Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

П. аэругиноза Зараженная 3D сокультура бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов при воздушно-жидком интерфейсе для доклинической оценки антиинфекционных элементов

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61069
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 4, 3, 1, 1, 1,2
1Department of Drug Delivery, Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), 2Department of Pharmacy, Saarland University, 3Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Department of Internal Medicine V - Pulmonology, Allergology, Respiratory Intensive Care Medicine, Saarland University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем протокол для трехмерной модели совместной культуры инфицированных дыхательных путей, с использованием CFBE41o- клеток, макрофагов THP-1 и Pseudomonas aeruginosa, установленной на воздушно-жидком интерфейсе. Эта модель предоставляет новую платформу для одновременного тестирования эффективности антибиотиков, функции эпителиального барьера и воспалительных маркеров.

Abstract

FDrug исследования для лечения легочных инфекций прогрессирует в направлении прогностических в пробирке модели высокой сложности. Многогранное присутствие бактерий в моделях легких может пере адаптировать эпителиальное расположение, в то время как иммунные клетки координируют воспалительный ответ против бактерий в микросреде. В то время как in vivo модели были выбор для тестирования новых анти-инфекционных в контексте муковисцидоза, они до сих пор не точно имитировать in vivo условия таких заболеваний у людей и результаты лечения. Сложные в пробирке модели инфицированных дыхательных путей на основе клеток человека (бронхиальные эпителиальные и макрофаги) и соответствующие патогенные микроорганизмы могли бы преодолеть этот разрыв и облегчить перевод новых противоинфекционных средств в клинику. Для этих целей была создана модель совместной культуры человеческого муковисцидоза бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o- и макрофагов THP-1, полученных из моноцитов, имитирующих инфекцию человеческой бронхиальной слизистой P. aeruginosa в условиях воздушно-жидкого интерфейса (АЛИ). Эта модель настроена в течение семи дней, и одновременно оцениваются следующие параметры: целостность эпителиального барьера, трансмиграция макрофага, выживание бактерий и воспаление. Настоящий протокол описывает надежную и воспроизводимую систему оценки эффективности лекарств и реакции хозяев, которая может иметь отношение к обнаружению новых противоинфекционных препаратов и оптимизации их доставки аэрозолей в легкие.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa является соответствующим патогеном в муковисцидоз (CF), который способствует нарушению легочной ткани1. Производство полисахаридов, таких как альгинат и другие слизистые экзополисахариды, координирует прогресс заболевания, что приводит к цепкой бактериальной приверженности, ограничивает доставку антибиотиков бактериям и защищает бактерии от иммунной системы хозяина2. Переход P. aeruginosa от планктонной стадии к образованию биопленки является критическим вопросом в этом контексте, также способствуя возникновению толерантности к антибиотикам.

В контексте CF мышь в основном используется в качестве модели. Мыши, однако, не спонтанно развивать это заболевание с введением мутаций CF3. Большинство исследований бактериальной биопленки и восприимчивости к лекарственным препаратам проводились на абиотических поверхностях, таких как петри. Однако этот подход не представляет сложности in vivo. Например, отсутствуют важные биологические барьеры, включая иммунные клетки, а также мукозальный эпителий. Хотя P. aeruginosa довольно токсичен для эпителиальных клеток, некоторым группам удалось совместно культивировать более раннюю биопленку P. aeruginosa с человеческими бронхиальными клетками. Эти клетки возникли из муковисцидоза пациентов с мутацией CFTR (CFBE41o- клетки)4 и позволило оценить эффективность антибиотиков5 или оценить коррекцию белка CFTR во время инфекции6. Такая модель была показана для улучшения предсказуемости эффективности препарата, в дополнение к характеристике проблем с препаратами, которые не в более поздних стадиях разработки препарата7.

Однако в легких слизистый эпителий подвергается воздействию воздуха. Кроме того, иммунные клетки, присутствующие в дыхательных путях, как и макрофаги тканей, играют важную роль против вдыханных патогенов или частиц8. Макрофаги мигрируют через различные слои клеток, чтобы достичь бронхового просвета и бороться с инфекцией. Кроме того, вдыхаемые препараты также должны справиться с наличием слизи в качестве дополнительного неклеточного элемента легочного воздушно-кровавого барьера9. Действительно, было разработано несколько сложных трехмерных (3D) моделей in vitro, направленных на повышение релевантности in vivo. Системы совместного культуры не только повышают сложность систем in vitro для обнаружения лекарств, но и позволяют изучать взаимодействие клеток и клеток. Такая сложность была решена в исследованиях о миграции макрофагов10,высвобождении антимикробных пептидов нейтрофилами11,роли слизи в инфекции9,и эпителиальной клеточной реакции на чрезмерное повреждение12. Тем не менее, надежная CF-инфицированная модель in vitro, которая имеет генетическую мутацию в CF, которая подвергается воздействию воздуха (увеличенное физиологическое состояние), и интегрирует иммунные клетки, все еще отсутствует.

Чтобы преодолеть этот разрыв, мы описываем протокол стабильной 3D-культуры инфицированных дыхательных путей. Модель состоит из бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека, инфицированных P. aeruginosa и способных представлять как диффузный, так и иммунологический барьер. С целью тестирования противоинфекционных при достаточно высокой пропускной способности, эта со-культура была установлена на проницаемой мембране фильтра хорошо пластины вставки, используя две линии клеток человека: CFBE41o- и THP-1 моноцитов производных макрофагов. Кроме того, чтобы в конечном итоге изучить осаждение аэрозолизированных противоинфекционных13, модель была создана на воздухе жидкости интерфейс (ALI), а не жидкости покрытые условия (LCC).

Как мы сообщаем здесь, эта модель позволяет оценить не только выживаемость бактерий при лечении антибиотиками, но и цитотоксичность клеток, целостность эпителиального барьера, трансмиграцию макрофагов и воспалительные реакции, которые являются существенными параметрами для разработки лекарств.

