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Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Abstract

Virus-basiertes microRNA-Silencing (VbMS) ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs (miRNAs) in Pflanzen. Das VbMS-System wurde für verschiedene Pflanzenarten entwickelt und angewendet, darunter Nicotiana benthamiana, Tomaten, Arabidopsis, Baumwolle und Monokotyledonen wie Weizen und Mais. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das PVX-basierte VbMS-Vektoren verwendet, um endogene miRNAs in Kartoffeln zum Schweigen zu bringen. Um die Expression einer spezifischen miRNA zu unterdrücken, werden Target-Mimic-Moleküle (TM) von miRNA von Interesse entworfen, in pflanzliche Virusvektoren integriert und in Kartoffeln durch Agrobacterium-Infiltration exprimiert, um direkt an die endogene miRNA von Interesse zu binden und ihre Funktion zu blockieren.

Introduction

Pflanzliche microRNAs (miRNAs) werden als 20–24 nukleotidlange, kernkodierte regulatorische RNAs1 charakterisiert und spielen eine grundlegende Rolle in fast jedem Aspekt pflanzenbiologischer Prozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung2,3, Photosynthese und Metabolismus4,5,6,7, Hormonsynthese und Signalisierung8,9, biotische und abiotische Reaktionen10, 11,12,13 und Nährstoff- und Energieregulierung14,15. Die regulatorischen Rollen von pflanzlichen miRNAs sind gut programmiert und werden typischerweise auf posttranskriptionaler Ebene erfüllt, indem die Ziel-mRNAs entweder gespalten oder translational unterdrückt werden.

Enorme Fortschritte wurden bei der Identifizierung, transkriptionellen Profilerstellung und Zielvorhersage von miRNAs in Kartoffeln gemacht16,17,18,19,20,21. Die funktionelle Charakterisierung von miRNAs in Pflanzen, einschließlich Kartoffeln, ist jedoch aufgrund des Mangels an effizienten und hochdurchsatzigen genetischen Ansätzen hinter anderen Organismen zurückgeblieben. Es ist eine Herausforderung, eine funktionelle Analyse einzelner miRNA durch Standard-Loss-of-Function-Analyse durchzuführen, da die meisten miRNAs zu Familien mit erheblicher genetischer Redundanz gehören22. Darüber hinaus kann eine einzelne miRNA mehrere Zielgene kontrollieren23 und mehrere verschiedene miRNAs können denselben molekularen Signalweg gemeinsam modulieren24,25. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die Funktion einer bestimmten miRNA oder einer miRNA-Familie zu charakterisieren.

Ein Großteil der funktionalen Analyse von miRNAs stützt sich stark auf Ansatzmöglichkeiten mit Funktionsverstärkung, die offensichtliche Einschränkungen aufweisen. Die künstliche miRNA (amiRNA)-Methode nutzt die endogenen primären Transkripte (pri-miRNAs), um miRNAs auf hohem Niveau zu produzieren, was zu einer Hemmung der Zielgenexpression führt26,27,28,29. Aktivierungsmarkierung und miRNA-Überexpression unter Verwendung eines starken konstitutiven 35S-Promotors führen jedoch häufig zu einer erhöhten Expression von miRNAs, die nicht repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind und daher möglicherweise nicht die endogene Funktion von miRNAs widerspiegeln30. Es wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der die Expression von miRNA-resistenten Formen von Zielgenen beinhaltet, die unreibbare Mutationen in den Bindungs- und/oder Spaltungsstellen enthalten31,32,33. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer Fehlinterpretation des Phänotyps führen, der vom miRNA-resistenten Zieltransgen aufgrund transgener Artefakte abgeleitet wurde. Daher sollten Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zum Funktionsgewinn mit Vorsicht gezogen werden34. Eine weitere große Einschränkung der oben beschriebenen Ansätze besteht darin, dass sie eine Transformation erfordern, die arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind die transgenabhängigen Ansätze für transform-widerspenstige Pflanzenarten kaum anwendbar. Daher ist es wichtig, einen schnellen und effizienten Loss-of-Function-Ansatz zu entwickeln, um die Funktion von miRNAs zu entschlüsseln.

