Summary
Vi beskriver en protokol for en tre-dimensionel co-kultur model af inficerede luftveje, ved hjælp af CFBE41o- celler, THP-1 makrofager, og Pseudomonas aeruginosa, etableret på luft-væske interface. Denne model giver en ny platform til samtidig at teste antibiotika effekt, epitelbarriere funktion, og inflammatoriske markører.
Abstract
fDrug forskning til behandling af lungeinfektioner skrider frem i retning af prædiktive in vitro modeller af høj kompleksitet. Den mangesidede tilstedeværelse af bakterier i lungemodeller kan re-tilpasse epitel arrangement, mens immunceller koordinere en inflammatorisk reaktion mod bakterier i mikromiljø. Mens in vivo modeller har været valget til at teste nye anti-infektiøse i forbindelse med cystisk fibrose, de stadig ikke præcist efterligne in vivo betingelser for sådanne sygdomme hos mennesker og behandlingsresultater. Komplekse in vitro-modeller af de inficerede luftveje baseret på humane celler (bronkiale epitel og makrofager) og relevante patogener kunne bygge bro over dette hul og lette oversættelsen af nye anti-infektiøs i klinikken. Til sådanne formål, en co-kultur model af den menneskelige cystisk fibrose bronkiale epitelcelle linje CFBE41o- og THP-1 monocyt-afledte makrofager er blevet etableret, efterligne en infektion af den menneskelige bronkiale slimhinde ved P. aeruginosa på luft-væske interface (ALI) betingelser. Denne model er sat op i syv dage, og følgende parametre er samtidig vurderet: epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakteriel overlevelse, og inflammation. Denne protokol beskriver et robust og reproducerbart system til evaluering af lægemiddeleffektivitet og værtsresponser, der kan være relevante for at opdage nye anti-infektiøsstoffer og optimere deres aerosollevering til lungerne.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa er et relevant patogen i cystisk fibrose (CF), der bidrager til nedsat lungevæv1. Produktionen af polysaccharider, såsom alginat og andre mucoid exopolysaccharider, koordinerer udviklingen af sygdommen, hvilket fører til ihærdig bakteriel overholdelse, begrænser leveringen af antibiotika til bakterier og beskytter bakterier mod værtens immunsystem2. Overgangen af P. aeruginosa fra planktonstadiet til biofilmdannelse er et kritisk spørgsmål i denne sammenhæng, hvilket også letter forekomsten af antibiotikatolerance.
I forbindelse med CF er musen primært blevet brugt som model. Mus, dog, ikke spontant udvikle denne sygdom med indførelsen af CF mutationer3. De fleste af de bakterielle biofilm udvikling og narkotika modtagelighed undersøgelser er blevet udført på abiotiske overflader, såsom petriskåle. Denne fremgangsmåde repræsenterer imidlertid ikke kompleksiteten. For eksempel er vigtige biologiske barrierer fraværende, herunder immunceller samt slimhindepitel. Selvom P. aeruginosa er ganske giftigt for epitelceller, har nogle grupper formået at co-dyrke en tidligere P. aeruginosa biofilm med menneskelige bronkiale celler. Disse celler stammer fra patienter med cystisk fibrose med CFTR-mutation (CFBE41o- celler)4 og fik lov til at vurdere antibiotiskeffekt 5 eller vurdere korrektionen af CFTR-proteinet underinfektion 6. En sådan model viste sig at forbedre forudsigeligheden af lægemidlets effektivitet, ud over at muliggøre karakterisering af problemer med lægemidler, der mislykkedes i senere faser af udviklingen af lægemidler7.
Men i lungerne, slimhinde epitel er udsat for luft. Desuden spiller immunceller, der findes i luftvejene, ligesom vævsmakrofager, en afgørende rolle mod inhalerede patogener eller partikler8. Makrofager migrere gennem de forskellige cellelag for at nå bronkial lumen og bekæmpe infektionen. Desuden, inhalerede lægemidler også nødt til at klare tilstedeværelsen af slim som en yderligere ikke-cellulære element i lungeluftblod barriere9. Faktisk er der udviklet flere komplekse tredimensionale in vitro-modeller med det formål at øge in vivo-relevansen. Co-kultur systemer ikke kun øge kompleksiteten af in vitro-systemer til opdagelse af lægemidler, men også gøre det muligt at studere celle-celle interaktioner. En sådan kompleksitet er blevet behandlet i undersøgelser om makrofag migration10, frigivelse af antimikrobielle peptider af neutrofiler11, den rolle, slimi infektion 9, og epitelcellereaktion på overdreven skade12. Men en pålidelig CF-inficeret in vitro-model, der er udstyret med den genetiske mutation i CF, der er udsat for luften (øget fysiologisk tilstand), og integrerer immunceller mangler stadig.
