Summary
Vi beskriver en protokoll for en tredimensjonal co-kultur modell av infiserte luftveier, ved hjelp av CFBE41o- celler, THP-1 makrofager, og Pseudomonas aeruginosa, etablert på luft-flytende grensesnitt. Denne modellen gir en ny plattform for samtidig å teste antibiotikaeffekt, epitelbarrierefunksjon og inflammatoriske markører.
Abstract
fDrug forskning for behandling av lungeinfeksjoner utvikler seg mot prediktive in vitro modeller av høy kompleksitet. Den mangefasetterte tilstedeværelsen av bakterier i lungemodeller kan tilpasse epitelordningen på nytt, mens immunceller koordinerer en inflammatorisk respons mot bakteriene i mikromiljøet. Mens in vivo modeller har vært valget for å teste nye anti-infeksiøse i sammenheng med cystisk fibrose, de fortsatt ikke nøyaktig etterligne in vivo forholdene til slike sykdommer hos mennesker og behandlingsutfall. Komplekse in vitro-modeller av de infiserte luftveiene basert på humane celler (bronkial epitel- og makrofager) og relevante patogener kan bygge bro over dette gapet og lette oversettelsen av nye antiinfeksiøs midler til klinikken. For slike formål har en co-kulturmodell av human cystisk fibrose bronkial epitelcellelinje CFBE41o- og THP-1 monocyttavledede makrofager blitt etablert, etterligne en infeksjon av human bronkial mucosa av P. aeruginosa på luftvæskegrensesnitt (ALI) forhold. Denne modellen er satt opp i syv dager, og følgende parametere vurderes samtidig: epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon, bakteriell overlevelse og betennelse. Den nåværende protokollen beskriver et robust og reproduserbart system for evaluering av legemiddeleffekt og vertsresponser som kan være relevante for å oppdage nye anti-infeksiøsiteter og optimalisere aerosolleveringen til lungene.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa er et relevant patogen i cystisk fibrose (CF) som bidrar til nedsatt lungevev1. Produksjonen av polysakkarider, som alginat og andre mucoid eksopolysakkarider, koordinerer sykdomsprogresjonen, noe som fører til seig bakteriell etterlevelse, begrenser levering av antibiotika til bakterier og beskytter bakteriene mot vertsufmunsystemet2. Overgangen av P. aeruginosa fra planktonisk stadium til biofilmdannelse er et kritisk problem i denne sammenhengen, og legger også til rette for forekomsten av antibiotikatoleranse.
I sammenheng med CF har musen primært blitt brukt som modell. Mus utvikler imidlertid ikke spontant denne sykdommen ved innføring av CF-mutasjoner3. De fleste bakterielle biofilmutvikling og legemiddelfølsomhetsstudier har blitt utført på abiotiske overflater, for eksempel Petri-retter. Denne tilnærmingen representerer imidlertid ikke in vivo-kompleksiteten. For eksempel er viktige biologiske barrierer fraværende, inkludert immunceller samt slimhinneepitelet. Selv om P. aeruginosa er ganske giftig for epitelceller, har noen grupper klart å dyrke en tidligere P. aeruginosa biofilm med menneskelige bronkialceller. Disse cellene stammer fra cystisk fibrose pasienter med CFTR mutasjon (CFBE41o- celler)4 og lov til å vurdere antibiotikaeffekt 5 eller vurdere korreksjon av CFTR protein underinfeksjon 6. En slik modell ble vist å forbedre forutsigbarheten av legemiddeleffekt, i tillegg til å muliggjøre karakterisering av problemer med legemidler som mislyktes i senere faser av narkotikautvikling7.
Men i lungene er slimhinneepitelet utsatt for luft. Videre spiller immunceller tilstede i luftveiene, som vevmakrofager, en viktig rolle mot inhalerte patogener eller partikler8. Makrofager migrerer gjennom de forskjellige cellelagene for å nå bronkial lumen og bekjempe infeksjonen. Videre må inhalerte legemidler også takle tilstedeværelsen av slim som et ekstra ikke-cellulært element i lungeluftblodbarrieren9. Faktisk er det utviklet flere komplekse tredimensjonale (3D) in vitro-modeller, med sikte på å øke in vivo relevansen. Co-kultur systemer ikke bare øke kompleksiteten i in vitro systemer for narkotika oppdagelse, men også gjøre det mulig å studere celle-celle interaksjoner. Slik kompleksitet har blitt adressert i studier om makrofagmigrasjon10, frigjøring av antimikrobielle peptider av nøytrofiler11, rollen som slim i infeksjon9, og epitelcellereaksjonen på overdreven skade12. Men en pålitelig CF-infisert in vitro-modell som har den genetiske mutasjonen i CF, som er utsatt for luften (økt fysiologisk tilstand), og integrerer immunceller mangler fortsatt.
For å bygge bro over dette gapet beskriver vi en protokoll for stabil menneskelig 3D-co-kultur i de infiserte luftveiene. Modellen er sammensatt av humane CF bronkial epitelceller og makrofager, infisert med P. aeruginosa og i stand til å representere både en diffus og immunologisk barriere. Med mål om å teste anti-infeksiøse midler ved rimelig høy gjennomstrømning, ble denne co-kulturen etablert på den gjennomtrengelige filtermembranen av brønnplateinnsatser, ved hjelp av to menneskelige cellelinjer: CFBE41o- og THP-1 monocyttavledede makrofager. Videre, for å til slutt studere avsetning av aerosoliserte anti-infeksiøs13, ble modellen etablert ved luftvæskegrensesnittet (ALI) i stedet for flytende dekket forhold (LCC).
Som vi rapporterer her, gjør denne modellen det mulig å vurdere ikke bare bakteriell overlevelse ved antibiotikabehandling, men også cellecytoktoksisitet, epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon og inflammatoriske responser, som er viktige parametere for narkotikautvikling.
Denne protokollen kombinerer to relevante celletyper for innåndingsbehandling av lungeluftveiene: makrofager og CF bronkial epitel. Disse cellene er seeded på motsatte sider av gjennomtrengelige støtteinnlegg, slik at celleeksponering for luft (kalt luft-flytende grensesnitt (ALI) forhold). Denne medkulturen av vertsceller blir senere smittet med P. aeruginosa. Begge vertscellelinjene er av menneskelig opprinnelse: epitelcellene representerer cystisk fibrose bronkial epitel, med en mutasjon på CF-kanalen (CFBE41o-), og THP-114-cellene er en godt preget makrofaglignende cellelinje. Et samløpet epitellag får først dannes på oversiden av brønnplateinnsatser før de makrofaglignende cellene legges til det motsatte rommet. Når samkulturen er etablert på ALI, er systemet inokulert med P. aeruginosa på den a apiske siden. Dette infiserte kokultursystemet brukes deretter til å vurdere effekten av et antibiotikum, for eksempel tobramycin. Følgende endepunkter analyseres: epitelbarriereintegritet når det gjelder transepithelial elektrisk motstand (TEER), visualisering av cellecelle- og cellebakterierinteraksjoner ved konfokal laserskanning av mikroskopi (CLSM), bakteriell overlevelse ved telling av kolonidannende enheter (CFU), vertscelleoverlevelse (cytotoksisitet) og cytokinfrigjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vekst og differensiering av celler i gjennomtrengelige støtteinnlegg
- Dyrk CFBE41o- i en T75 kolbe med 13 ml minimum essensiell medium (MEM) som inneholder 10% fosterkalvserum (FCS), 1% ikke-essensielle aminosyrer og 600 mg / l glukose ved 37 ° C med 5 % CO2 atmosfære. Tilsett friskt medium til cellene hver 2–3.
- Løsne cellene etter å ha nådd 70% samløpet i kolben med 3 ml trypsin- Etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) ved 37 °C i 15 min. Tilsett 7 ml fersk MEM og sentrifuger cellene ved 300 x g i 4 min ved romtemperatur (RT). Kast det overnaturlige og tilsett nye 10 ml MEM samtidig som klumpene forstyrres ved å pipe forsiktig opp og ned.
- Telle cellene med en automatisert celle teller eller hemocytometer kammer. Frøceller med en tetthet på 2 x 105 celler/ brønn i 12-brønnsplater med gjennomtrengelige støtter (porestørrelse på 3 μm, se Materialtabell).
MERK: Den automatiserte celletelleren bestemmer cellenummer, størrelsesfordeling og levedyktighet for cellene (se Materialtabell). Gjennomtrengelige støtter med en porestørrelse på 0,4 μm kan brukes her; Makrofagene bør imidlertid i denne tilstanden legges direkte til den a apiske siden, og deres transcellulære migrasjon vil ikke bli vurdert i dette tilfellet. - Frøceller ved flytende væsketilstand (LLC) ved å tilsette 500 μL av cellefjæringen på den apiske siden av den gjennomtrengelige støtten og 1,5 ml friskt medium i basolateral side. Deretter inkubere celler ved 37 °C under 5 % CO2, i 72 timer.
- For å skifte til luft-flytende grensesnitt (ALI) kultur, på den tredje dagen etter seeding, fjern mediet fra basolateral side først, deretter fra den apiske siden. Til basolateral side, tilsett 500 μL fersk MEM og endre mediet annenhver dag til cellene danner et sammenføyd monolag.
MERK: For forholdene som brukes i denne protokollen, er CFBE41o- cellene vanligvis samløpet etter 3-7 dager i kultur. - Vurder epitelbarriereegenskapene på dag 7 ved å inkubere CFBE41o- celler med 500 μL cellemedium i den apiske siden og 1,5 ml i basolateral side i 1 time, ved 37 °C under 5 % CO2.
- Mål barriereegenskaper via transepithelial elektrisk motstand (TEER), med en STX2 spisepinne elektrode og en epitelvolt-ohmmeter; etter 7 dager er dette høyere enn 300 Ω × cm².
MERK: Til slutt, i noen membraninnlegg, har cellene lav TEER. Derfor brukes ikke gjennomtrengelige innsatser med TEER < 300 Ω×cm².
- For å dyrke THP-1 celler, vokse dem i en T75 kolbe ved hjelp av 13 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% FCS, og inkubere ved 37 ° C under 5% CO2. Del celler annenhver dag ved å så 2 x 106 celler / ml celler i en ny T75 kolbe.
MERK: Ikke-differensierte THP-1-celler dyrkes som monocytter i suspensjon.- Differensier THP-1-cellene som følger. Sentrifugeinnholdet i en T75 ved 300 x g i 4 min. Kast den overnaturlige, resuspend pellet i friskt medium og sett i en ny T75. Legg til 10 ng / ml Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) inkubere cellene i RPMI i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2 atmosfære15.
MERK: Etter differensieringen med PMA sprer cellene seg ikke lenger og festes til kolben. - For å løsne THP-1 makrofaglignende celler, vask en gang med fosfatbufret saltvann (PBS) ved 37 °C og inkuber med 3 ml celleavløsning (f.eks. accutase) som inneholder 0,5 mM EDTA i 10 min ved romtemperatur.
- Inspiser cellene under et invertert mikroskop for å se etter celleavløsning. Tilsett 7 ml friskt medium og sentrifuge ved 300 x g i 4 min ved RT.
MERK: Makrofager kan også løsnes med trypsin-EDTA, 37 °C i 20 min. Trypsin er imidlertid strengere for makrofager enn den valgte celleavløsningsløsningen (se Materialtabell). - Etter å ha fjernet de overnaturante, re-suspendere makrofagceller i 3 ml THP-1 medium i en 15 ml konisk rør, telle cellene som beskrevet i 1.1.2. og inkuber i maksimalt 1 t ved 37 °C under 5 % CO2 før du setter opp samkulturen.
