Summary
מוצג כאן הוא הפרוטוקול עבור סיסאי chemotaxis סיטו, מכשיר מיקרופלויד שפותח לאחרונה המאפשר מחקרים של התנהגות מיקרוביאלית ישירות בסביבה.
Abstract
התנהגויות מיקרוביאליות, כגון תנועתיות וchemotaxis (היכולת של תא לשנות את תנועתו בתגובה הדרגתי כימי), נפוצים על פני התחומים חיידקיים וארכאיים. Chemotaxis יכול לגרום יתרונות משמעותיים רכישת משאבים בסביבות הטרוגניות. הוא גם ממלא תפקיד מכריע באינטראקציות סימביוטיות, מחלות, ותהליכים גלובליים, כגון רכיבה ביו-גיאוכימית. עם זאת, הטכניקות הנוכחיות להגביל את המחקר chemotaxis למעבדה והם לא ישימים בקלות בתחום. מוצג כאן הוא פרוטוקול שלב אחר שלב לפריסה של סיסטו chemotaxis assay (ISCA), מכשיר המאפשר חקירה חזקה של chemotaxis מיקרוביאלי ישירות בסביבה הטבעית. ISCA הוא מכשיר מיקרו-נוזלים המורכב ממערך של 20 בארות, שבו ניתן לטעון כימיקלים בעלי עניין. לאחר הפריסה בסביבות מימיות, כימיקלים לפזר מתוך הבארים, יצירת מעברי ריכוז כי חיידקים תחושה ולהגיב על ידי שחייה לתוך הבארים באמצעות chemotaxis. לאחר מכן ניתן לדגום את תכולת הבאר ולהשתמש בה כדי לכמת (1) את עוצמת התגובות הכימותרפיות לתרכובות ספציפיות באמצעות ציטומטריית זרימה, (2) לבודד ולתרבות מיקרואורגניזמים מגיבים, ו-(3) לאפיין את הזהות והפוטנציאל הגנומי של האוכלוסיות המגיבות באמצעות טכניקות מולקולריות. ISCA היא פלטפורמה גמישה שניתן לפרוס בכל מערכת עם שלב מים, כולל סביבות ימיות, מים מתוקים וקרקע.
Introduction
מיקרואורגניזמים מגוונים להשתמש בתנועתיות ו chemotaxis כדי לנצל סביבות תזונתיות לא אחידות, למצוא מארחים, או להימנעתנאים מזיקים 1,,2,,3. התנהגויות מיקרוביאליות אלה יכולות בתורן להשפיע על שיעוריהטרנספורמציה הכימית 4 ולקדם שותפויות סימביוטיות על פני מערכות אקולוגיות ארציות, מים מתוקיםומערכות אקולוגיות ימיות 2,5.
Chemotaxis נחקר בהרחבה בתנאי מעבדה במשך 60 השנים האחרונות6. השיטה הכמותית הראשונה ללמוד chemotaxis, תסיסה נימי, כרוך צינור נימי מלא כימותרפיה putative שקוע השעיה שלחיידקים 6. דיפוזיה של הכימיקל מתוך הצינור יוצר מעבר צבע כימי, וחיידקים chemotactic להגיב הדרגתי זה על ידי נדידה לתוך צינור7. מאז הפיתוח של תסיסה נימי, עדיין בשימוש נרחב כיום, טכניקות רבות אחרות פותחו כדי ללמוד chemotaxis בתנאים פיזיים / כימיים מבוקרים יותר ויותר, עם האחרונה מעורבים בשימוש microfluidics8,,9,,10.
מיקרו-נוזלים, יחד עם מיקרוסקופית וידאו במהירות גבוהה, מאפשרים מעקב אחר התנהגותם של תאים בודדים בתגובה לשינועים מבוקרים בקפידה. למרות טכניקות אלה שיפרו במידה רבה את ההבנה שלנו של chemotaxis, הם הוגבלו לשימוש במעבדה ולא לתרגם בקלות פריסת שדה במערכות סביבתיות. כתוצאה מכך, היכולת של קהילות טבעיות של חיידקים להשתמש chemotaxis בתוך מערכות אקולוגיות טבעיות לא נבדקה; לפיכך, ההבנה הנוכחית של החשיבות האקולוגית הפוטנציאלית של chemotaxis מוטה כלפי תנאי מעבדה מלאכותיים ומספר מוגבל של מבודדים חיידקיים במעבדה.תרבית. ISCA שפותח לאחרונה מתגבר על מגבלות אלה11.
ISCA בונה על העיקרון הכללי של ההתכחה ניח; עם זאת, הוא עושה שימוש בטכניקות microfabrication מודרניות כדי לספק פלטפורמה ניסיונית משוכפלת מאוד, לפריסה בקלות לכימות של chemotaxis כלפי תרכובות של עניין בסביבה הטבעית. הוא גם מאפשר זיהוי ואפיון של מיקרואורגניזמים כימיים על ידי בידוד ישיר או טכניקות מולקולריות. בעוד מכשיר העבודה הראשון היה מפוברק עצמו ונבנה זכוכית PDMS11, הגרסה האחרונה הזרקה מעוצב מורכב פוליקרבונט, באמצעות הליך ייצור מתוקן מאוד (לעניין בגרסה העדכנית ביותר של המכשיר, המחברים המתאימים ניתן ליצור קשר).
