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감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

Abstract

바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 식물에서 microRNAs(miRNAs)의 기능적 특성화를 위한 신속하고 효율적인 도구입니다. VbMS 시스템은 니코티아나 벤타미안, 토마토, 아라비도시스, 면, 밀과 옥수수 와 같은 모노코트 식물 등 다양한 식물종에 개발 및 적용되었습니다. 여기에서는 PVX 기반 VbMS 벡터를 사용하여 감자내생 내성 miRNAs를 침묵시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 특정 miRNA의 발현을 무너뜨리기 위해, 관심 있는 miRNA의 표적 모방(TM) 분자는 설계되고, 식물 바이러스 벡터에 통합되고, Agrobacterium 침투에 의해 감자에 발현되어 내인성 miRNA에 직접 결합하고 그 기능을 차단한다.

Introduction

식물 microRNAs (miRNAs)는 20-24 뉴클레오티드 길이의 핵 으로 인코딩 된 규제 RNAs1로 특징 지어지며 성장 및 개발, 광합성 및 신진 대사4,5,6,7, 호르몬 합성 및 신호 8,9, 생물학적 반응 10, 생물학적 및 생물학적 반응을 포함하여 식물 생물학적 과정의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을합니다. 11,12,13, 영양 및 에너지 조절14,15. 식물 miRNA의 규제 역할은 잘 프로그래밍되고 대상 mRNA를 분개하거나 번역하여 전사 후 수준에서 일반적으로 충족됩니다.

감자 16,17,18,19,20,21에서 miRNAs의 식별, 전사 프로파일링 및 표적 예측을 향한 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 감자를 포함한 식물에서 miRNAs의 기능적 특성화는 효율적이고 높은 처리량 유전 적 접근법의 부족으로 인해 다른 유기체보다 뒤쳐졌습니다. 대부분의 miRNAs는 상당한 유전 중복을 가진 가족에 속하기 때문에, 기능 분석의 표준 손실에 의해 개별 miRNA의 기능 분석을 수행하는 것은 도전적입니다222. 또한, 단일 miRNA는 다중 표적 유전자23 및 여러 상이한 miRNA를 제어할 수 있어 동일한 분자 경로를 공동으로 조절할 수 있다24,25. 이러한 특성은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 특성화하기 어렵게 만듭니다.

miRNAs의 기능 적 분석의 대부분은 명백한 한계가있는 기능의 이득 접근 방식에 크게 의존했습니다. 상기 인공 miRNA(amiRNA) 방법은 내인성 1차 성적증명서(pri-miRNAs)를 높은 수준에서 생성하여 표적 유전자 발현의 억제로 이어집니다26,27,28,29. 그러나, 강력한 구성 35S 프로모터를 이용한 활성화 태깅 및 miRNA 과발현은 종종 생체 내 조건을 대표하지 않는 miRNAs의 고조된 발현으로 이어지므로 miRNAs30의 내인성 기능을 반영하지 않을 수 있다. 결합 및/또는 분열 부위에 항만 돌연변이를 포함하는 미RNA 내성 형태의 표적 유전자의 발현을 포함하는 대안적인 접근법이 개발되었다31,32,33. 그러나 이 접근법은 또한 잠재적으로 형질화 성 유물로 인해 miRNA 내성 표적 트랜스진에서 파생된 표현형의 오해를 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 기능 의 이득 연구에서 결론주의34 그려야 한다. 위에서 설명한 접근 방식의 또 다른 주요 제한사항은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 변환이 필요하다는 것입니다. 또한, 트랜스진 의존성 접근법은 변성 식물 종에 거의 적용되지 않습니다. 따라서 miRNAs의 기능을 해명하기 위해 빠르고 효율적인 기능 상실 접근 법을 개발하는 것이 필수적입니다.

변환 절차의 전제 조건인 바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 표적 모방(TM) 전략을 바이러스 유래 벡터와 결합하여 확립되었다. VbMS 시스템에서 인공 적으로 설계된 TM 분자는 바이러스 백본에서 일시적으로 발현되어 강력한 고처리량 및 시간 절약 도구를 제공하여 식물 내인성 miRNAs35,36의 기능을 해부합니다. VbMS는 처음에 N에서 개발되었습니다. 담배 딸랑이 바이러스(TRV)35,36,37 을 사용한 벤타미안과 토마토는 감자 X(PVX)38, 면잎 구겨진 바이러스(ClCrV)39, 오이 모자이크 바이러스(CMV)40,412,CWM바이러스(CMV)를 포함한 다양한 바이러스 발현 시스템을 사용하여 아라비도시스, 면, 밀 및 옥수수로 확장되었습니다. , 보리 스트라이프 모자이크 바이러스 (BSMV)44,45.

감자(Solanum tuberosum)는 영양가가 높고 에너지 생산량이 높고 입력 요건이 상대적으로 낮기 때문에 주로 세계에서 가장 중요한 식품 작물이자 가장 널리 재배된 비시리얼 작물입니다. 감자의 몇 가지 특징은 매력적인 이질 모델 식물을 만든다. 그것은 높은 횡단 속도 식물성 전파 폴리 플로이드 작물, 이종성, 유전 적 다양성. 그러나 현재까지 VbMS를 사용하여 감자에서 miRNAs의 기능을 특성화하는 보고서는 없습니다. 여기서는 감자 식물38에서 miRNAs의 기능을 평가하기 위해 리그션 독립적 복제(LIC) 조정 된 감자 PVX 기반 VbMS 접근 방식을 제시합니다. miR165/166 제품군과 대상 mRNA 및 클래스 III 동종 도메인/Leu zipper(HD-ZIP III) 전사 요인이 광범위하게 특징지어졌기 때문에 VbMS 분석방법을 설명하기 위해 miR165/166 제품군을 선택했습니다222,47,48. HD-ZIP III 유전자는 메리스템 발달 및 장기 극성의 주요 조절제이며, miR165/166 기능의 억제는 HD-ZIP III 유전자의 발현이 증가하여 잎 극성의 감소된 어포형 지배력 및 비정상적인 패턴과 같은 흉부 발달 결함의 결과로 22,35,411 . miRNA165/166의 침묵과 상관관계가 있는 쉽게 접할 수 있는 발달 표현형은 PVX 기반 VbMS 분석의 효과를 정확하게 평가할 수 있게 해주다.

이 연구에서는 PVX 기반 VbMS 시스템이 감자에서 miRNAs의 기능을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여줍니다. PVX 기반 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 시스템은 다수의 감자 품종에 설치되어 있기 때문에49,50,51,52, 이 PVX 기반 VbMS 접근법은 광범위한 디플로이드 및 테트라피드 감자 종에 적용될 가능성이 있다.

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Protocol

1. 감자 식물을 성장.

  1. 무라시게와 스쿠그(MS) 미디어와 감보르그 비타민(MS 기저염 혼합물, 감보리의 비타민, 30g/L 수당, 3.5g/L agar, pH = 5.7)을 함유한 배양 튜브(25 x 150mm)에 체외 감자 식물을 전파합니다. 20-22°C, 16h 라이트/8h 다크 포토기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 성장실에 튜브를 놓습니다.
    참고 : 새로운 싹과 뿌리는 일반적으로 식물에서 1-2 주에 개발됩니다. 매달 신선한 MS/감보르그의 비타민 미디어를 통해 식물을 전파합니다.
  2. 4주 후, 체외 식물을 토양으로 이식하고 20-22°C, 16h 빛/8h 어두운 광기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 온실에서 자랍니다.
    참고: 새로 발달된 뿌리와 잎이 있는 식물은 이식에 적합합니다. 처음 3-4 일 동안 갓 이식 된 식물에 대한 수분을 유지합니다.

2. VbMS 벡터를 구성합니다.

  1. 짧은 탠덤 TM 분자(STTM, 도 1)22,53을 설계 및 복제하여 관심 있는 miRNA에 대해.
    참고: 실험 데이터 또는 miRbase 데이터베이스54,55,56,57,58,59를 기반으로 miRNA 서열을 획득합니다. 이 연구에서 사용되는 miR166 서열은 이전에 설명되었다60.
    1. TM 모듈을 miRNA의 10-11뉴클레오티드에 대응하는 부위에 miRNA의 역형 체열에 일반적으로 5'-CTA-3'을 삽입하여 TM 모듈을 설계한다.
      참고: 예를 들어, Stu-miR160 서열은 5'-UGUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61이며, 여기서 10-11번째 뉴클레오티드가 굵게 있다. 역보체 서열(탈옥뉴클레오티드)은 5'-GGCATACAGAGCCAGCA-3'이며 불일치 벌지 삽입 부위는 굵게 표시됩니다. TM 분자 서열(탈옥핵증)은 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'이어야 한다.
    2. STTM 조각을 복제하기 위한 리머를 디자인합니다(그림 1). 48nt 스페이서 서열과 함께 DNA 올리고뉴클레오티드를 PCR 복제를 위한 템플릿으로 사용하십시오. 포워드 프라이머는 LIC1 링커(5'-CgACgACAAGACCgT-3'), TM 분자용으로 설계된 위의 전방 서열, 48nt 스페이서(5'-GTTGTTGTTTATGGT-3')의 부분 5' 서열로 구성된다. 역프라이머는 LIC2 링커(5'gAgAgAgCCgT-3'), TM 분자의 역형 보체 서열, 48nt 스페이서(5'-ATTCTTCTTTTAGACCAT-3')의 3'시퀀스에 대한 부분역 보체로 구성된다.
      참고: 48nt 스페이서 시퀀스는 5'-GTTGTTGTTATTTCTAATTCTAATTCTAATTCTAAA아가AT-3'입니다. 예를 들어, STTM-miR160의 경우, 포워드 프라이머는 5'-CgACgACAAGACCgT-GGCATACAGGG-CTA-GAGCCAGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'이어야 한다. 역프라이머는 5'-gAgAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CTGTATGCC-ATTCTCTTCTTTAGACCAT-3'(그림 1)이어야 한다.
    3. 합성된 범블 48nt 스페이서를 템플릿및 높은 충실도 DNA 폴리머라아제로서 합성된 범용 48nt 스페이서를 사용하여 PCR에 의해 50 μL의 부피로 STTM 단편을 증폭시한다.
      1. 각 프라이머(40 μM), 48nt 스페이서 올리고(40 μM), 10x PCR 버퍼의 5μL, 5μL을 혼합하여 PCR 반응을 설정, dNTP 혼합물(각 10mM), 고충실도 DNA 폴리머라제(10U/μL)의 0.1 μL, ddH2O의 43μL은 총 50μL의 부피로 표준 PCR 증폭을 수행합니다. 94°C 3분, 94°C의 32사이클은 45s, 60°C는 45s, 72°C는 60초용.
    4. 에탄올 강수량에 의해 STTM 조각을 정화합니다. PCR 제품에 2.5권의 에탄올과 1/10 부피를 3M 아세테이트(pH = 4.0)를 추가합니다. 14,000 x g 에서 10분 간 활발하게 원심분리기를 섞습니다. 상체를 제거하고 70 % 에탄올의 1 mL로 펠릿을 헹구십시오. 펠릿을 건조시키고 ddH2O의 20 μL로 녹입니다.
      참고: DNA 전기전도를 사용하여 STTM PCR 제품의 증폭을 확인합니다.
    5. 정제된 STTM PCR 제품의 2.5 μL, 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼의 0.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.05 μL 의 1 M 디티오트리톨 (DTT), 0.25 μL 100 mM dATP, T4 DNA 폴리머라제의 0.1 μL (3 U/μL), 및 ddH2O의 1.6 μL은 총 부피 5 μL. 37 °C에서 혼합물을 37°C에서 배양합니다. T4 DNA 폴리머라아제의 비활성화를 위해 제품을 75°C에서 20분 동안 치료한다.
  2. PVX 기반 VbMS 구조를 준비합니다.
    1. 100 μL의 부피에서 2.5 μL의 SmaI (20 U/μL)를 가진 PVX-LIC 플라스미드38의 5 μg를 소화합니다.
    2. 페놀:클로로폼:이소프로파놀(25:24:1, pH = 6.7/8.0)을 소화된 PVX-LIC 제품에 동일한 볼륨을 추가하고 격렬하게 혼합합니다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상체부를 새로운 원심분리기 튜브로 옮긴다. 동일한 부피의 클로로폼을 추가: isopropanol (24:1) 적극적으로 소용돌이. 10 분 동안 14,000 x g 에서 원심 분리기.
      참고: PVX-LIC 벡터는 복제를 위해 LIC 카세트를 항구합니다. PVX-LIC 벡터의 LIC 카세트는 ccdB 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하고 있으며, 가나마이신(50 μg/L) 및 클로람페니콜(15 μg/L)을 함유하는 LB 배지를 사용하여 대장균 DB3.1에서 유지/전파될 필요가 있다.
    3. 새로운 원심분리기 튜브로 상체를 옮는다. 에탄올 2.5부와 아세테이트 1/10부(pH = 4.0)를 넣고 적극적으로 섞는다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다.
    4. 펠릿을 70% 에탄올과 소용돌이의 1mL로 강하게 헹구세요. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다. 펠릿을 건조시키고 소화된 PVX-LIC 플라스미드를 ddH2O 100 μL로 녹입니다.
    5. 소화된 PVX-LIC 벡터 DNA의 2.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.5 μL 의 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼, 0.05 μL 1 M DTT, 0.25 μL 100 mM dTTP, T4 DNA 폴리머라제 (3 U/μL)의 0.1 μL은 총 부피5 μL에서 혼합물을 37 °C에서 15 분 동안 37 °C로 배양하고 25 분에서 치료하는 데 20 분 T4 DNA 폴리머라아제비활성화.
  3. STTM 시퀀스를 LIC 반응을 사용하여 PVX-LIC 벡터로 복제합니다. T4 DNA 폴리머라제 처리 STTM PCR 제품(5 μL)과 T4 DNA 폴리머라제 처리 PVX-LIC 플라스미드(5 μL)를 혼합한다. 70°C에서 5분간 배양하고, 0.1°C/s의 경사로에서 22°C까지 식히고, PCR 기계를 사용하여 30분 동안 22°C로 보관하십시오.
    참고: LIC 복제의 높은 효율을 달성하기 위해 잠복기 시간을 4°C에서 하룻밤로 연장합니다.
  4. LIC 반응 제품의 5 μL을 대장균 DH5α로 변환하고 50 μg/mL kanamycin62,63을 포함하는 LB 플레이트에서 성장한다. PVX-LIC 벡터에 대한 복제 프라이머및 범용 프라이머로 PCR에 의해 양수 콜로니를 선택하고 검증한 다음 시퀀싱합니다.
    1. 양성 클론을 식별하기 위해 STTM 복제용 역 프라이머와 함께 PVX-LIC(5'GTTGGCTTGCAACTAGAT-3')의 포워드 프라이머로 콜로니 PCR을 수행합니다. PCR 대역의 크기는 ~300 bp여야 합니다.
      참고: 종료기 주기 시퀀싱64,65에 의해 STTM 조각의 시퀀스를 확인합니다.
  5. 검증된 클론으로부터 PVX-STTM 플라스미드를 분리하여 그로박테리움 균주 GV3101, GV2260 또는 EHA10562,63으로 변환합니다. PCR에 의해 아그로박테리움 식민지를 확인합니다.
    참고: PVX-LIC의 전방 프라이머와 STTM 복제를 위한 역 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 아그로박테리움 콜로니를 확인합니다.

3. 감자 식물에서 PVX 기반 VbMS 분석 작업을 수행합니다.

  1. 체외 감자 식물을 토양으로 이식합니다. 이식된 식물은 3-4일 후에 VbMS 분석의 대상이 됩니다.
  2. PVX-STTM 플라스미드를 함유한 아그로박테리움 을 함유한 감자 식물을 접종한다.
    참고: 감자의 VbMS 분석의 경우 , 아그로박테리움 매개 침투 및 이쑤시개 긁힘 접종이 동시에 수행됩니다.
    1. 50 μg/mL 카나마이신 및 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 액체 LB의 50mL로 PVX-STTM 벡터를 포함하는 양성 변압제를 선택하고 접종합니다. OD600 = 1.0까지 16 시간 동안 220 rpm에서 28 °C 인큐베이터에서 성장합니다.
    2. 동시에, 양성 아그로박테리움 콜로니를 50 μg/mL 카나마이신 과 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 적어도 2개의 새로운 LB 플레이트에 줄이며 1일 동안 28°C에서 자랍니다. PVX-LIC38,66 벡터를 대조군으로 포함시키고 PVX-GFP67,68을 모니터링하여 바이러스 확산을 모니터링한다.
    3. Agrobacterium 액체 배양을 원심분리로 3,400 x g에서 실온에서 10분 동안 수집합니다. 침투 완충제(10m MgCl2, 10mM MES 및 200 μM 아세토시링곤, pH = 5.6)의 동일한 부피로 아그로박테리움 세포를 재차 중단하고 OD600 = 1.0으로 조정한다. 6 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
    4. 1 mL 바늘없는 주사기로 완전히 확장 된 잎의 축축 측에 Agrobacterium 문화에 침투하십시오.
      1. 한 손으로 잎을 뒤집어 들고 한 손가락을 사용하여 침투 부위의 adaxial 측에서 잎 라미나를 지원합니다. 주사기를 다른 손으로 잎 표면에 수직으로 유지하고 Agrobacterium 문화에 침투하여 라미나의 축축한 면으로 침투합니다.
    5. LB 플레이트에서 Agrobacterium 배양을 긁어 내고 이쑤시개를 가진 침투 된 감자 식물의 첫 번째 하나 또는 두 개의 상호 노드의 줄기 표면을 긁습니다. 줄기의 표피를 부드럽게 긁습니다. 식물에 심각한 손상을 일으킬 수있는 줄기를 관통하지 마십시오.
  3. 16h 빛/8h 어두운 광기간과 온실에서 120 μmol/m2∙ s1 의 광강도로 22°C에서 침투된 식물을 성장시다.
    참고: miRNA 침묵으로 인한 표현형은 일반적으로 2-4주 후 접종에 나타납니다(그림 2, 그림 3). VbMS 표현형이 침투 후 나타나는 데 는 일반적으로 10-20 일이 걸립니다. VbMS 표현형은 특정 miRNA 및 표적 유전자, 성장 조건 및 감자 품종의 특성에 달려 있습니다.

4. 식 분석을 수행합니다.

  1. 표현형이 2-4주 후 접종에 나타나면 VbMS 식물의 현상형과 가위를 가진 대조군 식물의 피노타입이 있는 사격, 잎, 꽃 또는 뿌리와 같은 조직을 수집합니다. 수집된 조직에서 총 RNA를 분리합니다.
  2. 전기전도62,63에 의한 RNA 품질을 확인하고 분광광계로 OD260 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량화한다.
  3. 줄기 루프 실시간 역전사 PCR(RT-PCR)을 사용하여 miRNA 발현을 분석한다.
    1. 특정 miRNAs의 경우 줄기 루프 역전사 프라이머를 디자인합니다. 줄기 루프 RT 프라이머는 보편적 인 5 '백본과 특정 miRNA의 3'6 nt 확장을 포함합니다. 줄기 루프 구조를 형성하는 5'- GTCTCTGGTGGGGAgggtgggtgtattcGCACCAGAGGAGAC-3')를 설계합니다. (대문자는 역반복 시퀀스와 루프 영역에 대한 소문자에 해당한다).
    2. 루프를 형성하는 5' 백본 서열의 일부는 후속 PCR 증폭을 위한 역프라이머 역할을 한다(백본 서열에서 굵은 기울임꼴 시퀀스). 줄기 루프 프라이머에 관심 있는 miRNA의 3'말에 역보완적 인 6 nt 확장 서열을 추가하여 역전사에 대한 특이성을 제공합니다(보충 도 1A).
      참고: 첸 외.69 및 에리카 바르코니-가스 외.70,71,72에 의해 설명된 바와 같이 줄기 루프 역 전사 프라이머를 설계한다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'로 설계되었습니다. 감자 miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtgtattcGCACCAGAGGAGACGGGGGG(A/G)A-3'로 설계되었습니다. (굵은 대문자 시퀀스는 특정 miRNA에 대한 역 전사의 특이성을 제공합니다).
    3. 총 RNA의 50-200 ng를 혼합하여 역전사 반응을 설정, 줄기 루프 역전사 프라이머(100 μM), 10x 버퍼의 2μL, RNase 억제제의 0.2 μL(40 U/μL), dNTP의 0.25 μL(각 10mM), 그리고 얼음 에 대한 역전사 1μL(200 U/μL)의 1μL. 20 μL의 총 부피에 뉴클레아제 없는 ddH2O를 추가합니다.
    4. 펄스 역 전사 절차를 사용하여 역전사를 수행합니다. 역전사 반응 혼합물을 16°C에서 30분 동안 배양하고, 30초동안 30°C, 30s용 42°C, 1초에 대해 50°C의 온도 주기를 수행하고, 총 60사이클동안, 5분 동안 85°C에서 배양하여 역전사를 비활성화한다.
    5. miRNA 발현의 실시간 PCR 분석을 위해 miRNA 서열을 기반으로 전방 프라이머를 설계하지만 위에서 설계된 줄기 루프 역전사 프라이머와 겹치는 서열을 포함하지 않는다. 길이, 용융 온도 및 GC 콘텐츠를 최적화하기 위해 전방 프라이머의 5'에 3-7nt 확장을 추가합니다(보충 도 1).
      참고 : 보편적 인 역 프라이머는 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'입니다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'로 설계되었습니다. miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTCGGACCACCAGGCTT-3'입니다. 굵은 시퀀스는 프라이머 최적화를 위한 5' 확장 역할을 합니다. miRNA용 줄기 루프 역전사 프라이머 및 실시간 PCR 프라이머는 miRNA 프라이머 디자인 Tool73을 사용하여 설계할 수 있다.
  4. 표준 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 대상 mRNA의 cDNA를 합성합니다. 역전사 반응 혼합물을 37°C에서 60분 동안 배양하고 5분 동안 85°C로 가열하여 역전사를 비활성화한다.
    참고: (1) 표적 mRNA가 알려지지 않은 경우 psRNATarget program74 를 사용하여 표적 mRNAs를 예측한다. (2) mRNA를 위한 보편적인 역전사 프라이머는 고정된 프라이머 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'이다.
  5. 관심있는 miRNA와 대상 mRNAs 모두에 대한 실시간 PCR 반응을 설정합니다. 템플릿 cDNA의 0.5 μL, 2배 실시간 PCR 버퍼 5μL, 각 전방 및 역 프라이머(40 μM)의 0.05 μL, ddH2O의 4.4 μL을 얼음에 5μL의 총 부피로 혼합합니다.
  6. 3 분 동안 95 °C에서 배양하고, 30 s용 95 °C의 40 사이클과 60 °C에서 30 초동안 배양하십시오. 다음과 같이 후속 용융 곡선 해석을 수행 : 15 초에 대한 95 °C에서 인큐베이션, 20 °C / s의 경사로에서 60 °C로 냉각, 60 s에 대한 60 °C에서 유지, 0.2 ° C /s의 경사로에서 95 °C에 가열, 15 s에 대한 95 °C에서 유지. ΔΔCt 메서드76,77을 사용하여 Ct 값을 분석하고 표준 오류로 수단을 플롯합니다.
    참고: (1) 대상 mRNA용 실시간 PCR 프라이머는 설명된 것으로 설계될 수 있다75. (2) 감자 폴리비퀴틴 10 유전자는 감자의 정상화를 위한 내부 통제역할을 할 수 있다. 감자 폴리우비퀴틴 10 유전자의 포워드 프라이머는 5'-ATGTTGCCTTGTGTGTGTGTTTGTTG-3'과 역프라이머 5'-TTATTATTCACATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGTTCAACC-3'이다. (3) 실시간 PCR 분석의 경우, 오염 및 프라이머-디머 형성은 거짓 양성 결과를 생성할 수 있다. 비특이적 증폭을 모니터링하고 실시간 PCR 분석의 책임을 높이기 위해 실시간 PCR 분석용 템플릿 및 역전사 없이 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다.

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Representative Results

도 2 는 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 잎 조직의 자궁 내성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Katahdin)을 나타낸다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었다. 대조적으로, PVX 대조공장에서는 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VbMS 시스템이 테트라클로드 감자 식물에서 내인성 miRNA 기능을 억제하는 데 효과적이었으며 PVX-VbMS 시스템은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 결정하는 견고한 유전 적 도구였다는 것을 보여준다.

도 3 은 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 자궁외 잎 조직 성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Russet Burbank)을 나타낸다. 이러한 결과는 PVX-VbMS 시스템이 주요 감자 품종을 포함한 다른 감자 종에 적용될 수 있음을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: PVX 기반 VbMS 벡터 및 PVX-STTM165/166 구조의 회로도도. LB = T-DNA 왼쪽 테두리; RB = T-DNA 오른쪽 테두리; 35S = 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터; NOST = 노팔린 신타제 터미네이터; RdRP = RNA 의존RNA 폴리머라제; TGB1 = 트리플 유전자 블록 단백질 1; TGB2 = 트리플 유전자 블록 단백질 2; TGB3 = 트리플 유전자 블록 단백질 3; sgP = PVX 체증 RNA 프로모터; CP = 코트 단백질; LIC 카세트 = 결찰 독립적 복제 카세트; 48 nt = 48 뉴클레오티드 불완전한 줄기 루프 링커. STTM165/166은 48nt 불완전한 스템 루프 링커 시퀀스로 구분된 miR165/166의 탠덤 TM 시퀀스로 구성됩니다. PVX-LIC 벡터내의 녹색 화살촉은 STTM 서열을 수용하는 PVX 지하유전체 RNA의 시작 부위를 나타낸다. miRNA 서열에서 삼중 마이너스 하이픈은 분열 부위를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 테트라클로이드 감자 품종 카타딘에서 miR165/166의 VbMS. PVX 벡터 제어 또는 PVX-STTM165/166을 발현하는 감자 식물(Katahdin)의 표현형. 마젠타 화살표는 잎 정맥에서 국어로 생성된 잎 구조를 나타냅니다. 주황색 화살촉은 나팔모양의 잎 구조를 나타냅니다. 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 테트라클로드 감자 품종 러셋 버뱅크에서 miR165/166의 VbMS. PVX 벡터를 제어 또는 PVX-STTM165/166으로 표현하는 감자 식물(Russet Burbank)의 표현형. 마젠타 화살표는 잎 정맥에서 국어로 생성된 잎 구조를 나타냅니다. 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: miRNAs 및 실시간 PCR 프라이머 디자인의 줄기 루프 RT-PCR 분석의 회로도 도표. (A) miRNAs의 줄기 루프 RT-PCR 분석. 역전사 동안, 3'miRNA에 줄기 루프 프라이머의 결합이 역전사및 cDNA를 합성했다. PCR 제품은 관심있는 miRNA및 보편적 인 역 프라이머의 특정 포워드 프라이머로 증폭되었다. (B) 실시간 PCR 프라이머 디자인. 스튜-miR160 및 스튜-miR165/166의 전방 및 역 프라이머가 표시됩니다. 전방 프라이머는 miRNA 서열을 기반으로 설계되었지만 설계된 줄기 루프 역전사 프라이머와 겹치는 서열을 포함하지 않았다. 길이, 용융 온도 및 GC 함량을 조정하기 위해 전방 프라이머의 5'에 3-7nt 확장이 추가되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

STTM 설계를 PVX 벡터에 통합하여 감자내성 miRNAs의 기능을 특성화하기 위해 PVX 기반 miRNA 침묵 시스템을 제시합니다. VbMS 시스템은 식물 종에 걸쳐 매우 보존 된 miRNA 가족인 감자에서 miRNA165/166을 침묵시키는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.

TM 접근법은 표적 miRNA의 격리 및 그 활동의 체포를 초래하는 miRNA 보충 서열 내의 예상 분열 부위에서 불일치 루프를 생성하도록 설계된 인공 miRNA 표적 모방에 기초하여 miRNAs의 발현을 방해하기 위해 개발되었습니다22,35,78,79 . TM 분자와 표적 miRNAs 사이의 페어링은 표적 mRNAs의 상향 조절으로 이어지는 특정 miRNA 또는 miRNA 가족의 수준을 쓰러뜨려 miRNAs의 기능을 차단합니다. 내인성 miRNA 표적 모방(eTM)79,80을 포함하여 여러 TM 기술이 miRNAs의 침묵을 위해 개발되었습니다. eTM 기반 miRNA 모방 (MiM)35,78, 짧은 탠덤 대상 모방 (StTM)22,53, 단백질 코딩 성적 증명서의 3'UTR에 통합 된 TM을 갖는 miRNA 미끼 접근법 81, 미RNA (cmSPs)를 대상으로 두 개의 중앙 불일치가있는 miRNA SPONGEs가 함유된 miRNA SPONGEs 82. STTM은 경험적으로 최적화된 48nt 스페이서에 의해 연결된 3nt 불일치 벌지를 가진 2개의 miRNA 결합 사이트로 이루어져 있습니다. STTM은 표적 miRNAs22,53의 효율적인 억제를 트리거합니다. STTM 기술은 최근 모델 식물 아라비도시스와 쌀, 옥수수 등 주요 작물의 miRNAs에 대한 대규모 기능 분석에 성공적으로 적용되었습니다. 이것은 수확량과 호르몬 통제에 관련된 몇몇 내인성 miRNAs의 전례없는 역할의 발견으로 이끌어 냈습니다, 작물 사육을 개선에 있는 큰 약속을 보유47. STTM 디자인의 장점을 바탕으로 STTM을 선택하고 감자에서 miRNAs의 기능적 특성화를 위해 PVX 벡터에 통합했습니다. CmSP, MIM 및 STTM과 같은 TM 분자의 다양한 설계는 다른 miRNAs82의 기능을 차단하는 데 가변적인 효능을 가지고 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 따라서 다양한 TM 설계 전략을 사용하면 보다 효과적인 miRNA 억제를 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미RNA 결합 부위에 인접한 뉴클레오티드 변경뿐만 아니라 타의 추종을 불허하는 부푼 것의 길이 및 서열 컨텍스트는 또한 특정 miRNA 침묵 결과에 최적화될 필요가 있을 수 있다22,36,38,78,83. 더욱이, 실험 분석과 함께 전산 예측의 지도하에 TM 분자의 설계는 아마 miRNAs84의 더 신뢰할 수 있는 억제로 이끌어 낼 것입니다.

PVX 기반 VIGS 시스템은 디플로이드와 재배된 테트라클로드 솔라눔 종 모두에서 RNA 침묵을 유발하는 데 효과적이라는 것을 보여주었다. PVX 기반 전신 침묵은 여러 사이클 및 시험관 내 생성된 microtubers85에 대한 시험관 내 전파 감자 식물에 폴리 조직 전체에 걸쳐 유도 및 유지된다85. 우리는 최근 PVX 기반의 VIGS 시스템이 안실라, 아란 파일럿, 마리우스 바드 및 세라나86과 같은 여러 테트라클로드 감자 품종에 대한 관심의 유전자를 침묵시킬 수 있다고 보고했습니다. PVX 기반 VbMS 효과가 감자의 식물 성 전파를 통해 여러 세대에 걸쳐 전달되고 지속될 수 있는지 여부를 결정해야 합니다. TM 분자를 감자 식물에 안정적으로 도입하는 트랜스제닉 접근법은 후속 세대에 miRNA의 침묵 효과를 유지해야 할 때 여전히 권장됩니다.

감자 의 성장과 개발에 관련된 수많은 miRNAs가 확인되었습니다. RNA-seq, 게놈 시퀀싱 및 생물정보학적 예측은 miRNAs 및 그들의 표적17,19,20,21의 식별을 크게 촉진했습니다. 지금까지, 세 감자 게놈은 두 배 단색 S. tuberosum 그룹 푸레자 클론 DM1-3, 야생 디플로이드 종 S. commersonii, 그리고 S. chacoense87,88,89의 디플로이드 근친교클 M6을 포함하여 3개의 감자 게놈이 시퀀싱되었습니다. 현재까지 제한된 수의 감자 miRNAs만이 TM 기술을 사용하여 기능적으로 특징지어졌습니다. 예를 들어, 꽃메뚜기 LOCUS T(FT) 호모로그 SP6A는 감자에서 결핵을 제어하는 모바일 신호로서 작용하고 miRNA에 의해 표적화되어 SP6A 전사의 열 유도 분열을 중재하는 SP6A(SES)의 발현을 억제한다90,91. StTM 매개 과발현은 SES miRNA의 활성을 차단하고 연속 열 조건하에서도 결핵을 용이하게 합니다91. 면역 반응에 관여하는 miR160의 녹다운, eTM 접근법에 의한 miR160은 감자92의 Phytophthora 감염에 대한 국소 및 전신 획득 저항 모두에서 miR160이 요구된다는 것을 보여주었습니다.

생물포지학적 접근법을 이용하여, 감자와 토마토에서 뉴클레오티드 결합 부위 류신이 풍부한 반복(NLR) 면역 수용체를 표적으로 하는 miRNAs의 8개의 독특한 패밀리가 확인되었다. miRNA 가족 중 하나인 miR482/2118은 다양한 병원균에 대한 저항을 부여하고 STTM 구조물의 형질전환 발현에 의해 매개되는 miR482/2118 가족 miRNAs의 억제를 부여하는 여러 NlR을 대상으로 하여 P. 인페탄과 슈돔오나스 시알리에 대한 토마토의 강화된 저항을 이끕다. 증가된 기록은 병원체와 호스트에서 생성된 작은 RNA가 두 유기체 사이를 여행하고 크로스 킹덤 RNA 간섭에 의해 중재된 서로의 유전자 발현을 억제할 수 있다는 것을 건의합니다94,95,96,97. 예를 들어, 오미세테 병원균 유래 sRNAs의 표적 모방은 이러한 침입 sRNA를 청소하고 병원균 감염을 감소시킬 수 있다61. 현재 VbMS 시스템이 식물의 저항을 개선하기 위해 병원균 유래 sRNA를 대상으로 사용할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 흥미로운 것입니다.

요약하자면 바이러스 기반 miRNA 침묵 시스템은 신속하고 비용 효율적이며 높은 처리량 형식으로 수행될 수 있습니다. PVX 기반 VbMS 시스템은 특정 miRNAs 또는 miRNA 제품군 및 표적 유전자의 기능을 결정하는 효율적이고 강력한 유전 도구를 제공합니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

우리는 PVX-LIC 벡터를 제공한 칭화 대학의 율류 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A&M 농업 연구및 미국 농무부(USDA) 국립 식품 농업 연구소에서 JS에 이르기까지 해치 프로젝트 TEX0-1-9675의 스타트업 펀드에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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환경과학 문제 159 바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS) 감자 바이러스 X(PVX) 마이크로RNA(miRNA) 표적 모방(TM) 짧은 탠덤 표적 모방(STTM) 솔라눔 튜닝로섬
감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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