Um die Voraussetzung des Transformationsverfahrens zu umgehen, wurde ein virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) etabliert, indem die Target-Mimic-Strategien (TM) mit virus-abgeleiteten Vektoren kombiniert werden. Im VbMS-System werden künstlich konstruierte TM-Moleküle vorübergehend von einem Virus-Backbone exprimiert und bieten ein leistungsfähiges, hochdurchsatzreiches und zeitsparendes Werkzeug, um die Funktion von pflanzlichen endogenen miRNAs zu sezieren35,36. VbMS wurde ursprünglich in N. benthamiana und Tomaten mit dem Tabakrasselvirus (TRV)35,36,37 entwickelt und unter Verwendung verschiedener anderer Virusexpressionssysteme auf Arabidopsis, Baumwolle, Weizen und Mais ausgedehnt, darunter Kartoffelvirus X (PVX)38, Baumwollblattknautschvirus (ClCrV)39, Gurkenmosaikvirus (CMV)40,41,42, Chinesisches Weizenmosaikvirus (CWMV)43 , und Gerstenstreifenmosaikvirus (BSMV)44,45.

Die Kartoffel (Solanum tuberosum) ist die viertwichtigste Nahrungspflanze und die am weitesten verbreitete Noncerealpflanze der Welt, vor allem wegen ihres hohen Nährwerts, ihrer hohen Energieproduktion und ihres relativ geringen Inputbedarfs46. Mehrere Eigenschaften der Kartoffel machen sie zu einer attraktiven zweikeimblättrigen Modellpflanze. Es ist eine vegetativ vermehrte polyploide Pflanze mit hoher Auskreuzungsrate, Heterozygotie und genetischer Vielfalt. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht, der die Funktion von miRNAs in Kartoffeln mit VbMS charakterisiert. Hier stellen wir einen ligationsunabhängigen Klonierungs-(LIC)-angepassten Kartoffel-PVX-basierten VbMS-Ansatz vor, um die Funktion von miRNAs in Kartoffelpflanzen zu bewerten38. Wir haben die miR165/166-Familie ausgewählt, um den VbMS-Assay zu veranschaulichen, da die miR165/166-Familie und ihre Ziel-mRNAs und Transkriptionsfaktoren der Klasse III Homöodomänen/Leu-Reißverschluss (HD-ZIP III) umfassend charakterisiert wurden22,47,48. Die HD-ZIP III-Gene sind Schlüsselregulatoren der Meristementwicklung und Organpolarität, und die Unterdrückung der miR165/166-Funktion führt zu einer erhöhten Expression der HD-ZIP III-Gene, was zu pleotropen Entwicklungsdefekten wie reduzierter apikaler Dominanz und abweichenden Mustern der Blattpolarität führt22,35,38,41 . Die leicht scorablen Entwicklungsphänotypen, die mit dem Silencing von miRNA165/166 korrelieren, ermöglichen eine genaue Bewertung der Wirksamkeit des PVX-basierten VbMS-Assays.

In dieser Studie zeigen wir, dass das PVX-basierte VbMS-System die Funktion von miRNAs in Kartoffeln effektiv blockieren kann. Da das PVX-basierte virusinduzierte Gen-Silencing-System (VIGS) in einer Reihe von Kartoffelsorten etabliert wurde49,50,51,52, kann dieser PVX-basierte VbMS-Ansatz wahrscheinlich auf eine breite Palette von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden.

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Protocol

1. Wachsen Sie Kartoffelpflanzen.

  1. Vermehrung von In-vitro-Kartoffelpflanzen in Kulturröhrchen (25 x 150 mm) mit Murashige und Skoog (MS) Medien plus Gamborg-Vitamin (MS-Basalsalzmischung, Gamborg-Vitamin, 30 g/L Saccharose, 3,5 g/L Agar, pH = 5,7). Platzieren Sie die Röhren im Wachstumsraum unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1.
    HINWEIS: Neue Triebe und Wurzeln entwickeln sich normalerweise in 1-2 Wochen aus Pflanzen. Vermehren Sie jeden Monat Pflanzen mit frischen MS / Gamborg-Vitaminmedien.
  2. Vier Wochen später transplantieren Sie In-vitro-Pflanzen in den Boden und züchten sie in einem Gewächshaus unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h Dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1.
    HINWEIS: Die Pflanzen mit neu entwickelten Wurzeln und Blättern sind zum Umpflanzen geeignet. Halten Sie die Feuchtigkeit für die frisch umgepflanzten Pflanzen für die ersten 3-4 Tage aufrecht.