ISCA הוא בגודל כרטיס אשראי ומורכב 20 בארות מופץ במערך 5 x 4 בארות, כל המקושר לסביבה הימית החיצונית על ידי נמל קטן (800 μm קוטר; איור 1). כימותרפיה פוטטיבית נטען לתוך בארות מפוזרים לתוך הסביבה דרך הנמל, וחיידקים chemotactic להגיב על ידי שחייה דרך הנמל לתוך הבאר. כמו גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה של ניסוי ISCA בסביבה הטבעית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה יסייע למשתמשים חדשים להתגבר על מכשולים פוטנציאליים ולהקל על פריסות יעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אנו ממליצים לבצע את סעיף 1 לפני ניסויי שדה כדי למטב את התוצאות.
1. אופטימיזציה של המעבדה
הערה: אמצעי האחסון המתוארים בהליך המיטוב מספיקים עבור ISCA יחיד (המורכב מ- 20 בארות).
- הכנת הכימיקל של עניין
הערה: הריכוז האופטימלי עבור כל כימותרפיה לעתים קרובות צריך להיקבע בתנאי מעבדה לפני פריסות שדה. שדה הריכוז הכימי יקטן בעוצמה עם מרחק מהמקור (ISCA היטב), מה שאומר כי הריכוז שחוו מיקרואורגניזמים בסביבה יהיה נמוך יותר מזה הנוכחי בתוך המכשיר. הריכוז האופטימלי לשימוש ב-ISCA תלוי בקצב ההתהודה של הכימותרפיה. אם הריכוז בבאר הוא נמוך מדי (קרוב למגבלת הגילוי של החיידקים), לא יבחינו בכימותרפיה חיובית. לעומת זאת, אם הריכוז בבאר הוא גבוה מדי, הריכוז יהיה גם גבוה בסביבה הקרובה והצטברות מיקרוביאלית תתרחש מעל בארות ISCA ולא בפנים. לכן, סדרת דילול צריכה להתבצע בתנאי מעבדה עבור כל מתחם על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור פריסות שדה. באופן אידיאלי, טווח ריכוז צריך להיבדק גם בשטח כדי לאשר את תוצאות המעבדה.- הכן 2.5 ל' של מדיום מתאים המכיל את ריכוז המלח המתאים (לדוגמה, תמיסת מלח עם חוצץ פוספט [PBS] או מי ים מלאכותיים). סנן את המדיום באמצעות מסנן 0.2 μm באמצעות משאבת פריסלטי או ואקום ו autoclave.
- הכן תמיסת 10 מ"מ של כימותרפיה ב-1 מ"ל של המדיום הסטרילי. לסנן את הפתרון chemoattractant עם מסנן מזרק 0.2 μm כדי להסיר חלקיקים ומזהמים פוטנציאליים.
הערה: באופן אידיאלי, אין תרכובות אורגניות מלבד כימותרפיה צריך להיות נוכח בפתרון הסופי.
- טווח ריכוז לפי סדרת דילול
- תדלל את פתרון המניות המסונן chemoattractant בסדרות, החל (לדוגמה) מ- 10 mM עד 100 μM.
הערה: לפחות נפח סופי של 0.7 מ"ל נדרש לכל ריכוז שנבדק.
- תדלל את פתרון המניות המסונן chemoattractant בסדרות, החל (לדוגמה) מ- 10 mM עד 100 μM.
- טעינת ISCA
- מלא מזרק של 1 מ"ל עם הכימותרפיה המסוננת וחבר אותו למזרק 27 G. החזקת ISCA עם היציאה פונה כלפי מעלה, לאט להזריק את החומר עד טיפה קטנה מופיעה על גבי היציאה.
הערה: 1) כל דילול או חומר חייב להיות מוזרק עם מזרק ומחט נפרדים כדי למנוע זיהום צולב. 2) טיפה קטנה זו חשובה משום שהיא מבטיחה כי אין בועת אוויר לכודה בתוך הנמל, אשר עלול לפגוע ביכולת של חיידקים לנדוד דרך הנמל. 3) מומלץ למלא שורה שלמה לכל חומר או ריכוז (חמש בארות) כדי לספק נפח מינימלי הולם לניתוחים נוספים. 4) שורה אחת לכל ISCA צריך לפעול כפקד שלילי ויש למלא עם המדיום מסונן שבו החיידקים יושעו. טיפול זה מסביר את ההשפעה של תנועבת אקראית על ידי חיידקים לתוך בארות ISCA ויש להשתמש בו כדי לנרמל את הטיפולים המכילים כימותרפיה.
- מלא מזרק של 1 מ"ל עם הכימותרפיה המסוננת וחבר אותו למזרק 27 G. החזקת ISCA עם היציאה פונה כלפי מעלה, לאט להזריק את החומר עד טיפה קטנה מופיעה על גבי היציאה.
- פריסה במעבדה
- בין לילה, דגירה תרבות 5 מ"ל מועשר 1% מרק ימי (עבור חיידקים ימיים) או 1% מרק ליזוגני (LB, עבור חיידקים מים מתוקים).
הערה: מבודד חיידקים מוטיב או קהילות חיידקים טבעיים יכול לשמש עבור פריסות מעבדה. - דגירה את התרבות במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר (RT) ו 180 סל"ד. לאחר 12 שעות, ודא כי הקהילות המיקרוביאליות הן מוטיב על ידי תצפית ישירה תחת מיקרוסקופ.
- סובבו את התרבות ב-1,500 x גרם למשך 10 דקות ו-1/100 ב-150 מ"ל של מדיום מתאים (לדוגמה, מי ים מסוננים, מים מתוקים מסוננים).
- מניחים שתי חתיכות קטנות של סרט דבק דו-צדדי על המשטח השטוח של מגש קיבולת של 200 מ"ל (המכסים של קופסאות קצה של 1 מ"ל יש את הממדים האידיאליים למטרה זו, ניתן בקלות autoclaved). מקם ISCA אחד למעלה, כדי להבטיח שהוא מתחבר באופן מאובטח לקלטת. מלא לאט את מגש הפריסה בתמיסה החיידקית באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל.
הערה: מלאו את המגש עד שה-ISCA תשקע תחת כ-1-2 ס"מ של נוזל. אם אתה משתמש במגשים מרובים, השתמש באותו אמצעי אחסון על-פני כולם. - השאר את ISCA לתגנר במשך 1 שעות כדי לאפשר chemotaxis חיידקים. לאחר שעה אחת, הסר את המדיום בעדינות רבה עם פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל כדי למזער את הזרימה הסוערת.
- אחזר את ה- ISCA ממגש הפריסה מבלי לגעת במשטח העליון. השתמש בפיפטה ובגבים חד-פעמיים כדי להסיר את הנוזל הנותר על משטח ISCA.
הערה: חשוב להימנע מלגעת בנמלים במהלך תהליך זה, כמו השינויים וכתוצאה מכך בלחץ יכול להסיר או להוסיף חיידקים מהסביבה החיצונית לתוך הבאר ובכך להטות את הצפיפות החיידקית והרכב בתוך הבאר.
- בין לילה, דגירה תרבות 5 מ"ל מועשר 1% מרק ימי (עבור חיידקים ימיים) או 1% מרק ליזוגני (LB, עבור חיידקים מים מתוקים).
- אחזור הדגימות
- מחזיק את ISCA עם היציאה פונה כלפי מטה, לאחזר את נפח הבארים באמצעות מחט סטרילית 27 G מזרק מחובר מזרק 1 מ"ל.
הערה: כל שורה (אם מכילה את אותו חומר) ניתן לאסוף כדי לספק מדגם עבודה של כ 550 μL. מדגם זה לאחר מכן ניתן לצטט לתוך צינורות שונים בהתאם ליישומים במורד הזרם הנדרשים. - לקבוע את מספר החיידקים נמשכים לכל ריכוז chemoattractant על ידי ניתוח הדגימות עם ציתום זרימה12. בחר את הריכוז של כימותרפיה הממקסמת את הכימותרפיה עבור פריסות שדה עוקבות.
- מחזיק את ISCA עם היציאה פונה כלפי מטה, לאחזר את נפח הבארים באמצעות מחט סטרילית 27 G מזרק מחובר מזרק 1 מ"ל.
2. הכנה לפריסת שדה
הערה: יש לבצע הכנת חומר ובנייה של מארז שיכוך הזרימה (סעיף 2) לפני הפריסה.
- הכנת חומרים
- הכן את כל החומרים המפורטים בטבלה 1.
הערה: כמויות חומרים מסופקות עבור ISCA אחד.
- הכן את כל החומרים המפורטים בטבלה 1.
- בנייה והכנה של מתחם שיכוך הזרימה
הערה: מארז שיכוך הזרימה ממזער מערבולות לא רצויות המונעות אחרת הקמת מעברי צבע כימיים הבוקעים מה-ISCA.- חותכים את החלקים עבור מארז הפריסה עם חותך לייזר מסדין אקריליק 3 מ"מ.
הערה: ניתן למצוא את הקובץ עבור החלקים באמצעות הקישור הבא: - להרכיב את החלקים בחיתוך לייזר כפי שהוכח איור 2 באמצעות דבק אקרילי.
הערה: להרכיב את החלקים בזהירות. חורים או אי-יישור יכולים ליצור דליפות בעת הפריסה, דבר המשפיע ישירות על איכות הנתונים. - השאר את המתחם המורכב להתייבש בן לילה.
- לשטוף את המתחם עם מים deionized.
- זהה דליפה אפשרית על ידי שפיכת מים מנוים לתוך המתחם. לתקן את כל המפרקים דולף פוטנציאלי על ידי הוספת דבק אקריליק יותר, ולאחר מכן לחזור על שלבים 2.2.3–2.2.5.
- חותכים את חוטי הבורג לתוך חתיכת אקריליק שישמש כדי לאבטח את ISCA. ניתן להשיג זאת באמצעות ברז בקוטר ועם גובה התואם את ברגי ההרכבה.
- ראשית, הדבק את הברז לתוך מפתח ברגים, לאחר מכן לאבטח את חתיכת אקריליק להיות טפח בסגן ספסל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא פיסת אקריליק הוא ברמה ככל האפשר. ודא כי הברז הוא ניצב על פיסת אקרילי ולהתחיל לסובב את מפתח הברז (בכיוון השעון), הפעלת לחץ קל על הברז.
- לאחר כמה מהפכות מלאות בחתיכה אקריליק, להפוך את הסיבוב של הברז (נגד כיוון השעון) עבור רבע סיבוב כדי לנקות אקריליק מהברז. חזור על התהליך עד כל העומק של חתיכת אקריליק הוא טפח.
- לבסוף, הסר את הברז (פונה נגד כיוון השעון) ובדוק את הליכי המשנה באמצעות בורג.
- חותכים את החלקים עבור מארז הפריסה עם חותך לייזר מסדין אקריליק 3 מ"מ.
3. נוהל בתחום
- סינון מים
- לאסוף מים מאתר השדה כאשר מוכן להתחיל את הניסוי. מסנן 5 מ"ל מים לכל ISCA באמצעות מסנן מזרק 0.2 μm (עם מזרק 50 מ"ל) לתוך צינור צנטריפוגה חרלי 50 מ"ל.
הערה: כ-3 מ"ל של מים מסוננים נדרשים למלא את כל בארות ISCA; עם זאת, מומלץ 1) מסנן 5 מ"ל לכל מכשיר כדי להסביר הפסדים במהלך תהליך סינון מרובע, ו 2) לשמר aliquots של filtrates כמו פקדים שליליים עבור שני ציטומטריה זרימה והליכים מולקולריים. - לסנן את הסינון פעמיים דרך מחסנית מסנן GP הידרופילי 0.2 μm (באמצעות אותו אחד, בשתי הפעמים) עם מזרק חדש 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה חרסית 50 מ"ל חדש. לסנן את הסינון דרך מסנן מזרק 0.02 μm (עם מזרק חדש 50 מ"ל) לתוך צינור חרס חדש 50 מ"ל.
הערה: סינון מרובע זה צריך להסיר כמעט את כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מהמים. להרחיק את הסינון הסופי מכל מקור חום עד לשימוש. מים אלה ישמשו לשימוש חוזר של כל הכימיקלים המשמשים ב-ISCA, ויש לשמור עליהם באותה טמפרטורה כמו המים באתר הפריסה. זרמים קונבקטיביים המופעלים על ידי הבדלים בטמפרטורה בין בארות ISCA והסביבה החיצונית עלולים להתרחש אחרת. - השתמש aliquots של הסינון כדי לתפור מחדש את כל chemoattractants של עניין (בדרך כלל יבש) לריכוזים הרצויים בצינורות צנטריפוגה חרסית 15 מ"ל.
- לסנן את הכימותרפיה מחדש דרך מסנן מזרק 0.2 μm עם מזרק 10 מ"ל לתוך צינורות צנטריפוגה חסין 15 מ"ל כדי להסיר חלקיקים לא רצויים או תרכובות מסיסות מים (אם באמצעות תמציות).
הערה: סנן בעדינות כדי למנוע מחלקיקים לעבור דרך המסנן. חשוב לתבל מחדש את הכימותרפיה במים המנוננים במיוחד מאתר השדה ולא להסב את היציבות שלהם לפתרונות אחרים. שימוש במים מאתר השדה הכרחי כדי (1) להשיג את אותו ריכוז מלח בתוך הבארים כמו זה במים הסביבתיים בתפזורת כדי למנוע זרימה מונעת צפיפות, ו-(2) להבטיח כי רמות החומרים המזינים ברקע שוות בתוך הבאר ומחוצה לה.
- לאסוף מים מאתר השדה כאשר מוכן להתחיל את הניסוי. מסנן 5 מ"ל מים לכל ISCA באמצעות מסנן מזרק 0.2 μm (עם מזרק 50 מ"ל) לתוך צינור צנטריפוגה חרלי 50 מ"ל.
- מילוי ISCA
- בצע את סעיף 1.3 כדי למלא את ה- ISCA.
הערה: מומלץ למלא שורה אחת (חמש בארות) לכל חומר (כלומר, שלושה חומרים שונים לכל ISCA ובקרת מי ים אחת מסונון במיוחד).
- בצע את סעיף 1.3 כדי למלא את ה- ISCA.
- פריסה בשדה
- בורג ISCA(איור 3A)לחתיכה 9 של המתחם (איור 2K ו איור 3B).
הערה: מארז שיכוך הזרימה המתואר לעיל יכול להכיל שני תתי-יחידות קאי זה לצד זה או ISCA אחד הממוקם במרכזו. - סגור את המארז(איור 3C)ולאטום אותו עם סרט דבק(איור 3D).
הערה: יש להימנע מקמטים כדי להבטיח אטם מושלם. אטמו תחילה את כל הצדדים, ולאחר מכן (בשלב שני) לאטום את החורים הצדדיים, אשר ישמשו לנקז מים מהמתחם בסוף הדגימה. אל תאטמו את החורים העליונים והתחתון. אין למקם את ISCA הפוך, כמו זרימה מונעת צפיפות יכול להתרחש בארות המכילות כימותרפיה, אשר יהיה להטות את מספר התאים בארות. - מכיוון שהמתחם חייב להישאר יציב במהלך הפריסה, מומלץ לחבר אותו למבנים בעבודת אדם (לדוגמה, פונטון, סולם) באמצעות כבלי בנג'י.
הערה: ניתן לחבר את המארז לזרוע פריסה (כאן, מלחציים מותאמים עם פלטפורמה ניצבת) באמצעות כבלי בנג'י לפני הטבילה במים. לחלופין, ניתן למלא את המתחם ולאבטח אותו עם משקל קטן על מצעים רדודים. אם פריסות מיועדות באוקיינוס הפלגי, ניתן לחבר את המתחם לרשת עם מצוף בצד אחד ולצלול במשקל בצד השני. - לשקוע במתחם לחלוטין כדי להתחיל למלא. בעת מילוי, החזק את המתחם בחוזקה כדי למנוע תנועת מים מוגזמת בפנים. ברגע שמפלס המים מגיע לראש המתחם, ודא שאין אוויר לכוד בפנים.
הערה: במקרה כמה בועות אוויר לכודים, להטות את המתחם בעדינות עם חור האוורור פונה כלפי מעלה, אשר יאפשר בועות לברוח. - לאחר מלא לחלוטין, לאטום את החורים התחתית והלמעלה עם שני תקעים, אשר יכול להיות עשוי סיליקון או גומי או על ידי איטום הגפיים של 20 μL פיפט טיפים(איור 4).
הערה: שלב זה מונע זרימה בתוך המארז במהלך הדגימה. - השאר את ISCA במקום לדגימת עבור 1-3 שעות.
הערה: זמן הפריסה האידיאלי מוכתב בעיקר על ידי טמפרטורת המים והכפלת זמן הקהילה החיידקית. כאשר טמפרטורת המים היא מעל 20 °C, לא מומלץ לפרוס את ISCA עבור יותר מ שעה אחת, מכיוון חלוקת תאים יכול להתרחש בארות המכילות כימותרפיה לאחר 1.5-2.0 שעות. עם זאת, זמן פריסה אופטימלי ניתן לבדוק לפני הניסוי ISCA על ידי תיקון קהילות טבעיות עם כימיקלים טעונים וכמת את מספר התאים לאורך זמן. - הסר את המתחם מהמים. מניחים אותו מעל מיכל המאפשר לרוקן את המים מהמתחם.
- הסר את החלק העליון של סרט הדבק מהחורים הקדמיים בעדינות רבה.
הערה: זרימת המים העוזבת את המתחם חייבת להיות במהירות נוטפת. המשיכו חור אחד בכל פעם, מההעליון של המתחם לתחתית. זה צריך לקחת בערך 10-15 דקות כדי לרוקן את המתחם לחלוטין. - לאחר שקווי המים עוברים מתחת לראש ISCA, הסר את התקע התחתון ורוקן את שאר המים.
- בעוד ISCAs עדיין מחוברים למתחם, בזהירות להסיר את המים לכודים על גבי ISCA עם פיפטה 1 מ"ל.
- הסר את ISCA מבלי לגעת במשטח העליון והשתמש במגבונים חד-פעמיים כדי להסיר את כל הנוזלים הנותרים על פני השטח.
הערה: חשוב לא לגעת בנמלים במהלך תהליך זה, כמו השינויים וכתוצאה מכך בלחץ יכול להסיר או להוסיף חיידקים בתפזורת לתוך הבאר ולהטיה ספירות חיידקים. - אחזר את הדגימות מה-ISCA על-ידי חזרה על שלב 1.5.1.
- בורג ISCA(איור 3A)לחתיכה 9 של המתחם (איור 2K ו איור 3B).
4. יישומים במורד הזרם
הערה: אמצעי אחסון ניתנים בהתבסס על מדגם μL 550 (שורה אחת של ISCA).
- לתקן 100 μL של תוכן טוב עם גלוטרלדהייד (2% ריכוז סופי) עבור ציתום זרימה לכמת chemotaxis לכל מושך.
הערה: לאחסן על קרח (או ב- 4 °C) ולנתח את הדגימות באותו היום. לחלופין, דגימות יכול להיות פלאש קפוא חנקן נוזלי בעקבות קיבעון אם הניתוח אינו אפשרי באותו היום. ציתום זרימה היא השיטה המומלצת לכמת את מספר התאים בארות ISCA, כפי שהוא פשוט, מהיר, ומדויק12. - הצמד להקפיא 300 μL של תוכן טוב חנקן נוזלי עבור הפקת DNA עוקבות וניתוח11.
הערה: אחסן את הדגימות ב- -80 °C עד לניתוח. - הוסף 90 μL של תוכן באר 10 μL של מאגר TE-גליצטרול והצמד-להקפיא את הדגימות עבור גנומיקה של תא יחיד13.
- מורחים 10-20 μL על לוחות אגר המכילים את המדיום הרצוי לבידוד חיידקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מציג תוצאות מעבדה באמצעות ISCA כדי לבדוק את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים לטווח ריכוז של גלוטמין, חומצת אמינו ידוע למשוךחיידקים קרקע 14. ריכוז הגרלוטמין שהביע את התגובה הכימית החזקה ביותר בבדיקות המעבדה שימש לביצוע תסיסה כימית בסביבה הימית.
כדי לבצע את בדיקות המעבדה, קהילות מי ים שנדגמו ממי החוף בסידני, אוסטרליה, הועשרו עבור תאיםצייתנים באמצעות תיקון תזונתי פשוט 4, כמתואר בשלב 1.4. גלוטמין היה מדולל באופן סדרתי במי ים אולטרה מסוננים כדי להשיג ריכוזים סופיים החל 10 mM כדי 100 μM. חמישה שכפולים ISCA נפרסו בו זמנית עבור ניסוי זה, וכל אחד הכיל שלושה ריכוזי גלוטמין שונים (ריכוז אחד בכל שורה) כמו גם שורת בקרת מי ים מסוננים. לאחר פריסה של שעה אחת, התוכן של כל שורת ISCA (המכילה את אותו ריכוז גלוטמין) אוגרו כדי לספק דגימות עבודה של כ 550 μL. נפח זה תוקן גלוטראלדהייד (2% ריכוז סופי), ואת מספר חיידקים מגיבים מכמת באמצעות ציתימת זרימה.
בקצרה, שפע חיידקי היה לכמת על ידי 1) מכתים את התאים עם צבע DNA פלורסנט ירוק 2) ניתוח באמצעות ציטומטר זרימה עם מים deionised אולטרה מסוננת כמו נוזל הנדן. עבור כל מדגם, פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC) ופלואורסצינציה ירוקה נרשמו. הדגימות נותחו בקצב זרימה של 25 μL/min, עם תאים חיידקיים מופלים על פי SSC ופלואורסץ ירוק. מדד chemotactic (Ic )נקבעעל ידי חלוקת ספירות חיידקים הנוכחים בכל מדגם על ידי ספירות חיידקים ממוצע בארות בקרת מי ים מסוננים (FSW).
התוצאות הראו כי 1 mM היה ריכוז פריסת גלוטמין אופטימלי, כפי שהוא גרם לתגובה chemotactic משמעותית שהיה 18-פי גבוה יותר מאשר בקרת מי ים מסוננים (t-test, p < 0.001) (איור 5A). ריכוזים גבוהים או נמוכים יותר של גלוטמין גרמו לתגובות כימיות משמעותיות אך חלשות יותר (Ic = 5.43 עבור 100 μM, p < 0.001; Ic = 7.34 עבור 10 μM, p < 0.001). אם ריכוז כימותרפיה הוסיף באר ISCA הוא גבוה מדי, chemotaxis לתוך הבאר ניתן להפחית, כי (1) חיידקים לא יוכלו לזהות הדרגתי בחלק הנמל עשוי לצבור מעל הבאר, או (2) pH או osmolarity של הבאר עשוי להיות מושפע.
ריכוז גלוטמין אופטימלי שימש לאחר מכן לפריסת שדה. חמישה שכפולים ISCA מלא 1 mM גלוטמין נפרסו במשך 1 שעה באתר החוף ליד סידני, אוסטרליה (33.91 °S, 151.26 °E). גלוטמין משך פי 2.98 יותר חיידקים מאשר בארות הבקרה המלאות במי ים מסוננים מאתר הפריסה(איור 5B). התגובה הכימותרפית בניסוי שדה זה הייתה שונה באופן משמעותי מהפקדים (t-test, p < 0.001) ומהוותה תגובה חזקה עבור מיים החוף 11.
איור 1: תצוגות מפורטות של תס"א chemotaxis (ISCA). (א)ISCA היצוק הזרקה האחרונה. (ב)סכמטי של באר ISCA. סרגל קנה מידה = 7.463 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הרכבה של מארז שיכוך הזרימה. (א)החלקים הדרושים להרכבת מארז הפריסה. במהלך ההתברות, הקצוות צריכים להיות חלקים. (ב)מניחים חתיכות 2a, 2b, 3a, ו 3b סביב חתיכה 1 (משטח תחתון). (ג)להרכיב את החלק התחתון של המארז על ידי הצבת שכבה דקה של דבק אקרילי סביב הקצה הראשון של המשטח התחתון (1). (ד) מניחים את החלק הארוך יותר (2a) אנכית על הדבק והחזקו אותו במקומו. הדבק דורש ~ 1 דקות כדי לחזק ומאפשר חתיכה 2a לתמוך את עצמו בעת הצבת הרכיב הבא. (ה) למרוח שכבה דקה של דבק אקרילי על המשטח התחתון בצד קצר יותר של חתיכה 1. מניחים את פיסת הקיר הצדדית הקצרה (3a) על דבק אקרילי ולנעול אותו לתוך הקיר הצדדי ממוקם בעבר. החזק את שתי החלקים למשך כ- 1 דקות (F) מקם את החלק השני של הקיר הצדדית הקצר (3b) על הצד הנגדי של המשטח התחתון (1). שוב, לנעול אותו לתוך החלק המחבר (2a) ולהחזיק אותו כ 1 דקות (G) במידת הצורך, להחיל מחדש דבק אקריליק לצד הארוך הנותר של המשטח התחתון (1). מניחים את החלק האחרון של הקיר הארוך (2b) וחברו אותה לשני החלקים הסמוכים (3a ו-3b). ודא כי כל החלקים מיושרים כראוי עם החלק התחתון (1) ושלקיים סימנים של אי-יישור או פערים בין קירות הצד או המשטח התחתון. חזור על שלבים אלה כדי להרכיב את החלק העליון המשלים של המארז (4, 5a, 5b, 6a ו- 6b). (H) ודא כי החור בפינה של חתיכה 4 אינו חסום במהלך ההרכבה, אחרת אגרוף את הפתח עם אובייקט חד כגון מחט. החורים של המתחם לשחק תפקיד קריטי בתהליך הפריסה ולאפשר מים לנקז באופן איטי ומבוקר. הקוטר שלהם עבר אופטימיזציה כדי להפחית את הזרימה הסוערת בתוך המתחם, אשר מונע הפרעה של הנוזלים המקיפים את יציאות ISCA בעת אחזור. אני לאיודע מה לעשות. הדבק יחד שני מלבנים גדולים (7) והדבק בנפרד שני מלבנים קטנים יותר (8). חזור פעם אחת עבור כל אחד. (J) הדבק את ארבעת מלבנים המורכבים במרכז המשטח התחתון של המתחם (1). (K) הדבק את הסיפון העליון (9) מעל מלבנים (7 ו- 8). ודא כי החורים בצד של היצירה נמצאים בצד החיצוני של מלבנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקום תב"ע במארז ואיטום על-ידי הקלטה. (A)מקם את ברגי ההרכבה ב- ISCA. (ב)מיקום ISCA במארז הפריסה. מקם את ה- ISCA באמצע מארז הפריסה וצרף אותו עם הברגים שצוינו. יש לאטום את חור הניקוז התחתון של המתחם עם קצה μL שונה(איור 4)לאחר שהמתחם מלא במים. זה עוזר למנוע דור של זרמים סוערים שיכולים להשפיע על היציבות של השדה הכימי ויעילות של chemotaxis. החלקיםהעליונים והתוארים מורכבים יחד. (ד)איטום המארז באמצעות סרט דביק. יש להימנע מקמטים כדי למנוע דליפות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: חבר לאיטום מארז שיכוך הזרימה. התקע יכול להיעשות על ידי איטום קצה פיפטה 20 μL עם חום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: Chemotaxis תססים שימוש ISCA כלפי גלוטמין של קהילה מועשרת מוטיב במעבדה ואוכלוסייה מיקרוביאלית טבעית בתחום. מדד Chemotaxis Ic (המייצג את ריכוז התאים בתוך בארות ISCA) מנורמל על ידי הריכוז הממוצע של תאים בתוך בארות המכילות את מי הים מסוננים (FSW) לאחר 60 דקות של פריסה. כל ריכוז נבדק בחמישה שכפולים ISCA. תאים חיידקיים היו מכמתים על ידי ציתום זרימה (A): FSW = 4.46 ± 0.25 x 103; 100 μM = 2.43 ± 0.16 x 104; 1 mM = 8.07 ± 0.45 x 104; 10 mM = 3.28 ± 0.20 x 104; (ב): FSW = 1.26 ± 0.11 x 104; 1 mM = 3.76 ± 0.28 x 104 תאים/מ"ל). כל ריכוזי גלוטמין שנבדקו במעבדה (A) ושדה (ב) גרמו לתגובה כינוקטית גבוהה משמעותית מהבקרות המסוננים של מי הים (FSW).. בכל ההשוואות לזווג: (א) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005; (ב) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005. קווי שגיאה מייצגים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חומר שדה | כמות (כמות) |
| סינון מים | |
| מתלה צינור - 50 מ"ל | 1 |
| מחסנית מסנן GP הידרופילית - 0.2 μm | 1 |
| מסנן מזרק - 0.2 μm | 1 |
| מסנן מזרק - 0.02 μm | 1 |
| מזרקים - 50 מ"ל | 4 |
| צנטריפוגה חרטונית צינור - 50 מ"ל | 5 |
| התחדשות כימית | |
| צנטריפוגה חרטונית צינור - 15 מ"ל | 4 |
| כימותרפיה | |
| מזרקים - 10 מ"ל | 4 |
| מסנן מזרק - 0.2 μm | 4 |
| מתלה צינור - 15 מ"ל | 1 |
| מילוי ISCA | |
| מחט מזרק 27G | 4 |
| מזרק - מ"ל אחד | 4 |
| ISCA (19) | 1 |
| פריסה ופריסה | |
| מארז פריסה | 1 |
| ברגי ראש שטוחים מחוריצי ניילון | 2 |
| זרוע פריסה | 1 |
| כבל בנג'י | 2 |
| סרט דבק | 1 |
| תקע מארז פריסה | 1 |
| אחזור דוגמאות | |
| מחט מזרק 27G | 4 |
| מזרקים - מ"ל אחד | 4 |
| צנטריפוגה שפופרת - 2 מ"ל | 12 |
| מגבים חד פעמיים | תיבה אחת |
| גלוטרדהייד 25% | 10 מ"ל |
| חומרים אחרים | |
| סט פיפטות | 1 |
| פיפטה טיפים 200 μL | תיבה אחת |
| פיפטה טיפים 20 μL | תיבה אחת |
| פיפטה טיפים 1 מ"ל | תיבה אחת |
טבלה 1: חומרים הדרושים לפריסת שדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בקנה מידה של מיקרואורגניזמים ימיים, הסביבה רחוקה מלהיות הומוגנית ומאופיינת לעתים קרובות על ידי מעברי צבע פיזיים/כימיים המוסיינים קהילות מיקרוביאליות1,15. היכולת של מיקרואורגניזמים מוטיב להשתמש בהתנהגות (כלומר, chemotaxis) מקל על חיפוש מזון בתוך מיקרו מיקרו-סביבה הטרוגנית אלה1. לימוד chemotaxis ישירות בסביבה יש פוטנציאל לזהות אינטראקציות בין ספציפיות חשובות והעדפות כימיות, וזה יכול לעזור להתיר את התרומות של חיידקים ספציפיים לתהליכים ביו-כימיים. הפרוטוקול המוצג פורס את ISCA בסביבה11 כדי להקל על רכישת מחקר לשחזור על chemotaxis ב situ.
באמצעות ISCA, זה מראה כי גלוטמין מעורר תגובה כימית חיובית הן בתנאי מעבדה והן בתחום. פריסת ISCA של גלוטמין בתחום מניבה תגובה כימית נמוכה יותר מאשר במעבדה(איור 5). פטפוטים דומים בין ניסויי מעבדה ושדה נצפו בעבר11. אלה יכולים להיות מוסברים על ידי השיעור הנמוך של תאים מוטיב בסביבה לעומת הקהילות המועשר או מבודד מוטיב יחיד המשמש בבדיקות מעבדה.
אין לזלזל בחשיבותם של ניסויים ראשוניים מבוססי מעבדה, מכך שהם מאפשרים קביעת ריכוזים כימותרפיים אופטימליים לשימוש בפריסה בשטח. הריכוז האופטימלי הוא ספציפי לכל כימותרפיה ומושפע ממשקלו המולקולרי, המסיסות והמפזרות מהבארות. במקרה של פריסה של חומרים שונים, כל אחד צריך להיבדק בנפרד על פני טווח ריכוז. אם לא זוהה chemotaxis בשדה לאחר שעה אחת, ניתן לבצע פריסות ארוכות יותר. עם זאת, אורך הפריסה מוגבל מאוד על ידי צמיחה חיידקית ותמיד צריך להיות קצר יותר מקצב החלוקה של חיידקים בסביבה ממוקדת. פעולה זו מסייעת למנוע גידול באוכלוסייה בתוך ISCA.
ISCA הוא רגיש מערבולות מים וטיפול צריך להילקח בעת מילוי ורוקן את המתחם שיכוך זרימה. יש לבצע שלבים אלה באיטיות, מכיוון שזרמים הנובעים ממילוי מהיר יכולים לשטוף או לדלל את תכולת הבארים. כתוצאה מכך, זה מסיר או מונע chemoattractants ממפזר כראוי או החדרת חיידקים מהסביבה שמסביב, בסופו של דבר הטיית ספירת תאים. מילוי מלא של המתחם במים תוך כדי אוורור כל האוויר, לאחר מכן סגירתו לחלוטין, מבטיח כי מערבולות לא יפריעו לפריסה. איסוף מטה-נתונים באתר הפריסה (כלומר, טמפרטורה, ממליחות, כלורופיל/ריכוז תזונתי) הוא גם צעד קריטי לפענוח תוצאות, מכיוון שגורמים אלה יכולים להשפיע על כימותרפיה.
ISCA הוא מכשיר נגיש וידידותי למשתמש המספק תובנות חדשות על התפקיד והשכיחות של chemotaxis בסביבה. היא מאפשרת חקירה של chemotaxis בכל מערכת המכילה שלב נוזלי (למשל, ימי, מים מתוקים, אדמה, מערכות שפכים). לבסוף, זה יכול לשמש מחקרים ממוקדים על פתוגנים ועמידות לאנטיביוטיקה בסביבה, בידוד של חיידקים מרכזיים עבור bioprospecting, ותיקון ביולוגי של מזהמים ספציפיים ומיקרופלסטיק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי יוזמת המיקרוביולוגיה הימית של קרן גורדון ובטי מור, באמצעות מענק GBMF3801 לג'יי.אר.ס ו-ר.ס, ופרס חוקר (GBMF3783) ל-R.S., כמו גם מלגת מועצת המחקר האוסטרלית (DE160100636) לג'יי.בי.אר, פרס מקרן סימונס ל-B.S.L. (594111) ומענק מקרן סימונס (542395) ל-R.S. כחלק מעקרונות המערכות האקולוגיות המיקרוביאליות (PriME).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
