Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

Abstract

Le silençage des microARN à base de virus (VbMS) est un outil rapide et efficace pour la caractérisation fonctionnelle des microARN (miARN) dans les plantes. Le système VbMS a été développé et appliqué pour diverses espèces végétales, notamment Nicotiana benthamiana, la tomate, l’Arabidopsis, le coton et les plantes monocotylédones telles que le blé et le maïs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des vecteurs VbMS basés sur PVX pour faire taire les miARN endogènes dans la pomme de terre. Pour éliminer l’expression d’un miARN spécifique, des molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont conçues, intégrées dans des vecteurs de virus végétaux et exprimées dans la pomme de terre par infiltration d’Agrobacterium pour se lier directement au miARN endogène d’intérêt et bloquer sa fonction.

Introduction

Les microARN végétaux (miARN) sont caractérisés comme des ARN régulateurs codés nucléairement de 20 à 24 nucléotidiques1 et jouent un rôle fondamental dans presque tous les aspects des processus biologiques des plantes, y compris la croissance et le développement2,3, la photosynthèse et le métabolisme4,5,6,7, la synthèse et la signalisation hormonales8,9, les réponses biotiques et abiotiques10, 11,12,13, et la régulation des nutriments et de l’énergie14,15. Les rôles régulateurs des miARN végétaux sont bien programmés et remplis généralement aux niveaux post-transcriptionnels en clivant ou en réprimant par translation les ARNm cibles.

D’énormes progrès ont été réalisés en ce qui concerne l’identification, le profilage transcriptionnel et la prédiction des miARN dans la pomme de terre16,17,18,19,20,21. Cependant, la caractérisation fonctionnelle des miARN dans les plantes, y compris la pomme de terre, a pris du retard par rapport à d’autres organismes en raison du manque d’approches génétiques efficaces et à haut débit. Il est difficile d’effectuer une analyse fonctionnelle des miARN individuels par analyse standard de perte de fonction, car la plupart des miARN appartiennent à des familles présentant une redondance génétique considérable22. De plus, un seul miARN peut contrôler plusieurs gènes cibles23 et plusieurs miARN différents peuvent moduler la même voie moléculaire de manière collaborative24,25. Ces propriétés rendent difficile la caractérisation de la fonction d’un miARN spécifique ou d’une famille de miARN.

Une grande partie de l’analyse fonctionnelle des miARN s’est fortement appuyée sur des approches de gain de fonction qui ont des limites évidentes. La méthode des miARN artificiels (amiRNA) exploite les transcriptions primaires endogènes (pri-miARN) pour produire des miARN à un niveau élevé, conduisant à l’inhibition de l’expression du gène cible26,27,28,29. Cependant, le marquage d’activation et la surexpression de miARN à l’aide d’un puissant promoteur constitutif de 35S conduisent souvent à une expression accrue de miARN qui ne sont pas représentatifs des conditions in vivo et peuvent donc ne pas refléter la fonction endogène des miARN30. Une autre approche a été développée impliquant l’expression de formes résistantes aux miARN de gènes cibles contenant des mutations indésirables dans les sites de liaison et/ou de clivage31,32,33. Mais cette approche peut également potentiellement entraîner une mauvaise interprétation du phénotype dérivé du transgène cible résistant aux miARN en raison d’artefacts transgéniques. Par conséquent, les conclusions de ces études sur le gain de fonction doivent être tirées avec prudence34. Une autre limitation majeure des approches décrites ci-dessus est qu’elles nécessitent une transformation, ce qui nécessite beaucoup de travail et de temps. De plus, les approches dépendantes du transgène ne sont guère applicables aux espèces végétales transformatrices-récalcitrantes. Par conséquent, il est essentiel de développer une approche rapide et efficace de perte de fonction pour démêler la fonction des miARN.