2. Konstruiere die VbMS-Vektoren.

  1. Entwerfen und klonen Sie die kurzen Tandem-TM-Moleküle (STTM, Abbildung 1)22,53 für die interessierende miRNA.
    HINWEIS: Erfassen Sie miRNA-Sequenzen basierend auf experimentellen Daten oder aus der miRbase-Datenbank54,55,56,57,58,59. Die in dieser Studie verwendete miR166-Sequenz wurde bereits beschrieben60.
    1. Entwerfen Sie das TM-Modul, indem Sie eine Mismatch-Sequenz, normalerweise 5'-CTA-3', in die reverse Komplementsequenz der miRNA an der Stelle einfügen, die den 10.–11. Nukleotiden der miRNA entspricht.
      HINWEIS: Zum Beispiel ist die Stu-miR160-Sequenz 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, wobei die 10.–11. Nukleotide fett gedruckt sind. Die umgekehrte Komplementsequenz (in Desoxynukleotiden) ist 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' und die Mismatch-Bulge-Insertionsstelle ist fett dargestellt. Die TM-Molekülsequenz (Desoxynukleotid) sollte 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' sein.
    2. Entwurfsprimer für das Klonen des STTM-Fragments (Abbildung 1). Verwenden Sie DNA-Oligonukleotide mit der 48-nt-Spacer-Sequenz als Vorlage für das PCR-Klonen. Der Vorwärtsprimer besteht aus einem LIC1-Linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), der Vorwärtssequenz des oben für TM entwickelten Moleküls und der partiellen 5'-Sequenz des 48-nt-Abstandhalters (5'-GTTGTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Der Reverse Primer besteht aus einem LIC2-Linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), der reversen Komplementsequenz des TM-Moleküls und einem partiellen reversen Komplement zur 3'-Sequenz des 48-nt-Spacers (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      HINWEIS: Die 48-nt-Abstandshaltersequenz ist 5'-GTTGTTGTTGTTGTTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Zum Beispiel sollte für STTM-miR160 der Vorwärtsprimer 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' sein; Der Reverse Primer sollte 5'-gAggAgAagAgCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' lauten (Abbildung 1).
    3. Amplifizieren Sie das STTM-Fragment in einem Volumen von 50 μL durch PCR unter Verwendung des synthetisierten universellen 48-nt-Abstandhalters als Vorlage und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase.
      1. Richten Sie die PCR-Reaktion ein, indem Sie 0,5 μL jedes Primers (40 μM), 0,5 μL 48-nt-Spacer-Oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-Puffer, 1 μL dNTP-Gemisch (je 10 mM), 0,1 μL High-Fidelity-DNA-Polymerase (10 U/μL) und 43 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μL mischen. 94 °C für 3 min, 32 Zyklen von 94 °C für 45 s, 60 °C für 45 s und 72 °C für 60 s.
    4. Reinigen Sie das STTM-Fragment durch Ethanolfällung. Zu den PCR-Produkten werden 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) gegeben. Kräftig mischen und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol ab. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie es in 20 μL ddH2O auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Elektrophorese, um die Amplifikation der STTM-PCR-Produkte zu überprüfen.
    5. Die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis durch Mischen von 2,5 μL gereinigtem STTM PCR-Produkt, 0,5 μL 10x T4 DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) und 1,6 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 5 μL mischen. und die Produkte 20 min lang bei 75 °C behandeln, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.
  2. Bereiten Sie das PVX-basierte VbMS-Konstrukt vor.
    1. Verdauung von 5 μg PVX-LIC-Plasmid38 mit 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in einem Volumen von 100 μL.
    2. Den verdauten PVX-LIC-Produkten wird eine gleiche Menge Phenol:Chloroform:Isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) zugesetzt und kräftig vermischt. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und überführe den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Chloroform:Isopropanol (24:1) hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifuge bei 14.000 x g für 10 min.
      HINWEIS: Der PVX-LIC-Vektor beherbergt die LIC-Kassette zum Klonen. Die LIC-Kassette des PVX-LIC-Vektors enthält ein ccdB-Gen und ein Chloramphenicol-resistentes Gen und muss im E. coli-Stamm DB3.1 unter Verwendung von LB-Medium, das Kanamycin (50 μg/L) und Chloramphenicol (15 μg/L) enthält, aufrechterhalten/vermehrt werden.
    3. Den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr überführen. 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) zugeben und kräftig mischen. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand.
    4. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und wirbeln Sie es kräftig. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie das aufgeschlossene PVX-LIC-Plasmid mit 100 μL ddH2O auf.
    5. Richten Sie die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis ein, indem Sie 2,5 μL verdaute PVX-LIC-Vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4-DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP und 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) in einem Gesamtvolumen von 5 μL mischen. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 15 min und behandeln Sie die Produkte bei 75 °C für 20 min bis 20 min inaktivieren Sie die T4-DNA-Polymerase.
  3. Klonen Sie die STTM-Sequenz mithilfe einer LIC-Reaktion in den PVX-LIC-Vektor. Mischen Sie die T4 DNA Polymerase-behandelten STTM PCR Produkte (5 μL) und die T4 DNA Polymerase-behandelten PVX-LIC Plasmide (5 μL). 5 min bei 70 °C inkubieren, an einer Rampe von 0,1 °C/s auf 22 °C abkühlen und 30 min mit einer PCR-Maschine bei 22 °C halten.
    HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf über Nacht bei 4 °C, um eine höhere Effizienz des LIC-Klonens zu erreichen.
  4. 5 μL der LIC-Reaktionsprodukte in die E. coli DH5α umwandeln und auf einer LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin wachsen62,63. Wählen und verifizieren Sie positive Kolonien durch PCR mit den Klonprimern und dem universellen Primer für den PVX-LIC-Vektor, gefolgt von der Sequenzierung.
    1. Führen Sie eine Kolonie-PCR mit dem Vorwärtsprimer für PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in Kombination mit dem Reverse Primer für das STTM-Klonen durch, um positive Klone zu identifizieren. Die Größe des PCR-Bandes sollte ~ 300 bp betragen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Sequenzen von STTM-Fragmenten anhand der Terminatorzyklussequenzierung64,65.
  5. Isolieren Sie die PVX-STTM-Plasmide aus den validierten Klonen und wandeln Sie sie in Agrobacterium-Stämme GV3101, GV2260 oder EHA10562,63 um. Verifizieren Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR.
    HINWEIS: Bestätigen Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR mit dem Forward Primer für PVX-LIC und dem Reverse Primer für das STTM-Klonen.