For at bygge bro over denne kløft beskriver vi en protokol for stabile menneskelige 3D-samkulturer i de inficerede luftveje. Modellen består af humane CF bronkiale epitelceller og makrofager, inficeret med P. aeruginosa og i stand til at repræsentere både en diffusional og immunologisk barriere. Med det mål at teste anti-infektiøs på rimeligt høj gennemløb, blev denne co-kultur etableret på den gennemtrængelige filtermembran af godt plade skær, ved hjælp af to menneskelige cellelinjer: CFBE41o- og THP-1 monocyt-afledte makrofager. Desuden, til sidst at studere deposition af aerosoliserede anti-infektiøs13, modellen blev etableret på luft-væske interface (ALI) snarere end flydende dækket betingelser (LCC).
Som vi rapporterer her, denne model giver mulighed for at vurdere ikke kun bakteriel overlevelse på en antibiotikabehandling, men også celle cytotoksicitet, epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, og inflammatoriske reaktioner, som er væsentlige parametre for udviklingen af lægemidler.
Denne protokol kombinerer to relevante celletyper til inhalationsbehandling af lungeluftvejene: makrofager og CF bronkial epitel. Disse celler er seedet på modsatte sider af gennemtrængelige støtte skær, så celle eksponering for luft (kaldet luft-væske interface (ALI) betingelser). Denne samkultur af værtsceller er efterfølgende inficeret med P. aeruginosa. Begge værtscellelinjer er af menneskelig oprindelse: Epitelcellerne repræsenterer cystisk fibrose bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o-), og THP-114 celler er en vel karakteriseret makrofag-lignende cellelinje. Et sammenløb epitellag er først tilladt at danne på oversiden af godt plade skær før makrofag-lignende celler er føjet til det modsatte rum. Når co-kulturen er etableret på ALI, er systemet podet med P. aeruginosa på den apikale side. Dette inficerede samkultursystem anvendes derefter til at vurdere effekten af et antibiotikum, f.eks. Følgende endepunkter analyseres: epitelbarriereintegritet i form af transepithelial elektrisk modstand (TEER), visualisering af cellecelle- og cellebakterier ved konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM), bakteriel overlevelse ved optælling af kolonidannende enheder (CFU), værtscelleoverlevelse (cytotoksicitet) og cytokinfrigivelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vækst og differentiering af celler i gennemtrængelige støtte skær
- Dyrk CFBE41o- i en T75 kolbe med 13 ml minimumstingentielt medium (MEM), der indeholder 10% føtal kalveserum (FCS), 1% ikke-essentielle aminosyrer og 600 mg/L-glucose ved 37 °C med 5 % CO2-atmosfære. Tilføj frisk medium til cellerne hver 2-3 dage.
- Aflad cellerne efter at have nået 70% sammenløb i kolben med 3 ml trypsin- Ethylenediamintetraaceticsyre (EDTA) ved 37°C i 15 min. Der tilsættes 7 ml frisk MEM, og cellerne centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT). Kassér supernatanten og tilsæt nye 10 ml MEM, mens klumperne forstyrres ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Tæl cellerne med en automatiseret celletæller eller hæmocytometerkammer. Frøceller med en massetæthed på 2 x 105 celler/brønd i 12-brøndplader med gennemtrængelige understøtninger (porestørrelse på 3 μm, se materialetabel).
BEMÆRK: Den automatiserede celletæller bestemmer cellernes cellenummer, størrelsesfordeling og levedygtighed (se Materialefortegnelse). Permeable støtter med en pore størrelse på 0,4 μm kunne anvendes her; Makrofagerne i denne tilstand bør dog føjes direkte til den apikale side, og deres transcellulære migration vil ikke blive vurderet i dette tilfælde. - Frøceller i flydende væsketilstand (LLC) ved at tilsætte 500 μL af cellesuspensionen på den apikale side af den gennemtrængelige støtte og 1,5 ml frisk medium i basolateral side. Derefter inkuberes celler ved 37°C under 5% CO2i 72 timer.
- For at skifte til den luft-væske interface (ALI) kultur, på den tredje dag efter såning, skal du først fjerne mediet fra basolateral side, derefter fra den apikale side. Til basolateral side, tilsæt 500 μL frisk MEM og ændre mediet hver anden dag, indtil cellerne danner et sammenflydende monolag.
BEMÆRK: For de forhold, der anvendes i denne protokol, CFBE41o- celler normalt er sammenløb efter 3-7 dage i kultur. - Vurder epitelbarriereegenskaberne på dag 7 ved inkubering af CFBE41o- celler med 500 μL cellemedium i den apikale side og 1,5 ml i basolateral side i 1 time ved 37°C under 5% CO2.