Pour contourner la condition préalable de la procédure de transformation, le silençage des microARN à base de virus (VbMS) a été établi en combinant les stratégies d’imitation de cible (TM) avec des vecteurs dérivés du virus. Dans le système VbMS, les molécules de MT conçues artificiellement sont exprimées transitoirement à partir d’une colonne vertébrale virale, offrant un outil puissant, à haut débit et permettant de gagner du temps pour disséquer la fonction des miARN endogènes végétaux35,36. VbMS a été initialement développé chez N. benthamiana et la tomate avec le virus du hochet du tabac (TRV)35,36,37 et a été étendu à Arabidopsis, coton, blé et maïs en utilisant divers autres systèmes d’expression du virus, y compris le virus de la pomme de terre X (PVX)38, le virus de la déformation des feuilles de coton (ClCrV)39, le virus de la mosaïque du concombre (CMV)40,41,42, le virus de la mosaïque du blé chinois (CWMV)43 et le virus de la mosaïque des bandes d’orge (BSMV)44,45.

La pomme de terre (Solanum tuberosum) est la quatrième culture vivrière la plus importante et la culture non céréale la plus cultivée au monde, principalement en raison de sa valeur nutritionnelle élevée, de sa production d’énergie élevée et de ses besoins en intrants relativement faibles46. Plusieurs caractéristiques de la pomme de terre en font une plante modèle dicotylédone attrayante. Il s’agit d’une culture polyploïde à multiplication végétative avec un taux de croisement élevé, une hétérozygotie et une diversité génétique élevée. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun rapport caractérisant la fonction des miARN dans la pomme de terre utilisant VbMS. Nous présentons ici une approche VbMS de pomme de terre basée sur le PVX de pomme de terre adaptée au clonage indépendant de la ligature (LIC) pour évaluer la fonction des miARN dans les plants de pommes de terre38. Nous avons choisi la famille miR165/166 pour illustrer le test VbMS parce que la famille miR165/166 et leurs ARNm cibles et les facteurs de transcription homéodomaine/fermeture à glissière Leu de classe III (HD-ZIP III) ont été largement caractérisés22,47,48. Les gènes HD-ZIP III sont des régulateurs clés du développement du méristème et de la polarité des organes, et la suppression de la fonction miR165/166 conduit à une expression accrue des gènes HD-ZIP III, entraînant des défauts de développement pléotropes tels qu’une dominance apicale réduite et des modèles aberrants de polarité des feuilles22,35,38,41 . Les phénotypes de développement facilement enregistrables corrélés avec le silence des miRNA165/166 permettent une évaluation précise de l’efficacité du test VbMS à base de PVX.

Dans cette étude, nous démontrons que le système VbMS basé sur PVX peut bloquer efficacement la fonction des miARN dans la pomme de terre. Étant donné que le système de silençage génique induit par le virus (VIGS) à base de PVX a été établi dans un certain nombre de variétés de pommes de terre49,50,51,52, cette approche VbMS basée sur PVX peut probablement être appliquée à un large éventail d’espèces de pommes de terre diploïdes et tétraploïdes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultivez des plants de pommes de terre.

  1. Propager des plants de pommes de terre in vitro dans des tubes de culture (25 x 150 mm) avec des milieux Murashige et Skoog (MS) plus la vitamine de Gamborg (mélange de sel basal MS, vitamine gamborg, 30 g/L de saccharose, 3,5 g/L de gélose, pH = 5,7). Placez les tubes dans la salle de croissance sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1.
    REMARQUE: De nouvelles pousses et racines se développent normalement en 1 à 2 semaines à partir des plantes. Propager les plantes avec des milieux vitaminiques frais de MS / Gamborg tous les mois.
  2. Quatre semaines plus tard, transplantez des plantes in vitro dans le sol et cultivez-les dans une serre sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1.
    REMARQUE: Les plantes avec des racines et des feuilles nouvellement développées conviennent à la transplantation. Maintenez l’humidité pour les plantes fraîchement transplantées pendant les 3 à 4 premiers jours.