3. Führen Sie einen PVX-basierten VbMS-Assay in Kartoffelpflanzen durch.

  1. Verpflanzen Sie 4 Wochen alte In-vitro-Kartoffelpflanzen in den Boden. Die transplantierten Pflanzen werden 3–4 Tage später einem VbMS-Assay unterzogen.
  2. Impfen Sie Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium , das die PVX-STTM-Plasmide enthält.
    HINWEIS: Für den VbMS-Assay in Kartoffeln werden agrobacterium-vermittelte Infiltration und Zahnstocher-kratzende Inokulation gleichzeitig durchgeführt.
    1. Picken und impfen Sie positive Transformanten, die PVX-STTM-Vektoren enthalten, in 50 ml flüssige LB mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin. Wachsen Sie in einem 28 °C Inkubator bei 220 U / min für 16 h bis OD600 = 1,0.
    2. Gleichzeitig streifen Sie die positiven Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin und wachsen 1 Tag lang bei 28 °C. Fügen Sie den PVX-LIC38,66-Vektor als Kontrolle und PVX-GFP67,68 zur Überwachung der Virusausbreitung hinzu.
    3. Sammeln Sie die Agrobacterium-Flüssigkultur durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Agrobacterium-Zellen mit einem gleichen Volumen an Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES und 200 μM Acetosyringon, pH = 5,6) resuspendieren und auf OD600 = 1,0 einstellen. Bei Raumtemperatur 6 h inkubieren.
    4. Infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur mit einer 1 ml nadellosen Spritze in die Abaxialseite vollständig expandierter Blätter.
      1. Drehen und halten Sie ein Blatt mit einer Hand und verwenden Sie dann einen Finger, um die Blattlamina von der adaxialen Seite an der Infiltrationsstelle zu stützen. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina.
    5. Kratzen Sie die Agrobacterium-Kultur von den LB-Platten und kratzen Sie mit einem Zahnstocher an der Stammoberfläche der ersten ein oder zwei Internodien der infiltrierten Kartoffelpflanzen. Kratzen Sie vorsichtig die Epidermis des Stiels. Vermeiden Sie es, durch den Stängel zu stechen, was zu schweren Schäden an den Pflanzen führen kann.
  3. Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen bei 22 °C mit einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙ s1 in einem Gewächshaus.
    HINWEIS: Phänotypen, die durch miRNA-Silencing verursacht werden, treten normalerweise 2-4 Wochen nach der Aminokulation auf (Abbildung 2, Abbildung 3). Es dauert in der Regel 10-20 Tage, bis der VbMS-Phänotyp nach der Infiltration auftritt. Der VbMS-Phänotyp hängt von den Eigenschaften der spezifischen miRNA- und Zielgene, den Wachstumsbedingungen und den Kartoffelsorten ab.