- Mål barriereegenskaber via transepithelial elektrisk modstand (TEER) med en STX2 spisepindelektrode og et epiteltet-volt-ohmmeter; efter 7 dage er dette højere end 300 Ω×cm².
BEMÆRK: Til sidst, i nogle membran skær, cellerne har lav TEER. Derfor anvendes gennemtrængelige skær med TEER < 300 Ω×cm² ikke.
- At dyrke THP-1 celler, dyrke dem i en T75 kolbe ved hjælp af 13 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% FCS, og inkubere ved 37 ° C under 5% CO2. Opdel celler hver anden dag ved at så 2 x 106 celler/ml-celler i en ny T75-kolbe.
BEMÆRK: Ikke-differentierede THP-1 celler dyrkes som monocytter i suspension.- Differentiere THP-1 celler som følger. Centrifugeindholdet i en T75 ved 300 x g i 4 min. Kassér supernatanten, opspjælret pellet i frisk medium og sat i en ny T75. Der tilsættes 10 ng/ml Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) incubatig cellerne i RPMI i 48 timer ved 37 °C og 5% CO2 atmosfære15.
BEMÆRK: Efter differentieringen med PMA formerer cellerne sig ikke længere og fastgøres til kolben. - For at frigøre THP-1-makrofaglignende celler vaskes en gang med fosfatbukket (PBS) ved 37 °C og inkuberes med 3 ml celleløsning (f.eks. accutase), der indeholder 0,5 mM EDTA i 10 min. ved stuetemperatur.
- Undersøg cellerne under et omvendt mikroskop for at lede efter celleopdeling. Tilsæt 7 ml frisk medium og centrifuge ved 300 x g i 4 min ved RT.
BEMÆRK: Makrofager kan også tages af med trypsin-EDTA, 37 °C i 20 min. Trypsin er dog hårdere for makrofager end den valgte celleløsning (se Materialetabel). - Efter fjernelse af supernatant, re-suspendere makrofag celler i 3 ml THP-1 medium i en 15 ml konisk rør, tælle cellerne som beskrevet i 1.1.2. og inkuberes i højst 1 time ved 37 °C under 5% CO2, før samkulturen etableres.
BEMÆRK: THP-1 celler i suspension kan farves med levedygtighed farvestoffer til at billedet co-kultur yderligere. På dette trin skal du bruge nedenstående fremgangsmåde (trin 1.2.5). - Pletten makrofager med 10 μM af en celle levedygtighed farvestof (baseret på omdannelse af acetat moieties af intracellulære esteraser, se Tabel over materialer), hvor 3 μL af cellens levedygtighed farvestof anvendes på celle suspension. Inkuber celler i 20 min ved 37 °C, 5% CO2,derefter vaskes 1x med PBS 37°C for at fjerne farvestoffet.
BEMÆRK: Centrifuge cellerne til at fjerne farvestoffet ved 300 x g i 4 min ved stuetemperatur (RT).
- Differentiere THP-1 celler som følger. Centrifugeindholdet i en T75 ved 300 x g i 4 min. Kassér supernatanten, opspjælret pellet i frisk medium og sat i en ny T75. Der tilsættes 10 ng/ml Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) incubatig cellerne i RPMI i 48 timer ved 37 °C og 5% CO2 atmosfære15.
2. Etablering af en epitel-makrofag co-kultur på gennemtrængelige støtter
- Brug CFBE41o- monolag hos ALI med TEER ≥ 300 Ω×cm² (trin 1.1.6.). Fjern mediet fra det nederste kammer, omvend forsigtigt støtten inde i en steril glas petriskål (50 mm x 200 mm), og fjern cellerne tilgroet gennem membranporerne på den nederste side af membranen ved hjælp af en celleskraber.
BEMÆRK: På grund af porestørrelsen på 3 μm har epitelceller tendens til at vokse gennem porerne mod basolateralsiden. Derfor er man nødt til at fjerne dem, før du tilføjer makrofager på denne side. CFBE41o- lunge epitelceller kan farves på dette trin. Proceduren i trin 1.2.5 kan anvendes. I stedet for en cellesuspension påføres farveopløsningen i MEM imidlertid (kun 500 μL apikersiden) på de klæbende celler på den gennemtrængelige støtte. - Brug 2 x 105 celler/brønd (i 200 μL RPMI) fra cellesuspensionen af PMA-differentierede THP-1-makrofager, og placer cellerne på basolateralsiden af de omvendte skær.
- Petriskålene lukkes forsigtigt og inkuberes i 2 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
- Anfør indsatsen tilbage i de 12 brønds mikroplader og tilsæt 500 μL MEM-medium i basolateral side af den gennemtrængelige skær for at opretholde ALI betingelser. Cellerne er nu klar til infektion.
3. Infektion med P. aeruginosa
BEMÆRK: Alle følgende trin herfra skal udføres i et laboratorium på biosikkerhedsniveau 2 (BSL2).
- Inokuler 15 ml lysogen bouillon (LB) suppleret med 300 μg/mL ampicillin i en Erlenmeyerkolbe (50 ml) med en enkelt koloni P. aeruginosa PAO1-GFP.
BEMÆRK: Andre stammer af P. aeruginosa kan også anvendes her, for eksempel, PAO1 vilde type, PA14, eller kliniske stammer, efter deres egne dyrkning protokoller. - Inkuber bakterierne i 18 timer ved 37°C, og ryst ved 180 omdrejninger i minuttet.
- Indholdet overføres efter 18 timer til et konisk rør på 50 ml og centrifuge ved 3850 x g i 5 min. Kassér supernatanten og tilsæt 10 ml steril PBS ved 37°C.
- Optisk tæthed måles på et spektrofotometer ved bølgelængde 600 nm, og bakteriekoncentrationen justeres ved hjælp af cellekulturmediet til en endelig koncentration på 2 x 105 CFU/ml. Dette svarer til en mangfoldighed af infektion (MOI) af en bakterie pr epitelcelle.
- Der tilsættes 100 μL bakteriel suspension til den apikale side af den gennemtrængelige støtte (trin 2.4.) og inkuberes ved 37 °C under 5% CO2 i 1 time for at tillade bakterier, der er knyttet til cellerne. Fjern derefter apsk væske omhyggeligt med en pipette for at genoprette ALI betingelser. Hold nogle prøver uintrinstreret som en kontrol.
BEMÆRK: På dette stadium skal de påsatte bakterier belagt i LB agar (se trin 5.4/5.5) for at bestemme de oprindelige bakterier inoculum. - Inkuber det stof af interesse efter bakteriel vedhæftning i cellerne. Til behandlingsforsøg tilsættes 500 μL af en lægemiddelopløsning fortyndet i cellemedium (i denne protokol blev der anvendt tobramycin 6 μg/ml) til den apikale side. Tilsæt 1.500 μL cellemedium uden medicin på basolateral side.
BEMÆRK: I stedet for at indgyde lægemidlerne som en løsning, kan modellen også tilpasses aerosoldeposition. Til sådanne formål fodres cellerne ved ALI fra basolateralsiden med 500 μL cellemedium. Stoffet er derefter først forstøvet og lov til at deponere i apical rum ved en passende enhed (ikke beskrevet her). Den inficerede og behandlede prøve kan kontrolleres for de endepunkter, der er beskrevet i afsnit 4-7. Fra dette trin kan gennemtrængelige understøtninger bruges til at skabe enten billeder (afsnit 4) eller til at opnå resultater af bakterievækst og pattedyrcelles levedygtighed, blandt andre (afsnit 5-7).
4. Prøveforberedelse til konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM)
- Efter etableringen af co-kultur, infektion og narkotika behandling, fjerne alle medium fra den apikale og basolaterale side. 1x vaskes med PBS ved 37°C, og cellerne fastgørs derefter med 3 % paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved RT (300 μL på apisk/600 μL på basolateral). Cellekerner farves med 5 μg/ml DAPI-PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: PFA er farlig. - Skær membranerne med en skalpel og læg dem mellem to 12 mm mikroskopidækselsdias ved hjælp af et monteringsmedium (se Materialetabel). Lad den tørre inde i flowbænken i 30 minutter før opbevaring ved 4 °C. Visualiser ved konfokal scanning mikroskopi.
BEMÆRK: Efter co-kultur og før monteringen kan der udføres stramme vejkryds immunstaining. For at, celler er fastgjort med paraformaldehyd 3% for 30 min, vaskes igen med PBS, og permeabilized med saponin 0,05% / BSA 1% i PBS. I denne protokol blev zonula okklusoverproteinet (ZO-1) påvist via mus anti-humant ZO-1 antistof (1:400, inkubation ved 4 °C natten over). Prøverne blev derefter inkuberet i 2 timer på RT med ged anti-mus IgG antistof Alexa Fluor 633 (1:2000 i rødt). Kerner blev plettet med DAPI (1 μg/ml) og monteret med monteringsmedium på dækslæber. - Brug et konfokalt mikroskop til billeddannelse af de lagrede membraner. Vælg 25x eller 63x vand-nedsænkning mål og lasere på 405, 488, 505 eller 633 nm til detektion. Billeder skal have en opløsning på 1024 x 1024 pixel.
BEMÆRK: Laserne vælges i henhold til den anvendte plet. - Indskiv apikale og tværsnitvisninger, og brug zeta-stack-tilstand (10-15 stakke) til konstruktion af en tredimensionel model ved hjælp af billedbehandlingssoftware.
5. Måling af bakteriespredning via kolonidannende enheder (CFU)
- Indsamle apikale og basolaterale medium (indeholdende bakterier) til at vurdere CFU af løsgængere bakterier. Saml 500 μL fra de apikale og basolaterale sider og pool dem.
BEMÆRK: Brug denne suspension direkte til at tælle bakterier (trin 5.4) eller centrifuge ved 21.250 x g i 10 minutter til at evaluere laktatdehydrogenase (LDH) fra supernatanten (afsnit 6) og/eller re-suspenderet i PBS for at tælle ekstracellulære bakterier (trin 5.4). - Vurder overlevelsen af de påsatte og/eller internaliserede bakterier i cellerne ved at tilsætte 500 μL sterilt deioniseret koldt vand i hvert rum i den gennemtrængelige støtte. Inkuber celler i 30 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Prøverne kan enten belagt på LB agar (se trin 5.4) eller fryses (som hele indsæt plade) ved -20 °C for plating senere. - Til vurdering af CFU af tilhængs-/internaliserede bakterier skal prøverne optø ved 37°C i 10 min. (hvis de er frosset). Brug pipettespidser til hver brønd, skrab membranens overflade og pipette op og ned for at fjerne alt klæbet indhold.
BEMÆRK: På dette trin lyses alle epitelceller, og klæbende/internaliserede bakterier fås som en suspension, der skal belagt. - Med bakteriel suspension fra begge fraktioner, udføre en 1/10 seriel fortynding ved hjælp af Tween-80 0,05% i PBS og plade bakterierne på LB agar plader.
BEMÆRK: Fortyndinger i mellem 1 og 10 anbefales. Bakterierne skal tælles i den højeste fortynding, hvor enkelte kolonier først identificeres. - Inkuber agarplader ved 30°C i 16-72 timer til de amter kolonier, og beregn CFU i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: En temperatur på 30°C på tidspunktet for pladeinkubation er afgørende for behandlede prøver og for at observere forsinket vækst af kolonier.
6. Vurdering af cytotoksicitet for celler via laktatdehydrogenaseanalyse
- Anvendes supernatanten af inficerede celler, der indeholder bakterier (fra trin 5.1) til celle levedygtighed vurdering for LDH-analyse16. Centrifuge supernatant på 21.250 x g i 10 min at pellet bakterierne og i sidste ende resten af cellerne. Brug den bakteriefrie supernatant til at måle LDH-frigivelsen.
BEMÆRK: Supernatanten må ikke fryses, før LDH måles med denne analyse. - Overfør 100 μL af supernatanten til en 96-brøndplade, og der tilsættes 100 μL μL μL μL af LDH-analyseopløsningen (se materialetabel). Inkuberes ved stuetemperatur i 5 min i mørke, og aflæs derefter absorbans ved 492 nm.
7. Vurdering af udsætningen af cytokiner fra mennesker
- Ved cytokin kvantificering anvendes enten ELISA eller cytometrisk perlearray immunoassay17 (se materialetabel). Til dette til dette centrifuge supernatant fra trin 5.1 ved 21,250 x g i 10 min og måles enten straks eller opbevares -80 °C i op til 15 dage indtil analysen.
- Vurder supernatanter med et kommercielt tilgængeligt ELISA-sæt.
BEMÆRK: Fremgangsmåden følger fremstillingsvejledningen, som omfatter belægning af plader med opsamlingsantistof, tilsætning af prøverne (100 μL) og cytokinstandarder, inkubation, vask og tilsætning af detektionsantistof for at give en koloimetrisk måling af cytokintilstedeværelse. Alternativt kan flowcytometri bruges til at måle cytokiner via kommercielt tilgængelige sæt (se Tabel over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser morfologien af den resulterende samkultur af menneskelige bronkiale epitelceller og makrofager efter dyrkning både i 24 timer på den apikale og basolaterale side af gennemtrængelige understøtninger, henholdsvis. Epitelbarrierens integritet vises ved højere TEER (834 Ω×cm2) og CLSM ved immunstaining for det stramme krydsprotein ZO-1 (Figur 1B). De samme resultater observeret med hensyn til barriere integritet ikke-inficerede CFBE41o- monokultur kunne ses i de ikke-inficerede epitel-makrofag co-kulturer.
For at modellere en bakteriel infektion blev P. aeruginosa vaccineret ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 1:1 på CFBE41o- celler. Seks timer efter infektion (figur 2A)blev der observeret makrofager på den apikale side af samkulturen. Efter infektionen faldt TEER'en fra 834 til 250 Ω×cm2, hvilket indikerer en kompromitteret epitelbarriere, som også visualiseres af ZO-1-farvning (Figur 2B).
Figur 3 viser makrofag transmigration gennem den gennemtrængelige membran porer og bakterier optagelse af THP-1 celler på den apikale side. Prøverne blev fastsat til 1, 3 og 6 timer efter inkubationen fra uafhængige forsøg. I THP-1 monokulturer (Figur 3A-C)blev der observeret makrofagermigration så tidligt som 1 time, mens det i samkulturen (figur 3D-F) så efter 3 timers infektion. Bakterier optagelse i THP-1 blev observeret efter 3 timers infektion, i både monokultur og co-kultur. Cfbe41o's bakterielle optagelse kunne ikke ses. Tværsnitsvisninger blev placeret således, at den gennemtrængelige membran støtte var i midten som en adskillelse af det apiske og basolaterale rum.
Figur 4 viser konfokale scanning laser mikroskopi billeder af inficerede co-kulturer (CFBE41o- + THP-1) behandlet med eller uden tobramycin i 6 h (Figur 4A, B) eller 20 h ( Figur4C, D). Uden behandling døde både epitelcellerne og makrofagerne efter 20 timers infektion (figur 4C). Men efter tobramycinbehandling bevares værtscellerne efter 20 timer; stadig, nogle bakterier kan observeres i kulturen. På trods af at bakterierne efter 6 timers behandling i mikroskopibillederne (Figur 4B)ikke blev set efter 6 timers behandling i mikroskopibillederne ( Figur 4B ), formere sig de ikke som observeret i CFU-analyser i figur 4E. Ikke desto mindre, efter 20 h behandling, bakterierne genvundet spredning kapacitet, som det ses af kolonierne i CFU assay (Figur 4F). Cellen lysis protokol med koldt vand og skrabning kan frigive bakterier knyttet og eventuelt internaliseret i celler. Samtidig destrueres cellerne (supplerende figur S1A, B). De centrifugeringstrin, der anvendes i dette papir til epitelceller (300 x g) eller bakterier (21.250 x g),hæmmede ikke levedygtigheden af begge (supplerende tal S1C, D). Alle CFU-analyser blev udført ved nedfrysning af prøverne ved -20°C efterfulgt af optøning og plating. Denne procedure reducerede antallet af bakterier med 2 logs sammenlignet med friske prøver (supplerende figur S1E). Da denne procedure udføres samtidigt for alle forsøgsgrupper (behandlet og ubehandlet) på forskellige tidspunkter, vil denne reduktion blive indarbejdet i de endelige resultater (supplerende figur S1E). Desuden viste den koncentration af tobramycin, der anvendes her, ingen toksicitet for de ikke-inficerede celler (supplerende figur S2A) og heller ikke yderligere inflammatorisk respons (supplerende figur S2B). Men det var inden for rækkevidde af den mindste hæmmende koncentration at dræbe P. aeruginosa.
Figur 5 viser den transepithelaale elektriske modstand (TEER) og cellernes levedygtighed. Figur 5A-B illustrerer teeren af monokulturer og samkulturer. Co-kultur CFBE41o- celler med THP-1 ikke fremkalde nogen ændring i epitelbarriere integritet i forhold til monokultur (røde bjælker). Ved infektionen faldt TEER-værdien (grøn bjælke). Efter 1 h infektion blev nogle prøver behandlet med antibiotika tobramycin (blå bar), i 6 eller 20 timer. Behandlingen bevarede epitelbarrierens integritet, som observeret af den højere TEER. Figur 5C viser procentdelen af LDH-frigivelse som en indikation af celletoksicitet ved infektion og tobramycinbehandling efter 6 timer. Selve samkulturen fremkaldte en frigivelse af LDH, som var den samme for de inficerede celler (ca. 20 %). Efter 20 timers infektion, intet signal af LDH kunne påvises. For at bevise LDH pålidelighed for langvarig infektion, PAO1-GFP blev inkuberet i medium med og uden LDH 1 U/ ml sammenlignet med respektive ikke-inficerede kontroller (Supplerende Figur S2C). LDH-signalet gik tabt efter langvarig inkubation (20 h) med P. aeruginosa, hvilket indikerer, at LDH kun er stabil i kortere inkubationstider i inficerede kulturer.
Figur 6 viser kinetik af proinflammatoriske cytokiner, der er påvist via ELISA. Fordelen ved en inficeret co-kultur cfbe41o- og THP-1 celler blev observeret med de højere sekreter af pro-inflammatoriske cytokiner. Udskillelsen af nogle proinflammatoriske cytokiner var enten ens (IL-6) eller højere (IL-8, TNF-α, IL-1β) i den inficerede samkultur (Figur 6C) end i de tilsvarende monokulturer (Figur 6A-B). Uventet er nogle cytokiner i THP-1 monokulturer (figur 6B) nedreguleret i inficerede prøver (Il-8, TNFα, IL-1β).
Figur 7 viser frigivelsen af cytokiner i mono- og samkulturer ved infektion og behandling med tobramycin målt via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Udskillelsen af det proinflammatoriske cytokin IL-8 (Figur 7A) og det antiinflammatoriske cytokin IL-10 (Figur 7F) var højere i samkulturerne mellem epitelceller og makrofager sammenlignet med monokulturerne. For alle andre cytokiner (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 og GM-CSF) (figur 7B-E)var cytokinsafretionsniveauerne dog ikke højere i den samkultur, der i de respektive monokulturer.
Figur 1: Tværsnit og apikale syn på den ikke-inficerede epitel-makrofag co-kultur. (A)Krydsvisninger af usinficeret 24 h epitel-makrofag co-kultur. CFBE41o- farves rød, THP-1 makrofager i gul og kerner i blå (DAPI). (B) Apikale synspunkter af den ikke-inficerede CFBE41o- monolayer immun-farvede for ZO-1 (rød). DAPI: kerner. Skalabarer: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tværsnit og apikale syn på den inficerede epitel-makrofag co-kultur. (A)Krydsvisninger og(B)apikale opfattelse af epitel-makrofag co-kultur på 6 h post-infektion (hpi) med P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- farves i rødt, THP-1 makrofager i gul, kerner i blå (DAPI) og P. aeruginosa PAO1-GFP i grøn. (B) Apikale synspunkter af 6 h inficeret CFBE41o- monolayer. Skalabarer: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kinetik af makrofag transmigration og bakterieoptagelse visualiseret af tværsnit af 3D-modellen. PAO1-GFP infektion kinetik i monokulturer af THP-1 makrofager (A-C) eller co-kultur (D-F). THP-1 makrofager er plettet i røde, kerner af epitelceller i blå (DAPI), og P. aeruginosa i grøn (GFP). Hvert tal er opdelt i apiske og basolaterale sider, rummet i mellem anses for at være membranen, som er tom eller besat af CFBE41o- sammenløbet lag (D-F). Skær i tallene viser bakterier optagelse af makrofager på forskellige tidspunkter (A-F). Skalabarer: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakterisering af PAO1-GFP overlevelse i tobramycin-behandlet co-culture. (A-D) Konfokale mikrografer co-kulturer med og uden behandling. (A)Ubehandlet co-kultur efter 6 timers infektion. b) Inficeret co-kultur behandlet med tobramycin 6 μg/ml (Tob) i 6 timer ( C )Ubehandletco-culture 20 h post-infektion,(D)inficeret co-kultur behandlet med tobramycin 6 μg/ml i 20 timer. Kerner farves med DAPI (blå), makrofager (rød) og P. aeruginosa GFP (grøn). (E) Kolonidannende enheder (CFU) af klæbende/internaliserede bakterier efter 6 og (F) 20 timer med tobramycin 6 μg/ml behandling. Tom membran indsætte blev brugt som en abiotisk substrat til at vokse PAO1-GFP. Tovejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligninger test (# ingen kolonier) blev brugt, * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: ikke signifikant. Fejllinjer angiver standardafvigelse, n = 9-27 replikater af 3-9 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Barriereintegritet og evaluering af mono- og samkulturens levedygtighed. Følgende samkulturbetingelser blev vurderet: ikke-inficerede (grå bjælker), inficerede (grønne bjælker) eller inficeret og behandlet med tobramycin (blå bjælker). aA) Transepithelial elektrisk modstand efter 6 h og (B) 20 timers infektion i monokulturer (CFBE41o- og THP-1) og co-kultur. cC) Cytotoksicitet af mono- og samkultur målt via LDH frigiver 6 timer efter infektionen. Tovejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningstest blev anvendt; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: ikke signifikant. Fejllinjer angiver standardafvigelse. n = 9 replikater af tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kinetik af cytokinfrigivelse af ikke-inficerede og inficerede mono- og samkultursupernatanter vurderet via ELISA. ELISA blev udført i henhold til kit producentens protokol. a) CFBE41o-,B) THP-1 ogc) co-kultur, der frigiver IL-8, TNF-α, IL-1β og IL-6. Fejllinjer angiver standardafvigelse. n = 6 replikater af 2 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Supernatant-resultater af cytokinpanelet målt via FACS med og uden tobramycin 6 μg/ml i 6 timer efter infektion. Supernatanter af mono- og samkultur efter 6 timer efter infektion, der anvendes til at analysere de respektive cytokiner IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) og IL-10 (F). Fejllinjen angiver standardafvigelsen, n = 9 replikater af 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur S1: Kontrolforsøg for kritiske trin i protokollen. aA, B) Mikrografer af CFBE41o- celler i 24-brøndsplader dyrket i 2 dage ved tæthed på 2 x 105 celler/brønd. a) CFBE41o- celler i PBS i 30 min og(B)vandbehandlede celler efter 30 min efter skrabning med en pipette. C) Pattedyrscellers levedygtighed efter centrifugering. CFBE41o- celler blev fjernet fra T75-cellekulturkolben som beskrevet i trin 1.1.1 og 1.1.2. 