Summary
我々は、ポテトウイルスX(PVX)ベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)システムの詳細なプロトコルを提示し、ポテト中の内因性マイクロRNA(miRNA)を機能的に特徴付ける。目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子はPVXベクターに統合され、一過性にジャガイモで発現して標的miRNAまたはmiRNAファミリーを沈黙させる。
Abstract
ウイルスベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)は、植物におけるマイクロRNA(miRNA)の機能的特性評価のための迅速かつ効率的なツールです。ニコ チアナ・ベンタミアナ、トマト、シロイヌナズナ、綿、小麦やトウモロコシなどのモノコット植物など、さまざまな植物種に対してVbMSシステムが開発・適用されています。ここでは、PVXベースのVbMSベクターを用いて、ジャガイモ中の内在性miRNAを沈黙させる詳細なプロトコルについて述べている。特定のmiRNAの発現をノックダウンするために、目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子が設計され、植物ウイルスベクターに統合され、 アグロバクテリウム 浸潤によってジャガイモで発現され、目的の内因性miRNAに直接結合し、その機能を遮断する。
Introduction
植物マイクロRNA(miRNA)は、20-24ヌクレオチド長の核コード化された調節RNA1として特徴付けられており、成長および発達2,3、光合成および代謝4,5,6,7、ホルモン合成およびシグナル8,9、生物および非生物応答10、生物合成および非生物応答を含む植物生物学的プロセスのほぼすべての側面において基本的な役割を果たす11,12,13,および栄養素およびエネルギー規制14,15。植物miRNAの調節的役割は、ターゲットmRNAを切断または翻訳的に抑圧することによって、通常、転写後レベルで十分にプログラムされ、果たされます。
ジャガイモ16,17,18,19,20,21におけるmiRNAの同定、転写プロファイリング、および目標予測に向けて大きな進歩が見られました。しかし、ジャガイモを含む植物のmiRNAの機能的特徴付けは、効率的で高スループットな遺伝的アプローチの欠如のために他の生物に遅れをとっている。ほとんどのmiRNAは、かなりの遺伝的冗長性を持つ家族に属するため、標準的な機能損失分析によって個々のmiRNAの機能解析を行うことは困難です22。さらに、単一のmiRNAは複数の標的遺伝子23を制御することができ、いくつかの異なるmiRNAは、同じ分子経路を共同で24,25に調節することができる。これらの特性は、特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーの機能を特徴付けることを困難にします。
miRNAの機能分析の多くは、明らかな制限がある機能の得るアプローチに大きく依存してきました。人工miRNA(amiRNA)法は、内因性一次転写物(pri-miRNA)を利用して高レベルでmiRNAを産生し、標的遺伝子発現26,27,28,29の阻害を招く。しかし、強力な構成的な35Sプロモーターを用いた活性化タグ付けおよびmiRNA過剰発現は、多くの場合、インビボ状態を代表しないmiRNAの発現を高め、したがってmiRNA30の内因性機能を反映しない可能性がある。結合および/または切断部位に不用な突然変異を含む標的遺伝子のmiRNA耐性形態の発現を含む別のアプローチが開発された31,32,33。しかし、このアプローチはまた、トランスジェニックアーチファクトによるmiRNA耐性標的トランスジーンに由来する表現型の誤解釈を引き起こす可能性がある。したがって、これらの機能獲得研究からの結論は注意34で描かれるべきである。上述のアプローチのもう一つの大きな制限は、人件数が多く時間のかかる変換が必要なことです。さらに、遺伝子導入依存的アプローチは、変換-再石灰化植物種にはほとんど適用されません。したがって、miRNAの機能を解明するためには、高速かつ効率的に機能喪失アプローチを開発することが不可欠です。
変換手順の前提条件を回避するために、標的模倣(TM)戦略をウイルス由来ベクターと組み合わせることにより、ウイルスベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)が確立された。VbMSシステムでは、人工的に設計されたTM分子はウイルス骨格から一過性発現し、強力で高スループットで時間を節約するツールを提供し、植物内因性miRNA35,36の機能を解剖します。VbMS は、タバコガラガラウイルス (TRV)35,36,37 を持つ N. ベンタミアナとトマトで開発され、ジャガイモウイルスX(PVX)38、綿葉のくしゃくしゃウイルス (ClCrV)39、 キュウリモザイクウイルス (CMV)40,41,41,422、および大麦ストライプモザイクウイルス(BSMV)44,45。
ジャガイモ(ソラナム結節)は、4番目に重要な食品作物であり、主にその高い栄養価、高エネルギー生産、および比較的低い入力要件のために、世界で最も広く栽培された非穀物作物である46。ジャガイモのいくつかの特徴は、魅力的な二コチドのモデル植物になります。これは、高い外交率、異種性、および遺伝的多様性を有する栄養学的に伝播された多倍化作物である。しかし、現在までに、VbMS を使用したジャガイモの miRNA の機能を特徴付けるレポートはありません。ここでは、ライゲーション非依存クローニング(LIC)適合ポテトPVXベースVbMSアプローチを用いて、ジャガイモ植物におけるmiRNAの機能を評価する38を提示する。miR165/166ファミリーとそのターゲットmRNAおよびクラスIIIホメオドメイン/ルージッパー(HD-ZIP III)転写因子が22,47,48に大きく特徴付けられているため、VbMSアッセイを説明するためにmiR165/166ファミリーを選択しました。HD-ZIP III遺伝子はメリステムの発達と器官極性の主要な調節因子であり、miR165/166機能の抑制はHD-ZIP III遺伝子の発現の増加をもたらし、その結果、有天性優位性の低下や葉極性の異常なパターンなどの多方性発生欠陥が生じる22,35,38,41.容易に相関性のある発生表現型はmiRNA165/166のサイレンシングと相関し、PVXベースのVbMSアッセイの有効性を正確に評価することを可能にする。
本研究では、PVXベースのVbMSシステムがジャガイモ中のmiRNAの機能を効果的に遮断できることを実証した。PVXベースのウイルス誘導遺伝子サイレンシング(VIGS)システムは、多くのジャガイモ品種49,50,51,52に確立されているため、このPVXベースのVbMSアプローチは、広範囲のジプロイドおよびテトラロイドジャガイモ種に適用される可能性が高い。
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Protocol
1.ジャガイモの植物を育てます。
- 培養管(25 x 150 mm)に、ムラシゲとスクーグ(MS)培地にガンボルグのビタミン(MS基底塩混合物、ガンボルグのビタミン、30 g/Lスクロース、3.5 g/L寒天、pH = 5.7)を加えた培養管内のインビトロポテト植物を伝播します。成長室にチューブを20~22°C、16時間光/8時間暗光周期、光強度120μmol/m2∙s1の下に置きます。
注:新しい芽や根は通常、植物から1〜2週間で発生します。新鮮なMS/ガンボルグのビタミン培地を毎月植物に伝播する。 - 4週間後、体外植物を土壌に移植し、20~22°Cの温室、16時間光/8時間の暗光周期、光強度120μmol/m2∙s1の下で成長させます。
注:新たに開発された根や葉を持つ植物は移植に適しています。最初の3~4日間は、移植したての植物の水分を維持します。
2. VbMS ベクトルを構築します。
- 目的のmiRNAに対して短タンデムTM分子(STTM、図1)22,53を設計およびクローン化する。
注:実験データに基づいて、またはmiRbaseデータベースからmiRNA配列を取得する54、55、56、57、58、59。この研究で使用されたmiR166配列は、前60に記載されている。- miRNAの10番目から11番目 のヌクレオチドに対応する部位のmiRNAの逆補数配列にミスマッチ配列(通常5'-CTA-3')を挿入してTMモジュールを設計します。
注: 例えば、Stu-miR160配列は5'-UGCCUGGCUCUCUGUAUGCC-3'61で、10番目から11番目のヌクレオチドは太字です。逆補体配列(デオキシヌクレオチド)は5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3'であり、不一致の膨らみ挿入部位は太字で示されている。TM分子配列(デオキシヌクレオチド)は5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'でなければなりません。 - STTMフラグメントをクローニングするためのプライマーを設計する(図1)。PCR クローニングのテンプレートとして、48-nt スペーサ配列を持つ DNA オリゴヌクレオチドを使用します。フォワードプライマーは、LIC1リンカー(5'-CgACgACAAgACCgT-3')、TM分子用に設計された上記の前方配列、および48-ntスペーサーの部分的な5'配列(5'-GTTGTGtTGTTATGGT-3')で構成されています。リバースプライマーは、LIC2リンカー(5'-gAgCCgT-3')、TM分子の逆補数配列、および48-ntスペーサーの3'配列に対する部分的な逆補体(5'-ATTCTCTCtTTAGACCAT-3')で構成されています。
注:48-ntスペーサーシーケンスは5'-GTGtGtTGTTTATTTTTCTAATAATAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAAT-3'です。例えば、STTM-miR160の場合、フォワードプライマーは5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGAGGCA-GTTGTGtTGTTTTATGGT-3'でなければなりません。リバースプライマーは、5'gAGAgAagAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-タグ-CCTGTATCC-ATTCTCTCTTTAGACCATAT-3' でなければなりません(図1)。 - 合成されたユニバーサル48-ntスペーサーをテンプレートとして、かつ高忠実度DNAポリメラーゼを用いて、PCRにより50μLの体積でSTTM断片を増幅します。
- 各プライマー(40 μM)の0.5 μL、48-ntスペーサーオリゴ(40 μM)の0.5 μL、10x PCRバッファの5 μLを混合してPCR反応を設定し、 dNTP混合物1 μL(各10 mM)、0.1μLの高忠実度DNAポリメラーゼ(10 U/μL)、ddH2Oの43 μLを合計容量50 μLに、標準PCR増幅を次のように実行します。 94°C(3分)、94°Cの32サイクル(45s)、60°C(45s)、60°C(60°C)
- エタノール沈殿によりSTTM断片を精製する。PCR製品に2.5量のエタノールと3M酢酸ナトリウム(pH = 4.0)の1/10容量を加えます。14,000 x g で 10 分間、激しく遠心分離機を混ぜます。上清を取り除き、70%エタノールの1 mLでペレットをすすます。ペレットを乾燥させ、20 μLのddH2Oに溶解します。
注:DNA電気泳動を使用して、STTM PCR製品の増幅を確認してください。 - T4 DNAポリメラーゼ反応を、精製されたSTTM PCR産物の2.5 μL、10x T4 DNAポリメラーゼバッファーの0.5 μLを混合して氷上にセットアップし、 0.05 μLの 1 M ジチオスレイトール (DTT), 0.25 μL 100 mM dATP, 0.1 μL T4 DNA ポリメラーゼ (3 U/μL), ddH2O の 1.6 μL 合計体積 5 μL で 37 °C の混合物をインキュベート 5 μL, 15 min, 75°CでT4DNAポリメラーゼを不活性化するために20分間製品を処理します。
- miRNAの10番目から11番目 のヌクレオチドに対応する部位のmiRNAの逆補数配列にミスマッチ配列(通常5'-CTA-3')を挿入してTMモジュールを設計します。
- PVX ベースの VbMS コンストラクトを準備します。
- PVX-LICプラスミド38 の5 μgを、100 μLの体積で2.5 μLの SmaI(20 U/μL)を消化します。
- 消化したPVX-LIC製品に等量のフェノール:クロロホルム:イソプロパノール(25:24:1、pH = 6.7/8.0)を加え、激しく混ぜます。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を新しい遠心管に移します。等量のクロロホルム:イソプロパノール(24:1)と渦を激しく加えます。14,000 x g で10分間遠心分離機。
注: PVX-LIC ベクターは、クローン作成用の LIC カセットを収容します。PVX-LICベクターのLICカセットは 、ccdB 遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでおり、カナマイシン(50μg/L)およびクロラムフェニコール(15μg/L)を含むLB培地を使用して 大腸菌 株DB3.1で維持/伝播する必要があります。 - 上清を新しい遠心管に移します。2.5量のエタノールと3M酢酸ナトリウム(pH =4.0)の1/10容量を加え、激しく混ぜます。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。
- 70%エタノールと渦の1 mLでペレットを精力的に洗浄します。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。ペレットを乾燥させ、消化したPVX-LICプラスミドを100 μLのddH2Oで溶解します。
- T4 DNAポリメラーゼ反応を2.5 μLの消化PVX-LICベクターDNAを混合して氷上にセットアップし、 0.5 μLの10x T4 DNAポリメラーゼバッファー、0.05 μLの1 M DTT、0.25 μLの100 mM dTTP、0.1 μLのT4 DNAポリメラーゼ(3 U/μL)の合計体積5μLで、37°Cで37°Cでインキュベート混合物を15minで75m°Cで処理し、75m°Cで製品を治療します。T4 DNAポリメラーゼを不活性化します。
- LIC反応を使用して、STTM配列をPVX-LICベクターにクローン化します。T4 DNAポリメラーゼ処理STTM PCR産物(5μL)とT4 DNAポリメラーゼ処理PVX-LICプラスミド(5μL)を混合します。70°Cで5分間インキュベートし、0.1°C/sのランプで22°Cまで冷却し、PCR機を使用して22°Cで30分間保ちます。
注意:LICクローニングの効率を高めるために、4°Cで一晩にインキュベーション時間を延長してください。 - LIC反応生成物の5μLを大腸菌DH5αに変換し、50 μg/mLカナマイシン62,63を含むLBプレート上で成長させます。PVX-LIC ベクターのクローニングプライマーとユニバーサルプライマーを使用して、シーケンシングを行い、正のコロニーを検出して検証します。
- PVX-LIC(5'-GTGTTGGTGCAACTAGAT-3')のフォワードプライマーでコロニーPCRを行い、STTMクローニング用リバースプライマーと組み合わせて陽性クローンを同定します。PCR バンドのサイズは、300 bp 以下にする必要があります。
注: ターミネータサイクルシーケンシング64,65でSTTMフラグメントのシーケンスを確認します。
- PVX-LIC(5'-GTGTTGGTGCAACTAGAT-3')のフォワードプライマーでコロニーPCRを行い、STTMクローニング用リバースプライマーと組み合わせて陽性クローンを同定します。PCR バンドのサイズは、300 bp 以下にする必要があります。
- PVX-STTMプラスミドを検証済みのクローンから分離し、GV3101、GV2260、またはEHA10562,63のアグロバクテリウム株に変換します。PCRでアグロバクテリウムコロニーを確認します。
注: PVX-LIC のフォワードプライマーと STTM クローニング用のリバース プライマーを使用して、PCR による アグロバクテリウム コロニーを確認します。
3. ポテトプラントでPVXベースのVbMSアッセイを行う。
- 4週齢のインビトロポテト植物を土壌に移植する。移植された植物は3〜4日後にVbMSアッセイを受ける。
- PVX-STTMプラスミドを含む アグロバクテリウム を用いてポテト植物を接種する。
注:ジャガイモのVbMSアッセイでは、 アグロバクテリウム媒介性浸潤と爪楊枝引っ掻き接種が同時に行われます。- PVX-STTMベクターを含む正の形質転換体を50 μg/mLカナマイシンおよび50 μg/mL リファンピシンを含む液体LB 50 mLに選んで接種します。OD600 = 1.0まで220 rpmで28°Cインキュベーターで16時間成長します。
- 同時に、陽性のアグロバクテリウムコロニーを、50 μg/mL カナマイシンと50 μg/mL リフィンピシンを含む少なくとも2つの新しいLBプレートにストリークし、28°Cで1日間成長します。コントロールとして PVX-LIC38,66 ベクターを、ウイルスの拡散を監視する PVX-GFP67,68 を含めます。
- 室温で10分間3,400xgで遠心分離することにより、アグロバクテリウム液培養液を収集します。等量の浸潤バッファー(10 mM MgCl2、10 mM MES、および200 μM アセトシリンギロン、pH = 5.6)のアグロバクテリウム細胞を再懸濁し、OD600 = 1.0 に調整します。室温で6時間インキュベートする。
- 1 mLの無針注射器で完全に膨張した葉の腹側に アグロバクテリウム 培養物を浸透させる。
- 片方の手で葉をめくって持ち、1本の指を使って浸潤部位のアダクシャル側から葉の層を支えます。もう一方の手で葉の表面に垂直にシリンジを保ち、ラミナの腹軸側に アグロバクテリウム 培養物を浸透させます。
- LBプレートから アグロバクテリウム 培養物を削り、浸潤したジャガイモ植物の最初の1つまたは2つの節間の茎表面を爪楊枝で傷つける。茎の表皮を軽く引っ掻きます。茎を突き抜け、植物に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。
- 浸潤した植物を22°Cで22°Cで、16時間光/8時間の暗い光周期と120 μmol/m2∙ s1 の光強度を温室で成長させます。
注:miRNAサイレンシングによって引き起こされる型の素型は、通常、2~4週間の後分に現れます(図2、 図3)。VbMS 表現型が浸透した後に現れるのに通常 10 ~ 20 日かかります。VbMS表現型は、特定のmiRNAおよび標的遺伝子の特性、成長条件、およびジャガイモの品種に依存する。
4. 式解析を実行します。
- 表現型が2~4週間の後に出現する場合、はさみでコントロール植物からVbMS植物や組織から、芽、葉、花、根などの組織をVbMS植物や組織から採取します。収集した組織から総RNAを分離します。
- 分光光度計でOD260吸光度を測定して、電気泳動62,63でRNAの品質を確認し、RNA濃度を定量化します。
- miRNAの発現を分析するために、ステムループリアルタイム逆転写PCR(RT-PCR)を使用します。
- 特定のmiRNAの場合は、ステムループ逆転写プライマーを設計します。ステムループRTプライマーは、ユニバーサル5'バックボーンと特定のmiRNAの3'6-nt拡張を含みます。ステムループ構造を形成する5'-GTCTCCTGTGTGGCagggtgcgttgcACCAGAGGAGAC-3'を設計します。(大文字は逆繰り返しシーケンスに対応し、下のケースはループ領域に対応します)。
- ループを形成する5'バックボーンシーケンスの一部は、その後のPCR増幅のためのリバースプライマーとして機能します(バックボーンシーケンスにおける太字斜体配列)。逆に目的のmiRNAの3'末端に逆相補的である6-nt拡張配列をステムループプライマーに加え、逆転写に特異性を与える(補足図1A)。
注:陳ら69およびエリカ・バルコニ-ガシックら70,71,72によって記述されるように、ステムループ逆転写プライマーを設計します。例えば、Stu-miR160用のステムループ逆転写プライマーは、5'-GTCTTGtGtGtGGGggcgtgggggtgtattgcACCAGAGGAGGAGGGCATA-3'として設計されています。ポテトmiR165/166ファミリー用のステムループ逆転写プライマーは、5'-GTCTTGTGtGtGGGgcgtgggtgtgtgtattgcACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3'として設計されています。(太字の大文字シーケンスは、特定の miRNA に対する逆転写の特異性を提供します)。 - 総RNA50~200ng、ステムループ逆転写プライマー1μL(100μM)、10x緩衝液2μL、RNase阻害剤0.2μL(40 U/μL)、0.25μLのdNTP(各10mM)、1μLの逆転転写反応を設定します。ヌクレアーゼフリーddH2Oを合計20μLに追加します。
- パルス逆転写処理を使用して逆転写を行います。逆転写反応混合物を16°Cで30分間インキュベートし、30sで30°C、30sで42°C、1sで42°C、合計60サイクル、85°Cでインキュベーションして逆転写酵素を5分間不活性化する。
- miRNA発現のリアルタイムPCR解析のために、miRNA配列に基づいてフォワードプライマーを設計しますが、上記の設計されたステムループ逆転写プライマーと重なる配列は含みないでください。長さ、溶融温度、および GC コンテンツを最適化するために、フォワードプライマーの 5' に 3-7 nt の拡張を追加します (補足図 1)。
注: ユニバーサルリバースプライマーは 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'です。例えば、Stu-miR160用のステムループ逆転写プライマーは、5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'として設計されています。miR165/166ファミリーのステムループ逆転写プライマーは5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'です。太字のシーケンスは、プライマー最適化のための 5' 拡張として機能します。miRNA用のステムループ逆転写プライマーおよびリアルタイムPCRプライマーは、miRNAプライマー設計ツール73を使用して設計することができます。
- 標準的な逆転写 PCR (RT-PCR) によって標的 mRNA の cDNA を合成する。逆転写反応混合物を37°Cで60分間インキュベートし、85°Cに加熱して逆転写酵素を5分間不活性化する。
注:(1)標的mRNAが不明な場合は、psRNATargetプログラム74 を用いて標的mRNAを予測する。(2) mRNAの普遍的な逆転写プライマーは、アンカープライマー5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVTVN-3'である。 - 目的のmiRNAとターゲットmRNAの両方にリアルタイムPCR反応を設定します。0.5 μLのテンプレート cDNA、SYBR グリーンの 2x リアルタイム PCR バッファ 5 μL、各フォワードプライマーとリバースプライマー(40 μM)の 0.05 μL、氷上の合計体積 5 μL の ddH2O を 4.4 μL 混合します。
- 95°Cで3分間、3sで95°Cの40サイクル、30sで60°Cでインキュベートします。その後の融解曲線解析を、95°Cで15sでインキュベートし、20°C/sの傾斜で60°Cまで冷却し、60°Cで60°Cに保ち、0.2°C/sの傾斜で95°Cに加熱し、95°Cで15°Cに保ちます。ΔΔCt メソッド76,77を使用して Ct 値を分析し、標準誤差を持つ平均をプロットします。
注: (1) 標的mRNAのリアルタイムPCRプライマーは、75を説明するように設計することができます。(2)ポテト ポリウビキチン10 遺伝子は、ジャガイモ中の正常化のための内部制御として役立つことができる。ジャガイモ ポリウビキチン10 遺伝子のフォワードプライマーは、5'-ATGTTGCCTTCTTTATGTGTGGTG-3'および逆プライマー5'-ッタッタタカターサーガッカクトカクトカACC-3'です。(3) リアルタイム PCR 解析の場合、汚染およびプライマー ダイマー形成により、偽陽性の結果が生じることがあります。非特異的増幅を監視し、リアルタイムPCR分析の責任を増大させるために、リアルタイムPCRアッセイ用のテンプレートおよび逆転写酵素を含まないコントロールを含めることが推奨されます。
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Representative Results
図2 は、静脈に沿った葉層の腹軸側から葉組織の異所性成長を有するPVX-STTM165/166ジャガイモ植物(Katahdin)を示す。トランペット状の葉形成のようなより厳しい表現型も観察されている。これに対し、PVX制御プラントでは、フェノミツ異常は認められなかった。これらの結果は、VbMSシステムがテトラピドポテト植物の内因性miRNA機能を抑制するのに有効であり、PVX-VbMSシステムは特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーの機能を決定するための堅牢な遺伝的ツールであったことを示した。
図3 は、葉層の静脈に沿った葉層の腹側から異所性葉組織成長を有するPVX-STTM165/166ジャガイモ植物(ラセットバーバンク)を示す。これらの結果は、PVX-VbMSシステムが主要なジャガイモ品種を含む他のジャガイモ種に適用できることを示している。
図1:PVXベースのVbMSベクターとPVX-STTM165/166構造の概略図 LB = T-DNA 左境界;RB = T-DNA 右境界;35S = カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター;NOST = ノパリン合成酵素ターミネーター;RdRP = RNA依存性 RNA ポリメラーゼ;TGB1 = トリプル遺伝子ブロックタンパク質 1;TGB2 = トリプル遺伝子ブロックタンパク質 2;TGB3 = トリプル遺伝子ブロックタンパク質 3;sgP = PVX サブゲノム RNA プロモーター;CP = コートタンパク質;LICカセット= ライゲーション非依存クローニングカセット;48 nt = 48 ヌクレオチド不完全なステムループリンカー。STTM165/166は、48-nt不完全なステムループリンカー配列で分離されたmiR165/166のタンデムTM配列で構成されています。PVX-LICベクターの緑色の矢印は、STTM配列を収容するPVXサブゲノムRNAの開始部位を示す。miRNA配列におけるトリプルマイナスハイフンは、切断部位を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:四トラボイドポテト品種カタディンにおけるmiR165/166のVbMS。PVXベクター制御またはPVX-STTM165/166を発現するジャガイモ植物(Katahdin)の表現型。マゼンタの矢印は、葉の静脈に異所性に生成された葉の構造を示す。オレンジ色の矢印はトランペットのような葉の構造を示しています。バー = 1 cm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:四肢ポテト品種ラセットバーバンクにおけるmiR165/166のVbMS。 制御またはPVX-STTM165/166としてPVXベクターを発現するジャガイモ植物(ラセットバーバンク)の表現型。マゼンタの矢印は、葉の静脈に異所性に生成された葉の構造を示す。バー = 1 cm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:miRNAのステムループRT-PCR分析とリアルタイムPCRプライマー設計の概略図 (A) miRNAのステムループRT-PCR分析。逆転写の間、3'miRNAへのステムループプライマーの結合は逆転写を開始し、cDNAを合成した。PCR産物は、目的のmiRNAの特異的なフォワードプライマーおよび普遍的なリバースプライマーで増幅した。(B) リアルタイム PCR プライマー設計。Stu-miR160およびStu-miR165/166のフォワードおよびリバースプライマーを示す。フォワードプライマーはmiRNA配列に基づいて設計されたが、設計されたステムループ逆転写プライマーと重なる配列は含まれなかった。長さ、溶融温度、およびGC含有量を調整するために、フォワードプライマーの5'に3-7-nt拡張が追加されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
STTM設計をPVXベクターに組み込むことにより、ジャガイモ中の内因性miRNAの機能を特徴づけるためのPVXベースのmiRNAサイレンシングシステムを紹介する。VbMSシステムは、植物種全体で保存度の高いmiRNAファミリーであるジャガイモ中のmiRNA165/166をサイレンシングするのに有効であることが判明した。
TMアプローチは、miRNA相補配列内の期待される切断部位にミスマッチループを作成するように設計された人工miRNA標的模倣に基づくmiRNAの発現を妨害するように開発されており、標的miRNAの隔離とその活性の停止22,35,78,79.TM分子と標的miRNAとの組み合わせは、特異的miRNAまたはmiRNAファミリーのレベルをノックダウンすることによってmiRNAの機能を遮断し、標的mRNAのアップレギュレーションにつながります。内因性miRNA標的模倣(eTM)79,80を含むmiRNAのサイレンシングのためにいくつかのTM技術が開発されている。 eTMベースのmiRNA模倣(MM)35,78、短タンデム標的模倣(STTMs)22,53、タンパク質コード転写物の3'UTRに統合されたTMを持つmiRNAおとりアプローチ81、および標的miRNA(cmSPs)に対する2つの中心的なミスマッチを有するmiRNA結合部位を含むmiRNA SPESTTMは、経験的に最適化された48-ntスペーサーによってリンクされた3-ntミスマッチバルジを有する2つのmiRNA結合部位で構成される。STTMは、標的miRNA22,53の効率的な阻害を引き起こす。最近、モデル植物であるシロイヌナズナのmiRNAや米やトウモロコシなどの主要作物のmiRNAの大規模な機能解析に、STTM技術が応用されています。これは、収量とホルモン制御に関与するいくつかの内因性miRNAの前例のない役割の発見につながりました, 作物の繁殖を改善する上で大きな約束を保持しています47.STTM設計のこれらの利点に基づいて、我々はSTTMを選び、ジャガイモのmiRNAの機能的特徴付けのためにPVXベクトルに統合した。cmSP、MMs、およびSTTMsなどのTM分子の様々な設計は、異なるmiRNA82の機能を遮断する際に可変的な有効性を有することは注目に値する。したがって、さまざまなTM設計戦略を使用すると、より効果的なmiRNA抑制を達成するのに役立つ可能性があります。一致しない膨らみの長さおよび配列コンテキスト、ならびにmiRNA結合部位に隣接するヌクレオチド変化は、特定のmiRNAサイレンシング結果22、36、38、78、83に対して最適化する必要がある場合があります。さらに、実験分析と共に計算予測の指導の下でTM分子を設計することは、おそらくmiRNAAs84のより信頼性の高い阻害につながるだろう。
PVXベースのVIGSシステムは、二倍および培養された四価ソラナム種の両方でRNAサイレンシングを引き起こすのに有効であることを示した。PVXベースの全身サイレンシングは、数サイクルにわたって、インビトロで増殖したジャガイモ植物の葉面組織全体に誘導され、維持され、インビトロで生成されたマイクロチュバー85です。我々は最近、PVXベースのVIGSシステムがアンシラ、アランパイロット、マリウスバード、セラナ86などのいくつかのテトラボイドポテト品種で関心のある遺伝子を沈黙させることができると報告している。PVXベースのVbMS効果がジャガイモの栄養伝播を通じて数世代にわたって伝達され持続できるかどうかはまだ決まっていない。TM分子をポテト植物に安定して導入するトランスジェニックアプローチは、その後の世代で目的のmiRNAのサイレンシング効果を維持する必要がある場合に、依然として推奨される。
ジャガイモの成長と開発に関与する多数のmiRNAが同定されている。RNA-seq、ゲノムシーケンシング、およびバイオインフォマティクス予測は、miRNAとその目標の同定を大いに促進しています17,19,20,21。これまでに、二重単数S.ヌグレヤグループPhurejaクローンDM1-3、野生の二倍化種S.コマーソニ、S.chacoense87,88,89のディプロイド近親交配クローンM6を含む3つのジャガイモゲノムが配列決定されている。TM技術を用いたほとんどの場合、最新の場合、限られた数のポテトmiRNAのみが機能的に特徴付けられています。例えば、FLOWERING LOCUS T(FT)ホモログSP6Aは、ジャガイモの結核を制御する移動シグナルとして機能し、miRNAによって標的とされ、SP6A(SES)の発現を抑制し、SP6A転写物90,91の熱誘発切断を媒介する。StTM媒介性SESの過剰発現は、SES miRNAの活性を遮断し、連続熱条件下でも結核を促進する91。miR160のノックダウンは、免疫応答に関与するmiRNAであり、eTMアプローチによって、miR160が、potato92におけるフィトフトーラの出没に対する局所および全身的獲得抵抗の両方に必要であることを示した。
バイオインフォマティクスを用いて、ジャガイモおよびトマト中のヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピート(NLR)免疫受容体を標的とするmiRNAの8つのユニークなファミリーを同定した。miRNAファミリーの1つであるmiR482/2118は、様々な病原体に対する耐性を与えるいくつかのNlRを標的とし、STTM構造のトランスジェニック発現によって媒介されるmiRNAmiRNAの抑制は、P.出出虫およびシュードモナス注射器13に対するトマトの耐性を高めることにつながる。増加する証拠は、病原体と宿主で産生される小さなRNAが2つの生物の間を移動し、クロス王国RNA干渉によって媒介される互いの遺伝子発現を抑制できることを示唆している94,95,96,97。例えば、オオミセテ病原体由来のsRNAの標的模倣は、これらの侵入sRNAを清掃し、病原体感染を減少させることができる61。本VbMSシステムを用いて、植物の抵抗性を向上させるために病原体由来のsRNAを標的とすることができるかどうかを調べることは興味深いだろう。
要約すると、ウイルスベースのmiRNAサイレンシングシステムは迅速かつ費用対効果が高く、ハイスループット形式で実行できます。PVXベースのVbMSシステムは、特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーおよび標的遺伝子の機能を決定するための効率的で堅牢な遺伝的ツールを提供します。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
PVX-LICベクターを提供してくれた清華大学のユレ・リュウ博士に感謝します。この研究は、テキサスA&MアグリライフリサーチとハッチプロジェクトTEX0-1-9675からUSDA国立食糧農業研究所からJSへのスタートアップファンドによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µM dATP and 100 µM dTTP | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA | TQAC136 | |
| 3 M Sodium acetate, pH 4.0. | Teknova, Hollister, CA 95023, USA | #S0297 | |
| Acetosyringone | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D2666-25G | |
| Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105. | |||
| Chloroform | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0757-950ML | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D0798-25G | |
| DTT | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0281-25G | |
| E. coli DB3.1 | for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene | ||
| E. coli DH5α | for the destination constructs generated by LIC cloning | ||
| Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed | ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA | G99260 | |
| High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA |
7958960001 | |
| Isoamyl alcohol | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0944-1L | |
| Koptec Pure Ethanol – 200 Proof | Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA | V1005M | |
| MES | TCI America, Portland, OR 97203, USA | M0606-250G | |
| MgCl2 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | MFCD00149781 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0253L | |
| Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | ND-ONEC-W | |
| PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System | Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA | 170-9703 | |
| PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro | Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA | 950030010 | |
| pH meter | Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA | Benchtop pH / mV Meter - 860031 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0883-400ML | |
| Phytagel: Gellan Gum | Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA | J63423-A1 | |
| PVX VIGS vector: PVX-LIC | Zhao et al., 2016 | ||
| Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | 4485697 | |
| Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA |
7959389001 | |
| Restriction enzyme: SmaI | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | R0141S | |
| Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix | Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA | 95107-100 | |
| RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA | SKU: D3485-01 | |
| RNase Inhibitor Murine | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0314L | |
| RNAzol RT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA | R4533 | |
| Soil: Metro-Mix 360 | Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA | Metro-Mix 360 | |
| T4 DNA polymerase and buffer | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0203S |
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