4. Führen Sie eine Ausdrucksanalyse durch.

  1. Wenn Phänotypen 2-4 Wochen nach der Aminokulation auftreten, sammeln Sie Gewebe wie Triebe, Blätter, Blüten oder Wurzeln mit Phänotypen aus den VbMS-Pflanzen und Geweben aus den Kontrollpflanzen mit einer Schere. Isolieren Sie die Gesamt-RNAs aus den gesammelten Geweben.
  2. Überprüfen Sie die RNA-Qualität durch Elektrophorese62,63 und quantifizieren Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die OD260-Absorption mit einem Spektralphotometer messen.
  3. Verwenden Sie stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR), um die miRNA-Expression zu analysieren.
    1. Entwerfen Sie für bestimmte miRNAs einen Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer. Stem-Loop-RT-Primer enthalten ein universelles 5'-Backbone und eine 3' 6-nt-Erweiterung einer spezifischen miRNA. Entwerfen Sie ein 5'-Universal-Backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), das eine Stamm-Loop-Struktur bildet. (Der Großbuchstabe entspricht einer umgekehrt-wiederholten Sequenz und der Kleinbuchstabe dem Schleifenbereich).
    2. Ein Teil der 5'-Backbone-Sequenz, die eine Schleife bildet, dient als reverse Primer für die nachfolgende PCR-Amplifikation (fett-kursive Sequenz in der Backbone-Sequenz). Fügen Sie eine 6-nt-Erweiterungssequenz hinzu, die umgekehrt komplementär zum 3'-Ende der miRNA ist, das für den Stem-Loop-Primer von Interesse ist, um Spezifität für die umgekehrte Transkription bereitzustellen (ergänzende Abbildung 1A).
      HINWEIS: Entwerfen Sie den Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer, wie von Chen et al.69 und Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72 beschrieben. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für Stu-miR160 als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für die Kartoffel miR165/166 Familie ist als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3' konzipiert. (Die fett gedruckten Großbuchstabensequenzen bieten die Spezifität der reversen Transkription für bestimmte miRNAs).
    3. Richten Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion ein, indem Sie 50–200 ng Gesamt-RNA, 1 μL des Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimers (100 μM), 2 μL 10x Puffer, 0,2 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (je 10 mM) und 1 μL Reverse Transkriptase (200 U/μL) auf Eis mischen. Nukleasefreies ddH2O zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzufügen.
    4. Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit dem gepulsten reversen Transkriptionsverfahren durch. Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 16 °C für 30 min, führen Sie einen Temperaturzyklus von 30 °C für 30 s, 42 °C für 30 s und 50 °C für 1 s für insgesamt 60 Zyklen durch und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Inkubation bei 85 °C für 5 min.
    5. Für die Real-Time-PCR-Analyse der miRNA-Expression entwerfen Sie den Forward-Primer basierend auf der miRNA-Sequenz, schließen jedoch keine Sequenzen ein, die sich mit dem oben entworfenen Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer überlappen. Fügen Sie den 5' des Vorwärtsprimers eine 3-7-nt-Erweiterung hinzu, um die Länge, die Schmelztemperatur und den GC-Gehalt zu optimieren (ergänzende Abbildung 1).
      HINWEIS: Der universelle Reverse Primer ist 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für Stu-miR160 als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für die miR165/166-Familie ist 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Die fett gedruckten Sequenzen dienen als 5'-Erweiterungen zur Primer-Optimierung. Die Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer und die Real-Time-PCR-Primer für miRNA können mit dem miRNA Primer Design Tool73 entworfen werden.
  4. Synthetisieren Sie cDNAs der Ziel-mRNAs mittels Standard-Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR). Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 37 °C für 60 min und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min.
    HINWEIS: (1) Prognostizieren Sie Ziel-mRNAs mit dem psRNATarget-Programm74, wenn die Ziel-mRNAs nicht bekannt sind. (2) Der universelle Reverse Transcription Primer für mRNA ist ein verankerter Primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. Richten Sie die real-time PCR-Reaktion sowohl für die miRNA von Interesse als auch für die Ziel-mRNAs ein. Mischen Sie 0,5 μL Template-cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-Puffer mit SYBR green, 0,05 μL jedes Forward- und Reverse-Primers (40 μM) und 4,4 μL ddH2O in einem Gesamtvolumen von 5 μL auf Eis.
  6. Bei 95 °C für 3 min, 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s inkubieren. Führen Sie eine anschließende Schmelzkurvenanalyse wie folgt durch: Inkubieren bei 95 °C für 15 s, Abkühlen auf 60 °C an einer Rampe von 20 °C/s, Halten bei 60 °C für 60 s, Erhitzen auf 95 °C bei einer Rampe von 0,2 °C/s und Halten bei 95 °C für 15 s. Analysieren Sie die Ct-Werte mit den ΔΔCt-Methoden76,77 und zeichnen Sie die Mittelwerte mit Standardfehlern auf.
    HINWEIS: (1) Die real-time PCR Primer für Ziel-mRNAs können wie beschrieben entworfen werden75. (2) Das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen kann als interne Kontrolle für die Normalisierung in Kartoffeln dienen. Der Vorwärtsprimer für das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen ist 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' und der reverse Primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Bei der Real-Time-PCR-Analyse können Kontamination und Primer-Dimer-Bildung zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um die unspezifische Amplifikation zu überwachen und die Haftung der Real-Time-PCR-Analyse zu erhöhen, wird empfohlen, Kontrollen ohne Template und Reverse Transkriptase für Real-Time-PCR-Assays einzubeziehen.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Katahdin) mit ektopischem Wachstum von Blattgeweben von der Abaxialseite der Blattlamina entlang der Venen. Schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden ebenfalls beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den PVX-Kontrollanlagen keine phänotypische Anomalie beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das VbMS-System die endogene miRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückte und das PVX-VbMS-System ein robustes genetisches Werkzeug zur Bestimmung der Funktion spezifischer miRNAs oder miRNA-Familien war.

Abbildung 3 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Russet Burbank) mit ektopischem Blattgewebewachstum von der abaxialen Seite der Blattlamina entlang der Venen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das PVX-VbMS-System auf andere Kartoffelarten angewendet werden könnte, einschließlich einer großen Kartoffelsorte.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der PVX-basierten VbMS-Vektoren und der PVX-STTM165/166-Struktur. LB = T-DNA linker Rand; RB = T-DNA rechter Rand; 35S = Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor; NOST = Nopalinsynthase-Terminator; RdRP = RNA-abhängige RNA-Polymerase; TGB1 = dreifaches Genblockprotein 1; TGB2 = dreifaches Genblockprotein 2; TGB3 = dreifaches Genblockprotein 3; sgP = PVX subgenomischer RNA-Promotor; CP = Mantelprotein; LIC-Kassette = ligationsunabhängige Klonkassette; 48 nt = 48 Nukleotid-unvollkommener Stamm-Schleifen-Linker. STTM165/166 besteht aus Tandem-TM-Sequenzen von miR165/166, die durch eine 48-Nt-Imperfekt-Stem-Loop-Linker-Sequenz getrennt sind. Die grüne Pfeilspitze im PVX-LIC-Vektor zeigt den Startort der subgenomischen PVX-RNA an, die die STTM-Sequenz beherbergt. Die Dreifach-Minus-Bindestriche in miRNA-Sequenzen zeigen die Spaltungsstellen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: VbMS von miR165/166 in der tetraploiden Kartoffelsorte Katahdin. Phänotypen der Kartoffelpflanzen (Katahdin), die die PVX-Vektorkontrolle oder PVX-STTM165/166 exprimieren. Magenta-Pfeile bezeichnen ektopisch erzeugte Blattstrukturen in den Blattadern. Die orangefarbene Pfeilspitze kennzeichnet trompetenartige Blattstrukturen. Balken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: VbMS von miR165/166 in der tetraploiden Kartoffelsorte Russet Burbank. Phänotypen der Kartoffelpflanzen (Russet Burbank), die PVX-Vektor als Kontrolle oder PVX-STTM165/166 exprimieren. Magenta-Pfeile bezeichnen ektopisch erzeugte Blattstrukturen in den Blattadern. Balken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Diagramme der Stem-Loop-RT-PCR-Analyse von miRNAs und Real-Time-PCR-Primer-Design. (A) Stem-Loop RT-PCR-Analyse von miRNAs. Während der reversen Transkription initiierte die Bindung des Stem-Loop-Primers an die 3' miRNA die reverse Transkription und cDNA wurde synthetisiert. PCR-Produkte wurden mit einem spezifischen Forward Primer der interessierenden miRNA und dem universellen Reverse Primer amplifiziert. (B) Real-time PCR Primer Design. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Stu-miR160 und Stu-miR165/166 werden gezeigt. Der Forward Primer wurde basierend auf der miRNA-Sequenz entwickelt, enthielt jedoch keine Sequenzen, die sich mit dem entworfenen Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer überlappten. Den 5' des vorderen Primers wurde eine Verlängerung von 3-7 nt hinzugefügt, um die Länge, die Schmelztemperatur und den GC-Gehalt einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Wir präsentieren ein PVX-basiertes miRNA-Silencing-System zur Charakterisierung der Funktion von endogenen miRNAs in Kartoffeln durch Integration des STTM-Designs in den PVX-Vektor. Das VbMS-System erwies sich als wirksam bei der Stummschaltung von miRNA165/166 in Kartoffeln, einer hochkonservierten miRNA-Familie über Pflanzenarten hinweg.

Der TM-Ansatz wurde entwickelt, um die Expression von miRNAs auf der Grundlage einer künstlichen miRNA-Zielmimik zu stören, die eine Mismatch-Schleife an der erwarteten Spaltungsstelle innerhalb der miRNA-Komplementationssequenz erzeugen soll, die zur Sequestrierung der zielgerichteten miRNA und zum Stillstand ihrer Aktivität führt22,35,78,79 . Die Paarung zwischen TM-Molekülen und den Ziel-miRNAs blockiert die Funktion der miRNAs, indem sie die Spiegel einer spezifischen miRNA oder einer miRNA-Familie herunterschlägt, was zu einer Hochregulierung der Ziel-mRNAs führt. Mehrere TM-Technologien wurden für das Stummschalten von miRNAs entwickelt, darunter endogene miRNA-Zielmimikry (eTM)79,80, eTM-basierte miRNA-Mimiks (MIMs)35,78, kurze Tandem-Target-Mimics (STTMs)22,53, ein miRNA-Köderansatz mit TMs, die in die 3' UTR von proteinkodierenden Transkripten integriert sind81, und miRNA-SPONGEs, die miRNA-Bindungsstellen mit zwei zentralen Mismatches enthalten, um miRNAs (cmSPs) anzugreifen. 82. STTM besteht aus zwei miRNA-Bindungsstellen mit einem 3-nt-Mismatch-Bulge, verbunden durch einen 48-nt-Spacer, der empirisch optimiert wurde. STTM löst eine effiziente Hemmung der Ziel-miRNAs aus22,53. Die STTM-Technologie wurde kürzlich erfolgreich auf eine groß angelegte Funktionsanalyse von miRNAs aus der Modellpflanze Arabidopsis und Hauptkulturen wie Reis und Mais angewendet. Dies führte zur Entdeckung einer beispiellosen Rolle mehrerer endogener miRNAs, die an der Ertrags- und Hormonkontrolle beteiligt sind, was für die Verbesserung der Pflanzenzüchtung sehr vielversprechend ist47. Basierend auf diesen Vorteilen des STTM-Designs haben wir uns für STTM entschieden und es in den PVX-Vektor zur funktionalen Charakterisierung von miRNAs in Kartoffeln integriert. Es ist erwähnenswert, dass die verschiedenen Designs von TM-Molekülen, wie cmSPs, MIMs und STTMs, unterschiedliche Wirksamkeiten bei der Blockierung der Funktion verschiedener miRNAs82 haben. Daher kann die Verwendung verschiedener TM-Designstrategien dazu beitragen, eine effektivere miRNA-Suppression zu erreichen. Die Länge und der Sequenzkontext der unübertroffenen Ausbuchtung sowie die Nukleotidveränderungen neben den miRNA-Bindungsstellen müssen möglicherweise auch für ein spezifisches miRNA-Silencing-Ergebnis optimiert werden22,36,38,78,83. Darüber hinaus wird das Design von TM-Molekülen unter Anleitung von computergestützten Vorhersagen zusammen mit experimenteller Analyse wahrscheinlich zu einer zuverlässigeren Hemmung von miRNAs84 führen.

Es wurde gezeigt, dass das PVX-basierte VIGS-System das RNA-Silencing sowohl bei diploiden als auch bei kultivierten tetraploiden Solanum-Spezies wirksam auslöst. Die PVX-basierte systemische Stummschaltung wird induziert und im gesamten Blattgewebe an in vitro vermehrten Kartoffelpflanzen über mehrere Zyklen und auf in vitro erzeugten Mikrotuberen aufrechterhalten85. Wir haben kürzlich berichtet, dass das PVX-basierte VIGS-System Gene von Interesse in mehreren tetraploiden Kartoffelsorten wie Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard und Serrana86 zum Schweigen bringen kann. Es bleibt abzuwarten, ob der PVX-basierte VbMS-Effekt durch vegetative Vermehrung in Kartoffeln über mehrere Generationen übertragen und aufrechterhalten werden kann. Transgene Ansätze, um TM-Moleküle stabil in Kartoffelpflanzen einzuführen, werden immer noch empfohlen, wenn die Stummschaltungseffekte von miRNAs von Interesse in den nachfolgenden Generationen aufrechterhalten werden müssen.

Zahlreiche miRNAs, die am Wachstum und der Entwicklung von Kartoffeln beteiligt sind, wurden identifiziert. RNA-seq, Genomsequenzierung und bioinformatische Vorhersage haben die Identifizierung von miRNAs und ihren Zielen erheblich erleichtert17,19,20,21. Bisher wurden drei Kartoffelgenome sequenziert, darunter ein doppelter monoploider Phureja-Klon der Gruppe S. tuberosum DM1-3, eine wilde diploide Spezies S. commersonii und ein diploider Inzuchtklon M6 von S. chacoense87,88,89. Bisher wurde nur eine begrenzte Anzahl von Kartoffel-miRNAs funktional charakterisiert, in den meisten Fällen mit TM-Technologie. Zum Beispiel wirkt das FLOWERING LOCUS T (FT) Homolog SP6A als mobiles Signal zur Kontrolle der Knollenbildung in Kartoffeln und wird von einer miRNA angegriffen, die die Expression von SP6A (SES) unterdrückt, die die wärmeinduzierte Spaltung des SP6A-Transkripts vermittelt90,91. Die STTM-vermittelte Überexpression von SES blockiert die Aktivität der SES-miRNA und erleichtert die Tuberisierung auch unter kontinuierlichen Wärmebedingungen91. Der Knockdown von miR160, einer an der Immunantwort beteiligten miRNA, durch den eTM-Ansatz zeigte, dass miR160 sowohl bei lokal als auch bei systemisch erworbener Resistenz gegen Phytophthora in befallen in Kartoffeln benötigt wird92.

Mit Hilfe eines bioinformatischen Ansatzes wurden acht einzigartige Familien von miRNAs identifiziert, die auf NUKLEOTID-Bindungsstelle Leucin-reiche Repeat (NLR) Immunrezeptoren in Kartoffeln und Tomaten abzielen93. Eine der miRNA-Familien, miR482/2118, zielt auf mehrere NLRs ab, die eine Resistenz gegen verschiedene Krankheitserreger verleihen, und die Unterdrückung der miR482/2118-Familie miRNAs, die durch die transgene Expression von STTM-Konstrukten vermittelt werden, führt zu einer erhöhten Resistenz von Tomaten gegen P. infestans und Pseudomonas syringae13. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass kleine RNAs, die in Krankheitserregern und Wirten produziert werden, zwischen den beiden Organismen wandern und die Genexpression des anderen unterdrücken können, die durch königreichsübergreifende RNA-Interferenz vermittelt wird94,95,96,97. Beispielsweise können Ziel-Nachahmungen eines oomyceten pathogen-abgeleiteten sRNAs diese eindringenden sRNAs abfangen und die Pathogeninfektion reduzieren61. Es wäre interessant zu untersuchen, ob das derzeitige VbMS-System eingesetzt werden kann, um aus Krankheitserregern gewonnene sRNAs zu bekämpfen, um die Resistenz in Pflanzen zu verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das virusbasierte miRNA-Silencing-System schnell und kostengünstig ist und in einem Hochdurchsatzformat ausgeführt werden kann. Das PVX-basierte VbMS-System bietet ein effizientes und robustes genetisches Werkzeug, um die Funktion spezifischer miRNAs oder miRNA-Familien und der Zielgene zu bestimmen.

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Disclosures

Nichts.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Yule Liu von der Tsinghua University für die Bereitstellung des PVX-LIC-Vektors. Diese Arbeit wurde von einem Start-up-Fonds der Texas A&M AgriLife Research und dem Hatch Project TEX0-1-9675 des USDA National Institute of Food and Agriculture an JS unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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Umweltwissenschaften Ausgabe 159 virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) Kartoffelvirus X (PVX) microRNA (miRNA) Target-Mimik (TM) Kurze Tandem-Target-Mimics (STTMs) Solanum tuberosum
Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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