2. Construisez les vecteurs VbMS.

  1. Concevoir et cloner les molécules TM en tandem court (STTM, Figure 1)22,53 pour les miARN d’intérêt.
    REMARQUE: Acquérir des séquences de miARN basées sur des données expérimentales ou à partir de la base de données miRbase54,55,56,57,58,59. La séquence miR166 utilisée dans cette étude a été décrite précédemment60.
    1. Concevez le module TM en insérant une séquence d’inadéquation, normalement 5'-CTA-3', dans la séquence du complément inverse des miARN au site correspondant aux 10e à 11e nucléotides du miARN.
      REMARQUE: Par exemple, la séquence Stu-miR160 est 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, où les 10e à 11e nucléotides sont en gras. La séquence inverse du complément (dans les désoxynucléotides) est 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' et le site d’insertion du renflement de discordance est indiqué en gras. La séquence moléculaire TM (désoxynucléotide) doit être 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Concevoir des amorces pour le clonage du fragment STTM (Figure 1). Utilisez des oligonucléotides d’ADN avec la séquence d’espacement 48-nt comme modèle pour le clonage par PCR. L’amorce avant se compose d’un liant LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), de la séquence avant de ce qui précède conçue pour la molécule TM et de la séquence partielle 5' de l’espaceur 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). L’amorce inverse se compose d’un liant LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), de la séquence du complément inverse de la molécule TM et d’un complément inverse partiel à la séquence 3' de l’espaceur 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      REMARQUE: La séquence d’espacement 48-nt est 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Par exemple, pour STTM-miR160, l’amorce avant doit être 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTATGGT-3'; l’amorce inverse doit être 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figure 1).
    3. Amplifiez le fragment STTM dans un volume de 50 μL par PCR en utilisant l’espaceur universel 48-nt synthétisé comme modèle et une ADN polymérase haute fidélité.
      1. Configurez la réaction de PCR en mélangeant 0,5 μL de chaque amorce (40 μM), 0,5 μL d’oligo d’espacement 48-nt (40 μM), 5 μL de tampon PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (10 mM chacun), 0,1 μL d’ADN polymérase haute fidélité (10 U/μL) et 43 μL de ddH2O pour un volume total de 50 μL. Effectuez l’amplification PCR standard comme suit : 94 °C pendant 3 min, 32 cycles de 94 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 60 s.
    4. Purifier le fragment STTM par précipitation d’éthanol. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) aux produits PCR. Mélanger vigoureusement et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et rincez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Sécher la pastille et la dissoudre dans 20 μL de ddH2O.
      REMARQUE: Utilisez l’électrophorèse de l’ADN pour vérifier l’amplification des produits de PCR STTM.
    5. Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL de produit STTM PCR purifié, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M de dithiothréitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) et 1,6 μL de ddH2O pour un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min, et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min pour inactiver l’ADN polymérase T4.
  2. Préparez la construction VbMS basée sur PVX.
    1. Digérer 5 μg de plasmide PVX-LIC38 avec 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) dans un volume de 100 μL.
    2. Ajouter un volume égal de phénol:chloroforme:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) aux produits PVX-LIC digérés et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter un volume égal de chloroforme:isopropanol (24:1) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min.
      REMARQUE: Le vecteur PVX-LIC héberge la cassette LIC pour le clonage. La cassette LIC du vecteur PVX-LIC contient un gène ccdB et un gène résistant au chloramphénicol et doit être maintenue/propagée dans la souche DB3.1 d’E. coli à l’aide d’un milieu LB contenant de la kanamycine (50 μg/L) et du chloramphénicol (15 μg/L).
    3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
    4. Rincez vigoureusement la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 % et vortexez vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant. Sécher la pastille et dissoudre le plasmide PVX-LIC digéré avec 100 μL de ddH2O.
    5. Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL d’ADN vecteur PVX-LIC digéré, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP et 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) dans un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min à inactiver l’ADN polymérase T4.
  3. Clonez la séquence STTM dans le vecteur PVX-LIC à l’aide d’une réaction LIC. Mélanger les produits DE PCR STTM traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL) et les plasmides PVX-LIC traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL). Incuber à 70 °C pendant 5 min, refroidir à 22 °C à une rampe de 0,1 °C/s et maintenir à 22 °C pendant 30 min à l’aide d’une machine PCR.
    REMARQUE: Prolongez le temps d’incubation jusqu’à la nuit à 4 ° C pour obtenir une plus grande efficacité du clonage LIC.
  4. Transformer 5 μL des produits de réaction LIC en E. coli DH5α et croître sur une plaque LB contenant 50 μg/mL de kanamycine62,63. Choisissez et vérifiez les colonies positives par PCR avec les amorces de clonage et l’amorce universelle pour le vecteur PVX-LIC suivi du séquençage.
    1. Effectuer la PCR de colonie avec l’amorce avant pour PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') en combinaison avec l’amorce inverse pour le clonage STTM afin d’identifier les clones positifs. La taille de la bande PCR doit être d’environ 300 pb.
      REMARQUE : Vérifiez les séquences de fragments STTM par séquençage du cycle de terminaison64,65.
  5. Isolez les plasmides PVX-STTM des clones validés et transformez-les en souches Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Vérifier les colonies d’Agrobacterium par PCR.
    REMARQUE: Confirmer les colonies d’Agrobacterium par PCR en utilisant l’amorce avant pour PVX-LIC et l’amorce inverse pour le clonage STTM.

3. Effectuer un test VbMS à base de PVX dans les plants de pommes de terre.

  1. Transplantez des plants de pommes de terre in vitro de 4 semaines dans le sol. Les plantes transplantées seront soumises au test VbMS 3 à 4 jours plus tard.
  2. Inoculer les plants de pommes de terre avec Agrobacterium contenant les plasmides PVX-STTM.
    REMARQUE: Pour le test VbMS dans la pomme de terre, l’infiltration médiée par Agrobacterium et l’inoculation de grattage de cure-dents sont effectuées simultanément.
    1. Prélever et inoculer des transformants positifs contenant des vecteurs PVX-STTM en 50 mL de LB liquide contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine. Cultiver dans un incubateur à 28 °C à 220 tr/min pendant 16 h jusqu’à OD600 = 1,0.
    2. Dans le même temps, strier les colonies positives d’Agrobacterium sur au moins deux nouvelles plaques LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine et croître à 28 °C pendant 1 jour. Inclure le vecteur PVX-LIC38,66 comme témoin et le PVX-GFP67,68 pour surveiller la propagation du virus.
    3. Recueillir la culture liquide d’Agrobacterium par centrifugation à 3 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules d’Agrobacterium avec un volume égal de tampon d’infiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES et 200 μM acétosyringone, pH = 5,6) et ajuster à OD600 = 1,0. Incuber à température ambiante pendant 6 h.
    4. Infiltrer la culture d’Agrobacterium dans la face abaxiale des feuilles complètement dilatées avec une seringue sans aiguille de 1 mL.
      1. Retournez et tenez une feuille d’une main, puis utilisez un doigt pour soutenir la lame de la feuille du côté adaxial sur le site d’infiltration. Gardez la seringue verticale à la surface de la feuille avec l’autre main et infiltrez la culture d’Agrobacterium dans le côté abaxial de la lame.
    5. Grattez la culture d’Agrobacterium des plaques LB et grattez la surface de la tige des deux premiers entre-nœuds des plants de pommes de terre infiltrés avec un cure-dent. Grattez doucement l’épiderme de la tige. Évitez de percer la tige, ce qui peut causer de graves dommages aux plantes.
  3. Cultivez les plantes infiltrées à 22 °C avec une photopériode sombre de 16 h/8 h et une intensité lumineuse de 120 μmol/m2∙ s1 dans une serre.
    REMARQUE: Les phénotypes causés par le silençage du miARN apparaissent généralement dans les 2 à 4 semaines suivant la post-ininoculation (Figure 2, Figure 3). Il faut généralement 10 à 20 jours pour que le phénotype VbMS apparaisse après l’infiltration. Le phénotype VbMS dépend des propriétés des miARN spécifiques et des gènes cibles, des conditions de croissance et des variétés de pommes de terre.

4. Effectuer une analyse d’expression.

  1. Lorsque les phénotypes apparaissent à 2 à 4 semaines après la post-vaccination, collectez des tissus tels que des pousses, des feuilles, des fleurs ou des racines avec des phénotypes des plantes VbMS et des tissus des plantes témoins avec des ciseaux. Isoler les ARN totaux des tissus prélevés.
  2. Vérifiez la qualité de l’ARN par électrophorèse62,63 et quantifiez la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance OD260 avec un spectrophotomètre.
  3. Utilisez la PCR à transcription inverse en temps réel en boucle tige (RT-PCR) pour analyser l’expression des miARN.
    1. Pour des miARN spécifiques, concevez une amorce de transcription inverse tige-boucle. Les amorces RT à boucle tige contiennent une colonne vertébrale universelle de 5' et une extension de 3' 6-nt d’un miARN spécifique. Concevoir une dorsale universelle de 5' (5'- GTCTCCTCTGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') qui forme une structure tige-boucle. (La majuscule correspond à une séquence répétée inversement et la minuscule à la région de boucle).
    2. Une partie de la séquence dorsale 5' qui forme une boucle sert d’amorce inverse pour l’amplification PCR ultérieure (séquence gras-italique dans la séquence dorsale). Ajoutez une séquence d’extension 6-nt qui est inversement complémentaire à l’extrémité 3' du miARN d’intérêt à l’amorce de boucle tige pour fournir une spécificité pour la transcription inverse (Figure supplémentaire 1A).
      REMARQUE: Concevoir l’amorce de transcription inverse tige-boucle telle que décrite par Chen et al.69 et Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Par exemple, l’amorce de transcription inverse en boucle tige pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 de pomme de terre est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (Les séquences majuscules en gras fournissent la spécificité de la transcription inverse pour des miARN spécifiques).
    3. Mettre en place la réaction de transcription inverse en mélangeant 50 à 200 ng d’ARN total, 1 μL de l’amorce de transcription inverse tige-boucle (100 μM), 2 μL de tampon 10x, 0,2 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM chacun) et 1 μL de transcriptase inverse (200 U/μL) sur glace. Ajouter le ddH2O sans nucléase à un volume total de 20 μL.
    4. Effectuez une transcription inverse à l’aide de la procédure de transcription inverse pulsée. Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 16 °C pendant 30 min, effectuer un cycle de température de 30 °C pendant 30 s, 42 °C pendant 30 s et 50 °C pendant 1 s, pour un total de 60 cycles, et inactiver la transcriptase inverse par incubation à 85 °C pendant 5 min.
    5. Pour l’analyse PCR en temps réel de l’expression des miARN, concevez l’amorce avant en fonction de la séquence de miARN, mais n’incluez pas les séquences qui chevauchent l’amorce de transcription inverse de la boucle de tige conçue ci-dessus. Ajoutez une extension de 3 à 7 pouces aux 5' de l’amorce avant pour optimiser la longueur, la température de fusion et la teneur en GC (figure supplémentaire 1).
      REMARQUE: L’amorce inverse universelle est 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Par exemple, l’amorce de transcription inverse tige-boucle pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 est 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Les séquences en gras servent d’extensions 5' pour l’optimisation de l’amorce. Les amorces de transcription inverse en boucle de tige et les amorces de PCR en temps réel pour le miARN peuvent être conçues à l’aide de l’outil de conception d’amorces miRNA73.
  4. Synthétiser les ADNc des ARNm cibles par PCR à transcription inverse standard (RT-PCR). Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 37 °C pendant 60 min et inactiver la transcriptase inverse en chauffant à 85 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : (1) Prédire les ARNm cibles à l’aide du programme psRNATarget74 si les ARNm cibles ne sont pas connus. (2) L’amorce universelle de transcription inverse pour l’ARNm est une amorce ancrée 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. Configurez la réaction pcR en temps réel pour les miARN d’intérêt et les ARNm cibles. Mélanger 0,5 μL d’ADNc modèle, 5 μL de 2x tampon PCR en temps réel avec du vert SYBR, 0,05 μL de chaque amorce avant et arrière (40 μM) et 4,4 μL de ddH2O dans un volume total de 5 μL sur glace.
  6. Incuber à 95 °C pendant 3 min, 40 cycles de 95 °C pendant 3 s et 60 °C pendant 30 s. Effectuer une analyse ultérieure de la courbe de fusion comme suit : Incuber à 95 °C pendant 15 s, refroidir à 60 °C à une rampe de 20 °C/s, maintenir à 60 °C pendant 60 s, chauffer à 95 °C à une rampe de 0,2 °C/s et maintenir à 95 °C pendant 15 s. Analysez les valeurs Ct à l’aide des méthodes ΔΔCt76,77 et tracez les moyennes avec des erreurs-types.
    REMARQUE: (1) Les amorces de PCR en temps réel pour les ARNm cibles peuvent être conçues comme décrit75. (2) Le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre peut servir de contrôle interne pour la normalisation dans la pomme de terre. L’amorce avant pour le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre est 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' et l’amorce inverse 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Pour l’analyse PCR en temps réel, la contamination et la formation d’amorces-dimères peuvent générer des résultats faussement positifs. Pour surveiller l’amplification non spécifique et augmenter la responsabilité de l’analyse PCR en temps réel, il est recommandé d’inclure des contrôles sans modèle et une transcriptase inverse pour les tests PCR en temps réel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 2 montre les plants de pommes de terre PVX-STTM165/166 (Katahdin) avec une croissance ectopique des tissus foliaires du côté abaxial de la lame des feuilles le long des veines. Des phénotypes plus sévères tels que la formation de feuilles en forme de trompette ont également été observés. En revanche, aucune anomalie phénotypique n’a été observée dans les usines témoins pvx. Ces résultats montrent que le système VbMS était efficace pour supprimer la fonction endogène des miARN chez les plants de pommes de terre tétraploïdes et que le système PVX-VbMS était un outil génétique robuste pour déterminer la fonction de miARN ou de familles de miARN spécifiques.

La figure 3 montre les plants de pommes de terre PVX-STTM165/166 (Russet Burbank) avec une croissance du tissu foliaire ectopique du côté abaxial de la lame foliaire le long des nervures. Ces résultats montrent que le système PVX-VbMS pourrait être appliqué à d’autres espèces de pommes de terre, y compris un important cultivar de pommes de terre.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique des vecteurs VbMS basés sur PVX et de la structure PVX-STTM165/166. LB = bordure gauche de l’ADN-T; RB = bordure droite de l’ADN-T; 35S = promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S; NOST = terminateur de la nopaline synthase; RdRP = ARN polymérase dépendante de l’ARN; TGB1 = protéine de bloc de gène triple 1; TGB2 = protéine triple bloc génique 2; TGB3 = protéine de bloc de gène triple 3; sgP = promoteur d’ARN sous-gnomique PVX; CP = protéine de manteau; Cassette LIC = cassette de clonage indépendante de la ligature; 48 nt = 48 nucléotides imparfaits stem-loop linker. STTM165/166 se compose de séquences TM en tandem de miR165/166 séparées par une séquence de liaison tige-boucle imparfaite de 48 nt. La pointe de flèche verte dans le vecteur PVX-LIC indique le site de départ de l’ARN sous-gnomique PVX hébergeant la séquence STTM. Les traits d’union triples moins dans les séquences de miARN indiquent les sites de clivage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : VbMS de miR165/166 dans la variété de pomme de terre tétraploïde Katahdin. Phénotypes des plants de pommes de terre (Katahdin) exprimant la lutte antivectorielle PVX ou PVX-STTM165/166. Les flèches magenta désignent des structures foliaires générées ectopiquement dans les nervures des feuilles. La pointe de flèche orange désigne des structures de feuilles en forme de trompette. Barres = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.

Figure 3
Figure 3 : VbMS de miR165/166 dans la variété de pomme de terre tétraploïde Russet Burbank. Phénotypes des plants de pommes de terre (Russet Burbank) exprimant le vecteur PVX comme témoin ou PVX-STTM165/166. Les flèches magenta désignent des structures foliaires générées ectopiquement dans les nervures des feuilles. Barres = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Diagrammes schématiques de l’analyse RT-PCR en boucle de tige des miARN et de la conception de l’amorce par PCR en temps réel. (A) Analyse RT-PCR en boucle de tige des miARN. Au cours de la transcription inverse, la liaison de l’amorce de la boucle de tige au miARN 3' a initié la transcription inverse et l’ADNc a été synthétisé. Les produits pcR ont été amplifiés avec un amorce avant spécifique du miARN d’intérêt et l’amorce inverse universelle. (B) Conception de l’amorce pcR en temps réel. Les amorces avant et arrière pour Stu-miR160 et Stu-miR165/166 sont affichées. L’amorce avant a été conçue sur la base de la séquence de miARN, mais n’incluait pas de séquences qui se chevauchaient avec l’amorce de transcription inverse de boucle de tige conçue. Une extension de 3 à 7 pouces a été ajoutée aux 5' de l’apprêt avant pour ajuster la longueur, la température de fusion et la teneur en GC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nous présentons un système de silencieux miARN à base de PVX pour caractériser la fonction des miARN endogènes dans la pomme de terre en intégrant la conception STTM dans le vecteur PVX. Le système VbMS s’est avéré efficace pour faire taire les miARN165/166 dans la pomme de terre, une famille de miARN hautement conservée parmi les espèces végétales.

L’approche DE MT a été développée pour interférer avec l’expression des miARN sur la base d’une imitation artificielle de la cible de miARN conçue pour créer une boucle de décalage au site de clivage attendu dans la séquence de complémentation des miARN qui entraîne la séquestration des miARN ciblés et l’arrêt de son activité22,35,78,79 . L’appariement entre les molécules de MT et les miARN cibles bloque la fonction des miARN en abaissant les niveaux d’un miARN spécifique ou d’une famille de miARN, ce qui conduit à une régulation à la hausse des ARNm cibles. Plusieurs technologies de MT ont été développées pour le silence des miARN, y compris le mimétisme endogène de la cible miARN (eTM)79,80, les mimiques de miARN basées sur l’eTM (MMI)35,78, les mimiques de cible en tandem court (STTM)22,53, une approche de leurre de miARN avec des MT intégrées dans l’UTR 3' des transcriptions codant pour les protéines81, et des SPONGE miARN contenant des sites de liaison miARN avec deux incohérences centrales pour cibler les miARN (cmSP) 82. STTM se compose de deux sites de liaison de miARN avec un renflement de décalage de 3-nt, reliés par un espaceur de 48-nt qui a été optimisé empiriquement. STTM déclenche une inhibition efficace des miARN cibles22,53. La technologie STTM a récemment été appliquée avec succès à une analyse fonctionnelle à grande échelle des miARN de la plante modèle Arabidopsis et des principales cultures telles que le riz et le maïs. Cela a conduit à la découverte de rôles sans précédent de plusieurs miARN endogènes impliqués dans le contrôle du rendement et des hormones, ce qui est très prometteur pour améliorer la sélection des cultures47. Sur la base de ces avantages de la conception STTM, nous avons choisi STTM et l’avons intégré dans le vecteur PVX pour la caractérisation fonctionnelle des miARN dans la pomme de terre. Il convient de noter que les différentes conceptions de molécules de MT, telles que les cmSP, les MMI et les STTM, ont des efficacités variables pour bloquer la fonction de différents miARN82. Par conséquent, l’utilisation de diverses stratégies de conception de MT peut aider à obtenir une suppression plus efficace des miARN. La longueur et le contexte séquentiel du renflement inégalé ainsi que les altérations nucléotidiques adjacentes aux sites de liaison aux miARN peuvent également devoir être optimisés pour un résultat spécifique de silençage des miARN22,36,38,78,83. En outre, la conception de molécules de MT sous la direction de prédictions informatiques ainsi que l’analyse expérimentale conduiront probablement à une inhibition plus fiable des miARN84.

Il a été démontré que le système VIGS à base de PVX est efficace pour déclencher le silençage de l’ARN chez les espèces diploïdes et tétraploïdes cultivées Solanum. Le silencieux systémique à base de PVX est induit et maintenu dans les tissus foliaires sur les plants de pommes de terre multipliés in vitro pendant plusieurs cycles et sur les microtubercules générés in vitro85. Nous avons récemment rapporté que le système VIGS basé sur PVX peut faire taire les gènes d’intérêt dans plusieurs cultivars de pommes de terre tétraploïdes, tels que Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard et Serrana86. Il reste à déterminer si l’effet VbMS à base de PVX peut être transmis et maintenu pendant plusieurs générations par multiplication végétative dans la pomme de terre. Les approches transgéniques pour introduire des molécules de MT de manière stable dans les plants de pommes de terre sont toujours recommandées lorsque les effets de silence des miARN d’intérêt doivent être maintenus dans les générations suivantes.

De nombreux miARN impliqués dans la croissance et le développement de la pomme de terre ont été identifiés. Le séquençage de l’ARN, le séquençage du génome et la prédiction bioinformatique ont grandement facilité l’identification des miARN et de leurs cibles17,19,20,21. Jusqu’à présent, trois génomes de pommes de terre ont été séquencés, dont un clone DM1-3 DM1-3 du groupe phureja monoploïde double, une espèce diploïde sauvage S. commersonii et un clone consanguin diploïde M6 de S. chacoense87,88,89. À ce jour, seul un nombre limité de miARN de pommes de terre ont été caractérisés fonctionnellement, dans la plupart des cas à l’aide de la technologie TM. Par exemple, l’homologue SP6A DU LOCUS T (FT) DE FLORAISON agit comme un signal mobile pour contrôler la tubérisation dans la pomme de terre et est ciblé par un miARN, supprimant l’expression de SP6A (SES), qui médie le clivage induit par la chaleur de la transcription SP6A90,91. La surexpression de SES médiée par STTM bloque l’activité des miARN SES et facilite la tubérisation même dans des conditions de chaleur continue91. L’élimination de miR160, un miARN impliqué dans la réponse immunitaire, par l’approche eTM a montré que miR160 est nécessaire dans la résistance acquise locale et systémique contre Phytophthora infestans dans la pomme de terre92.

À l’aide d’une approche bioinformatique, huit familles uniques de miARN qui ciblent les récepteurs immunitaires à répétition riche en leucine (NLR) du site de liaison nucléotidique dans la pomme de terre et la tomate ont été identifiées93. L’une des familles de miARN, miR482/2118, cible plusieurs NWR qui confèrent une résistance à divers agents pathogènes et la suppression des miARN de la famille miR482/2118 médiée par l’expression transgénique des constructions STTM conduit à une résistance accrue de la tomate contre P. infestans et Pseudomonas syringae13. De plus en plus de preuves suggèrent que les petits ARN produits dans les agents pathogènes et les hôtes peuvent voyager entre les deux organismes et supprimer l’expression génique de l’autre médiée par l’interférence ARN entre les règnes94,95,96,97. Par exemple, les imitations ciblées d’un ARNs dérivé d’un agent pathogène de l’oomycète peuvent récupérer ces ARN envahissants et réduire l’infection par des agents pathogènes61. Il serait intéressant d’examiner si le système VbMS actuel peut être utilisé pour cibler les ARNs dérivés d’agents pathogènes afin d’améliorer la résistance chez les plantes.

En résumé, le système de silencieux miARN à base de virus est rapide et rentable et peut être effectué dans un format à haut débit. Le système VbMS basé sur PVX fournit un outil génétique efficace et robuste pour déterminer la fonction de miARN ou de familles de miARN spécifiques et les gènes cibles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Yule Liu de l’Université Tsinghua d’avoir fourni le vecteur PVX-LIC. Ce travail a été soutenu par un fonds de démarrage du Texas A & M AgriLife Research et le projet Hatch TEX0-1-9675 de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Sciences de l’environnement numéro 159 silençage de microARN à base de virus (VbMS) virus de la pomme de terre X (PVX) microARN (miARN) mimique de cible (TM) mimique de cible en tandem court (STTM) Solanum tuberosum
MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter