye brukt for kliniske prøver1,,2,3. Mens FFPE bevaring opprettholder vevmorfologi, viser nukleinsyrene i FFPE-vev vanligvis et bredt spekter av skade og nedbrytning, noe som gjør det vanskelig å hente den genomiske informasjonen som kan føre til viktig innsikt om molekylære mekanismer som ligger til grunn for ulike lidelser.
Genuttrykksdata generert av RNA-sekvensering er ofte medvirkende til å studere sykdoms- og resistensmekanismer og utfyller DNA-mutasjonsanalyse. RNA er imidlertid mer utsatt for nedbrytning, noe som gjør det mer utfordrende å generere nøyaktige genuttrykksdata fra FFPE-vev. Videre, fordi den brede tilgjengeligheten og rimeligheten av sekvensering er relativt nylig, ble eldre prøver ofte ikke lagret under forhold som kreves for å bevare RNA integritet. Noen av problemene for FFPE prøver inkluderer nedbrytning av RNA på grunn av innebygging i parafin, kjemisk modifikasjon av RNA fører til fragmentering eller refractoriness til enzymatiske prosesser som kreves for sekvensering, og tap av poly-A haler, begrense anvendelsen av oligo-dT som en primer for omvendt transkripsjonase4. En annen utfordring er håndtering/lagring av FFPE-prøver under suboptimale forhold, noe som kan føre til ytterligere nedbrytning av labilemolekyler som RNA i vevene5. Dette er spesielt relevant for eldre prøver som kan ha blitt samlet inn i en tid da genuttrykksanalyse ved RNA-sekvensering ikke var forventet for prøvene. Alle disse fører til redusert kvalitet og kvantitet av den ekstraherte RNA tilgjengelig for generering av nyttige sekvensdata. Den lave sannsynligheten for suksess, kombinert med de høye kostnadene ved sekvensering, har frarådet mange forskere fra å prøve å generere og analysere genuttrykksdata fra potensielt nyttige FFPE-prøver. Noen studier de siste årene har vist brukervennlighet av FFPE vev for genuttrykk analyse2,6,7,8,9, om enn for færre og / eller nyere prøver.
Som en mulighetsstudie brukte vi RNA ekstrahert fra FFPE tumorvevsprøver fra tre gjenværende vevsrepositorier fra Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) kreftregistre for RNA sekvensering og genuttrykkanalyse10. Anskaffet fra kliniske patologi laboratorier, FFPE vev fra høyverdig ovarie serøse adenokarsinomer ble lagret fra 7-32 år under varierende forhold før RNA utvinning. Fordi i de fleste tilfeller disse blokkene hadde blitt lagret på forskjellige steder i årevis uten forventning om noen sensitiv genetisk analyse i fremtiden, ikke mye omsorg hadde blitt tatt for å bevare nukleinsyrer. Dermed viste de fleste prøvene dårlig kvalitet RNA, med en stor andel av prøvene forurenset med bakterier. Likevel var vi i stand til å utføre genkvantifisering, måle ensartethet og kontinuitet i gendekningen, og utføre Pearson-korrelasjonsanalysen blant biologiske replikasjoner for å måle reproduserbarhet. Basert på et sett med nøkkelsignaturgenpanel sammenlignet vi prøvene i vår studie med The Cancer Genome Atlas (TCGA) data og bekreftet at omtrent 60% av prøvene hadde sammenlignbare genuttrykksprofiler11. Basert på korrelasjonen mellom ulike QC-resultater og eksempelmetadata, identifiserte vi viktige QC-beregninger som har god prediktiv verdi for å identifisere prøver som er mer sannsynlig å generere brukbare sekvensdata11.
Her beskriver vi metodikken som brukes for kvalitetsvurdering av FFPE-RNA, generering av sekvenseringsbiblioteker fra utvunnet RNA-prøver og bioinformatikkanalyse av sekvenseringsdataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RNA kvantitet og kvalitetsvurdering
- Velg FFPE-prøvene i henhold til forhåndsdefinerte kriterier og trekk ut RNA ved hjelp av en passende metode (f.eks. FFPE-nukleisyreavsugssett, Tabell over materialer).
MERK: Det finnes flere forskjellige metoder tilgjengelig for FFPE-RNA-ekstraksjon, inkludert de nyere mikrodisseksjonsmetodene som kan fungere med svært lite vev og trekke ut god kvalitet RNA12,,13,,14. - Ytterste forsiktighet bør tas for å bevare integriteten til RNA i alle stadier. Dette inkluderer arbeid med RNase gratis deionisert vann, bruk av RNase gratis plastikk, og rengjøring av alle instrumenter som kommer i kontakt med FFPE-blokkene med RNase dekontamineringsreagenser.
- RNA skal alltid håndteres forsiktig og oppbevares i is med mindre annet er spesifisert for å minimere nedbrytning under håndtering.
- Hvis nok materiale er tilgjengelig, trekker du ut RNA fra mer enn én region i FFPE-blokken for å generere biologiske replikeringer fra så mange prøver som mulig. For noen av prøvene med rikelig RNA-utbytte, del den ekstraherte RNA i to for å behandle som tekniske replikeringer.
- Hvis det er mulig, samle en liten mengde prøve separat etter ekstraksjon for QC (dvs. en QC aliquot) for å unngå gjentatt håndtering og fryse-tine sykluser av prøven som sannsynligvis vil føre til nedbrytning av RNA.
- Kontroller kvaliteten på RNA (helst fra QC aliquot) ved å kjøre den på et RNA QC-system (f.eks. Agilent Bioanalyzer-system ved hjelp av en RNA Nano-chip, Materialstabell) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Analyser fordelingen av RNA-fragmenter i prøvene (f.eks. ved hjelp av Bioanalyzer 2100 Expert-programvaren) ved å beregne DV200- og DV100-verdiene som prosentandelen av fragmenter som er større enn 200 nt (DV200) eller 100 nt (DV100) i størrelse.
- Blant DV200 og DV100identifiserer du målingen som har en større spredning av verdier for det gitte utvalgssettet, og velger det for gruppering av prøvene i henhold til graden av intakthet.
MERK: For prøvesett med mer intakte RNA-molekyler (dvs. høye DV200-verdier, alle eller de fleste med DV200 > 40 %), vil DV200 sannsynligvis være en nyttig QC-beregning. For eksempelsett med mer nedgraderte transkripsjoner (dvs. lave DV200-verdier, alle eller de fleste med DV200 < 40 %), er DET mer sannsynlig at DV100 er nyttig. - Identifiser eksemplene som har DV100 < 40 %. Fordi denne graden av nedbrytning er svært sannsynlig å ikke generere nyttige sekvenseringsdata11, er det tilrådelig å unngå å behandle slike prøver. Hvis erstatninger for slike prøver er tilgjengelige, bør kvaliteten kontrolleres for å ideelt sett bare inkludere prøver med DV100 > 50%.
2. Klargjøring av sekvensering av bibliotek
- Basert på kvaliteten på prøvene som vurdert i del 1, identifiserer du en passende metode for generering av sekvenseringsbibliotekene.
- For prøvesett med svært lav nedbrytning og høye DV200-verdier, bruk mRNA-sekvensering (dvs. fangst av polyadenylerte transkripsjoner), målrettet RNA-sekvensering (dvs. bruk av fangstsonder for spesifikke gener av interesse), RNA exome sekvensering (dvs. bruk av fangst prober for å berike for koding transkripsjon), eller total RNA sekvensering (dvs. bruk av tilfeldige primere for omvendt transkripsjon for å sekvensere hele RNA populasjonen etter fjerning ribosomal RNA fra prøvene). Det er imidlertid viktig å merke seg at fikseringsprosessen kan introdusere skjevhet i den ekstraherte RNA. Dermed kan fangsttilnærmingene ikke fungere bra i alle tilfeller, selv med høye DV200-verdier.
- Hvis eksempelsettet inneholder prøver med høy nedbrytning (DV200 < 30 %), bruker du en total klargjøringsmetode for RNA-bibliotek og ikke en som avhenger av fang av bestemte områder av transkripsjonene, fordi de bestemte områdene kan mangle i forringede prøver. Bruken av tilfeldige primere for generering av cDNA fører til høyere representasjon av brukbar RNA i det endelige biblioteket, og er derfor mer egnet for FFPE-RNA-prøver.
- Bruk RNaseH-baserte metoder for ribosomal RNA-uttømming for prøvesett med høy nedbrytning. Dette er metoder der rRNA-spesifikke DNA-sonder binder seg til rRNA, dobbeltstrandede molekyler fordøyes av RNaseH, og rester av sonder ryddes opp av DNase (f.eks. NEBNext rRNA uttømmingssett, Tabell over materialer). Disse metodene fungerer bedre for degraderte prøver enn noen andre metoder8.
- For å generere sekvenseringsbiblioteker bruker du høyere inndatabeløp (hvis mulig) for prøver som har mer forringet RNA (DV100 < 60 %). Mens prøver med rimelig god kvalitet RNA (DV100 > 60%) kan gi gode sekvensdata selv ved lavere inndatamengder (den laveste testede for denne protokollen med FFPE-RNA var ~ 20 ng), for mer degradert RNA (DV100 < 60%), er det bedre å starte med høyere inndatamengder (f.eks., > 100 ng).
MERK: Hvis nok (f.eks. >500 ng)-prøven er tilgjengelig, anbefales det å lagre minst halvparten av prøven for å gjenta bibliotekforberedelsen om nødvendig. For eksempler med lav inndata (f.eks. <100 ng) er det vanligvis bedre å bruke hele beløpet og generere et bibliotek med tilstrekkelig mangfold. - Etter å ha valgt et passende bibliotekforberedelsessett for å generere totalt RNA seq-biblioteker fra prøver med høy nedbrytning (f.eks. NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina, se Materialtabell), følg produsentens instruksjoner for å generere bibliotekene.
MERK: Under bibliotekforberedelse er det viktig å hoppe over RNA-fragmenteringstrinnet for forringede prøver og for å sikre bruk av tilfeldige primere for første tråd cDNA-syntese. - For å forbedre effektiviteten og hastigheten, spesielt for lavinngangsprøvene, bruk passende magnetiske stativer med sterke faste magneter for perlebasert rensing og størrelsesvalgtrinn (se Tabell over materialer).
- For PCR-berikelse av adapterbefestet DNA, juster antall forsterkningssykluser basert på mengden input DNA for å sikre maksimal representasjon samtidig som du unngår unødvendig duplisering av bibliotekmolekylene. For ffpe-RNA-prøver med lav inngang (<100 ng) anbefaler vi 16–18 forsterkningssykluser, mens de høye inndataprøvene (1000 ng) vanligvis genererer nok bibliotekmengder i 12–14 runder med forsterkning.
- Etter PCR-forsterkning og opprydding i henhold til produsentens instruksjoner, vurder bibliotekkvaliteten ved å analysere bibliotekkonsentrasjon og molekylfordeling på en passende plattform (f.eks. Agilent Bioanalyzer DNA Chip, se Tabell over materialer). For prøver med primertopper (~ 80 bp) eller adapter-dimer topper (~ 128 bp), gjenta oppryddingen for å fjerne disse toppene.
- Beregn den gjennomsnittlige bibliotekstørrelsen for hvert bibliotek (f.eks. ved hjelp av Bioanalyzer 2100 Expert-programvaren).
3. Sekvensering bibliotek QC
- Når det har blitt konstatert at bibliotekene er fri for overflødig primer og adapter-dimers og har tilstrekkelig konsentrasjon for etterfølgende sekvensering, kvantum ytterligere av qPCR.
MERK: På grunn av følsomheten til klyngegenerering mot bibliotekkonsentrasjon, er nøyaktig kvantifisering avgjørende for å forhindre kostbar sekvensering av løp fra underytelse eller overbelastning. Kvantitative PCR-metoder (qPCR) i sanntid er nyttige for å forbedre klyngetettheten på Illumina-plattformer uten å føre til overklynging. QPCR-metoden er mer presis og mer følsom enn metodene basert på kvalitativ og/eller kvantitativ analyse av alle bibliotekmolekyler (f.eks. Agilent Bioanalyzer), fordi den måler malene som har begge adaptersekvensene i hver ende som vil danne klynger på flowcellen. Bibliotekstørrelse må imidlertid være kjent på forhånd som en størrelseskorrigering må brukes på alle eksempler, slik at resultatene kan sammenlignes med en standardkurve.
FORSIKTIG: Laboratoriefrakker og hansker må alltid brukes når du utfører qPCR, og prosedyren må utføres i et biosikkerhetsskap etter produsentens instruksjoner.- Sett opp en 96-brønnplate med tre replikasjoner for hver prøve for feilforebygging ved hjelp av et passende sett (f.eks. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix for Illumina-biblioteker, en del av Library Quantification kit, se Tabell over materialer), sammen med standardene, en positiv kontroll (f.eks PhiX-kontroll, se Tabell over materialer),og en ingen malkontroll (NTC). NTC er qPCR-blanding uten DNA-bibliotek. Den positive kontrollen kan være ethvert bibliotek med kjent konsentrasjon og fragmentstørrelse.
- Klargjør minimum seks fortynninger av standardene etter leverandørprotokollen.
- Etter å ha lagt til alle komponentene (dvs. qPCR master mix, biblioteker, standarder), dekke platen med forsegling film og bruke en nal for å sikre at filmen gjør jevn og sikker kontakt med platen.
- Vortex og spinn ned platen ved 1500 o/min i minst 1 min. Inspiser platen visuelt for å sikre at det ikke er luftbobler på bunnen av brønnene.
- Sett opp platen på den termiske sykkelbryteren (f.eks. CFX96 Touch System, se Tabell over materialer) ved hjelp av produsentens anbefalte innstillinger.
- Lagre kjøremappen der den kan åpnes for dataanalyse.
- Under dataanalyse kontrollerer du at skråningen er i -3,1 til -3,6-området, effektivitet fra 90 % til 110 % og R2 (korrelasjonskoeffisient oppnådd for standardkurven) ikke mindre enn 0,98.
- Sett opp en 96-brønnplate med tre replikasjoner for hver prøve for feilforebygging ved hjelp av et passende sett (f.eks. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix for Illumina-biblioteker, en del av Library Quantification kit, se Tabell over materialer), sammen med standardene, en positiv kontroll (f.eks PhiX-kontroll, se Tabell over materialer),og en ingen malkontroll (NTC). NTC er qPCR-blanding uten DNA-bibliotek. Den positive kontrollen kan være ethvert bibliotek med kjent konsentrasjon og fragmentstørrelse.
- Pooling: Når qPCR-konsentrasjonen av sekvenseringsklare biblioteker er oppnådd, kan du samle likevektsmengder av hvert av bibliotekene, avhengig av antall sekvenseringslesninger som kreves per prøve og sekvenseringsutgangen til instrumentet.
- QC for puljer: Antall bibliotekpulter på nytt ved qPCR etter samme protokoll som beskrevet i trinn 3.1.
4. Sekvensering
- Avhengig av kjøreparametrene trekker du sekvenseringsreansagesettene og tiner dem etter brukerhåndboken. Vennligst sjekk Illumina nettstedet for de nyeste versjonene av alle brukerveiledninger for sekvensering på Illumina instrumenter.
- Kontroller at reagensene er helt tint og plasser reagensbrettet ved 4 °C. Løpet skal startes senest 2 timer etter at reagensene er tint. Ikke gjør som kan påvirke kvaliteten på kjøreresultatene.
- Snu kassetten 5x for å blande reagenser og trykk forsiktig på benken for å redusere luftbobler.
- Sett den upakkede strømningscellepakken til side ved romtemperatur i 30 min.
- Pakk ut strømningscellepakken og rengjør glassoverflaten på strømningscellen med en lofri alkoholserviett. Tørk glasset med et lav-lo laboratorievev.
- Åpne Illumina "Experiment Manager" søknad. Velg "Opprett eksempelark", velg deretter Sequencer og klikk "Neste".
- Opprett og last opp eksempelarket basert på Illumina sequencer kriterier (f.eks Illumina Experiment Manager, programvareguide).
- Ved ledetekstene skanner du i strekkoden reagenssett og angir de kjørede oppsettsparametere (f.eks. for en enkelt indeksert PE 75-sykluskjøring, skriver du inn 76-8-76).
- Denature og fortynne bibliotekutvalget basert på sekvenserens brukerhåndbokanbefaling (f.eks. NextSeq 500 Systemguide fra Illumina, se Materialliste).
- Denature og fortynn kontrollbiblioteket PhiX (se Materialtabell) til riktig konsentrasjon (f.eks. 1,8 pM for NextSeq).
- Bland eksempelbibliotek og PhiX-kontroll for å resultere i et volumforhold på 1 % PhiX-kontroll.
- Last denaturert og fortynnet prøven i reagenskassetten i det angitte reservoaret.
- Legg i strømningscellen, bufferkassetten og reagenskassetten.
- Utfør en automatisk kontroll og gjennomgang for å sikre at kjøreparameterne passerer systemkontrollen.
- Når den automatiske kontrollen er fullført, velger du Start for å starte sekvenseringskjøringen.
5. Dataanalyse og kvalitetsvurdering
MERK: En typisk arbeidsflyt for RNA-seq-dataanalyse(figur 1)inkluderer forhåndsbehandling og QC, justering av genom og postjustering QC, gen- og transkripsjonskorrelasjonsanalyse, differensialanalyse mellom ulike utvalgsgrupper, behandlingsforhold og gensettberikelse og veianalyse.
RNA-seq-dataene kan ha kvalitetsproblemer som kan påvirke nøyaktigheten av genprofilering og føre til feilaktige konklusjoner. Derfor er innledende QC-kontroller for sekvenseringskvalitet, kontaminering, sekvensering av dekningsbias og andre kilder til artefakter svært viktige. Bruk av et RNA-Seq QC-rørledning som ligner på arbeidsflyten som er beskrevet her, anbefales å oppdage artefakter og bruke filtrering eller korrigering før nedstrømsanalyse.
- Forbehandling
MERK: Dette inkluderer demultiplexing, vurdering av sekvenslesingskvalitet, GC-innhold, tilstedeværelse av sekvenseringsadaptere, overrepresentert k-mers og PCR dupliserte leser. Denne informasjonen bidrar til å oppdage sekvenseringsfeil, PCR-artefakter eller kontaminering.- Demultiplex Illumina sekvensering kjøre ved hjelp av Illumina programvareverktøyet bcl2fastq2 å generere rå FASTQ filer for hver prøve definert i eksempelarket. Tillat at én feil i eksempelindeksstrekkodene tåler sekvenseringsfeil hvis det ikke er noen strekkodekollisjon.
- Kjør VERKTØYET FASTQC15 for å utføre en kvalitetskontroll på rå FASTQ-filer for å oppdage eventuelle dårlige kvaliteter eller abnormiteter i sekvenseringslesninger.
- For adapter- og lavkvalitetsbaser som trimmer, kan du trimme sekvenseringsadapterne og basene av lav kvalitet ved hjelp av Cutadapt16- eller Trimmomatic17-programvareverktøy. Lagre de trimmede lesene i pair-end fastq-filene.
- Skjermbilde for kontaminering
- Kjør FASTQ_screen18 for å oppdage mulig krysskontaminering med andre arter.
- Kjør miniKraken av Kraken219 for å identifisere taksonomiene til forurensende arter.
- Justering for å referere genom og post justering QC
- De trimmede lesingene kan justeres etter en referansegenomsekvens (GRCh Build hg19 eller hg38) ved hjelp av STAR aligner20. Bruk GENcode-merknads-GTF-filen til å veilede den skjøtede transkripsjonsjusteringen. Det anbefales å kjøre STAR 2-pass for å øke følsomheten for nye skjøtekryss. I andre omgang vil alle lesninger bli tilordnet på nytt ved hjelp av kommenterte gen og transkripsjoner og nye veikryss fra første passering.
- Utfør QC etter justering.
- Kjør Picards21MarkDuplicates for å evaluere bibliotekkompleksiteten ved å bestemme mengden unike eller ikke-opplisensierte leser i prøvene.
- Kjør Picards CollectRnaSeqMetrics-program for å samle kartprosenter på koding, intronic, intergene, UTR-regioner og genkroppsdekning.
- Kjør RSeQC22 for å bestemme leseparets indre avstand, les distribusjon blant CDS-exons, 5'UTR, 3'UTR, intron, TSS_up_1kb, TSS_up_5kb, TSS_up_10kb, TES_down_1kb, TES_down_5kb, TES_down_10kb, les GC-innhold, koblingsmetning og bibliotekinformasjon.
- Kjør multi-QC23 for å generere en aggregert rapport i HTML-format.
- Analyse av genkvantifisering og korreksjon
- Kjør RSEM24 for å få rå telling samt normalisert lesetelling på gener og transkripsjoner. Lesetellingsmålingen som RPKM (leser per kilobase av exon-modell per million leser), FPKM (fragmenter per kilobase av exon modell per million kartlagte leser), og TPM (transkripsjoner per million) er de hyppigst rapporterte RNA-seq genuttrykksverdier. Gener uttrykt under en støyterskel (for eksempel TPM < 1 eller råtelling <5) kan filtreres.
- Utfør transkripsjonskvantifisering til samlede råtellinger av tilordnede leser til hver transkripsjonssekvenser ved hjelp av programmer som HTSeq-count eller featureCounts.
- Kjør Principal Components Analysis (PCA) ved hjelp av et R-skript for å bestemme batcheffekter og vurdere et kvalitetskart over det angitte datasettet25. Eksempel korrelasjonsanalyse kan utføres ved hjelp av Pearson-korrelasjonen mellom ulike beregninger.
- Analyse av differensialgenuttrykk
- Utfør genforskjellsanalyse mellom prøveforholdene ved hjelp av programmet edgeR26,,27 og/eller limma-Voom28 og bruk normaliseringsmetoder, inkludert TPM, TMM, DESeqeller UpperQuartile.
- Det anbefales å kjøre minst to differensialanalyseprogramvareverktøy for å ringe to sett med DEGs-lister for sammenligning og få de endelige DEGs for å forbedre deteksjonsfølsomhet og nøyaktighet.
- Gensettberikelse og veianalyse
- Utfør Gensettberikelsesanalyse (GSEA)29,30 basert på rangering av transkripsjoner i henhold til en måling av differensialuttegnede gener (DEGs) for å avgjøre om DEGs viser statistisk signifikante, konkordansiske forskjeller mellom biologiske tilstander.
- Utfør funksjonsanalyse ved hjelp av ressurser som Gene Ontology31, DAVID32,,33eller andre tilgjengelige programvareverktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodikken som er beskrevet ovenfor, ble brukt på 67 FFPE-prøver som hadde blitt lagret under en rekke forskjellige forhold i 7–32 år (median lagringstid for prøvene var 17,5 år). Datasettet og analyseresultatene som presenteres her, ble tidligere beskrevet og publisert i Zhao et al.11. Ved kontroll av prøvekvaliteten som beskrevet tidligere (dvs. eksempelspor i figur 2),ble DV100 funnet å være mer nyttig enn DV200 fordi det er mer følsomt å nøyaktig måle andelen mindre fragmentstørrelser for svært nedbruterte RNA-prøver.
I det gitte utvalgssettet var færre enn 10 % av prøvene (7 av 67) over DV200 kuttet av 30 %, som anbefalt av Illumina34. Omtrent 26 % av prøvene (19 av 67) hadde en DV100 > 60 % (dvs. høyere sannsynlighet for å generere data i god sekvens), 40 % (27 av 67) var i området 40 %–60 % for DV100 (dvs. akseptable, men med en lavere sannsynlighet for å generere gode sekvensdata), og ca 10% (7 av 67) hadde en DV100 av < 40% (dvs. svært lav sannsynlighet for å resultere i gode sekvensdata). For 14 av 67 prøver kunne ikke programvaren fastslå DV-verdiene. Tabell 1 viser et sammendrag av QC-beregninger for prøvene i forskjellige DV100-kategorier. For detaljert QC analyse og data korrelasjon for alle 67 prøver, vennligst se Zhao et al.11.
Gitt den høye graden av nedbrytning i prøvesettet, ble det valgt en "total RNA"-bibliotekforberedelsesmetode, og sekvenseringsbiblioteker ble utarbeidet ved hjelp av NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (Tabell over materialer). For å forbedre representasjonen av sekvenseringsbibliotekene til tross for den høye graden av prøveforringelse, ble den maksimale mulige mengden RNA (1000 ng når tilgjengelig) brukt som inngang for bibliotekforberedelse. I tillegg nødvendiggjorde den høye nedbrytningen av FFPE-RNA-prøvene rRNA-uttømmingsmetoden, fordi de forringede transkripsjonene sannsynligvis ikke hadde poly-A-haler for mRNA-fangst. Etter uttømming av ribosomal RNA ved hybridisering til spesifikke sonder og fordøyelse av hybridiserte transkripsjoner ved hjelp av RNaseH, ble de resterende transkripsjonene konvertert til cDNA ved hjelp av tilfeldige primere. Størrelsesvalg ble også unngått for biblioteker utarbeidet fra lavere inndataprøver. Eksempel på spor av endelige biblioteker vises i figur 3.
Svært nedbrut FFPE-prøver representerer en stor utfordring for genuttrykkprofilering i tumorprøver. Bruk av korrekte bioinformatikkanalysemetoder og programvareverktøy er derfor avgjørende for å oppdage artefakter eller abnormiteter i datasett for å sikre høy nøyaktighet og reproduserbarhet av genkvantifisering. Programvareverktøyene som brukes i denne studien er oppført i tilleggstabellen. I det angitte eksempelsettet utførte vi sekvensering og kvalitetsvurdering av biblioteker, med noen eksempelberegninger vist i figur 4. En oversikt over rå fastq filsekvenseringskvalitet og prøvekortinnhold vises i henholdsvis figur 4A og figur 4B. Fastqc-skjermen kan bidra til å oppdage kontaminering, for eksempel bakteriell og musekontaminering, i prøvene som vist i figur 4C. I det gitte utvalgssettet hadde 41 av 67 prøver 5 %–48 % bakteriell kontaminering, og seks prøver hadde 4 %–11 % musekontaminering (figur 4C). STAR justering resultater (Figur 4D) viste andelen av leser kartlagt til referanse genom, prosentandel av leser unikt kartlagt til referanse genom, og andel av leser som ikke ble kartlagt eller kartlagt til flere loci. Picard CollectRNAStatistics ble brukt til å bestemme prosent mRNA, intronic og intergene baser som finnes i justeringsfilene (Figur 4E). For å vurdere ensartethet av lesedekning på gen og transkripsjoner, brukte vi Picard-programvareverktøyet til å generere et genkroppsdekningsplott, som måler prosentandelen av leser som dekker hver nukleotidposisjon av alle gener skalert i hyller fra 5 'UTR til 3' UTR. Figur 4F viser at noen forringede biblioteker hadde 3' bias, hvor flere leser er kartlagt nærmere 3'end enn til 5'end.
FFPE-prøver har vanligvis stor variasjon i genuttrykksprofiler som kan oppstå på grunn av variabel nedbrytning under prøvelagring, RNA-ekstraksjon eller prøvebehandling. Det er viktig å bruke egnede statistiske metoder for å avdekke de underliggende mønstrene og måle variasjonen og korrelasjonen mellom utvalgene. Vi brukte Principal Component Analysis (PCA) for seks par biologiske replikeringer fra et delsett av 67 FFPE-prøvene. En PCA-tomt viste at 26 % av den totale variasjonen ble fanget opp av den første hovedkomponenten og 19 % fra andre og tredje komponenter til sammen (figur 5). Blant de seks par replikene hadde to par replikeringer høyere variasjoner (korrelasjoner under 0,22) enn de fire siste prøvene (korrelasjonsverdier mellom 0,7–0,8) når de sammenlignet genuttrykksverdier mellom replikerparene. Fordi replikene ble generert ved å trekke ut RNA fra to forskjellige vevskrøller kuttet fra de samme FFPE-blokkene, var vevsalderen ikke en faktor i høyere varians her, og det var sannsynligvis forårsaket av den forskjellige mengden bakteriell forurensning (1%-55%) samt forskjellig mRNA-innhold (2–3 fold forskjell) mellom replikene. Tilfeldigheten av mRNA-nedbrytning etter ekstraksjon kan også bidra til høyere varians mellom prøver av lignende opprinnelse.
Figur 1: Arbeidsflyt for RNaseq-analyse. Flytskjemaet beskriver analysetrinnene for forhåndsbehandling, kvalitetsvurdering, kartlegging til referanse, genkvantifisering og differensialanalyse mellom ulike utvalgsgrupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel Bioanalyzer spor av seks forskjellige FFPE-RNA prøver. Den horisontale aksen betegner molekylvekten (bp) og fluorescensenhetene (FU) og den vertikale aksen viser konsentrasjonen av forskjellige størrelsesfragmenter. RNA Integrity Numbers (RIN), DV200 (dvs. prosent av fragmenter >200 bp) og DV100 (dvs. prosent av fragmenter >100 bp) verdiene er angitt på hver profil. En 25 bp topp i hver profil indikerer molekylvektmarkøren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel Bioanalyzer spor av endelige biblioteker utarbeidet fra fire forskjellige prøver. Den horisontale aksen betegner molekylvekten (bp) og fluorescensenhetene (FU) på den vertikale aksen indikerer konsentrasjonen av forskjellige størrelsesfragmenter. De nedre (35 bp eller 50 bp) og øvre (10 380 bp) markørtoppene er merket med henholdsvis grønt og lilla. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempel på multi-QC-rapport for forhåndsbehandlende QC-resultater. (A) Linjediagram som viser prosentene for Q30-baser for alle sekvenseringslesninger i hvert utvalg. (B)Sekvensering av adapterinnhold i rå fastq-filer. (C) Kontamineringsskjerm for å sjekke nøye matchet arter. (D) Genom kartlegging statistikk. (E) Les distribusjon basert på Gencode genmerknad. (F)Gene kropp / transkripsjon dekning Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempel på PCA-analyse for å vise eksempelgruppekonkordans. PCA-analyse for biologiske replikeringer. PCA-plott med prøver plottet i to dimensjoner ved hjelp av sine anslag på de to første hovedkomponentene. Biologiske replikeringer vises i samme farge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antall eksempler | Median Inngang for lib prep (ng) | Median RIN | Median DV200 | Median DV100 | Median Lib-størrelse (bp) | Median Lib-utbytte (ng) | Median Lib Molarity (nM) | Median prøvelagringstid (år) | Median % kontaminering | Median genantall | |
| DV100 <40 % | 7 | 237.6 | 2.5 | 6 | 34 | 445 | 24.5 | 7 | 22 | 27.4 | 14,759 |
| DV100 40-60% | 27 | 1000 | 2.5 | 12 | 51 | 408 | 19.8 | 5.9 | 18 | 9.9 | 10,202 |
| DV100 >60 % | 19 | 1000 | 2.3 | 26 | 73 | 355 | 84.9 | 24 | 13 | 3.2 | 9,993 |
Tabell 1: Sammendrag av eksempler på sett QC-beregninger. Tabellen viser QC-beregningene for prøvene, gruppert i henhold til DV100-verdiene. Antall prøver i hver gruppe er oppført, og medianverdier for hver beregning vises.
Supplerende tabell: Analyseprogramvareverktøy, parametere og programvarereferanse. Tabellen viser analyseprogramvareverktøy og parametere som brukes i hvert trinn i RNA-seq-analysen. Referansene for programvareverktøyet er oppført i tabellen. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som er beskrevet her skisserer de viktigste trinnene som kreves for å få gode sekvensdata fra FFPE-RNA-prøver. Hovedpoengene å vurdere med denne metoden er: (1) Sørg for at RNA er bevart så godt som mulig etter ekstraksjon ved å minimere prøvehåndtering og frysing og tining sykluser. Separate QC aliquots er svært nyttig. (2) Bruk en QC-beregning som er best for det angitte eksempelsettet. RIN-verdier og DV200 er ofte ikke nyttige for forringede prøver, og DV100 kan være den foretrukne beregningen for å vurdere kvaliteten i et gitt utvalgssett. (3) For mer forringede prøver er det best å bruke en høy prøveinngang. Høyere inndatamengder fører til bedre mangfold og lavere duplisering i det endelige biblioteket, noe som fører til forbedret datakvalitet. Fordi ikke alle RNA i FFPE-RNA-prøver er brukbare på grunn av høy nedbrytning og refractoriness til enzymatiske prosesser, er disse effektene mer uttalt i FFPE-RNA sammenlignet med fersk frossen RNA. (4) Bruk tilfeldig priming for omvendt transkripsjon trinn i motsetning til bruk av oligo-dT eller spesifikke sekvenser som primere. Med mindre settet med spesifikke sonder er i stand til å dekke så mye sekvens som mulig for alle transkripsjoner av interesse, er tilfeldige primere et trygt spill for å sikre konvertering av et maksimalt antall transkripsjoner (eller fragmenter av disse) til cDNA. Dermed er totale RNA bibliotek prep metoder mer nyttig for degradert prøver enn mRNA metoder, som er avhengige av tilstedeværelsen av poly-A haler. (5) Nøyaktig kvantifisering av biblioteker ved kvantitativ sanntids PCR (qPCR) er viktig for å unngå underprestasjon eller overbelastning av sequencers. (6) Vurder potensiell kontaminering av RNA som en del av standard rna-seq QC-protokollene. Bakteriell kontaminering og genomisk DNA-kontaminering er vanlig for FFPE-prøver på grunn av lagringsforhold og prøveforberedelsesprosedyrer. Prøver forurenset med fremmede arter kan kaste bort sekvenseringsdekning, avhengig av omfanget av forurensning. I tillegg kan intern forurensning oppstå fra ufullstendig rRNA-uttømming, noe som fører til en høy prosentandel av lesing til rRNAs. Ineffektiv genomisk DNA-fjerning under DNase fordøyelsen kan føre til falsk positiv uttrykksdeteksjon av transkripsjoner eller feilaktig de novo montering av transkripsjoner. Adapterkontaminering introdusert under bibliotekforberedelse er også et vanlig problem for svært nedbrutede RNA-fragmenter med svært korte RNA-fragmenter. Kontaminering kan påvirke genet og transkripsjonprofileringsnøyaktigheten og føre til falsk oppdagelse. Derfor er det viktig å nøyaktig identifisere forurensningskildene og fjerne forurensningen, om mulig, under prøve- eller bibliotekforberedelsestrinnene, eller filtrere forurensende lesing under databehandlingstrinnet. (7) Preprosessering og kvalitetskontroll etter justering er viktig for å oppdage dårlig kvalitet og lav mRNA-innholdseksempler. Disse prøvene bør elimineres fra videre analyse. Genuttrykksdata fra prøver som genererer lavt gentall, dårlig dekning bør brukes med forsiktighet. (8) Det er god praksis å inkludere biologiske replikeringer for å måle prøver varians og korrelasjon for å sikre data reproduserbarhet.
FFPE-prøver representerer en svært verdifull ressurs for et stort antall sykdommer. Evnen til å få pålitelig sekvensinformasjon fra slike prøver ville hjelpe mange studier med sikte på å forstå molekylære mekanismer bak ulike lidelser, resistens og mottakelighet. Selv om begrensningene pålagt av den ofte suboptimale kvaliteten på RNA hentet fra slike prøver hindrer slik innsats, bidrar trinnene som er beskrevet her til å redusere disse begrensningene til en viss grad og gjøre oss i stand til å få mest mulig ut av FFPE-RNA for å få pålitelig genuttrykksinformasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble finansiert av National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. er drifts- og teknisk støtteentreprenør for Frederick National Laboratory for Cancer Research som er fullt finansiert av NIH. Flere forfattere (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) er tilknyttet Leidos Biomedical Research, Inc., men alle forfatterne er fullt finansiert av National Cancer Institute, inkludert forfatternes lønn og forskningsmateriell. Leidos Biomedical Research, Inc. ga ikke lønn til forfatterne (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) eller materiale for studien, og det hadde heller ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Dr. Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) for fortsatt hjelp, spesielt for å initiere denne studien, gi oss prøvene, og for nyttige forslag under dataanalyse. Vi takker oppriktig alle medlemmer av CCR Sequencing Facility ved Frederick National Laboratory for Cancer Research for deres hjelp under prøveforberedelse og sekvensering, spesielt Brenda Ho for hjelp i prøve QC, Oksana tysk for bibliotek QC, Tatyana Smirnova for å kjøre sequencers. Vi vil også takke Tsai-wei Shen og Ashley Walton i Sequencing Facility Bioinformatics Group for å ha hjulpet til med dataanalyse og implementering av RNA-seq-rørledninger. Vi takker også CCBR og NCBR for hjelp med RNaseq analyserørledning og beste praksisutvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
References
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).
- Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).
- Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).
- Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).
- Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
- Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
- Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).
- Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Broad Institute. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2019).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).
- McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016).