Этот протокол сочетает в себе два соответствующих типа клеток для ингаляционной терапии легочных дыхательных путей: макрофаги и CF бронхиальный эпителий. Эти клетки посеяны на противоположных сторонах проницаемых опорных вставок, что позволяет клеточному воздействию воздуха (так называемые условия воздушно-жидкого интерфейса (ALI). Эта со-культура клеток-хозяев впоследствии заражена P. aeruginosa. Обе линии клеток-хозяев имеют человеческое происхождение: эпителиальные клетки представляют муковисцидоз бронхиального эпителия, с мутацией на канале CF (CFBE41o-), и THP-114 клетки хорошо характеризуется макрофагом, как клеточная линия. Слияние эпителиального слоя сначала допускается для формирования на верхней стороне хорошо пластины вставки до макрофагов, как клетки добавляются в противоположном отсеке. После того, как совместно культуры устанавливается в АЛИ, система прививается с P. aeruginosa на апсиа. Эта зараженная система совместной культуры затем используется для оценки эффективности антибиотика, например, тобрамицина. Анализируются следующие конечные точки: эпителиальная целостность барьера с точки зрения трансэпителиальной электрической резистентности (TEER), визуализация клеточно-клеточных и клеточно-бактериальных взаимодействий confocal лазерной сканирующей микроскопией (CLSM), бактериальное выживание путем подсчета колониообразующих единиц (CFU), выживаемость клеток-хозяев (цитотоксичность) и высвобождение цитокинов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рост и дифференциация клеток в проницаемых опорных вставках

  1. Культивировать CFBE41o- в колбе T75 с 13 м Л минимальной необходимой среды (MEM), содержащей 10% фетальной сыворотки икры (FCS), 1% несущественных аминокислот и 600 мг/л глюкозы при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 атмосферы. Добавляйте свежую среду в клетки каждые 2-3 дня.
    1. Отсоедините клетки после достижения 70% слияния в колбе с 3 мл трипсина- этилендиаминистетраацетической кислоты (ЭДТА) при 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Добавьте 7 мл свежего MEM и центрифугу в клетки при температуре 300 х г в течение 4 минут при комнатной температуре (RT). Отбросьте супернатант и добавьте новые 10 мл MEM, нарушая при этом комки, мягко трубя вверх и вниз.
    2. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика ячейки или гемоцитометра. Семенные клетки с плотностью 2 х 105 клеток/хорошо в 12-хорошо пластин с проницаемыми опорами (размер поры 3 мкм, см. Таблицу Материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный счетчик ячейки определяет номер ячейки, распределение размера и жизнеспособность ячеек (см. Таблицу Материалов). Здесь можно использовать проницаемые опоры с размером поры 0,4 мкм; однако, макрофаги, в этом состоянии, должны быть добавлены непосредственно к аполической стороне, и их трансклеточной миграции не будет оцениваться в этом случае.
    3. Семенные клетки в жидком жидком состоянии (LLC) путем добавления 500 мл клеточной суспензии на апикаловой стороне проницаемой опоры и 1,5 мл свежей среды в басотераальной стороне. Затем инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2, для 72 ч.
    4. Чтобы перейти к воздушно-жидкой интерфейс (ALI) культуры, на третий день после посева, удалить среду из басотеральная сторона, а затем с аической стороны. К басолатеральной стороне добавьте 500 МЛ свежего MEM и меняйте среду каждый второй день, пока клетки не образуют слияние монослой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для условий, используемых в этом протоколе, CFBE41o- клетки обычно смешиваются после 3-7 дней в культуре.
    5. Оцените свойства эпителиального барьера на 7-й день путем инкубации CFBE41o- клеток с 500 хЛ клеточной средой в аписальной стороне и 1,5 мл в басотераальной стороне на 1 ч, при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2.
    6. Измерьте свойства барьера с помощью трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), с электродом stX2 палочки и эпителиальным вольт-охметром; после 7 дней это выше, чем 300 Ω'cm2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце концов, в некоторых мембранных вставок, клетки имеют низкий TEER. Поэтому проницаемые вставки с TEER lt; 300 Ω-cm2 не используются.
  2. Чтобы культивировать клетки THP-1, выращивать их в колбе T75 с помощью 13 мл Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних дополнены 10% FCS, и инкубировать на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2. Разделение клеток каждый второй день, посев 2 х 106 клеток / мЛ клетки в новой колбе T75.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недифференцированные клетки THP-1 выращиваются как моноциты в суспензии.
    1. Дифференцировать клетки THP-1 следующим образом. Содержимое центрифуги T75 при 300 х г в течение 4 мин. Откажитесь от супернатанта, перезахоите гранулы в свежей среде и положите в новый T75. Добавьте 10 нг/мЛ Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) инкупати клетки в RPMI для 48 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 атмосфера15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференциации с PMA, клетки не размножаются больше и прикрепляются к колбе.
    2. Чтобы отсоединить THP-1 макрофагоподобные клетки, мыть один раз с фосфат-буферным солевым раствором (PBS) при температуре 37 градусов по Цельсию и инкубировать 3 мЛ раствора отслоения клеток (например, accutase), содержащего 0,5 мМ EDTA на 10 мин при комнатной температуре.
    3. Осмотрите клетки под перевернутым микроскопом, чтобы найти клеточный отсо отряда. Добавьте 7 мл свежей средней и центрифуги при 300 х г в течение 4 минут в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаги также могут быть отделены с трипсин-ЭДТА, 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Тем не менее, трипсин жестче к макрофагам, чем выбранное решение отсоединение клеток (см. Таблицу Материалов).
    4. После удаления супернатанта, повторно приостановить макрофаг клеток в 3 мЛ THP-1 среды в 15 мЛ конической трубки, подсчитать клетки, как описано в 1.1.2. и инкубировать на максимум 1 ч при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2 до создания совместной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: THP-1 клетки в подвеске могут быть окрашены с жизнеспособностью красителей для изображения со-культуры дальше. На этом этапе используйте процедуру ниже (шаг 1.2.5).
    5. Пятно макрофагов с 10 мл красителя жизнеспособности клетки (на основе преобразования ацетат moieties внутриклеточной эстерас, см. Таблица Материалов), в котором 3 МЛ жизнеспособность клетки красителя применяется к суспензии клетки. Инкубировать клетки в течение 20 мин при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2, затем мыть 1x с PBS 37'C, чтобы удалить краситель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифуга клетки для удаления красителя на 300 х г в течение 4 минут при комнатной температуре (RT).

2. Создание эпителиальной макрофаговой со-культуры на проницаемых опорах

  1. Используйте CFBE41o- монослой в ALI с TEER 300 Ω см2 (шаг 1.1.6.). Снимите среду с нижней камеры, тщательно инвертировать опору внутри стерильного стекла Петри блюдо (50 мм х 200 мм), и удалить клетки, заросшие через мембранные поры на нижней стороне мембраны с помощью скребка клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за поры размер 3 мкм, эпителиальные клетки, как правило, растут через поры к басотераальной стороне. Поэтому, нужно удалить их, прежде чем добавлять макрофаги на этой стороне. CFBE41o- эпителиальные клетки легких могут быть окрашены на этом этапе. Процедура в шаге 1.2.5 может быть использована; однако вместо клеточной подвески на проницаемой опоре применяется раствор красителя в MEM (только 500 МЛ) на прилипаемых клетках.
  2. Используйте 2 х 105 ячеек/хорошо (в 200 мл RPMI) из клеточной суспензии макрофагов PMA-дифференцированного THP-1 и поместите клетки на басонатеральной стороне перевернутых вставок.
  3. Закройте чашки Петри тщательно и инкубировать на 2 ч при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2.
  4. Поместите вставки обратно в 12-хорошо микропласты и добавить 500 МЛ MEM среды в basolateral стороны проницаемой вставки для поддержания условий ALI. Клетки теперь готовы к инфекции.

3. Инфекция P. aeruginosa

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги отсюда должны быть сделаны в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2).

  1. Прививка 15 мл бульона лизогении (LB) дополнена 300 мкг/мл ампициллина в колбе Эрленмейера (50 мл) с одной колонией P. aeruginosa PAO1-GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие штаммы P. aeruginosa также могут быть использованы здесь, например, PAO1 дикий тип, PA14, или клинических штаммов, следуя своим собственным протоколам культивирования.
  2. Инкубировать бактерии в течение 18 ч при 37 градусов по Цельсию, встряхивая при 180 об/мин.
  3. Перенесите содержимое после 18 ч в коническую трубку 50 мЛ и центрифугу при 3850 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и добавьте 10 мл стерильных PBS при 37 градусов по Цельсию.
  4. Измерьте оптическую плотность на спектрофотометре на длине волны 600 нм и отрегулируйте концентрацию бактерий с помощью клеточной культуры среды до конечной концентрации 2 х 105 CFU/mL. Это соответствует множественности инфекции (МВД) одной бактерии на эпителиальную клетку.
  5. Добавьте 100 мл бактериальной суспензии к аписальной стороне проницаемой поддержки (шаг 2.4.) и инкубировать при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2 на 1 ч, чтобы бактерии привязанности к клеткам. Затем, удалить апической жидкости тщательно с пипеткой для восстановления условий ALI. Держите некоторые образцы неинфицированы в качестве контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе, бактерии прилагается должны быть покрыты в LB агар (см. шаги 5.4/5.5), чтобы определить первоначальные бактерии inoculum.
  6. Инкубировать препарат, представляющий интерес после бактериальной адгезии в клетках. Для лечебных экспериментов добавьте 500 мл лекарственного раствора, разбавленного в клеточной среде (в этом протоколе использовался тобрамицин 6 мкг/мл) в аическую сторону. Добавьте 1500 мл клеточной среды без препарата на басотераальной стороне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того, чтобы прививать лекарства в качестве решения, модель также может быть адаптирована к осаждению аэрозолей. Для этих целей клетки в ALI питаются с базалатеральной стороны 500 мл клеточной среды. Препарат затем сначала распылиется и разрешен к отложению в аписном отсеке соответствующим устройством (не описано здесь). Зараженный и обработанный образец может быть проверен на конечные точки, изложенные в разделах 4-7. С этого шага, проницаемые опоры могут быть использованы для создания либо изображений (раздел 4) или получить результаты роста бактерий и жизнеспособности клеток млекопитающих, среди других (разделы 5-7).

4. Пример подготовки к конфокальной лазерной микроскопии (CLSM)

  1. После установления совместного культуры, инфекции и лечения наркомании, удалить все средства массовой информации с апкической и базалатеральной стороны. Вымойте 1x с PBS при 37 градусов по Цельсию, а затем исправить клетки с 3% параформальдегида (PFA) на 1 ч на RT (300 мл на аписальных / 600 мл на басотеральная). Ядра клеток окрашены 5 мкг/мл DAPI-PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: PFA является опасным.
  2. Вырезать мембраны с помощью скальпеля и поместить их между двумя 12 мм микроскопии крышки слайдов с помощью монтажа среды (см. Таблицу материалов). Дайте ему высохнуть внутри потока скамейке в течение 30 минут до хранения при 4 градусов по Цельсию. Визуализируйте с помощью конфокальной сканирующей микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После со-культуры и до монтажа, жесткие соединения иммуносхеи могут быть выполнены. Для этого клетки фиксируются параформальдегидом 3% в течение 30 мин, снова промывают с помощью PBS и пермяки с сапонином 0,05%/BSA 1% в PBS. В этом протоколе, zonula окклюденов белка (ЗО-1) был обнаружен с помощью мыши анти-человека ЗО-1 антитела (1:400, инкубация при 4 градусов по Цельсию в одночасье). Образцы были затем инкубированы на 2 ч на RT с козой анти-мым мыши IgG антитела Alexa Fluor 633 (1:2000 в красном). Ядра были окрашены DAPI (1 мкг/мл) и установлены с монтажной средой на крышках.
  3. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации сохраненных мембран. Выберите 25x или 63x цели погружения воды и лазеры на 405, 488, 505 или 633 нм для обнаружения. Изображения должны иметь разрешение 1024 x 1024 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазеры выбираются в соответствии с пятном используется.
  4. Приобретайте апкические и поперечные представления и используйте режим zeta-stack (10-15 стеков) для построения трехмерной модели с использованием программного обеспечения для визуализации.

5. Измерение распространения бактерий через колонии-формирующие единицы (CFU)

  1. Соберите апикалическую и базалатерскую среду (содержащую бактерии) для оценки CFU не прикрепленных бактерий. Соберите 500 мл с апкической и базалатеральной сторон и с бассете их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эту подвеску непосредственно для подсчета бактерий (шаг 5.4) или центрифуги на 21,250 х г в течение 10 минут для оценки лактата дегидрогеназы (LDH) от супернатанта (раздел 6) и / или повторно приостановлено в PBS для подсчета внеклеточных бактерий (шаг 5.4).
  2. Оцените выживаемость бактерий, прикрепленных и/или интернализированных в клетках, добавив 500 мл стерильной деионизированной холодной воды в каждом отсеке проницаемой опоры. Инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть покрыты на LB агар (см. шаг 5.4) или замороженные (как и весь вставки пластины) при -20 градусов по Цельсию для покрытия позже.
  3. Для оценки CFU адептов / интернализированных бактерий, оттаивания образцов при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин (если заморожены). Используя пипетки советы для каждого колодца, царапать мембранную поверхность и пипетки вверх и вниз, чтобы удалить все придерживались содержания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, все эпителиальные клетки lysed и адептов / интернализированных бактерий доступны в качестве подвески, чтобы быть покрыты.
  4. С бактериальной подвеской от обеих фракций, выполните 1/10 серийное разбавление с использованием Tween-80 0.05% в PBS и пластины бактерий на пластинах LB агар.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется разбавить от 1 до 10. Бактерии должны быть подсчитаны в наибольшей разбавления, где одиночные колонии впервые определены.
  5. Инкубировать агар пластин при 30 градусов по Цельсию на 16-72 ч для подсчета колоний, и рассчитать CFU соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура 30 градусов в момент инкубации пластины имеет важное значение для обработанных образцов и наблюдать отсроченный рост колоний.

6. Оценка цитотоксичности клеток с помощью анализа лактата дегидрогеназы

  1. Используйте супернатант инфицированных клеток, содержащих бактерии (от шага 5.1) для оценки жизнеспособности клеток для анализа LDH16. Центрифуга супернатанта на 21,250 х г в течение 10 минут, чтобы гранулировать бактерии и в конечном итоге остальные клетки. Используйте супернатант без бактерий для измерения выброса LDH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант не должен быть заморожен до измерения LDH по этому анализу.
  2. Перенесите 100 мл супернатанта на 96-хорошую пластину и добавьте 100 мл решения анализа LDH (см. таблицу материалов). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут в темноте, затем читать абсорбции при 492 нм.

7. Оценка высвобождения цитокинов человека

  1. Для количественной оценки цитокинов используйте либо ELISA, либо цитометрический бусиновой массив иммуноанализ17 (см. Таблицу материалов). Для этого центрифуг супернатант от шага 5.1 на 21,250 х г в течение 10 мин и измерять либо немедленно, либо хранить -80 градусов по Цельсию до 15 дней до анализа.
  2. Оцените супернац с помощью коммерчески доступного комплекта ELISA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура следует инструкциям по производству, которые включают покрытие пластин с антителом захвата, добавление образцов (100 мл) и стандартов цитокинов, инкубации, стирки и добавления антитела обнаружения для обеспечения колоритического измерения присутствия цитокинов. Кроме того, цитометрия потока может быть использована для измерения цитокинов с помощью коммерчески доступных комплектов (см. Таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1A показана морфология результирующей сокультуры бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека после роста на 24 ч на апкической и басотераальной стороне проницаемых опор, соответственно. Целостность эпителиального барьера показана более высоким TEER (834 Ω см2)и CLSM путем иммуносвеинга для плотного соединения белка ЗО-1(Рисунок 1B). Те же результаты наблюдаются с точки зрения барьерной целостности неинфицированных CFBE41o- монокультуры можно увидеть в неинфицированных эпителиальных макрофагов со-культур.

Чтобы смоделировать бактериальную инфекцию, P. aeruginosa был привит при множественности инфекции (МВД) 1:1 на CFBE41o- клетки. Через шесть часов послезаражения (рисунок 2A),макрофаги наблюдались на аполической стороне сокультуры. После заражения, TEER упал с 834 до 250 Ω см2,что указывает на скомпрометирован эпителиальный барьер, а также визуализированы окрашивания ЗО-1 (Рисунок 2B).

На рисунке 3 показана трансмиграция макрофага через проницаемые мембранные поры и поглощение бактерий клетками THP-1 на аполической стороне. Образцы были зафиксированы на 1, 3 и 6 ч после инкубации от независимых экспериментов. В монокультурах THP-1(рисунок 3A-C),миграция макрофагов наблюдалась уже в 1 ч, в то время как в сокультуре(рисунок 3D-F),это было замечено после 3 ч инфекции. Поглощение бактерий в THP-1 наблюдалось после 3 ч инфекции, как в монокультуре, так и в кокультуре. Нет бактериального поглощения CFBE41o-можно было увидеть. Поперечные виды были размещены таким образом, что проницаемая мембранная опора находилась посередине в виде разделения апкического и басотерала.

Рисунок 4 показывает конфоциальное сканирование лазерной микроскопии фотографии инфицированных со-культур (CFBE41o- THP-1) лечение или без тобрамицина для 6 ч (Рисунок 4A, B) или 20 ч (Рисунок 4C,D). Без лечения, как эпителиальные клетки и макрофаги умер после 20 ч инфекции (Рисунок 4C). Однако, после лечения тобрамицина клетки-хозяина сохраняются после 20 ч; до сих пор, некоторые бактерии могут наблюдаться в культуре. Несмотря на то, видели после 6 ч лечения в микроскопии фотографии (Рисунок 4B), бактерии не размножаются, как наблюдается в анализе CFU в рисунке 4E. Тем не менее, после 20 ч лечения, бактерии восстановили способность к распространению, как видно из колоний в анализе CFU (Рисунок 4F). Протокол лиза клеток с холодной водой и соскоб может освободить бактерии прилагается и, возможно, интернализированы в клетках. В то же время, клетки разрушаются(Дополнительный рисунок S1A, B). Центробежные шаги, используемые в этой работе для эпителиальных клеток (300 х г)или бактерий (21 250 х г) не препятствовали жизнеспособности обоих (Дополнительные цифры S1C, D). Все анализы CFU были выполнены путем замораживания образцов при температуре -20 градусов, а затем оттаивания и покрытия. Эта процедура сократила количество бактерий на 2-бревна, по сравнению со свежими образцами(Дополнительный рисунок S1E). Поскольку эта процедура проводится одновременно для всех экспериментальных групп (обработанных и необработанных) в разные моменты времени, это сокращение будет включено в окончательные результаты (Дополнительный рисунок S1E). Кроме того, концентрация тобрамицина, используемого здесь, не показала токсичности для неинфицированных клеток(Дополнительный рисунок S2A),а такженикакой дальнейшей воспалительной реакции (Дополнительная фигура S2B). Тем не менее, он был в пределах минимальной концентрации ингибитори, чтобы убить P. aeruginosa.

На рисунке 5 показан трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) и жизнеспособность клеток. Рисунок 5A-B иллюстрирует TEER монокультур и со-культур. Со-культура CFBE41o- клетки с THP-1 не вызывают никаких изменений в целостности эпителиального барьера по сравнению с монокультурой (красными полосами). После заражения стоимость TEER упала (зеленый бар). После 1 ч инфекции, некоторые образцы были обработаны антибиотиком тобрамицин (синий бар), для 6 или 20 ч. Лечение сохранило целостность эпителиального барьера, как это наблюдалось в более высоком ТЭЕР. Рисунок 5C показывает процент выброса ЛПГ как признак токсичности клеток при инфекции и лечения тобрамицином после 6 ч. Сама сокультура индуцировала высвобождение ЛПГХ, что было одинаковым для инфицированных клеток (около 20%). После 20 ч инфекции, не было обнаружено никакого сигнала LDH. Чтобы доказать надежность LDH для долгосрочной инфекции, PAO1-GFP был инкубирован в среднем с и без LDH 1 U/mL по сравнению с соответствующими неинфицированными контроля(Дополнительный рисунок S2C). Сигнал LDH был потерян после длительной инкубации (20 ч) с P. aeruginosa, что указывает на то, что LDH является стабильным только в более короткие инкубационные времена в инфицированных культурах.

На рисунке 6 показана кинетика провоспалительных цитокинов, обнаруженных через ELISA. Преимущество инфицированной сокультуры клеток CFBE41o- и THP-1 наблюдалось при более высоких выделениях провоспалительных цитокинов.. Секреция некоторых провоспалительных цитокинов была либо похожа (IL-6) или выше (IL-8, TNF-Я, IL-1) в инфицированной со-культуры(рисунок 6C), чем в соответствующих монокультуры(рисунки 6A-B). Неожиданно некоторые цитокины в монокультурах THP-1(рисунок 6B)не регулируются в зараженных образцах (Ил-8, ТНФЗ, ИЛ-1).

Рисунок 7 демонстрирует высвобождение цитокинов в моно- и со-культурах при инфекции и лечении тобрамицином, измеряемым с помощью флуоресценции активированной клеточной сортировки (FACS). Секреция провоспалительных цитокинов IL-8(рисунок 7A)и противовоспалительных цитокинов IL-10(рисунок 7F)была выше в кокультурах эпителиальных клеток и макрофагов, по сравнению с монокультурами. Тем не менее, для всех других цитокинов (IL-1, IL-12p40, IL-23 и GM-CSF)(рисунки 7B-E),уровни секреции цитокинов не были выше в сокультуре, что в соответствующих монокультур.

Figure 1
Рисунок 1: Перекрестные сечения и апикалические взгляды на неинфицированные эпителиально-макрофаговые со-культуры. ( A )Перекрестныевиды неинфицированных 24 ч эпителиально-макрофагов со-культуры. CFBE41o- окрашенные красные, THP-1 макрофаги в желтом и ядра в синем (DAPI). (B) Апические виды неинфицированных CFBE41o- монослой иммуно-окрашенных для ЗО-1 (красный). ДАПИ: ядра. Масштабные бары: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Перекрестные сечения и апикритические взгляды на зараженную эпителиально-макрофагную со-культуру. ( A )Перекрестныевзгляды и (B) апический вид эпителиально-макрофаговой со-культуры на 6 ч после инфекции (hpi) с P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- окрашенные в красный цвет, THP-1 макрофаги в желтом, ядра в синем (DAPI) и P. aeruginosa PAO1-GFP в зеленом цвете. (B) Апические виды 6 ч инфицированных CFBE41o-монослой. Масштабные бары: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Кинетика макрофага трансмиграции и поглощения бактерий визуализированы поперечного сечения 3D-модели. PAO1-GFP инфекции кинетики в монокультуры THP-1 макрофагов(A-C) или совместной культуры(D-F). Макрофаги THP-1 окрашены в красный цвет, ядра эпителиальных клеток в синем (DAPI), и P. aeruginosa в зеленом (GFP). Каждая фигура делится на апкические и басотералы, пространство между ними считается мембраной, которая пуста или занята CFBE41o- слияние слой (D-F). Вставки в цифрах показывают поглощение бактериями макрофагами в разное время (A-F). Масштабные бары: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристика выживаемости PAO1-GFP в обработанных тобрамицином со-культуреe. (A-D) Confocal микрографы со-культуры с и без лечения. (A) Необработанные совместной культуры после 6 ч инфекции. ( B) Инфицированные со-культуры лечение тобрамицином 6 мкг /мл (Тоб) для 6 ч. (C) Необработанные со-культуры 20 ч после инфекции, (D) инфицированных совместно культуры лечение тобрамицин 6 мкг / мл на 20 ч. Ядра окрашены DAPI (синий), макрофаги (красный) и P. aeruginosa GFP (зеленый). (E) Колониообразующие единицы (CFU) адептов / интернализированных бактерий после 6 и (F) 20 ч с тобрамицином 6 мкг / мл лечения. Пустая мембранная вставка использовалась в качестве абиотического субстрата для выращивания PAO1-GFP. Двусторонний ANOVA с несколькими сравнениями тест Туки (я не колонии) был использован, p q lt; 0,05; р-л; 0,001; р-л; 0,0001; ns: не имеет значения. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение, n No 9-27 реплицирует 3-9 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Барьерная целостность и оценка жизнеспособности моно-и со-культуры. Оценивались следующие условия совместной культуры: неинфицированные (серые полосы), инфицированные (зеленые полосы) или инфицированные и обработанные тобрамицином (голубыми полосками). ()Трансэпителиальное электрическое сопротивление после 6 ч и (B) 20 ч инфекции в монокультурах (CFBE41o- и THP-1) и со-культуры. (C) Цитотоксичность моно- и со-культуры измеряется через LDH релиз 6 ч после инфекции. Двусторонний ANOVA с несколькими сравнениями тест Туки был использован; Зп хт; 0,05; р-л; 0,0001; ns: не имеет значения. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение; n No 9 повторяет три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Кинетика цитокинов релиз неинфицированных и инфицированных моно- и совместно культуры супернатантов оценивается с помощью ELISA. ELISA было сделано в соответствии с протоколом производителя комплекта. ()CFBE41o-, (B) THP-1, и (C) совместно-культуры выпуская IL-8, TNF-Я, ИЛ-1 , и IL-6. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. n No 6 повторяет 2 независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Supernatant результаты цитокинов панели измеряется через FACS с и без тобрамицина 6 мкг/мл для 6 ч после инфекции. Супернац моно- и со-культуры после 6 ч пост-инфекции используется для анализа соответствующих цитокинов IL-8 (A), IL-1 ' (B), IL12p40(C), IL-23 (D), ГМ-CSF(E) и IL-10 (F). Бар ошибок указывает на стандартное отклонение, n No 9 реплицирует 3 независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок S1: Контрольные эксперименты для критических шагов протокола. (A, B) Микрографы CFBE41o- клеток в 24-ну пластины, выращенные в течение 2 дней при плотности 2 х 105 клеток / хорошо. ()CFBE41o- клетки в PBS в течение 30 мин, и (B) водоочистных клеток после 30 мин после соскабливания с пипеткой. (C) жизнеспособность клеток млекопитающих после центробежности. CFBE41o- клетки были удалены из T75 клеточной культуры колбы, как описано в шаге 1.1.1 и 1.1.2. 100 мл полученной клеточной суспензии были проанализированы в изотоническом растворе 10 мл. Для оценки жизнеспособности одиночных ячеек использовался автоматизированный счетчик клеток. Затем соответствующие суспензии ячейки центрифугировались на 300 х г в течение 4 минут, повторно приостановили и пересчитывали снова. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение, n No 6 различных колб 2 отдельных экспериментов. (D) Жизнеспособность ПАО1-ГФП после центробежки. БАКТЕРИи PAO1-GFP были разбавлены до ОД 0,01 в клеточной среде. CFU был оценен с помощью 10-кратного раз разбавления строки и LB пластины инкубировали ночь на 30 градусов по Цельсию. Соответствующие пластиковые трубки были центрифугированны на 21,250 х г в течение 10 минут и вновь приостановлены в среднем. CFU был оценен соответствующим образом еще раз. Двуххвостый тест студента, р-лт; 0,033. Бар ошибок указывает на стандартное отклонение, n No 6 из 2 экспериментов. (E) жизнеспособность бактерий после замораживания. PAO1-GFP бактерии были подготовлены как в (D) и CFU был проанализирован, затем пластиковые трубки были заморожены в течение одного дня при -20 градусов по Цельсию и разморожены для оценки CFU снова. Двуххвостый тест студента, р-лт; 0,001. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение, n No 6 из двух экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Контрольные эксперименты для оценки поведения LDH и влияния тобрамицина. () Контрольныйэксперимент для оценки цитотоксичности после 20 ч инкубации с 6 мкг/мл тобрамицина. Моно- и со-культура была сделана, как описано в протоколе, но клетки были выращены в течение 2 дней на 24-ну пластин и THP-1 клетки были посеяны apically. Клетки с 6 мкг/мл тобрамицина или элементов управления были инкубированы на 20 ч. One-Way ANOVA, несколько сравнений тест Туки, р-lt; 0,001. Бар ошибок указывает на стандартное отклонение, n No 6 из 2 экспериментов (CFBE41o-), n No 3 одного эксперимента (THP-1 и со-культуры). (B) Контроль-ELISA супернатантов моно-и со-культуры с / без тобрамицина. Культура клеток была сделана согласно (A) для того чтобы показать никакой отпуск цитокина сравнен к контролю для всех условий. ELISA было сделано в шаге 7.1 и 7.2, 10 мкг/мл (LPS) было добавлено в качестве контроля, IL-8 релиз для LPS-обработанных элементов управления, содержащего THP-1 был выше, чем обнаруживаемые. Двух-Way ANOVA, Несколько сравнений Тест Туки, нс р р-л; 0,033; р Зтт; 0,001. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение, n No 6 из двух экспериментов, n No 3 одного эксперимента (контроль LPS). (C) деградация ЛПХ из-за чрезмерного распространения PAO1-GFP. LDH был добавлен при концентрации 1 U/mL к MEM Medium. Либо среда LDH или контрольная среда была использована для разбавления клеток до OD No 0,01 (соответствует 1 х 108 CFU/mL), а затем инкубируется в течение 20 ч. Анализ LDH был сделан, как описано в разделе 6. One-Way ANOVA, несколько сравнений тест Туки, нс р р Зтт; 0,001. Бар ошибок указывает на стандартное отклонение, n No 8-9 из трех индивидуальных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящем документе описывается протокол для 3D-культуры инфицированных дыхательных путей, образованной человеческой муковисцидоз бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o- и человека моноцитов производных макрофаг клеточной линии THP-1. Протокол позволяет оценить целостность эпителиального барьера, трансмиграцию макрофагов, выживаемость бактерий и воспаление, которые являются важными параметрами при тестировании эффективности препарата и реакции хозяина одновременно. Новинка в модели заключается в включении эпителиальных клеток (т.е. линии клеток КФ человека и макрофагов) с острой бактериальной инфекцией (т.е. P. aeruginosa). Доказана острая инфекция в эпителиальных клетках, которая контролируется антибиотиком (т.е. тобрамицином). Помимо использования линии клеток CF человека, вся модель настроена в условиях ALI, что значительно ближе к физиологическим условиям в CF. Использование линии клеток CF реализует некоторые характеристики болезни в модели. Мутация муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) напрямую связана с дисрегуляции переноса эпителиальной жидкости в легких. Кроме того, мутации в гене CF, такие как ЭФ508, приводят к густой слизи, с воспалением и тяжелым повреждением легких при инфекции P. aeruginosa4. Эти патологические проявления, вызванные дисфункциональными CFTR потенциально связаны аутофагии нарушения в качестве важного клеточного механизма, связанного с патогенезом заболевания легкихCF 18. Однако, CFBE41o- не секрет слизи, которая является ограничением этой клеточной линии. Если он предназначен для изучения роли слизи более конкретно, протокол может быть адаптирован с помощью других бронхиальных клеточных линий (например, Калу-3).

Одним из важнейших шагов для создания этого протокола является сочетание эпителиальных и иммунных клеток и последующей инфекции P. aeruginosa в АЛИ. Инфекция CFBE41o- P. aeruginosa in vitro уже была описана, в основном с использованием потока ячейки камеры, дополненной аргинина в средствах массовой информации культуры, для улучшения выживания эпителиальных клеток и поддержки формирования биопленки19. Настоящий протокол направлен на новую модель с использованием только человеческих клеток, которые, кроме того, могут быть выращены в ALI на проницаемых вставках пластины скважин для более высокой пропускной способности образца. Включение дифференцированных макрофагов THP-1 в увековеченную клеточные линии человека, вместо того, чтобы зависеть от получения воспроизводимых первичных клеток от доноров, является еще одним преимуществом нашей модели. Добавляя эти макрофаги к басонатеральной стороне проницаемой мембранной поддержки, было отмечено, что макрофаги выступают и в конечном итоге трансмиграированы в аическую сторону фильтрующего эпителиального барьера. Вариантом этого протокола может быть добавление макрофагов непосредственно на апикальной стороне в верхней части эпителиальных клеток, как описано Kletting et al. 14. Со-культура нечеловеческих иммунных и легких клеток уже была описана ранее. Дин и др. 10 используется мышь Льюис легких карциномы клеток на проницаемой вставки поддерживает в сочетании с макрофагами на басонатеральной стороне и инфицированных S. aureus, еще один критический патоген хронической инфекции у пациентов CF. Однако, в этом исследовании, не было никакого внимания на муковисцидоз или использовать совместно культуры в качестве платформы для оценки эффективности препарата. Наш протокол может быть адаптирован для других бактериальных инфекций, таких как золотистый стафилококк, mycobacterium abscessus, или Burkholderia cepacia- важные патогены в легких CF.

Другим важным шагом является добавление макрофагов THP-1 в ячейки путем листать проницаемые вставки вверх ногами (раздел 2). Это имеет решающее значение для оценки макрофага трансмиграции через скважину в сторону инфекции. Более поздний процесс визуализации с 3D-моделей с z-стеками, и поперечное представление, может быть выполнен для наблюдения внутри макрофагов и обнаружения поглощения бактерий(Рисунок 3). При 1 л.с., бактерии, применяемые на апсиальная сторона мигрируют через мембрану, в то время как миграция макрофагов и поглощение происходят только при 3 л.с. Поэтому после 1 ч инфекции, было уместно начать лечение тобрамицином и иметь возможность решать как клетки-хозяина и выживания бактерий в течение длительного периода (20 ч). В ходе протокола поддержание бесплодия является критическим вопросом из-за множества шагов, каждый из которых несет риск заражения. Тем не менее, опытный сотрудник клеточной культуры сможет следовать этому протоколу после соответствующей подготовки и обучения. Ячейка среды должны регулярно проверяться на загрязнение, предпочтительно после всех критических шагов.

Как и в любой модели, зараженная культура также имеет некоторые ограничения; например, интеграция макрофагов, подобных ячейкам. Здесь было важно иметь макрофаги на басонатеральной стороне; однако манипуляция вставкой с ранее выращенным эпителиальным слоем может привести к раннему повреждению и нарушениям сокультуры. Хотя проницаемая модель поддержки обеспечивала высокопроизводительные характеристики, которых не наблюдалось в предыдущих сокультурах инфицированного CF легкого20,,21. При этом, дальнейшие эксперименты должны оценить ограничения использования THP-1 в качестве заменителя макрофагов. Хотя эта линия клеток широко используется, она менее отзывчива к LPS22 и ей не хватает полной активации, и вся популяция не отличается от моноцитов до макрофагов, похожих на клетки23. Другим ограничением является отсутствие других ключевых компонентов в CF инфекции и доставки лекарств. CFBE41o- клеточная линия не обладает ресничками и не производит слизь, что обычно происходит 20-30 дней клеточной культуры в ALI. Поскольку это не относится к CFBE41o- клеточной линии, мы использовали клетки после семи дней, когда был сформирован плотный эпителиальный барьер. Mucociliary зазор изменяет условия проживания либо микробов24 или частицы наркотиков9,25 и в пробирке модели оценки осаждения легких должны принять это во внимание. В отличие от того, что наблюдается в других клетках, культура тканей вставляет покрытие внеклеточным матричным материалом (например, фибронектином или коллагеном I) не показывает существенной разницы для CFBE41o-, например, в TEER26. Таким образом, проницаемые фильтры не были покрыты внеклеточным матричным материалом в этом протоколе.

С протоколом, описанным здесь, моно-и со-культур после 6 ч инфекции обеспечивают достаточное высвобождение цитокинов, которые будут использоваться в качестве измерения в будущем тестировании на наркотики. Со-культура приносит преимущество клеточного сотрудничества в моделировании иммунного ответа. Неэффективность тобрамицина в снижении воспаления, какожидается,так как не все бактерии были устранены во время лечения(Рисунок 4 E,F ). Тем не менее, моделирование реакции на тобрамицин в модели CF имеет решающее значение, так как тобрамицин (в более высоких концентрациях) может быть эффективным при ингибировании P. aeruginosa, даже на биопленке19,27. Одной из возможностей для дальнейшего использования этого протокола является интеграция противовоспалительных препаратов в лечении. Общая рекомендация относительно воспалительных реакций будет использовать короткий срок лечения (6 ч), который до сих пор имеет клетки-хозяина и бактерии присутствуют. После этого момента клетки-хозяина уничтожаются в необработанных образцах. ElISA и FACS могут быть использованы для измерения выброса цитокинов. Наконец, если образцы хранятся дольше 15 дней при уровне -80 градусов по Цельсию, рекомендуется проверить надежность цитокинов с помощью, например, положительного контроля свежих образцов (например, клеток, стимулируемых LPS).

Возможны некоторые изменения протокола. Например, действующий протокол может быть расширен до применения небулизованных препаратов (шаг 3.6). Это необходимо для моделирования доставки легочных препаратов с помощью перорального вдыхания. Небулизация водорастворимых препаратов, таких как тобрамицин, или наноносов, таких как липосомный колистин, относительно прямолинейна коммерчески доступных устройств, обычно используемых в клинике. Кроме того, существует несколько коммерчески доступных устройств для депонировать аэрозоли на вставки клеточной культуры. Кроме того, поскольку описанная здесь модель основана на проницаемых мембранных опорах, она также может быть принята к некоторым современным микрофлюидным (например, "легким на чипу"), например, для изучения влияния дыхания и связанного с этим механического растяжения и изменения воздушного потока. Кроме того, этот протокол может быть изменен путем добавления слизи или замены первичных клеток в зависимости от научного вопроса, который будет рассмотрен. Еще одним интересным следующим шагом будет тестирование наномедицин, тем более, что нанотехнологии добивается прогресса в разработке новых антиинфекционных28,CF корректоров29 и совместной доставки антибиотиков и патоблокаторов30. В целом, текущий протокол может быть воспринят как полезный в оценке выживания бактерий при лечении антибиотиками в сложной системе, вместе с некоторыми принимающими считываниями: цитотоксичность клеток, целостность эпителиального барьера, макрофаг трансмиграционная и воспалительная реакция. Это важнейшие параметры для разработки лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа получила финансирование из Программы Европейского союза «ГОРИЗОНТ 2020» по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации в соответствии с грантовым соглашением No 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - проектированием и разработкой передовых наномедицин для преодоления биологических барьеров и лечения тяжелых заболеваний. Мы благодарим д-ра Ана Коста и д-ра Дженни Juntke за большую поддержку в развитии совместно-культуры, Ольга Хартвиг, для научной иллюстрации, Аня Хонеккер, для анализа ELISA, Петра Кёниг, Яна Westhues и д-р Кьяра Де Росси за поддержку в области клеточной культуры, аналитики и микроскопии. Мы также благодарим Челси Торн за то, что она корректив нашу рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Accutase AT104
Ampicillin Carl Roth, Germany HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer OLS Omni Life Sciences -
CellTrace Far Red Thermo Fischer C34564
Centrifuge Universal 320R Hettich, Germany 1406
CFBE41o- cells 1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich		 1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm World Precision Instruments, Sarasota, USA STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM Leica, Mannheim, Germany TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits Affymetrix eBioscience, USA 15541037
Cytokines Panel I and II LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). 740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche 11644793001
D-(+) Glucose Merck 47829
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fischer D1306
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments, Sarasota, USA EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile Corning, Amsterdam, Netherlands 353181
Fetal calf serum Lonza, Basel, Switzerland DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Invitrogen A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle Roche, Mannheim, Germany 10127230001
LB broth Sigma-Aldrich, Germany L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11140050
P. aeruginosa strain PAO1 American Type Culture Collection 47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP American Type Culture Collection 10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% EMS DIASUM 15710-S
Phosphate buffer solution buffer Thermo Fischer 10010023
Petri dishes Greiner 664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, Germany P8139-1MG
Precision Cover Glasses ThorLabs CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody BD Transduction Laboratories 610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK 11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) Normax, Portugal 5058561
Saponin Sigma-Aldrich, Germany S4521
T75 culture flasks Thermo Fischer 156499
THP-1 cells Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt Sigma T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fischer 25300054
Tween80 Sigma-Aldrich, Germany P1754

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

Tags

Этот месяц в JoVE Выпуск 160 Биопленки антибиотики легочные инфекции муковисцидоз воспаление интерлейкины TEER альтернативы тестированию на животных
<em>П. аэругиноза</em> Зараженная 3D сокультура бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов при воздушно-жидком интерфейсе для доклинической оценки антиинфекционных элементов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Montefusco-Pereira, C. V.,… More

Montefusco-Pereira, C. V., Horstmann, J. C., Ebensen, T., Beisswenger, C., Bals, R., Guzmán, C. A., Schneider-Daum, N., Carvalho-Wodarz, C. d. S., Lehr, C. M. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp. (160), e61069, doi:10.3791/61069 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter