Summary
Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell'ambiente.
Abstract
I comportamenti microbici, come la motilità e la chemiotaxis (la capacità di una cellula di alterare il suo movimento in risposta a un gradiente chimico), sono diffusi nei domini batterici e archeali. La chemitaxis può comportare notevoli vantaggi di acquisizione delle risorse in ambienti eterogenei. Svolge anche un ruolo cruciale nelle interazioni simbiotiche, nelle malattie e nei processi globali, come il ciclo biogeochimico. Tuttavia, le tecniche attuali limitano la ricerca sulla chemiotaxis al laboratorio e non sono facilmente applicabili sul campo. Presentato qui è un protocollo passo-passo per la distribuzione del saggio in situ chemiotaxis (ISCA), un dispositivo che consente un robusto interrogatorio di chemiotaxis microbica direttamente nell'ambiente naturale. L'ISCA è un dispositivo microfluidico costituito da un array di 20 possilui, in cui possono essere caricate sostanze chimiche di interesse. Una volta impiegate in ambienti aque, le sostanze chimiche si diffondono fuori dai pozzi, creando gradienti di concentrazione che i microbi percepiscono e rispondono nuotando nei pozzi tramite chemiotaxis. Il contenuto dei beni può quindi essere campionato e utilizzato per (1) quantificare la forza delle risposte chemiotatiche a composti specifici attraverso la citometria del flusso, (2) i microrganismi reattivi isolati e della coltura e (3) caratterizzare l'identità e il potenziale genomico delle popolazioni che rispondono attraverso tecniche molecolari. L'ISCA è una piattaforma flessibile che può essere impiegata in qualsiasi sistema con una fase molto aque, compresi gli ambienti marini, d'acqua dolce e del suolo.
Introduction
Diversi microrganismi utilizzano motilità e chemiotaxis per sfruttare ambienti nutritivi patchy, trovare ospiti, o evitare condizioni deleteri1,2,3. Questi comportamenti microbici possono a loro volta influenzare i tassi di trasformazione chimica4 e promuovere partenariati simbiotici tra gli ecosistemi terrestri, d'acqua dolce e marini2,5.
La chemitaxis è stata ampiamente studiata in condizioni di laboratorio negli ultimi 60 anni6. Il primo metodo quantitativo per studiare la chemitaxis, il saggio capillare, prevede un tubo capillare riempito con un chemoattractant putativo immerso in una sospensione del batterio6. La diffusione della sostanza chimica fuori dal tubo crea un gradiente chimico, e i batteri chemiotatici rispondono a questo gradiente migrando nel tubo7. Dallo sviluppo del saggio capillare, ancora oggi ampiamente utilizzato, molte altre tecniche sono state sviluppate per studiare la chemiotassi in condizioni fisiche/chimiche sempre più controllate, con la più recente che prevede l'uso di microfluidics8,9,10.
La microfluidica, insieme alla microscopia video ad alta velocità, consente di monitorare il comportamento delle singole cellule in risposta a gradienti attentamente controllati. Anche se queste tecniche hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della chemiotaxis, sono state limitate all'uso di laboratorio e non si traducono facilmente nella distribuzione sul campo nei sistemi ambientali. Di conseguenza, la capacità delle comunità naturali di batteri di utilizzare la chemitaxis all'interno degli ecosistemi naturali non è stata esaminata; pertanto, l'attuale comprensione della potenziale importanza ecologica della chemiotassi è prevenita verso le condizioni di laboratorio artificiali e un numero limitato di isolati batterici in laboratorio. L'ISCA recentemente sviluppato supera queste limitazioni11.
L'ISCA si basa sul principio generale del saggio capillare; tuttavia, si fa uso di moderne tecniche di microfabbricazione per fornire una piattaforma sperimentale altamente replicata e facilmente distribuibile per la quantificazione della chemiotassi verso composti di interesse nell'ambiente naturale. Permette anche l'identificazione e la caratterizzazione dei microrganismi chemiotattici mediante isolamento diretto o tecniche molecolari. Mentre il primo dispositivo di lavoro è stato auto-fabbricato e costruito in vetro e PDMS11, l'ultima versione a iniezione è composta da policarbonato, utilizzando una procedura di fabbricazione altamente standardizzata (per interesse per l'ultima versione del dispositivo, gli autori corrispondenti possono essere contattati).
L'ISCA è di dimensioni di carta di credito ed è costituito da 20 pozzi distribuiti in un array di pozzi 5 x 4, ciascuno collegato all'ambiente acquatico esterno da una piccola porta (800 m di diametro; figura 1). Chemoattractants putativi caricati nei pozzi si diffondono nell'ambiente attraverso il porto, e i microbi chemiotattici rispondono nuotando attraverso il porto nel pozzo. Poiché molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento ISCA nell'ambiente naturale, questo protocollo passo-passo aiuterà i nuovi utenti a superare potenziali ostacoli e a facilitare distribuzioni efficaci.
