Summary
Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.
Abstract
Motilite ve kemotaksis (bir hücrenin kimyasal bir degradeye yanıt olarak hareketini değiştirme yeteneği) gibi mikrobiyal davranışlar bakteriyel ve arke-dizilme deresi arasında yaygındır. Kemotaksiler heterojen ortamlarda önemli kaynak edinimi avantajlarına neden olabilir. Ayrıca biyojeokimyasal bisiklet gibi simbiyotik etkileşimler, hastalık ve küresel süreçlerde de önemli bir rol oynar. Ancak, mevcut teknikler laboratuvariçin kemotaksis araştırma kısıtlamak ve alanında kolayca uygulanabilir değildir. Burada sunulan in situ chemotaxis test (ISCA), doğrudan doğal ortamda mikrobiyal kemotaksilerin sağlam sorgulama sağlayan bir cihaz dağıtım için adım adım protokoldür. ISCA, 20 kuyu dizisinden oluşan ve ilgi çekici kimyasalların yüklenebileceği bir mikroakışkan cihazdır. Sulu ortamlarda konuşlandırıldıktan sonra kimyasallar kuyulardan dışarı yayılır ve mikropların hissedip tepki verdiği konsantrasyon degradeleri oluşturur. Kuyu içeriği daha sonra örneklenebilir ve kullanılabilir (1) akış sitometri yoluyla belirli bileşiklere kemotaktik yanıtların gücünü ölçmek için, (2) izole ve kültür duyarlı mikroorganizmalar, ve (3) moleküler teknikler yoluyla yanıt veren popülasyonların kimlik ve genomik potansiyelini karakterize. ISCA, deniz, tatlı su ve toprak ortamları da dahil olmak üzere sulu faza sahip her sistemde konuşlandırılabilen esnek bir platformdur.
Introduction
Çeşitli mikroorganizmalar yamalı besin ortamları yararlanmak için hareketlilik ve kemotaksiler kullanın, konakları bulmak, ya da zararlı koşullarönlemek 1,2,3. Bu mikrobiyal davranışlar sırayla kimyasal dönüşüm oranlarını etkileyebilir4 ve karasal genelinde simbiyotik ortaklıklar teşvik, tatlı su, ve deniz ekosistemleri2,5.
Kemotaksis kapsamlı son 60 yıldır laboratuvar koşulları altında incelenmiştir6. Kemotaksis çalışma için ilk kantitatif yöntem, kılcal dosdoğru, bir putatif kemoattractant bakteri bir süspansiyon batırılmış dolu bir kılcal tüp içerir6. Tüpün dışarı kimyasal difüzyon bir kimyasal gradyan oluşturur, ve kemotaktik bakteriler tüp içine göç ederek bu degrade yanıt7. Kılcal damar tofaş gelişiminden bu yana, hala yaygın olarak bugün kullanılan, birçok diğer teknikler giderek kontrol fiziksel / kimyasal koşullar altında kemotaksis çalışma geliştirilmiştir, en son mikroakışkanların kullanımını içeren8,9,10.
Mikroakışkanlar, yüksek hızlı video mikroskobu ile birlikte, dikkatle kontrol edilen degradelere yanıt olarak tek hücrelerin davranışlarının izlenmesini sağlar. Bu teknikler kemotaksis anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, laboratuvar kullanımıyla sınırlandırılmıştır ve çevre sistemlerinde saha dağıtımına kolayca çevrilmemektedir. Sonuç olarak, doğal bakteri topluluklarının doğal ekosistemler içinde kemotaksis kullanma kapasitesi incelenmemiştir; bu nedenle, kemotaksisin potansiyel ekolojik önemine yönelik mevcut anlayış yapay laboratuvar koşullarına ve sınırlı sayıda laboratuvar kültürlü bakteri izoleedilmesine yöneliktir. Son zamanlarda geliştirilen ISCA bu sınırlamalar11üstesinden .
ISCA kılcal damar tözünün genel prensibine dayanmaktadır; ancak, doğal ortamda ilgi bileşikleri doğru kemotaksis nicelleştirilmesi için son derece çoğaltılmış, kolayca dağıtılabilir deneysel platform sunmak için modern mikroüretim teknikleri kullanır. Ayrıca kemotaktik mikroorganizmaların doğrudan izolasyon veya moleküler tekniklerle tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. İlk çalışma cihazı kendi kendine imal edilmiş ve cam ve PDMS11inşa edilmiş iken, en son enjeksiyon kalıplı versiyonu polikarbonat oluşur, son derece standart üretim prosedürü kullanarak (cihazın en son sürümü ilgi için, ilgili yazarlar temasa geçilebilir).
ISCA kredi kartı büyüklüğündedir ve her biri dış su ortamına küçük bir bağlantı noktası (800 μm çapında) ile bağlanan 5 x 4 kuyu halinde dağıtılan 20 kuyudan oluşur; Şekil 1). Kuyulara yüklenen putatif kemoattractants liman üzerinden çevreye yayılır ve kemotaktik mikroplar limandan kuyuya yüzerek tepki verir. Doğal ortamdaki bir ISCA deneyinin sonucunu etkileyen birçok faktör olduğundan, bu adım adım protokol yeni kullanıcıların olası engelleri aşmasına ve etkili dağıtımları kolaylaştırmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sonuçları optimize etmek için alan denemelerini önce bölüm 1'i yürütmenizi öneririz.
1. Laboratuvar optimizasyonu
NOT: Optimizasyon prosedüründe açıklanan birimler tek bir ISCA (20 kuyudan oluşur) için yeterlidir.
- İlgi kimyasalının hazırlanması
NOT: Her kemoattractant için en uygun konsantrasyon genellikle saha dağıtımları öncesinde laboratuvar koşullarında belirlenmelidir. Kimyasal konsantrasyon alanı kaynaktan uzaklığı ile büyüklüğü azalacaktır (ISCA iyi), hangi ortamda mikroorganizmalar tarafından deneyimli konsantrasyon cihazın içinde mevcut daha düşük olacağı anlamına gelir. ISCA'da kullanılacak en uygun konsantrasyon kemoattractantın difüzyon hızına bağlıdır. Kuyudaki konsantrasyon çok düşükse (mikropların algılama sınırına yakın) pozitif kemotaksis gözlenmez. Tersine, kuyudaki konsantrasyon çok yüksekse, yakın çevrede konsantrasyon da yüksek olacaktır ve mikrobiyal birikim isca kuyularının üzerinde değil, içinde oluşacaktır. Bu nedenle, alan dağıtımları için en uygun konsantrasyonu belirlemek için seyreltme serileri her bir bileşiğin laboratuvar koşullarında yapılmalıdır. İdeal olarak, laboratuvar sonuçlarını doğrulamak için sahada bir konsantrasyon aralığı da test edilmelidir.- Uygun tuz konsantrasyonu (örneğin, fosfat tamponlu tuzlu [PBS] veya yapay deniz suyu içeren uygun bir ortam 2,5 L hazırlayın. Orta makineyi peristaltik veya vakum pompası ve otoklav kullanarak 0,2 μm filtre ile filtreleyin.
- Steril ortamda 1 mL'de 10 mM'lik kemoattractant çözeltisi hazırlayın. Partikülleri ve potansiyel kirleticileri temizlemek için kemoattractant çözeltisini 0,2 m şırınga filtresi ile filtreleyin.
NOT: İdeal olarak, nihai çözeltide kemoattractant dışında hiçbir organik bileşik bulunmamalıdır.
- Seyreltme serileri ile konsantrasyon aralığı
- Filtrelenmiş chemoattractant stok çözeltisini seri olarak seyreltin, (örneğin) 10 mM ile 100 μM arasında değişen.
NOT: Test edilen konsantrasyon başına en az 0,7 mL son hacim gereklidir.
- Filtrelenmiş chemoattractant stok çözeltisini seri olarak seyreltin, (örneğin) 10 mM ile 100 μM arasında değişen.
- ISCA'nın yüklenmesi
- 1 mL'lik bir şırıngayı filtrelenmiş kemoattractantla doldurun ve 27 G şırıngaya bağlayın. ISCA'yı yukarı bakacak şekilde tutarken, bağlantı noktasının üstünde küçük bir damlacık belirene kadar maddeyi yavaşça enjekte edin.
NOT: 1) Çapraz kontaminasyonu önlemek için her seyreltme veya maddeye ayrı bir şırınga ve iğne enjekte edilmelidir. 2) Bu küçük damlacık, hiçbir hava kabarcığı liman içinde sıkışıp kalmasını sağlar, bu da mikropların liman dan göç yeteneğini bozabilir çünkü önemlidir. 3) Daha fazla analiz için yeterli minimum hacim sağlamak için madde veya konsantrasyon (beş kuyu) başına bir satırın tamamının doldurulması önerilir. 4) ISCA başına bir satır negatif kontrol olarak hareket etmeli ve mikropların askıya alınacağı filtrelenmiş ortamla doldurulmalıdır. Bu tedavi, mikropların rastgele hareketliliğin ISCA kuyularına etkisini hesaplar ve kemoattractant içeren tedavileri normalleştirmek için kullanılmalıdır.
- 1 mL'lik bir şırıngayı filtrelenmiş kemoattractantla doldurun ve 27 G şırıngaya bağlayın. ISCA'yı yukarı bakacak şekilde tutarken, bağlantı noktasının üstünde küçük bir damlacık belirene kadar maddeyi yavaşça enjekte edin.
- Laboratuvarda dağıtım
- Bir gecede, %1 deniz suyu (deniz bakterileri için) veya %1 lisojen suyu (LB, tatlı su bakterileri için) ile zenginleştirilmiş 5 mL'lik bir kültürü kuluçkaya yatırın.
NOT: Motile bakteriyel izole veya doğal bakteri toplulukları laboratuvar dağıtımları için kullanılabilir. - Oda sıcaklığında 12 saat (RT) ve 180 rpm kültür kuluçka. 12 saat sonra, mikrobiyal toplulukların mikroskop altında doğrudan gözlem le hareket eden bir şekilde hareket lediğinden emin olun.
- Kültürü 10 dk için 1.500 x g'da döndürün ve 150 mL'lik 1/100'ü uygun ortama (örn. filtrelenmiş deniz suyu, filtrelenmiş tatlı su) yeniden askıya alın.
- 200 mL kapasiteli tepsinin düz yüzeyine iki küçük çift taraflı yapışkan bant yerleştirin (1 mL uçlu kutuların kapakları bu amaç için ideal boyutlara sahiptir ve kolayca otoklavlanabilir). Bir ISCA'yı teybe güvenli bir şekilde takmasını sağlamak için en üste yerleştirin. 50 mL serolojik pipet kullanarak dağıtım tepsisini yavaşça bakteriyel solüsyonla doldurun.
NOT: ISCA yaklaşık 1-2 cm sıvı nın altına batırılana kadar tepsiyi doldurun. Birden çok tepsi kullanıyorsanız, tüm genelinde aynı ses düzeyini kullanın. - Bakteriyel kemotaksis izin vermek için 1 saat kuluçka için ISCA bırakın. 1 saat sonra, türbülanslı akışı en aza indirmek için 50 mL serolojik pipet ile ortayı çok hafifçe çıkarın.
- ISCA'yı üst yüzeye dokunmadan dağıtım tepsisinden alın. ISCA yüzeyinde kalan sıvıyı çıkarmak için bir pipet ve tek kullanımlık silecek kullanın.
NOT: Bu işlem sırasında limanlara dokunmaktan kaçınmak önemlidir, çünkü basınçtaki değişiklikler dış ortamdan kuyuya bakteri ekleyebilir veya ekleyebilir ve böylece kuyunun içindeki bakteri yoğunluğunu ve bileşimini saptırır.
- Bir gecede, %1 deniz suyu (deniz bakterileri için) veya %1 lisojen suyu (LB, tatlı su bakterileri için) ile zenginleştirilmiş 5 mL'lik bir kültürü kuluçkaya yatırın.
- Örneklerin alınması
- ISCA'yı port aşağı bakacak şekilde tutarak, 1 mL şırıngaya bağlı steril 27 G şırınga iğnesi kullanarak kuyuların hacmini alın.
NOT: Her satır (aynı maddeyi içeriyorsa) yaklaşık 550 μL'lik bir çalışma numunesi sağlamak için bir araya alınabilir. Bu örnek daha sonra gerekli downstream uygulamalarına bağlı olarak farklı tüpler içine aliquoted olabilir. - Akış sitometrisi12ile numuneleri analiz ederek her kemoattractant konsantrasyonuna çekilen bakteri sayısını belirleyin. Sonraki alan dağıtımları için kemotaksisi en üst düzeye çıkaran kemoattractant konsantrasyonu seçin.
- ISCA'yı port aşağı bakacak şekilde tutarak, 1 mL şırıngaya bağlı steril 27 G şırınga iğnesi kullanarak kuyuların hacmini alın.
2. Saha konuşlandırması için hazırlık
NOT: Malzemenin hazırlanması ve akış sönümleme muhafazasının (bölüm 2) inşaatı dağıtımdan önce yapılmalıdır.
- Malzemelerin hazırlanması
- Tablo 1'delistelenen tüm malzemeleri hazırlayın.
NOT: Malzeme miktarları bir ISCA için sağlanmaktadır.
- Tablo 1'delistelenen tüm malzemeleri hazırlayın.
- Akış sönümleme muhafazasının yapımı ve hazırlanması
NOT: Akış sönümleme muhafazası, ISCA'dan yayılan kimyasal degradelerin oluşmasını engelleyen istenmeyen türbülansları en aza indirir.- 3 mm'lik akrilik bir levhadan lazer kesici ile dağıtım muhafazası için parçaları kesin.
NOT: Parçalar için dosya aşağıdaki linkten bulunabilir: - Şekil 2'de gösterildiği gibi lazer kesim parçaları akrilik tutkal kullanarak birleştirin.
NOT: Parçaları özenle monte edin. Delikler veya yanlış hizalama, dağıtım sırasında sızıntılar oluşturabilir ve bu da veri kalitesini doğrudan etkiler. - Birleştirilmiş muhafazayı bir gecede kurumaya bırakın.
- Muhafazayı deiyonize suile yıkayın.
- Kasaya deiyonize su dökerek potansiyel sızıntıyı belirleyin. Daha fazla akrilik tutkal ekleyerek herhangi bir potansiyel sızıntı eklemdüzeltmek, sonra adımları tekrarlayın 2.2.3-2.2.5.
- VIDA ipliklerini ISCA'yı sabitlemek için kullanılacak akrilik parçaya kesin. Bu, montaj vidaları ile eşleşen bir çap ve adım ile bir musluk kullanılarak elde edilebilir.
- İlk olarak, bir musluk anahtarı içine musluk yapıştırın, sonra bir tezgah vice dokundu akrilik parça güvenli. En iyi sonuçlar için, akrilik parça mümkün olduğunca seviye olduğundan emin olun. Musluğun akrilik parçaya dik olduğundan emin olun ve musluk anahtarını (saat yönünde) çevirerek musluğa ışık basıncı uygulayın.
- Akrilik parça birkaç tam devrimler sonra, musluk akrilik temizlemek için bir rotasyon dörtte biri için (saat yönünün tersine) dokunun dönüşünü tersine çevirin. Akrilik parçanın tüm derinliği dokunana kadar işlemi tekrarlayın.
- Son olarak, musluğu çıkarın (saat yönünün tersine çevirin) ve bir vida kullanarak ipleri test edin.
- 3 mm'lik akrilik bir levhadan lazer kesici ile dağıtım muhafazası için parçaları kesin.
3. Sahada prosedür
- Su filtrasyonu
- Deneye başlamaya hazır olduğunuzda saha alanından su toplayın. 50 mL konik santrifüj tüpüne 0,2 μm şırınga filtresi (50 mL şırınga ile) ile ISCA başına 5 mL su filtreleyin.
NOT: Bir ISCA'nın tüm kuyularını doldurmak için yaklaşık 3 mL filtrelenmiş su gereklidir; ancak, dört lü filtrasyon işlemi sırasında ki kayıpları hesaba katmak için cihaz başına 5 mL filtre leme ve 2) filtratların hem akış sitometrisi hem de moleküler prosedürler için negatif kontroller olarak korunması önerilir. - Filtrasyonu 0,2 μm'lik hidrofilik GP filtre kartuşu (aynı, her iki seferde kullanarak) yeni bir 50 mL şırınga ile yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne iki kez süzün. Filtronu 0,02 m şırınga filtresinden (yeni bir 50 mL şırıngayla) yeni bir 50 mL konik tüpe süzün.
NOT: Bu dörtlü filtrasyon su hemen hemen tüm mikroorganizmalar ve parçacıklar kaldırmalıdır. Kullanıma kadar son filtratı herhangi bir ısı kaynağından uzak tutun. Bu su, ISCA'da kullanılan tüm kimyasalları yeniden askıya almak için kullanılacak ve dağıtım yerindeki suyla aynı sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. ISCA kuyuları ile dış ortam arasındaki sıcaklık farklılıklarının tetiklediği konvektif akışlar oluşabilir. - 15 mL konik santrifüj tüplerinde istenilen konsantrasyonlarda ilgi (genellikle kuru) tüm kemoattractants (genellikle kuru) askıya almak için filtrate aliquots kullanın.
- İstenmeyen partikülleri veya suda çözünmeyen bileşikleri (ekstreler kullanıyorsanız) çıkarmak için yeniden askıya alınan kemoçekanları steril 15 mL konik santrifüj tüplerine 10 mL şırınga ile 0,2 m şırınga filtresinden filtreleyin.
NOT: Partiküllerin filtreden geçmesini önlemek için hafifçe filtre uygulayın. Ultrafiltrelenmiş sudaki kemoçekanları saha alanından yeniden uzaklaştırmak ve diğer çözeltilere dönüştürmemek önemlidir. Alan alanından su kullanarak (1) yoğunluk odaklı akışını önlemek için toplu çevresel su olarak kuyuiçinde aynı tuz konsantrasyonu elde etmek için gereklidir, ve (2) arka plan besin düzeyleri kuyu içinde ve dışında eşit olduğunu garanti.
- Deneye başlamaya hazır olduğunuzda saha alanından su toplayın. 50 mL konik santrifüj tüpüne 0,2 μm şırınga filtresi (50 mL şırınga ile) ile ISCA başına 5 mL su filtreleyin.
- ISCA dolumu
- ISCA'yı doldurmak için bölüm 1.3'u gerçekleştirin.
NOT: Madde başına bir satır (beş kuyu) doldurulması tavsiye edilir (yani, ISCA başına üç farklı madde ve bir ultra filtrelenmiş deniz suyu kontrolü).
- ISCA'yı doldurmak için bölüm 1.3'u gerçekleştirin.
- Alanda dağıtım
- ISCA(Şekil 3A)kasanın 9'una(Şekil 2K ve Şekil 3B)vidalayın.
NOT: Yukarıda özetlenen akış sönümleme muhafazası, iki ISCA'yı yan yana veya merkezinde yer alan bir ISCA içerebilir. - Muhafazayı kapatın(Şekil 3C)ve yapışkan bantla kapatın (Şekil 3D).
NOT: Kırışıklıklar mükemmel bir mühür sağlamak için kaçınılmalıdır. Tüm tarafları önce mühürleyin, sonra (ikinci bir adımda) örnekleme sonunda kasadan suyu boşaltmak için kullanılacak yan delikleri kapatın. Üst ve alt delikleri mühürlemeyin. ISCA'yı baş aşağı yerleştirmeyin, çünkü yoğuşma içeren kuyularda yoğunlukla çalışan akış oluşabilir, bu da kuyudaki hücre sayısını saptırır. - Muhafazanın dağıtım sırasında sabit kalması gerektiğinden, bungee kabloları kullanılarak insan yapımı yapılara (örneğin, ponto, merdiven) takılması önerilir.
NOT: Kasa, suya dalmadan önce bungee kabloları kullanılarak bir dağıtım koluna (burada, dik platformlu modifiye li modifiye li bir kelepçe) takılabilir. Alternatif olarak, kasa sığ yüzeylerde küçük bir ağırlıkla doldurulabilir ve sabitlenebilir. Dağıtımlar pelajik okyanusta tasarlanmıştırsa, kasa bir tarafında şamandıra, diğer tarafta ağırlık olan bir ağa bağlanabilir. - Doldurmaya başlamak için muhafazayı tamamen batırın. Doldururken, içaşırı su hareketini önlemek için muhafazayı sıkıca tutun. Suyun seviyesi kasanın üst seviyesine ulaştığında, içeride hava nın sıkışmadığından emin olun.
NOT: Bazı hava kabarcıklarının sıkışması durumunda, kapağı yukarı bakacak şekilde yavaşça yatırın, bu da kabarcıkların kaçmasını sağlayacaktır. - Tamamen dolduktan sonra, alt ve üst delikleri silikon veya kauçuktan veya 20 μL pipet uçlarının ekstremitelerini mühürleyerek yapabilen iki fişle kapatın (Şekil 4).
NOT: Bu adım örnekleme sırasında muhafazanın içindeki akışı önler. - ISCA'yı örnekleme için 1-3 saat bekletin.
NOT: İdeal dağıtım süresi öncelikle suyun sıcaklığı ve bakteri topluluğunun iki katına kadar dikte edilir. Su sıcaklığı 20 °C'nin üzerinde olduğunda, ISCA'nın 1 saatten fazla dağıtılması tavsiye edilmez, çünkü hücre bölünmesi 1,5-2.0 saatten sonra kemoattractants içeren kuyularda oluşabilir. Ancak, en uygun dağıtım süresi, doğal toplulukları yüklenen kimyasallarla değiştirerek ve zaman içinde hücre sayısını ölçerek ISCA denemesinden önce test edilebilir. - Muhafazayı sudan çıkarın. Suyun kasadan boşaltılmasını sağlayan bir kabın üzerine yerleştirin.
- Yapışkan bandın üst kısmını ön deliklerden çok nazikçe çıkarın.
NOT: Kasadan çıkan suyun akışı damlama hızında olmalıdır. Kasanın üstünden en altına kadar her seferinde bir deliğe devam edin. Kasanın tamamen boşaltılaması yaklaşık 10-15 dakika sürmelidir. - Su hattı ISCA'nın üst kısmı altından geçtikten sonra, alt fişi çıkarın ve suyun geri kalanını boşaltın.
- ISCA'lar hala kasaya bağlıyken, 1 mL pipetle ISCA'nın üzerine sıkışmış suyu dikkatlice çıkarın.
- IsCA'yı üst yüzeye dokunmadan çıkarın ve yüzeyde kalan sıvıyı çıkarmak için tek kullanımlık bir silme kullanın.
NOT: Bu işlem sırasında bağlantı noktalarına dokunmamak önemlidir, çünkü basınçtaki değişiklikler kuyuya dökme bakterileri kaldırabilir veya ekleyebilir ve bakteri sayılarını saptayabilir. - ISCA'dan 1.5.1 adımını tekrarlayarak örnekleri alın.
- ISCA(Şekil 3A)kasanın 9'una(Şekil 2K ve Şekil 3B)vidalayın.
4. Downstream uygulamaları
NOT: Hacimler 550 μL'lik bir örneğe (bir ISCA satırı) göre verilir.
- Her çekici için kemotaksisi ölçmek için akış sitometrisi için glutaraldehit (%2 nihai konsantrasyon) ile iyi içeriği100 μL düzeltin.
NOT: Buzüzerinde (veya 4 °C'de) saklayın ve örnekleri aynı gün analiz edin. Alternatif olarak, analiz aynı gün mümkün değilse, fiksasyon sonrasında sıvı nitrojen dondurulmuş örnekler flaş olabilir. Akış sitometrisi, ISCA kuyularında bulunan hücre sayısını ölçmek için önerilen yöntemdir, çünkü basit, hızlı ve doğru12. - Sonraki DNA çıkarma ve analiz için sıvı nitrojen de iyi içerik 300 μL snap dondurma11.
NOT: Numuneleri analiz edilene kadar -80 °C'de saklayın. - 10 μL TE-gliserol tamponuna 90 μL kuyu içeriği ekleyin ve tek hücreli genomik13için numuneleri tutturun.
- Bakteriyel izolasyon için istenilen ortamı içeren agar plakalarına 10-20°L yayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde, deniz mikroplarının toprak bakterisini cezbettiği bilinen bir amino asit olan glutamin konsantrasyon aralığına kemotaktik tepkisini test etmek için ISCA kullanılarak laboratuvar sonuçları vermiştir14. Laboratuvar testlerinde en güçlü kemotaktik yanıtı ortaya çıkaran glutamin konsantrasyonu, deniz ortamında kemotaksi testi yapmak için kullanıldı.
Laboratuvar testleri gerçekleştirmek için, Sydney kıyı suyundan örneklenen deniz suyu toplulukları, Avustralya, basit bir besin değişikliği4ile hareketli hücreler için zenginleştirilmiş , adım 1.4 açıklandığı gibi. Glutamin seri olarak ultrafiltrelenmiş deniz suyunda seyreltildi ve bu deney için 10 mM ile 100°M arasında değişen son konsantrasyonları elde etmek için beş ISCA kopyaları aynı anda dağıtıldı ve her birinde üç farklı glutamin konsantrasyonu (satır başına bir konsantrasyon) ve filtrelenmiş deniz suyu kontrol sırası bulunuyordu. 1 saat dağıtımdan sonra, her ISCA satırının içeriği (aynı glutamin konsantrasyonu içeren) yaklaşık 550 μL çalışma örnekleri sağlamak üzere bir araya getirildi. Bu hacim glutaraldehit (%2 nihai konsantrasyon) ve akış sitometrisi ile ölçülen yanıt veren bakteri sayısı ile sabitlendi.
Kısaca, bakteriyel bolluk 1) yeşil floresan DNA boyası ve 2) analiz kılıf sıvısı olarak ultrafiltrelenmiş deiyonised su ile bir akış sitometre kullanarak hücreleri boyama ile ölçüldü. Her örnek için, ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) ve yeşil floresan kaydedildi. Numuneler 25 μL/dk akış hızında analiz edildi ve bakteri hücreleri SSC ve yeşil floresan göre ayrımcılığa uğradı. Kemotaktik indeks(Ic),her numunede bulunan bakteri sayılarının filtrelenmiş deniz suyu kontrol kuyularında (FSW) ortalama bakteri sayısına bölünmesi ile belirlendi.
Sonuçlar, 1 mM'nin en uygun glutamin dağıtım konsantrasyonu olduğunu göstermiştir, çünkü filtrelenmiş deniz suyu kontrolünden 18 kat daha yüksek olan önemli bir kemotaktik yanıt(t-test, p < 0.001)(Şekil 5A). Glutamin indüklenen yüksek veya daha düşük konsantrasyonları önemli ama zayıf kemotaktik yanıtlar(Ic = 5.43 için 100 μM, p < 0.001; Ic = 7.34 için 10 μM, p < 0.001). Bir ISCA kuyusu eklenen kemoattractant konsantrasyonu çok yüksekse, (1) bakteri liman bölümünde bir degrade tespit etmek mümkün olmayacaktır ve kuyu nun üzerinde toplamak mümkün olmayacaktır, çünkü iyi içine kemotaksis azaltılabilir, ya da (2) kuyunun pH veya ozolaritite etkilenebilir.
Optimum glutamin konsantrasyonu daha sonra saha dağıtımı için kullanıldı. Avustralya'nın Sidney kenti yakınlarındaki bir kıyı bölgesinde 1 mM glutamin dolu beş ISCA çoğaltması kullanıldı (33.91 °S, 151.26 °E). Glutamin dağıtım sitesinden filtrelenmiş deniz suyu ile dolu kontrol kuyuları 2,98 kat daha fazla bakteri çekti(Şekil 5B). Bu alan deneyinde kemotaktik yanıt kontrollerden önemli ölçüde farklıydı(t-test, p < 0.001) ve kıyı deniz suyu için güçlü bir tepki oluşturdu11.
Şekil 1: In situ chemotaxis tsay (ISCA) ayrıntılı görünümleri. (A) En son enjeksiyon kalıplı ISCA. (B) Bir ISCA kuyusu şeması. Ölçek çubuğu = 7.463 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Akış sönümleme muhafazasının montajı. (A) Dağıtım kasasının montajı için gerekli parçalar. Üretim sırasında kenarlar pürüzsüz olmalıdır. (B) Parçaları 2a, 2b, 3a ve 3b'yi parça 1 (alt yüzey) etrafına yerleştirin. (C) Alt yüzeyin ilk kenarına ince bir akrilik tutkal tabakası koyarak muhafazanın alt kısmını birleştirin (1). (D) İlk uzun yanak parçasını (2a) dikey olarak yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve yerinde tutun. Tutkal katılaşmak için ~ 1 dk gerektirir ve bir sonraki öğeyi yerleştirirken parça 2a kendini desteklemek için izin verir. (E) Parça 1'in daha kısa bir tarafına alt yüzeye ince bir akrilik tutkal tabakası uygulayın. Kısa yanak parçasını (3a) akrilik tutkalüzerine yerleştirin ve önceden yerleştirilmiş yanak içine kilitleyin. İki parçayı yaklaşık 1 dakika tutun. (F) Diğer kısa yanak parçasını (3b) alt yüzeyin karşı tarafına yerleştirin (1). Yine, bağlantı parçası (2a) içine kilitleyin ve yaklaşık 1 dakika tutun. (G) Gerekirse, alt yüzeyin kalan uzun tarafına akrilik tutkal uygulayın (1). Son uzun yanak parçasını (2b) yerleştirin ve bitişik iki parçaya (3a ve 3b) bağlayın. Tüm parçaların alt parça (1) ile düzgün bir şekilde hizalandığından ve yan duvarlar veya alt yüzey arasında yanlış hizalama veya boşluk belirtisi bulunmadığından emin olun. Muhafazanın tamamlayıcı üst kısmını (4, 5a, 5b, 6a ve 6b) birleştirmek için bu adımları tekrarlayın. (H) 4. parçanın köşesindeki deliğin montaj sırasında tıkanmadığından emin olun, aksi takdirde deliği iğne gibi keskin bir nesneyle delin. Kasanın delikleri dağıtım işleminde kritik bir rol oynar ve suyun yavaş ve kontrollü bir şekilde akmasını sağlar. Çapları kasanın içindeki türbülanslı akışı azaltmak için optimize edilmiştir, bu da isca bağlantı noktalarını çevreleyen sıvının geri alınması üzerine bozulmasını önler. (Ia,b) İki büyük dikdörtgeni (7) ve iki küçük dikdörtgeni ayrı ayrı tutkallayın (8). Her biri için bir kez tekrarlayın. (J) Muhafazanın alt yüzeyinin ortasında ki dört birleştirilmiş dikdörtgeni yapıştırın (1). (K) Üst güverteyi (9) dikdörtgenlerin üzerine yapıştırın (7 ve 8). Parçanın yan deliklerinin dikdörtgenlerin dış tarafında olduğundan emin olun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ISC'lerin kasaya yerleştirilmesi ve bantlama ile sızdırmazlık. (A) Montaj vidalarını ISCA'ya yerleştirin. (B) Dağıtım muhafazasında ISCA yerleşimi. ISCA'yı dağıtım kasasının ortasına yerleştirin ve belirtilen vidalarla takın. Muhafazanın alt drenaj deliği, muhafaza suyla doldurulduktan sonra modifiye edilmiş 20 μL ucu(Şekil 4)ile kapatılmalıdır. Bu kimyasal alanın istikrarı ve kemotaksis etkinliğini etkileyebilir çalkantılı akışların nesil önlemek için yardımcı olur. (C) Üst ve alt kısımlar bir araya getirilir. (D) Kasanın yapışkan bant kullanılarak mühürleilmesi. Sızıntıları önlemek için kırışıklıklardan kaçınılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akış sönümleme muhafazasını sızdırmazlık için fiş. Fiş, 20 μL'lik pipet ucunu ısı ile kapatarak yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Laboratuvarda zenginleştirilmiş bir hareketli topluluğun glutaminine doğru ISCA'yı kullanan kemotaksis testleri ve bu alandaki doğal mikrobiyal popülasyon. Chemotaxis indeksi Ic (ISCA kuyularında hücrelerin konsantrasyonu temsil eden) dağıtım 60 dakika sonra filtredeniz suyu (FSW) içeren kuyular içinde hücrelerin ortalama konsantrasyonu ile normale. Her konsantrasyon beş ISCA kopyalarında test edildi. Bakteri hücreleri akış sitometrisi (A): FSW = 4.46 ± 0.25 x 103; 100 μM = 2,43 ± 0,16 x 104; 1 mM = 8,07 ± 0,45 x 104; 10 mM = 3,28 ± 0,20 x 104; (B): FSW = 1,26 ± 0,11 x 104; 1 mM = 3.76 ± 0.28 x 104 hücre/mL). (A) laboratuarında test edilen tüm glutamin konsantrasyonları ve (B) alanında süzülen deniz suyu (FSW) kontrollerinden önemli ölçüde daha yüksek bir kemotaktik yanıt indüklenmiştir.. Tüm çift yönlü karşılaştırmalarda: (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005. Hata çubukları SEM.'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Alan malzemesi | Miktar |
| Su filtrasyonu | |
| Tüp raf - 50 mL | 1 |
| Hidrofilik GP filtre kartuşu - 0,2 m | 1 |
| Şırınga filtresi - 0,2 m | 1 |
| Şırınga filtresi - 0,02 m | 1 |
| Şırıngalar - 50 mL | 4 |
| Konik santrifüj tüp - 50 mL | 5 |
| Kimyasal resuspension | |
| Konik santrifüj tüp - 15 mL | 4 |
| Kemoattractants | |
| Şırıngalar - 10 mL | 4 |
| Şırınga filtresi - 0,2 m | 4 |
| Tüp raf - 15 mL | 1 |
| ISCA dolumu | |
| Şırınga iğnesi 27G | 4 |
| Şırınga - 1 mL | 4 |
| İsCA | 1 |
| Dağıtım | |
| Dağıtım muhafazası | 1 |
| Naylon oluklu düz kafa vidaları | 2 |
| Dağıtım kolu | 1 |
| Bungee kablosu | 2 |
| Yapışkan bant | 1 |
| Dağıtım muhafaza sıctık fişi | 1 |
| Numune alma | |
| Şırınga iğnesi 27G | 4 |
| Şırıngalar - 1 mL | 4 |
| Santrifüj tüp - 2 mL | 12 |
| Tek kullanımlık silecekler | 1 kutu |
| Glutaraldehit %25 | 10 mL |
| Diğer malzemeler | |
| Pipet seti | 1 |
| Pipet uçları 200 μL | 1 kutu |
| Pipet uçları 20 μL | 1 kutu |
| Pipet uçları 1 mL | 1 kutu |
Tablo 1: Saha dağıtımı için gerekli malzemeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sucul mikroorganizmaların ölçeğinde, çevre homojen olmaktan uzaktır ve genellikle mikrobiyal toplulukları1,15yapı fiziksel / kimyasal degradeler ile karakterizedir.15 Hareketli mikroorganizmaların davranış kullanma kapasitesi (yani kemotaksis) bu heterojen mikroortamlarda avlanmayı kolaylaştırır1. Chemotaksilerin doğrudan çevrede incelenmesi, önemli interspesifik etkileşimleri ve kimyasal tercihleri belirleme potansiyeline sahiptir ve bu da belirli mikropların biyojeokimyasal süreçlere olan katkılarını çözmeye yardımcı olabilir. Sunulan protokol, isca'yı yerinde kemotaksis üzerine tekrarlanabilir araştırmaların edinimini kolaylaştırmak için environment11'e dağıtır.
ISCA kullanılarak, glutaminin hem laboratuvar koşullarında hem de sahada olumlu bir kemotaktik yanıt verdiği gösterilmiştir. Sahada glutamin ISCA dağıtımı laboratuvara göre daha düşük bir kemotaktik yanıt verir(Şekil 5). Laboratuvar ve saha deneyleri arasında benzer patters daha önce gözlenmiştir11. Bunlar, zenginleştirilmiş topluluklara göre çevredeki hareketli hücrelerin daha düşük oranı veya laboratuvar tahlillerinde kullanılan tek bir hareketli izole ile açıklanabilir.
Saha konuşlandırmalarında kullanılacak optimum kemoattractant konsantrasyonlarının belirlenmesine izin verdiklerinden, ön laboratuvar tabanlı deneylerin önemi küçümsenmemelidir. Optimal konsantrasyon her kemoattractant özgüdür ve molekül ağırlığı, çözünürlüğü ve kuyulardan difüzörlük etkilenir. Birden fazla farklı maddenin konuşlandırılması durumunda, her biri bir konsantrasyon aralığında ayrı ayrı test edilmelidir. 1 saat sonra sahada kemotaksi tespit edilmemişse, daha uzun dağıtımlar yapılabilir. Ancak, dağıtım uzunluğu güçlü bakteri büyümesi ile sınırlıdır ve her zaman hedeflenen ortamda bakterilerin bölünme oranı daha kısa olmalıdır. Bu ISCA içinde nüfus artışı önlemek için yardımcı olur.
ISCA su türbülansına duyarlıdır ve akış sönümleme muhafazasını doldururken ve boşaltırken dikkatli olunmalıdır. Hızlı dolumdan kaynaklanan akışlar kuyuların içeriğini temizleyebilir veya seyreltebileceğinden, bu adımlar yavaş yavaş yapılmalıdır. Sonuç olarak, bu kaldırır veya düzgün difüzyon veya çevreden bakteri tanıtan kemoterapi önler, sonuçta hücre sayımları önyargı. Tüm havayı boşaltırken muhafazayı tamamen suyla doldurmak, sonra tamamen kapatmak, türbülansın dağıtıma engel olmamasını sağlar. Dağıtım yerinde meta verilerin toplanması (örneğin, sıcaklık, tuzluluk, klorofil/besin konsantrasyonu) da sonuçları yorumlamak için kritik bir adımdır, çünkü bu faktörler kemotaksileri etkileyebilir.
ISCA, chemotaksilerin çevredeki rolü ve yaygınlığı hakkında yeni bilgiler sağlayan erişilebilir, kullanıcı dostu bir cihazdır. Sıvı faz (örneğin, deniz, tatlı su, toprak, atık su sistemleri) içeren herhangi bir sistemde kemotaksilerin sorgulanmasını sağlar. Son olarak, patojenler ve çevrede antibiyotik direnci, biyoprospektasyon için anahtar mikropların izolasyon ve belirli kirleticiler ve mikroplastiklerin biyoremediasyonu üzerinde hedeflenen çalışmalar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen Gordon ve Betty Moore Vakfı Deniz Mikrobiyolojisi Girişimi tarafından, J.R.S. ve R.S.'ye GBMF3801 ve R.S.'ye bir Araştırmacı Ödülü (GBMF3783) aracılığıyla finanse edilmiştir. yanı sıra Avustralya Araştırma Konseyi Bursu (DE160100636) J.B.R., Simons Vakfı'ndan B.S.L.'ye (594111) bir ödül ve Mikrobiyal Ekosistemler İlkeleri (PriME) İşbirliğinin bir parçası olarak Simons Vakfı'ndan (542395) R.S.'ye hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