MERK: THP-1-celler i suspensjon kan farges med levedyktighetsfargestoffer for å se for seg samkulturen ytterligere. På dette trinnet bruker du fremgangsmåten nedenfor (trinn 1.2.5). - Flekkmakrofager med 10 μM cellesynlighetsfargestoff (basert på konvertering av acetatmoaeter ved intracellulære esteraser, se Materialtabell)der 3 μL av cellevinabilitetsfargen påføres cellesuspensjonen. Inkuber celler i 20 min ved 37 °C, 5 % CO2, vask deretter 1x med PBS 37 °C for å fjerne fargestoffet.
MERK: Sentrifuger cellene for å fjerne fargestoffet ved 300 x g i 4 min ved romtemperatur (RT).
- Differensier THP-1-cellene som følger. Sentrifugeinnholdet i en T75 ved 300 x g i 4 min. Kast den overnaturlige, resuspend pellet i friskt medium og sett i en ny T75. Legg til 10 ng / ml Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) inkubere cellene i RPMI i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2 atmosfære15.
2. Etablering av en epitel-makrofag co-kultur på gjennomtrengelige støtter
- Bruk CFBE41o- monolayers ved ALI med TEER ≥ 300 Ω×cm² (trinn 1.1.6.). Fjern mediet fra det nedre kammeret, snu støtten forsiktig inne i et sterilt glass Petriskål (50 mm x 200 mm), og fjern cellene som er overgrodd gjennom membranporene på undersiden av membranen ved hjelp av en celleskraper.
MERK: På grunn av porestørrelsen på 3 μm har epitelceller en tendens til å vokse gjennom porene mot basolateral side. Derfor må man fjerne dem før du legger til makrofagene på denne siden. CFBE41o- lunge epitelceller kan farges på dette trinnet. Prosedyren i trinn 1.2.5 kan brukes; Men i stedet for en cellesuspensjon påføres fargestoffløsningen i MEM (kun 500 μL apical side) på de vedbekbare cellene på den gjennomtrengelige støtten. - Bruk 2 x 105 celler/brønn (i 200 μL RPMI) fra cellesuspensjonen av PMA-differensierte THP-1-makrofager og plasser cellene på basolateral side av de inverterte innsatsene.
- Lukk Petri-rettene forsiktig og inkuber i 2 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
- Plasser innsatsene tilbake i de 12-brønns mikroplatene og tilsett 500 μL MEM-medium på basolateral side av den gjennomtrengelige innsatsen for å opprettholde ALI-forholdene. Cellene er nå klare for infeksjon.
3. Infeksjon av P. aeruginosa
MERK: Alle følgende trinn herfra må gjøres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium.
- Inokulert 15 ml lysogeny buljong (LB) supplert med 300 μg/ml ampicillin i en Erlenmeyer kolbe (50 ml) med en enkelt koloni P. aeruginosa PAO1-GFP.
MERK: Andre stammer av P. aeruginosa kan også brukes her, for eksempel PAO1 vill type, PA14 eller kliniske stammer, etter sine egne dyrkingsprotokoller. - Inkuber bakteriene i 18 timer ved 37 °C, risting ved 180 o/min.
- Overfør innholdet etter 18 timer til et konisk 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 3850 x g i 5 min. Kast det overnaturlige og tilsett 10 ml steril PBS ved 37 °C.
- Mål optisk tetthet på et spektrofotometer ved bølgelengde 600 nm og juster konsentrasjonen av bakterier ved hjelp av cellekulturmediet til en endelig konsentrasjon på 2 x 105 CFU/ml. Dette tilsvarer et mangfold av infeksjon (MOI) av en bakterie per epitelcelle.
- Tilsett 100 μL bakteriell suspensjon på den aksiske siden av den gjennomtrengelige støtten (trinn 2.4.) og inkuber ved 37 °C under 5 % CO2 i 1 time, slik at bakterier kan festes til cellene. Fjern deretter akkal væske forsiktig med en pipette for å gjenopprette ALI-forholdene. Hold noen prøver uinfisert som en kontroll.
MERK: På dette stadiet skal bakteriene som er festet, være belagt i LB agar (se trinn 5.4/5.5) for å bestemme de første bakteriene inokuler. - Inkuber stoffet av interesse etter bakteriell vedheft i cellene. For behandlingseksperimenter, tilsett 500 μL av en legemiddelløsning fortynnet i cellemedium (i denne protokollen tobramycin 6 μg / ml ble brukt) til den a apiske siden. Tilsett 1500 μL cellemedium uten stoff på basolateral side.
MERK: I stedet for å instilling av stoffene som en løsning, kan modellen også tilpasses aerosoldeponering. For slike formål blir cellene ved ALI matet fra basolateral side med 500 μL cellemedium. Legemidlet blir deretter først nebulisert og lov til å deponere i det a apiske rommet av en passende enhet (ikke beskrevet her). Den infiserte og behandlede prøven kan kontrolleres for endepunktene som er beskrevet i avsnittene 4–7. Fra dette trinnet kan gjennomtrengelige støtter brukes til å lage enten bilder (avsnitt 4) eller for å få resultater av bakterievekst og pattedyrcelle levedyktighet, blant andre (avsnitt 5-7).
4. Prøve forberedelse for konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM)
- Etter etableringen av co-kultur, infeksjon og narkotikabehandling, fjern alt medium fra den akiske og basolaterale siden. Vask 1x med PBS ved 37 °C og fest deretter cellene med 3 % paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved RT (300 μL på aksisk/600 μL på basolateral). Cellekjerner er farget med 5 μg/ml DAPI-PBS i 30 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: PFA er farlig. - Klipp membranene med en skalpell og plasser dem mellom to 12 mm mikroskopideksellyser med et monteringsmedium (se Materialtabell). La den tørke inne i strømningsbenken i 30 min før lagring ved 4 °C. Visualiser ved konfokal skanning av mikroskopi.
MERK: Etter samkulturen og før monteringen kan tette veikryss utføres. For det er cellene festet med paraformaldehyd 3% i 30 min, vasket igjen med PBS, og gjennomsyret med saponin 0,05% / BSA 1% i PBS. I denne protokollen ble reguleringsplanokkluderproteinet (ZO-1) oppdaget via mus anti-humant ZO-1 antistoff (1:400, inkubasjon ved 4 °C over natten). Prøvene ble deretter inkubert i 2 timer ved RT med geit anti-mus IgG antistoff Alexa Fluor 633 (1:2000 i rødt). Kjerner ble farget med DAPI (1 μg/ml) og montert med monteringsmedium på dekkslips. - Bruk et konfokalt mikroskop for å avbilde de lagrede membranene. Velg mål og lasere på 25 x eller 63 x vannsenking ved 405, 488, 505 eller 633 nm for deteksjon. Bilder skal ha en oppløsning på 1024 x 1024 piksler.
MERK: Laserne velges i henhold til flekken som brukes. - Skaff deg aktiske og tverrsnittsvisninger, og bruk zeta-stack-modus (10–15 stabler) for bygging av en tredimensjonal modell ved hjelp av bildeprogramvare.
5. Måling av bakteriell spredning via kolonidannende enheter (CFU)
- Samle det akiske og basolaterale mediet (som inneholder bakterier) for å vurdere CFU av ikke-tilknyttede bakterier. Samle 500 μL fra de akiske og basolaterale sidene og samle dem.
MERK: Bruk denne suspensjonen direkte til å telle bakterier (trinn 5.4) eller sentrifuge ved 21 250 x g i 10 min for å evaluere laktatdehydrogenase (LDH) fra supernatanten (avsnitt 6) og/eller re-suspendert i PBS for å telle ekstracellulære bakterier (trinn 5.4). - Vurder overlevelsen av bakterier festet og/eller internalisert i cellene ved å tilsette 500 μL sterilt deionisert kaldt vann i hvert rom av den gjennomtrengelige støtten. Inkuber celler i 30 min ved romtemperatur.
MERK: Prøvene kan enten være belagt på LB agar (se trinn 5.4) eller frosset (som hel innsatsplate) ved -20 °C for plating senere. - For vurdering av CFU av tilhenger/internaliserte bakterier, tin prøver ved 37 °C i 10 min (hvis frosset). Bruk pipettespisser for hver brønn, skrap membranoverflaten og pipetten opp og ned for å fjerne alt festet innhold.
MERK: På dette trinnet er alle epitelcellene lysed og tilhenger / internaliserte bakterier er tilgjengelige som en suspensjon som skal belagt. - Med bakteriell suspensjon fra begge fraksjoner, utføre en 1/10 seriell fortynning ved hjelp av Tween-80 0,05% i PBS og plate bakteriene på LB agar plater.
MERK: Fortynninger mellom 1 og 10 anbefales. Bakteriene skal telles i den høyeste fortynningen, hvor enkeltkolonier først identifiseres. - Inkuber agarplater ved 30 °C i 16–72 timer for å telle kolonier, og beregn CFU tilsvarende.
MERK: En temperatur på 30 °C på tidspunktet for plateinkubasjon er avgjørende for behandlede prøver og for å observere forsinket vekst av kolonier.
6. Evaluering av cellecytoktoksisitet via laktatdehydrogenaseanalyse
- Bruk supernatanten til infiserte celler som inneholder bakterier (fra trinn 5.1) for vurdering av cellebruk for LDH-analyse16. Sentrifuger supernatanten ved 21 250 x g i 10 min for å pellet bakteriene og til slutt resten av cellene. Bruk den bakteriefrie supernatanten til å måle LDH-frigjøring.
MERK: Det overnaturlige bør ikke fryses før du måler LDH ved denne analysen. - Overfør 100 μL av supernatanten til en 96-brønns plate, og tilsett 100 μL av LDH-analysens oppløsning (se materialtabellen). Inkuber ved romtemperatur i 5 min i mørket, og les deretter absorbans ved 492 nm.
7. Vurdere frigjøring av humane cytokiner
- For cytokin kvantifisering, bruk enten ELISA eller cytometrisk perle array immunoassay17(se Materialse tabell). For dette, sentrifuge supernatant fra trinn 5.1 ved 21,250 x g i 10 min og måle enten umiddelbart eller lagre -80 °C i opptil 15 dager til analyse.
- Evaluer supernativa med et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett.
MERK: Prosedyren følger produksjonsinstruksjonene, som inkluderer belegg av plater med fangstantistoff, tilsetning av prøvene (100 μL) og cytokinstandarder, inkubasjon, vasking og tilsetning av deteksjonsantistoff for å gi en kolorimetrisk måling av cytokintilstedeværelse. Alternativt kan strømningscytometri brukes til å måle cytokiner via kommersielt tilgjengelige sett (se Materialse tabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser morfologien til den resulterende co-kulturen av humane bronkiale epitelceller og makrofager etter å ha vokst både i 24 timer på den apiske og basolaterale siden av gjennomtrengelige støtter, henholdsvis. Epitelbarriereintegriteten er vist ved høyere TEER (834 Ω×cm2)og CLSM ved å vaksinere for det tette koblingsproteinet ZO-1 (figur 1B). De samme resultatene observert i form av barriere integritet av uinfiserte CFBE41o- monokultur kan sees i de uinfiserte epitel-makrofag co-kulturer.
For å modellere en bakteriell infeksjon ble P. aeruginosa inokulert ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 1:1 på CFBE41o- celler. Seks timer etter infeksjon (figur 2A) ble makrofager observert på den a apiske siden av samkulturen. Etter infeksjonen falt TEER fra 834 til 250 Ω ×cm2, noe som indikerer en kompromittert epitelbarriere, som også visualisert av ZO-1 farging (figur 2B).
Figur 3 viser makrofagtransmigrasjon gjennom gjennomtrengelig membran porer og bakterier opptak av THP-1 celler på den a apiske siden. Prøvene ble fikset til 1, 3 og 6 t etter inkubasjon fra uavhengige eksperimenter. I THP-1 monokulturer (figur 3A-C)ble makrofager migrasjon observert så tidlig som 1 time, mens i co-kultur (Figur 3D-F), dette ble sett etter 3 h infeksjon. Bakterieopptak i THP-1 ble observert etter 3 timer infeksjon, både i monokultur og co-kultur. Ingen bakteriell opptak av CFBE41o- kunne sees. Tverrsnittsvisninger ble plassert slik at den gjennomtrengelige membranstøtten var i midten som en separasjon av det akiske og basolaterale rommet.
Figur 4 viser konfokal skanning av lasermikroskopibilder av infiserte kokulturer (CFBE41o- + THP-1) behandlet med eller uten tobramycin i 6 timer (figur 4A, B) eller 20 t ( figur4C, D). Uten behandling døde både epitelcellene og makrofagene etter 20 timer infeksjon (figur 4C). Men ved tobramycinbehandling bevares vertscellene etter 20 timer; fortsatt kan noen bakterier observeres i kulturen. Til tross for å bli sett etter 6 timer behandling i mikroskopibildene (figur 4B), spredte bakteriene seg ikke som observert i CFU-analysene i figur 4E. Likevel, etter 20 h behandling, bakteriene gjenvunnet spredningsevnen, sett av koloniene i CFU-analysen (Figur 4F). Cellelyseprotokollen med kaldt vann og skraping kan frigjøre bakterier festet og muligens internalisert i celler. Samtidig blir cellene ødelagt (Tilleggsfigur S1A, B). Sentrifugeringstrinnene som brukes i dette papiret for epitelceller (300 x g) eller bakterier (21 250 x g) hindret ikke levedyktigheten til begge (supplerende tall S1C, D). Alle CFU-analyser ble utført ved å fryse prøvene ved -20 °C, etterfulgt av tining og plating. Denne prosedyren reduserte antall bakterier med 2-logger, sammenlignet med ferske prøver (Supplerende figur S1E). Siden denne prosedyren gjøres samtidig for alle eksperimentelle grupper (behandlet og ubehandlet) på forskjellige tidspunkter, vil denne reduksjonen bli innlemmet i de endelige resultatene (Supplerende figur S1E). Videre viste konsentrasjonen av tobramycin som brukes her ingen toksisitet for de uinfiserte cellene (Supplerende figur S2A) og heller ingen ytterligere inflammatorisk respons (Supplerende figur S2B). Det var imidlertid innenfor rekkevidden av den minste hemmende konsentrasjonen for å drepe P. aeruginosa.
Figur 5 viser transepithelial elektrisk motstand (TEER) og celle levedyktighet. Figur 5A–B illustrerer TEER av monokulturer og medkulturer. Co-kulturen i CFBE41o- celler med THP-1 forårsaket ingen endring i epitelbarriereintegriteten sammenlignet med monokulturen (røde barer). Ved infeksjonen falt TEER-verdien (grønn bar). Etter 1 time infeksjon ble noen prøver behandlet med antibiotika tobramycin (blå bar), i 6 eller 20 timer. Behandlingen bevarte epitelbarriereintegriteten, som observert av den høyere TEER. Figur 5C viser prosentandelen av LDH-frigjøring som en indikasjon på celletoksisitet ved infeksjon og tobramycinbehandling etter 6 timer. Selve cokulturen induserte en frigjøring av LDH, som var den samme for de infiserte cellene (rundt 20%). Etter 20 timer infeksjon kunne det ikke oppdages noe signal om LDH. For å bevise LDH-pålitelighet for langtidsinfeksjon ble PAO1-GFP inkubert i medium med og uten LDH 1 E/ml sammenlignet med respektive uinfiserte kontroller (supplerende figur S2C). LDH-signalet gikk tapt etter langvarig inkubasjon (20 h) med P. aeruginosa, noe som indikerer at LDH bare er stabil i kortere inkubasjonstider i infiserte kulturer.
Figur 6 viser kinetikken til proinflammatoriske cytokiner som oppdages via ELISA. Fordelen med en infisert co-kultur av CFBE41o- og THP-1 celler ble observert med høyere sekreter av proinflammatoriske cytokiner. Sekresjonen av noen proinflammatoriske cytokiner var enten lik (IL-6) eller høyere (IL-8, TNF-α, IL-1β) i den infiserte kokulturen (figur 6C) enn i de tilsvarende monokulturene (figur 6A-B). Uventet er noen cytokiner i THP-1 monokulturer (figur 6B) nedregulert i infiserte prøver (Il-8, TNFα, IL-1β).
Figur 7 viser frigjøring av cytokiner i mono- og co-kulturer ved infeksjon og behandling med tobramycin målt via fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Sekresjonen av den proinflammatoriske cytokin IL-8 (figur 7A) og den antiinflammatoriske cytokin IL-10 (figur 7F) var høyere i co-kulturer av epitelceller og makrofager, sammenlignet med monokulturer. Men for alle andre cytokiner (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 og GM-CSF) (Figur 7B-E) var nivåene av cytokinsekresjon ikke høyere i samkulturen som i de respektive monokulturene.
Figur 1: Tverrsnitt og akeale syn på den uinfiserte epitel-makrofagskokulturen. (A) Kryssvisninger av uinfiserte 24 h epitel-makrofag co-kultur. CFBE41o- farget rød, THP-1 makrofager i gult og kjerner i blått (DAPI). (B) Aksial utsikt over uinfiserte CFBE41o- monolayer immuno-farget for ZO-1 (rød). -Kjerner. Skala barer: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tverrsnitt og aksiale syn på den infiserte epitel-makrofagskokulturen. (A) Kryssvisninger og (B) apical syn på epitel-makrofag co-kultur på 6 h etter infeksjon (hpi) med P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- farget i rødt, THP-1 makrofager i gult, kjerner i blått (DAPI) og P. aeruginosa PAO1-GFP i grønt. (B)Aksiale visninger av 6 h infisert CFBE41o- monolayer. Skala barer: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kinetikk av makrofagtransmigrasjon og bakterieopptak visualisert ved tverrsnitt av 3D-modellen. PAO1-GFP infeksjon kinetikk i monokulturer av THP-1 makrofager (A-C) eller co-kultur (D-F). THP-1 makrofager er farget i rødt, kjerner av epitelceller i blått (DAPI) og P. aeruginosa i grønt (GFP). Hver figur er delt inn i apiske og basolaterale sider, mellomrommet i mellom anses å være membranen, som er tom eller okkupert av CFBE41o- samløpet lag (D-F). Innlegg i tallene viser bakterieopptak av makrofager til forskjellige tider (A-F). Skala barer: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av PAO1-GFP overlevelse i tobramycin-behandlet co-culture. (A-D) Konfokale mikrografer co-kulturer med og uten behandling. (A)Ubehandlet medkultur etter 6 timer infeksjon. (B)Infisert samkultur behandlet med tobramycin 6 μg/ml (Tob) i 6 timer (C) Ubehandlet co-kultur 20 h etterinfeksjon, (D) infisert kokultur behandlet med tobramycin 6 μg/ml i 20 timer. Kjerner farget med DAPI (blå), makrofager (rød) og P. aeruginosa GFP (grønn). (E) Kolonidannende enheter (CFU) av tilhenger/internaliserte bakterier etter 6 og (F) 20 timer med tobramycin 6 μg/ml behandling. Tom membraninnsats ble brukt som et abiotisk substrat for å vokse PAO1-GFP. Toveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest (# ingen kolonier) ble brukt, *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: ikke signifikant. Feilfelt indikerer standardavvik, n = 9–27 replikeringer av 3–9 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Barriereintegritet og evaluering av levedyktigheten til mono- og co-kultur. Følgende samkulturforhold ble vurdert: uinfiserte (grå barer), infiserte (grønne barer), eller infiserte og behandlet med tobramycin (blå barer). (A) Transepithelial elektrisk motstand etter 6 timer og (B) 20 timer infeksjon i monokulturer (CFBE41o- og THP-1) og co-kultur. (C) Cytotoksisitet av mono- og co-kultur målt via LDH utgivelse 6 h etter infeksjon. Toveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest ble brukt; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: ikke signifikant. Feilfelt indikerer standardavvik. n = 9 replikerer av tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kinetikk av cytokinfrigjøring av uinfiserte og infiserte mono- og cokulturovernanter vurdert via ELISA. ELISA ble gjort i henhold til kit produsentens protokoll. (A) CFBE41o-, (B) THP-1, og (C) co-kultur slippe IL-8, TNF-α, IL-1β, og IL-6. Feilfelt indikerer standardavvik. n = 6 replikerer av 2 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Supernatante resultater av cytokinpanel målt via FACS med og uten tobramycin 6 μg/ml for 6 timer etter infeksjon. Supernatanter av mono- og co-kultur etter 6 t post-infeksjon brukes til å analysere de respektive cytokiner IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) og IL-10 (F). Feillinje indikerer standardavvik, n = 9 replikeringer av 3 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Kontroller eksperimenter for kritiske trinn i protokollen. (A, B) Mikrografer av CFBE41o- celler i 24-brønnsplater dyrket i 2 dager med tetthet på 2 x 105 celler / brønn. (A) CFBE41o- celler i PBS i 30 min, og (B) vannbehandlede celler etter 30 min etter skraping med en pipette. (C)Levedyktighet av pattedyrceller etter sentrifugering. CFBE41o- celler ble fjernet fra T75 celle kultur kolbe som beskrevet i trinn 1.1.1 og 1.1.2. 100 μL av resulterende cellesuspensjon ble analysert i 10 ml isotonisk oppløsning. En automatisert celleteller ble brukt til å vurdere levedyktigheten til enkeltceller. Deretter ble respektive cellesuspensjoner sentrifugert ved 300 x g i 4 min, suspendert og talt igjen. Feilfelt indikerer standardavvik, n = 6 forskjellige flasker med 2 individuelle eksperimenter. (D)Levedyktighet av PAO1-GFP etter sentrifugering. PAO1-GFP-bakterier ble fortynnet til OD = 0,01 i cellemedium. CFU ble vurdert via en 10-fold fortynningsrad og LB-plater inkubert over natten ved 30 °C. Respektive plastrør ble sentrifugert ved 21 250 x g i 10 min og suspendert på nytt i medium. CFU ble vurdert tilsvarende igjen. To-tailed studentens t-test, * p < 0,033. Feillinje indikerer standardavvik, n = 6 av 2 eksperimenter. (E) Levedyktighet av bakterier etter frysing. PAO1-GFP bakterier ble forberedt som i (D) og CFU ble analysert, deretter plastrør ble frosset i en dag ved -20 °C og tint for å vurdere CFU igjen. To-tailed studentens t-test, *** p < 0,001. Feilfelt indikerer standardavvik, n = 6 av to eksperimenter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Kontroller eksperimenter for å vurdere LDH-atferd og påvirkning av tobramycin. (A) Kontrolleksperiment for å vurdere cytotoksisitet etter 20 timer inkubasjon med 6 μg/ml tobramycin. Mono- og co-kultur ble gjort som beskrevet i protokollen, men cellene ble dyrket i 2 dager på 24-brønnsplater og THP-1-celler ble sådd apically. Celler med 6 μg/ml tobramycin eller kontroller ble inkubert i 20 timer. Enveis ANOVA, Tukeys flere sammenligningstest, *** p < 0,001. Feillinje indikerer standardavvik, n = 6 av 2 eksperimenter (CFBE41o-), n = 3 av ett eksperiment (THP-1 og co-kultur). (B) Kontroll-ELISA av supernatanter av mono- og samkultur med/uten tobramycin. Cellekulturen ble gjort i henhold til (A) for å vise ingen cytokinfrigjøring sammenlignet med kontroller for alle forhold. ELISA ble gjort i trinn 7.1 og 7.2, 10 μg/ml (LPS) ble lagt til som kontroll, IL-8-utgivelse for LPS-behandlede kontroller som inneholder THP-1 var høyere enn påviselig. Toveis ANOVA, Tukeys flere sammenligningstest, ns p > 0,12; * p < 0,033; p < 0,001. Feilfelt indikerer standardavvik, n = 6 av to eksperimenter, n = 3 av ett eksperiment (LPS-kontroll). (C) LDH nedbrytning på grunn av overdreven PAO1-GFP spredning. LDH ble tilsatt ved konsentrasjon på 1 E/ml til MEM Medium. Enten LDH medium eller kontrollmedium ble brukt til å fortynne celler til OD = 0,01 (tilsvarer 1 x 108 CFU / ml) og deretter inkubert i 20 h. LDH analyse ble gjort som beskrevet i avsnitt 6. Enveis ANOVA, Tukeys flere sammenligningstest, ns p > 0,12; p < 0,001. Feillinje indikerer standardavvik, n = 8–9 av tre individuelle eksperimenter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver en protokoll for en 3D-co-kultur av de infiserte luftveiene, som utgjøres av den menneskelige cystiske fibrose bronkial epitelcellelinjen CFBE41o- og den menneskelige monocyttavledede makrofagcellelinjen THP-1. Protokollen tillater vurdering av epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon, bakterieoverlevelse og betennelse, som er viktige parametere ved testing av legemiddeleffektivitet og vertsrespons samtidig. Nyheten i modellen ligger innenfor inkorporering av epitelceller (det vil vil vil at human CF-cellelinje og makrofager) med akutt bakteriell infeksjon (det vil vil at P. aeruginosa). Den akutte infeksjonen i epitelcellene er vist å være kontrollert av et antibiotikum (f.eks. tobramycin). I tillegg til bruk av en menneskelig CF-cellelinje, er hele modellen satt opp ved ALI-forhold, som er betydelig nærmere de fysiologiske forholdene i CF. Bruken av en CF-cellelinje implementerer noen av egenskapene til sykdommen i modellen. Mutasjonen av cystisk fibrose transmembrane konduktanledningsregulator (CFTR) er direkte relatert til dysregulering av epitelvæsketransport i lungene. Videre resulterer mutasjoner i CF-genet, som ΔF508, i tykt slim, med betennelse og alvorlig lungeskade ved infeksjon med P. aeruginosa4. Disse patologiske manifestasjonene forårsaket av dysfunksjonelle CFTR innebærer potensielt autofagifunksjon som en viktig cellulær mekanisme forbundet med patogenesen av CF lungesykdom18. Imidlertid cfbe41o- ikke klarer å hemmelig slim, som er en begrensning av denne cellelinjen. Hvis det er ment å studere rollen som slim mer spesifikt, protokollen kan tilpasses ved hjelp av andre bronkial cellelinjer (f.eks Calu-3).
Et kritisk skritt for å sette opp denne protokollen er kombinasjonen av epitel- og immunceller og den påfølgende infeksjonen med P. aeruginosa ved ALI. Infeksjonen av CFBE41o- av P. aeruginosa in vitro har allerede blitt beskrevet, hovedsakelig ved hjelp av et strømningscellekammer, supplert med arginin i kulturmediene, for å forbedre epitelcelleoverlevelse og støtte biofilmdannelse19. Den nåværende protokollen rettet mot en ny modell ved hjelp av bare menneskelige celler, som dessuten kan dyrkes på ALI på gjennomtrengelige brønnplateinnsatser for høyere prøvegjennomstrømning. Inkluderingen av THP-1 differensierte makrofager som en menneskelig udødeliggjort cellelinje, i stedet for å være avhengig av å skaffe reproduserbare primære celler fra givere, er en annen fordel med vår modell. Ved å legge disse makrofagene til basolateral side av gjennomtrengelig membranstøtte, ble det observert at makrofager utstikket og til slutt transmigrerte til den apiske siden av den filterdyrkede epitelbarrieren. En variant av denne protokollen kan være tillegg av makrofager direkte på den a apiske siden på toppen av epitelcellene, som beskrevet av Kletting et al. 14. Samkulturen til ikke-menneskelige immun- og lungeceller har allerede blitt beskrevet før. Ding et al. 10 brukte mus Lewis lungekarsinomceller på gjennomtrengelig innsats støtter i kombinasjon med makrofager på basolateral side og infisert med S. aureus, et annet kritisk patogen av kronisk infeksjon hos CF-pasienter. Men i denne studien var det ikke noe fokus på cystisk fibrose eller å bruke co-kulturen som en plattform for evaluering av legemiddeleffekt. Vår protokoll kan tilpasses andre bakterielle infeksjoner, som Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, eller Burkholderia cepacia- viktige patogener i CF lunge.
Et annet kritisk trinn er tillegg av THP-1 makrofager til cellene ved å vende de gjennomtrengelige innsatsene opp ned (seksjon 2). Dette er avgjørende for å vurdere makrofagtransmigrasjon gjennom brønnen til infeksjonssiden. Den senere bildebehandlingsprosessen fra 3D-modellene med z-stabler og tverrsnittsvisning kan utføres for å observere innsiden av makrofager og oppdage bakterieopptak (figur 3). Ved 1 hpi migrerer bakterier på den a apiske siden gjennom membranen, mens makrofagmigrasjon og opptak bare finner sted ved 3 hpi. Derfor etter 1 time infeksjon var det hensiktsmessig å starte behandlingen med tobramycin og ha mulighet til å håndtere både vertscelle- og bakterieoverlevelse i lang tid (20 h). I løpet av protokollen er opprettholdelse av sterilitet et kritisk problem på grunn av de mange trinnene som hver bærer risikoen for forurensning. Likevel vil erfarne cellekulturpersonell kunne følge denne protokollen etter riktig forberedelse og opplæring. Cellemedium bør kontrolleres regelmessig for forurensning, helst etter alle kritiske trinn.
Som med enhver modell har den infiserte samkulturen også noen begrensninger; For eksempel integreringen av makrofaglignende celler. Her var det viktig å ha makrofager på basolateral side; Imidlertid kan manipuleringen av innsatsen med et tidligere voksent epitellag ha gitt tidlig skade og forstyrrelser til samkulturen. Selv om den gjennomtrengelige støttemodellen ga høy gjennomstrømningsegenskaper, som ikke har blitt observert i tidligere medkulturer i CF-infisert lunge20,21. Med det må ytterligere eksperimenter vurdere begrensningene ved å bruke THP-1 som makrofagerstatning. Mens denne cellelinjen er mye brukt, er den mindre responsiv for LPS22, og den mangler full aktivering og hele befolkningen er ikke differensiert fra monocytter til makrofaglignende celler23. En annen begrensning er mangelen på andre viktige komponenter i CF-infeksjon og legemiddellevering. CFBE41o- cellelinjen har ikke cilia heller ikke produserer slim, som vanligvis skjer 20-30 dager med cellekultur på ALI. Da dette ikke var tilfelle for CFBE41o- cellelinje, brukte vi cellene etter syv dager da en tett epitelbarriere ble dannet. Mucociliary clearance endrer bostedsforholdene for enten mikrober24 ellerlegemiddelpartikler 9,,25 og in vitro modeller som vurderer lungedeponering bør ta hensyn til dette. Forskjellig fra det som observeres av andre celler, setter vevskulturen belegg med et ekstracellulært matrisemateriale (som fibronectin eller kollagen I) ikke en signifikant forskjell for CFBE41o-, for eksempel i TEER26. Derfor ble de gjennomtrengelige filtrene ikke belagt med et ekstracellulært matrisemateriale i denne protokollen.
Med protokollen beskrevet her, mono og co-kulturer etter 6 h infeksjon gir tilstrekkelig cytokin utgivelse som skal brukes som en måling i fremtidig narkotikatesting. Medkulturen gir en fordel av cellesamarbeid i modellering immunrespons. Ineffektiviteten av tobramycin i å redusere betennelse var forventet siden ikke alle bakterier ble eliminert under behandlingen (figur 4E, F). Likevel er modellering av responsen på tobramycin i en CF-modell avgjørende, da tobramycin (i høyere konsentrasjoner) kan være effektiv i P. aeruginosa hemming, selv på biofilm19,27. En mulighet for videre bruk av denne protokollen er å integrere antiinflammatoriske legemidler i behandlingen. Den generelle anbefalingen om inflammatoriske responser ville være å bruke den korte varighetsbehandlingen (6 h), som fortsatt har vertscellen og bakteriene tilstede. Etter dette tidspunktet blir vertscellene ødelagt i ubehandlede prøver. Både ELISA og FACS kan brukes til å måle frigjøring av cytokiner. Til slutt, hvis prøvene lagres lenger enn 15 dager ved -80 °C, anbefales det å kontrollere cytokinenes pålitelighet ved for eksempel positiv kontroll av ferske prøver (f.eks. celler stimulert med LPS).
Noen endringer av protokollen er mulige. For eksempel kan den nåværende protokollen utvides til anvendelse av nebuliserte legemidler (trinn 3.6). Dette er nødvendig for å modellere lungemedisinlevering via oral innånding. Nebulisering av vannløselige legemidler, som tobramycin, eller nanobærere derav, som liposomal colistin, er relativt rett frem av kommersielt tilgjengelige enheter som rutinemessig brukes i klinikken. Det er også flere kommersielt tilgjengelige enheter for å deponere aerosoler på cellekulturinnlegg. I tillegg, som modellen beskrevet her er basert på gjennomtrengelige membranstøtter, kan den også vedtas til noen moderne mikrofluidiske (f.eks. "lunge på en chip") enheter, for eksempel for å studere påvirkning av pust og tilhørende mekanisk strekking og endringer i luftstrømmen. Videre kan denne protokollen endres ved tillegg av slim eller erstatning av primære celler, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som skal tas opp. Et annet interessant neste skritt ville være testing av nanomedisiner, spesielt som nanoteknologi gjør fremskritt i utviklingen av romanen anti-infeksiøs28, CF correctors29 og co-levering av antibiotika og pathoblockers30. Samlet sett kan den nåværende protokollen oppfattes som nyttig for å vurdere bakteriell overlevelse ved antibiotikabehandling i et komplekst system, sammen med noen vertsrelaterte avlesninger: cellecytoktoksisitet, epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon og inflammatorisk respons. Dette er viktige parametere for narkotikautvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet fikk støtte fra EUs HORIZON 2020-program for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon i henhold til tilskuddsavtale nr. Vi takker Dr. Ana Costa og Dr. Jenny Juntke for den store støtten til utviklingen av medkulturen, Olga Hartwig, for den vitenskapelige illustrasjonen, Anja Honecker, for ELISA-analyser, Petra König, Jana Westhues og Dr. Chiara De Rossi for støtte til cellekultur, analyse og mikroskopi. Vi takker også Chelsea Thorn for korrekturlesing av manuskriptet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