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Protocol
Si consiglia di eseguire la sezione 1 prima degli esperimenti sul campo per ottimizzare i risultati.
1. Ottimizzazione di laboratorio
NOTA: i volumi descritti nella procedura di ottimizzazione sono sufficienti per un singolo ISCA (composto da 20 pozzetti).
- Preparazione della sostanza chimica di interesse
NOTA: La concentrazione ottimale per ogni chemioattractant spesso deve essere determinata in condizioni di laboratorio prima delle distribuzioni sul campo. Il campo di concentrazione chimica diminuirà di grandezza con la distanza dalla fonte (pozzo ISCA), il che significa che la concentrazione sperimentata dai microrganismi nell'ambiente sarà inferiore a quella presente all'interno del dispositivo. La concentrazione ottimale da utilizzare nel pozzo ISCA dipende dal tasso di diffusione del chemoattractant. Se la concentrazione nel pozzo è troppo bassa (vicino al limite di rilevamento dei microbi), non si osserverà alcuna chemiotassi positiva. Al contrario, se la concentrazione nel pozzo è troppo alta, la concentrazione sarà alta anche nell'ambiente immediato e l'accumulo microbico si verificherà sopra i pozzi ISCA piuttosto che all'interno. Pertanto, la serie di diluizione deve essere effettuata in condizioni di laboratorio per ogni composto al fine di determinare la concentrazione ottimale per le distribuzioni sul campo. Idealmente, un intervallo di concentrazione dovrebbe anche essere testato sul campo per confermare i risultati di laboratorio.- Preparare 2,5 L di un mezzo adeguato contenente l'adeguata concentrazione di sale (ad esempio, salina tamponata di fosfati [PBS] o acqua di mare artificiale). Filtrare il supporto con un filtro da 0,2 m utilizzando una pompa peristaltica o a vuoto e un'autoclave.
- Preparare una soluzione da 10 mM di chemoattractant in 1 mL del mezzo sterile. Filtrare la soluzione chemoattractant con un filtro siringa da 0,2 m per rimuovere particelle e potenziali contaminanti.
NOTA: Idealmente, nessun composto organico diverso dal chemoattractant deve essere presente nella soluzione finale.
- Gamma di concentrazione per serie di diluizione
- Diluire la soluzione di stock chemoattractant filtrata in serie, che va (ad esempio) da 10 mM a 100 M.
NOTA: è necessario almeno un volume finale di 0,7 mL per concentrazione testata.
- Diluire la soluzione di stock chemoattractant filtrata in serie, che va (ad esempio) da 10 mM a 100 M.
- Caricamento dell'ISCA
- Riempire una siringa da 1 mL con il chemoattractant filtrato e collegarla a una siringa da 27 G. Tenendo l'ISCA con il porto rivolto verso l'alto, iniettare lentamente la sostanza fino a quando non appare una piccola goccia sulla parte superiore del porto.
NOTA: 1) Ogni diluizione o sostanza deve essere iniettata con una siringa e un ago separati per evitare la contaminazione incrociata. 2) Questa piccola goccia è importante perché assicura che nessuna bolla d'aria sia intrappolata all'interno del porto, il che potrebbe compromettere la capacità dei microbi di migrare attraverso il porto. 3) Si raccomanda di riempire un'intera riga per sostanza o concentrazione (cinque pozzi) per fornire un volume minimo adeguato per ulteriori analisi. 4) Una riga per ISCA deve fungere da controllo negativo e deve essere riempita con il mezzo filtrato in cui i microbi saranno sospesi. Questo trattamento rappresenta l'effetto della motilità casuale da parte dei microbi nei pozzi ISCA e deve essere utilizzato per normalizzare i trattamenti contenenti un chemoattractant.
- Riempire una siringa da 1 mL con il chemoattractant filtrato e collegarla a una siringa da 27 G. Tenendo l'ISCA con il porto rivolto verso l'alto, iniettare lentamente la sostanza fino a quando non appare una piccola goccia sulla parte superiore del porto.
- Distribuzione in laboratorio
- Durante la notte, incubare una coltura di 5 mL arricchita con 1% brodo marino (per i batteri marini) o 1% brodo di glisogenio (LB, per i batteri dell'acqua dolce).
NOTA: Gli isolati batterici motile o le comunità batteriche naturali possono essere utilizzati per le distribuzioni di laboratorio. - Incubare la coltura per 12 h a temperatura ambiente (RT) e 180 rpm. Dopo 12 h, assicurarsi che le comunità microbiche siano motile mediante osservazione diretta al microscopio.
- Abbattere la coltura a 1.500 x g per 10 min e rispendere 1/100 in 150 mL di mezzo appropriato (ad esempio, acqua di mare filtrata, acqua dolce filtrata).
- Posizionare due piccoli pezzi di nastro adesivo a due lati sulla superficie piana di un vassoio di capacità di 200 mL (i coperchi delle scatole di punta da 1 mL hanno le dimensioni ideali per questo scopo e possono essere facilmente autoclaved). Posizionare un ISCA in cima, assicurandosi che si collega in modo sicuro al nastro. Riempire lentamente il vassoio di distribuzione con la soluzione batterica utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL.
NOTA: Riempire il vassoio fino a quando l'ISCA non è immerso sotto circa 1-2 cm di liquido. Se si utilizzano più vassoi, utilizzare lo stesso volume su tutti. - Lasciare incubare l'ISCA per 1 h per consentire la chemiotassi batterica. Dopo 1 h, rimuovere il mezzo molto delicatamente con una pipetta sierologica da 50 mL per ridurre al minimo il flusso turbolento.
- Recuperare l'ISCA dal vassoio di distribuzione senza toccare la superficie superiore. Utilizzare una pipetta e tergicristalli usa e getta per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie ISCA.
NOTA: È importante evitare di toccare le porte durante questo processo, poiché i cambiamenti di pressione risultanti possono rimuovere o aggiungere batteri dall'ambiente esterno nel pozzo e quindi sbilalare la densità batterica e la composizione all'interno del pozzo.
- Durante la notte, incubare una coltura di 5 mL arricchita con 1% brodo marino (per i batteri marini) o 1% brodo di glisogenio (LB, per i batteri dell'acqua dolce).
- Recupero dei campioni
- Tenendo l'ISCA con la porta rivolta verso il basso, recuperare il volume dei pozzetti utilizzando un ago sterile di siringa da 27 G attaccato a una siringa da 1 mL.
NOTA: ogni riga (se contenente la stessa sostanza) può essere in pool per fornire un campione funzionante di circa 550 L. Questo esempio può essere successivamente trasmesso in tubi diversi a seconda delle applicazioni a valle richieste. - Determinare il numero di batteri attratti da ogni concentrazione chemoattractant analizzando i campioni con citometria di flusso12. Scegliere la concentrazione di chemoattractant che massimizza la chemotaxis per le successive distribuzioni sul campo.
- Tenendo l'ISCA con la porta rivolta verso il basso, recuperare il volume dei pozzetti utilizzando un ago sterile di siringa da 27 G attaccato a una siringa da 1 mL.
2. Preparazione per la distribuzione sul campo
NOTA: la preparazione del materiale e la costruzione dell'involucro di smorzamento del flusso (sezione 2) devono essere effettuate prima della distribuzione.
- Preparazione dei materiali
- Preparare tutti i materiali elencati nella tabella 1.
NOTA: le quantità di materiale vengono fornite per un'ISCA.
- Preparare tutti i materiali elencati nella tabella 1.
- Costruzione e preparazione del recinto di smorzamento del flusso
NOTA: L'involucro di smorzamento del flusso riduce al minimo le turbolenze indesiderate che altrimenti impediscono la creazione di gradienti chimici provenienti dall'ISCA.- Tagliare i pezzi per l'involucro di distribuzione con una fresa laser da un foglio acrilico da 3 mm.
NOTA: il file per i pezzi può essere trovato utilizzando il seguente collegamento: - Assemblare i pezzi tagliati al laser come dimostrato nella Figura 2 utilizzando la colla acrilica.
NOTA: Assemblare i pezzi con cura. I fori o il disallineamento possono creare perdite durante la distribuzione, con un impatto diretto sulla qualità dei dati. - Lasciare asciugare il recinto assemblato durante la notte.
- Lavare il recinto con acqua deionizzata.
- Identificare potenziali perdite versando acqua deionizzata nel recinto. Correggere eventuali giunti che perdono aggiungendo altra colla acrilica, quindi ripetere i passaggi 2.2.3–2.2.5.
- Tagliare i fili a vite nel pezzo acrilico che verrà utilizzato per fissare l'ISCA. Questo può essere ottenuto utilizzando un rubinetto con un diametro e passo corrispondente alle viti di montaggio.
- In primo luogo, apposti il rubinetto in una chiave di fissazione, quindi fissa il pezzo acrilico da toccare in un vizio in panchina. Per ottenere i migliori risultati, assicurarsi che il pezzo acrilico sia il più livellato possibile. Assicurarsi che il rubinetto sia perpendicolare al pezzo acrilico e iniziare a girare la chiave del rubinetto (in senso orario), applicando la pressione della luce al rubinetto.
- Dopo diverse rivoluzioni complete nel pezzo acrilico, invertire la rotazione del rubinetto (in senso antiorario) per un quarto di una rotazione per cancellare l'acrilico dal rubinetto. Ripetere il processo fino a quando non viene toccata l'intera profondità del pezzo acrilico.
- Infine, rimuovere il rubinetto (girando in senso antiorario) e testare i fili utilizzando una vite.
- Tagliare i pezzi per l'involucro di distribuzione con una fresa laser da un foglio acrilico da 3 mm.
3. Procedura sul campo
- Filtrazione dell'acqua
- Raccogliere l'acqua dal sito sul campo quando è pronto per iniziare l'esperimento. Filtrare 5 mL di acqua per ISCA attraverso un filtro di siringa da 0,2 m (con una siringa da 50 mL) in un tubo di centrifuga conica da 50 mL.
NOTA: Sono necessari circa 3 mL di acqua filtrata per riempire tutti i pozzi di un ISCA; tuttavia, si raccomanda di filtrare 1) 5 mL per dispositivo per tenere conto delle perdite durante il processo di filtrazione quadrupla, e 2) conservare gli aliquots dei filtrati come controlli negativi sia per la citometria di flusso che per le procedure molecolari. - Filtrare il filtratore due volte attraverso una cartuccia di filtro GP idrofilo da 0,2 m (utilizzando la stessa, entrambe le volte) con una nuova siringa da 50 mL in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 mL. Filtrare il filtrato attraverso un filtro siringa da 0,02 m (con una nuova siringa da 50 mL) in un nuovo tubo conico da 50 mL.
NOTA: Questa filtrazione quadrupla dovrebbe rimuovere quasi tutti i microrganismi e le particelle dall'acqua. Tenere il filtrante finale lontano da qualsiasi fonte di calore fino all'uso. Quest'acqua sarà utilizzata per riespettere tutte le sostanze chimiche utilizzate nell'ISCA e dovrebbe essere mantenuta alla stessa temperatura dell'acqua nel sito di distribuzione. I flussi convettivi innescati da differenze di temperatura tra i pozzi ISCA e l'ambiente esterno potrebbero altrimenti verificarsi. - Utilizzare aliquots del filtrato per risundere tutti i chemoattractants di interesse (tipicamente asciutti) alle concentrazioni desiderate in tubi centrifuga conica da 15 mL.
- Filtrare i chemoattractants resuspended attraverso un filtro di siringa da 0,2 m con una siringa da 10 mL in tubi sterili di centrifugazione conica da 15 mL per rimuovere le particelle indesiderate o i composti insolubili in acqua (se si utilizzano estratti).
NOTA: Filtrare delicatamente per evitare che le particelle passano attraverso il filtro. È importante risundere i chemoattractants nell'acqua ultrafiltrata dal sito di campo e non solubilizzarli in altre soluzioni. L'utilizzo dell'acqua dal sito di campo è necessario (1) ottenere la stessa concentrazione di sale all'interno dei pozzi come quella nell'acqua ambientale alla rinfusa per evitare il flusso a densità, e (2) garantire che i livelli di nutrienti di fondo siano uguali all'interno e all'esterno del pozzo.
- Raccogliere l'acqua dal sito sul campo quando è pronto per iniziare l'esperimento. Filtrare 5 mL di acqua per ISCA attraverso un filtro di siringa da 0,2 m (con una siringa da 50 mL) in un tubo di centrifuga conica da 50 mL.
- Riempimento ISCA
- Eseguire la sezione 1.3 per riempire l'ISCA.
NOTA: Si raccomanda di riempire una riga (cinque pozzi) per sostanza (cioè, tre diverse sostanze per ISCA e un controllo dell'acqua di mare ultrafiltrato).
- Eseguire la sezione 1.3 per riempire l'ISCA.
- Distribuzione sul campo
- Screw l'ISCA (Figura 3A) al pezzo 9 dello chassis (Figura 2K e Figura 3B).
NOTA: l'involucro di smorzamento del flusso sopra descritto può contenere due ISCA affiancate o una ISCA posizionata al centro. - Chiudere l'alloggiamento( Figura 3C) e sigillarlo con nastro adesivo (Figura 3D).
NOTA: Le rughe devono essere evitate per garantire una guarnizione perfetta. Sigillare prima tutti i lati, quindi (in una seconda fase) sigillare i fori laterali, che verranno utilizzati per drenare l'acqua dal recinto alla fine del campionamento. Non sigillare i fori superiore e inferiore. Non posizionare l'ISCA a testa in giù, poiché il flusso a densità può verificarsi in pozzi contenenti chemoattractants, che distorceranno il numero di cellule nei pozzi. - Poiché l'involucro deve rimanere stabile durante il dispiegamento, si consiglia di collegarlo a strutture artificiali (ad esempio, pontone, scala) utilizzando cavi bungee.
NOTA: L'involucro può essere collegato a un braccio di distribuzione (qui, un morsetto modificato con una piattaforma perpendicolare) utilizzando cavi elastici prima dell'immersione in acqua. In alternativa, il recinto può essere riempito e fissato con un piccolo peso su substrati poco profondi. Se le distribuzioni sono destinate nell'oceano pelagico, il recinto può essere collegato a una rete con una boa da un lato e il peso dell'immersione dall'altro. - Immergere completamente il recinto per iniziare a riempirsi. Durante il riempimento, tenere saldamente il recinto per evitare un eccessivo movimento dell'acqua all'interno. Una volta che il livello dell'acqua raggiunge la parte superiore del recinto, assicurarsi che nessuna aria è intrappolata all'interno.
NOTA: Nel caso in cui alcune bolle d'aria siano intrappolate, inclinare delicatamente il recinto con il foro di sfiato rivolto verso l'alto, che consentirà alle bolle di fuori onda. - Una volta completamente pieni, sigillare i fori inferiore e superiore con due spine, che possono essere fatte in silicio o gomma o sigillando le estremità di 20 punte di pipetta 20 L (Figura 4).
NOTA: questo passaggio impedisce il flusso all'interno dell'alloggiamento durante il campionamento. - Lasciare l'ISCA in posizione per il campionamento per 1-3 h.
NOTA: Il tempo di distribuzione ideale è dettato principalmente dalla temperatura dell'acqua e dal raddoppio del tempo della comunità batterica. Quando la temperatura dell'acqua è superiore a 20 gradi centigradi, non è consigliabile dispiegare l'ISCA per più di 1 h, perché la divisione cellulare può verificarsi nei pozzi contenenti chemoattractants dopo 1,5–2,0 h. Tuttavia, il tempo di distribuzione ottimale può essere testato prima dell'esperimento ISCA modificando le comunità naturali con le sostanze chimiche caricate e quantificando il numero di cellule nel tempo. - Rimuovere l'involucro dall'acqua. Posizionarlo su un contenitore che consente di drenare l'acqua dal recinto.
- Rimuovere la parte superiore del nastro adesivo dai fori anteriori molto delicatamente.
NOTA: Il flusso dell'acqua che lascia il recinto deve essere ad una velocità gocciolante. Procedere un foro alla volta, dalla parte superiore del recinto verso il basso. Dovrebbe richiedere circa 10-15 minuti per drenare completamente l'involucro. - Una volta che la linea di galleggiamento passa sotto la parte superiore dell'ISCA, rimuovere la spina inferiore e drenare il resto dell'acqua.
- Mentre le ISCA sono ancora attaccate al recinto, rimuovere con attenzione l'acqua intrappolata sulla parte superiore dell'ISCA con una pipetta da 1 mL.
- Rimuovere l'ISCA senza toccare la superficie superiore e utilizzare una salvietta usa e getta per rimuovere il liquido rimanente sulla superficie.
NOTA: È importante non toccare le porte durante questo processo, poiché i cambiamenti di pressione risultanti possono rimuovere o aggiungere batteri sfuoca nel pozzo e distorsionare i conteggi batterici. - Recuperare i campioni dall'ISCA ripetendo il passaggio 1.5.1.
- Screw l'ISCA (Figura 3A) al pezzo 9 dello chassis (Figura 2K e Figura 3B).
4. Applicazioni a valle
NOTA: I volumi sono forniti sulla base di un campione di 550 L (una riga di un ISCA).
- Fissare 100 L di contenuto di pozzo con glutaraldeide (2% concentrazione finale) per la citometria di flusso per quantificare la chemitassi a ciascun attrattore.
NOTA: Conservare sul ghiaccio (o a 4 gradi centigradi) e analizzare i campioni nello stesso giorno. In alternativa, i campioni possono essere congelati in modo flash in azoto liquido dopo la fissazione se l'analisi non è fattibile nello stesso giorno. La citometria di flusso è il metodo consigliato per quantificare il numero di cellule nei pozzi ISCA, in quanto è semplice, veloce epreciso 12. - Snap congelare 300 L di contenuto di pozzo in azoto liquido per la successiva estrazione del DNA el'analisi 11.
NOTA: Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino all'analisi. - Aggiungere 90 L di contenuto di pozzo a 10 L di buffer TE-glicerolo e bloccare i campioni per la genomica a cella singola13.
- Stendere 10-20 L su piastre di agar contenenti il mezzo desiderato per l'isolamento batterico.
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Representative Results
Questa sezione presenta i risultati di laboratorio utilizzando l'ISCA per testare la risposta chemiotattica dei microbi marini a una gamma di concentrazione di glutammina, un aminoacido noto per attirare i batteridel suolo 14. La concentrazione di glutammina che ha suscitato la risposta chemiotatica più forte nei test di laboratorio è stata utilizzata per eseguire un saggio di chemiotaxis nell'ambiente marino.
Per eseguire i test di laboratorio, le comunità di acqua di mare campiova dall'acqua costiera di Sydney, in Australia, sono state arricchite per le cellule motile attraverso un semplice emendamentonutritivo 4, come descritto al punto 1.4. La glutamina è stata diluita in modo seriale nell'acqua di mare ultrafiltrata per ottenere concentrazioni finali che vanno da 10 mM a 100 M. Cinque repliche ISCA sono state impiegate simultaneamente per questo esperimento, ognuna delle quali conteneva tre diverse concentrazioni di glutammina (una concentrazione per fila) e una fila filtrata di controllo dell'acqua di mare. Dopo un dispiegamento di 1 h, il contenuto di ogni riga ISCA (contenente la stessa concentrazione di glutammina) è stato in pool per fornire campioni di lavoro di circa 550 L. Questo volume è stato fissato nella glutaraldeide (2% concentrazione finale) e il numero di batteri che rispondono è quantificato tramite citometria di flusso.
In breve, l'abbondanza batterica è stata quantificata da 1) macchiando le cellule con un colorante di DNA fluorescente verde e 2) analisi utilizzando un citometro di flusso con acqua deionizzata ultrafiltrata come fluido di sheath. Per ogni campione sono stati registrati la dispersione in avanti (FSC), la dispersione laterale (SSC) e la fluorescenza verde. I campioni sono stati analizzati ad una velocità di flusso di 25 L/min, con cellule batteriche discriminate in base all'SSC e alla fluorescenza verde. L'indice chemiotattico (Ic) è stato determinato dividendo i conteggi batterici presenti in ogni campione per i conteggi batterici medi nei pozzi filtrati di controllo dell'acqua di mare (FSW).
I risultati hanno mostrato che 1 mM era la concentrazione ottimale di distribuzione della glutammina, in quanto ha indotto una risposta chemiotatica significativa che era 18 volte superiore al controllo filtrato dell'acqua di mare (t-test, p < 0.001) (Figura 5A). Concentrazioni più elevate o più basse di glutammina hanno indotto risposte chemiotatiche significative ma più deboli (Ic - 5,43 per 100 M, p < 0,001; Ic - 7,34 per 10 M, p < 0,001). Se la concentrazione chemoattractant aggiunta ad un pozzo ISCA è troppo alta, la chemiotassi nel pozzo può essere ridotta, perché (1) i batteri non saranno in grado di rilevare un gradiente nella sezione del porto e possono aggregarsi sopra il pozzo, o (2) il pH o l'osmolarità del pozzo possono essere influenzati.
La concentrazione ottimale di glutammina è stata successivamente utilizzata per la distribuzione sul campo. Cinque repliche ISCA riempite con glutammina da 1 mM sono state impiegate per 1 h in un sito costiero vicino a Sydney, in Australia (33,91 gradi centigradi, 151,26 gradi centigradi). La glutamina ha attirato 2,98 volte più batteri rispetto ai pozzi di controllo riempiti con acqua di mare filtrata dal sito di distribuzione (Figura 5B). La risposta chemiotaca in questo esperimento sul campo è stata significativamente diversa dai controlli (t-test, p < 0.001) e ha costituito una forte risposta per l'acqua di mare costiera11.
Figura 1: viste dettagliate del saggio in situ chemiotaxis (ISCA). (A) L'ultima ISCA a iniezione. (B) Schematico di un pozzo ISCA. Barra della scala - 7.463 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Assemblaggio dell'involucro di smorzamento del flusso. (A) I pezzi necessari per l'assemblaggio dello chassis di distribuzione. Durante la fabbricazione, i bordi devono essere lisci. (B) Posizionare i pezzi 2a, 2b, 3a e 3b intorno al pezzo 1 (superficie inferiore). (C) Assemblare la parte inferiore dell'involucro mettendo un sottile strato di colla acrilica intorno al primo bordo della superficie inferiore (1). (D) Posizionare il primo pezzo di parete laterale più lungo (2a) verticalmente sulla colla e tenerlo in posizione. La colla richiede 1 minuto per solidificare e permette al pezzo 2a di sostenersi posizionando l'elemento successivo. (E) Applicare un sottile strato di colla acrilica sulla superficie inferiore su un lato più corto del pezzo 1. Posizionare il pezzo di parete laterale corto (3a) sulla colla acrilica e bloccarlo nella parete laterale precedentemente posizionata. Tenere i due pezzi per circa 1 min. (F) Posizionare l'altro pezzo di parete laterale corta (3b) sul lato opposto della superficie inferiore (1). Ancora una volta, bloccarlo nel pezzo di collegamento (2a) e tenerlo premuto per circa 1 min. (G) Se necessario, riapplicare la colla acrilica al lato lungo rimanente della superficie inferiore (1). Posizionare l'ultimo pezzo lungo sidewall (2b) e collegarlo nei due pezzi adiacenti (3a e 3b). Assicurarsi che tutti i pezzi siano correttamente allineati con il pezzo inferiore (1) e che non siano presenti segni di disallineamento o disaffidamento tra le pareti laterali o la superficie inferiore. Ripetere questi passaggi per assemblare la parte superiore complementare dell'involucro (4, 5a, 5b, 6a e 6b). (H) Assicurarsi che il foro nell'angolo del pezzo 4 non sia ostruito durante l'assemblaggio, altrimenti punzonare l'apertura con un oggetto affilato come un ago. I fori dell'involucro svolgono un ruolo fondamentale nel processo di distribuzione e consentono all'acqua di decolare in modo lento e controllato. Il loro diametro è stato ottimizzato per ridurre il flusso turbolento all'interno dello chassis, che impedisce il disturbo del fluido che circonda le porte ISCA al momento del recupero. (Ia,b) Incollare insieme due grandi rettangoli (7) e incollare separatamente due più piccoli (8). Ripetere una volta per ciascuno. (J) Incollare i quattro rettangoli assemblati al centro della superficie inferiore dell'involucro (1). (K) Incollare il ponte superiore (9) sopra i rettangoli (7 e 8). Assicurarsi che i fori laterali del pezzo si trovano sul lato esterno dei rettangoli. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento di ISCA nell'involucro e sigillatura mediante registrazione. (A) Posizionare le viti di montaggio nell'ISCA. (B) Posizionamento ISCA nello chassis di distribuzione. Posizionare l'ISCA al centro dell'involucro di distribuzione e collegarlo con le viti specificate. Il foro inferiore di scarico dell'involucro deve essere sigillato con una punta modificata da 20 gradi(Figura 4)una volta che l'involucro è riempito con acqua. Questo aiuta a evitare la generazione di flussi turbolenti che possono influenzare la stabilità del campo chimico e l'efficacia della chemiotaxis. (C) Le parti superiore e inferiore vengono assemblate insieme. (D) Sigillatura dell'involucro con nastro adesivo. Le rughe devono essere evitate per evitare perdite. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spina per sigillare l'involucro di smorzamento del flusso. La spina può essere realizzata sigillando con calore una punta di pipetta da 20 L. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi della chemiotassi che utilizzano l'ISCA verso la glutammina di una comunità motile arricchita in laboratorio e popolazione microbica naturale nel campo. Indice di chemitassi I Ic (che rappresenta la concentrazione di cellule all'interno dei pozzi ISCA) normalizzato dalla concentrazione media delle cellule all'interno dei pozzi contenenti l'acqua di mare filtrata (FSW) dopo 60 min di distribuzione. Ogni concentrazione è stata testata in cinque repliche ISCA. Le cellule batteriche sono state quantificate dalla citometria di flusso (A): FSW - 4,46 x 0,25 x 103; 100 M : 2,43 x 0,16 x 104; 1 mM - 8,07 x 0,45 x 104; 10 mM - 3,28 x 0,20 x 104; (B): FSW : 1,26 x 0,11 x 104; 1 mM - 3,76 x 0,28 x 104 celle/mL). Tutte le concentrazioni di glutammina testate nel campo (A) e (B) hanno indotto una risposta chemiotattica significativamente superiore ai controlli filtrati dell'acqua di mare (FSW).. In tutti i confronti pairwise: (A) Tukey HSD, n x 5, p < 0.005; (B) Tukey HSD, n x 5, p < 0.005. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Materiale da campo | Quantità |
| Filtrazione dell'acqua | |
| Rack per tubi - 50 mL | 1 |
| Cartuccia di filtro GP idrofilo - 0,2 m | 1 |
| Filtro siringa - 0,2 m | 1 |
| Filtro siringa - 0,02 m | 1 |
| Siringhe - 50 mL | 4 |
| Tubo centrifuga conico - 50 mL | 5 |
| Resuspensione chimica | |
| Tubo centrifuga conico - 15 mL | 4 |
| Chemoattractants | |
| Siringhe - 10 mL | 4 |
| Filtro siringa - 0,2 m | 4 |
| Rack per tubi - 15 mL | 1 |
| Riempimento ISCA | |
| Ago di siringa 27G | 4 |
| Siringa - 1 mL | 4 |
| Isca | 1 |
| Distribuzione | |
| Enclosure di distribuzione | 1 |
| Viti a testa piatta scanalate in nylon | 2 |
| Braccio di distribuzione | 1 |
| Cavo Bungee | 2 |
| Nastro adesivo | 1 |
| Spina enclosure di distribuzione | 1 |
| Recupero dei campioni | |
| Ago di siringa 27G | 4 |
| Siringhe - 1 mL | 4 |
| Tubo Centrifuga - 2 mL | 12 |
| Tergicristalli usa e getta | 1 scatola |
| Glutaraldeide 25% | 10 mL |
| Altro materiale | |
| Set di pipette | 1 |
| Punte di pipetta 200 | 1 scatola |
| Punte di pipetta 20 | 1 scatola |
| Punte pipette 1 mL | 1 scatola |
Tabella 1: Materiali necessari per la distribuzione sul campo.
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Discussion
Alla scala dei microrganismi acquatici, l'ambiente è tutt'altro che omogeneo ed è spesso caratterizzato da gradienti fisici/chimici che strutturano le comunità microbiche1,15. La capacità dei microrganismi motile di utilizzare il comportamento (cioè la chemiotaxis) facilita il foraggiamento all'interno di questi microambimi eterogenei1. Lo studio della chemitaxis direttamente nell'ambiente ha il potenziale per identificare importanti interazioni interspecifiche e preferenze chimiche, e questo può aiutare a districare i contributi di microbi specifici ai processi biogeochimici. Il protocollo presentato implementa l'ISCA nell'ambiente11 per facilitare l'acquisizione di ricerche riproducibili sulla chemiotassi in situ.
Utilizzando l'ISCA, è dimostrato che la glutammina suscita una risposta chemiotatica positiva sia in condizioni di laboratorio che sul campo. L'uso dell'ISCA della glutammina sul campo produce una risposta chemiotaca inferiore rispetto al laboratorio (Figura 5). Simili patters tra esperimenti di laboratorio e sul campo sono stati osservati in precedenza11. Ciò può essere spiegato dalla minore proporzione di cellule motile nell'ambiente rispetto alle comunità arricchite o al singolo isolato motile utilizzato nei saggi di laboratorio.
L'importanza degli esperimenti preliminari condotti in laboratorio non deve essere sottovalutata, in quanto consentono la determinazione di concentrazioni ottimali chemioattractant da utilizzare nelle distribuzioni sul campo. La concentrazione ottimale è specifica per ogni chemoattractant e influenzata dal suo peso molecolare, solubilità, e diffusione dai pozzi. Nel caso di dispiegamento di più sostanze distinte, ciascuna deve essere testata singolarmente su un intervallo di concentrazione. Se non viene rilevata chemiotaxis sul campo dopo 1 h, è possibile eseguire distribuzioni più lunghe. Tuttavia, la durata della distribuzione è fortemente limitata dalla crescita batterica e dovrebbe essere sempre più breve del tasso di divisione dei batteri nell'ambiente mirato. Questo aiuta a evitare la crescita della popolazione all'interno dell'ISCA.
L'ISCA è sensibile alla turbolenza dell'acqua e deve essere presa attenzione quando si riempie e svuota il recinto di smorzamento del flusso. Questi passaggi devono essere eseguiti lentamente, perché i flussi risultanti dal riempimento rapido possono lavare o diluire il contenuto dei pozzetti. Di conseguenza, questo rimuove o impedisce che i chemoattractants di diffondere correttamente o introdurre batteri dall'ambiente circostante, in ultima analisi, distorcere i conteggi delle cellule. Riempire completamente il recinto con acqua mentre sfoga tutta l'aria, quindi chiudendolo completamente, assicura che la turbolenza non interferisca con il dispiegamento. La raccolta di metadati nel sito di distribuzione (ad esempio, temperatura, salinità, concentrazione di clorofilla/nutriente) è anche un passaggio critico per interpretare i risultati, in quanto questi fattori possono influenzare la chemiotassi.
L'ISCA è un dispositivo accessibile e facile da usare che fornisce nuove informazioni sul ruolo e la prevalenza della chemiotaxis nell'ambiente. Consente l'interrogatorio della chemiotassi in qualsiasi sistema contenente una fase liquida (ad esempio, marine, acqua dolce, suolo, sistemi di acque reflue). Infine, può essere utilizzato per studi mirati su agenti patogeni e resistenza agli antibiotici nell'ambiente, isolamento di microbi chiave per la bioprospezione e biorisanamento di inquinanti e microplastiche specifici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, attraverso la sovvenzione GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e un Investigator Award (GBMF3783) a R.S., così come una borsa di studio dell'Australian Research Council (DE160100636) a J.B.R., un premio della Simons Foundation a B.S.L. (5941111), e una sovvenzione dalla Simons Foundation (542395) a R.S. come parte dei Principi di Ecosistema Microbiale (PriME) PriME.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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