100 μL resulterende celleaffjedring blev analyseret i 10 ml isotonisk opløsning. En automatiseret celletæller blev anvendt til at vurdere levedygtigheden af enkelte celler. Derefter blev de respektive cellesuspensioner centrifugeret ved 300 x g i 4 min. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen, n = 6 forskellige kolber af 2 individuelle forsøg. d)PAO1-GFP's levedygtighed efter centrifugering. PAO1-GFP bakterier blev fortyndet til OD = 0,01 i cellemedium. CFU blev vurderet via en 10-fold fortynding række og LB plader inkuberet natten over ved 30 °C. De respektive plastrør blev centrifugeret ved 21.250 x g i 10 min. og blev suspenderet igen i medium. CFU blev vurderet i overensstemmelse hermed igen. To-tailed studerendes t-test, * p < 0,033. Fejllinjen angiver standardafvigelsen, n = 6 ud af 2 eksperimenter. eE) Bakteriernes levedygtighed efter nedfrysning. PAO1-GFP bakterier blev fremstillet som i (D) og CFU blev analyseret, så plastrør blev frosset i en dag ved -20 °C og optøet til at vurdere CFU igen. To-tailed studerendes t-test, *** p < 0,001. Fejllinjer angiver standardafvigelse, n = 6 af to eksperimenter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Kontrolforsøg til vurdering af LDH's adfærd og indflydelse af tobramycin. a) Kontrolforsøg til vurdering af cytotoksicitet efter 20 timers inkubation med 6 μg/ml tobramycin. Mono- og co-kultur blev udført som beskrevet i protokollen, men celler blev dyrket i 2 dage på 24-brønd plader og THP-1 celler blev seedet apisk. Celler med 6 μg/ml tobramycin eller kontroller blev inkuberet i 20 timer. One-Way ANOVA, Tukey's multiple sammenligninger test, *** p < 0,001. Fejllinjen angiver standardafvigelsen, n = 6 ud af 2 forsøg (CFBE41o-), n = 3 af et eksperiment (THP-1 og co-culture). B) Kontrol-ELISA af supernatanter af mono- og samkultur med/uden tobramycin. Cellekultur blev udført i henhold til (A) for at vise ingen cytokin frigivelse i forhold til kontrol for alle betingelser. ELISA blev udført i trin 7.1 og 7.2, 10 μg/mL (LPS) blev tilføjet som kontrol, IL-8 frigivelse til LPS-behandlede kontroller, der indeholder THP-1 var højere end påviseligt. Tovejs ANOVA, Tukey's multiple sammenligninger test, ns p > 0,12; * p < 0,033; p < 0,001. Fejllinjer angiver standardafvigelse, n = 6 af to eksperimenter, n = 3 af et eksperiment (LPS-kontrol). cC) LDH-nedbrydning som følge af overdreven spredning af PAO1-GFP. LDH blev tilsat i en koncentration på 1 U/ml til MEM Medium. Enten LDH-medie eller kontrolmedium blev brugt til at fortynde celler til OD = 0,01 (svarer til 1 x 108 CFU/ml) og derefter inkuberet i 20 timer. LDH-analysen blev udført som beskrevet i afsnit 6. One-Way ANOVA, Tukey's multiple sammenligninger test, ns p > 0,12; p < 0,001. Fejllinjen angiver standardafvigelsen, n = 8-9 af tre individuelle eksperimenter. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en protokol for en 3D co-kultur af de inficerede luftveje, der udgøres af den menneskelige cystisk fibrose bronkial epitelcellelinje CFBE41o- og den menneskelige monocyt-afledte makrofag cellelinje THP-1. Protokollen gør det muligt at vurdere epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakterier overlevelse, og betændelse, som er vigtige parametre, når test af lægemidlets effektivitet og vært-respons samtidig. Det nye i modellen ligger i inkorporering af epitelceller (dvs. human CF cellelinje og makrofager) med akut bakteriel infektion (dvs. P. aeruginosa). Den akutte infektion i epitelcellerne påvises at være kontrolleret af et antibiotikum (dvs. tobramycin). Udover brugen af en human CF cellelinje, er hele modellen sat op på ALI betingelser, som er betydeligt tættere på de fysiologiske forhold i CF. Brugen af en CF celle linje gennemfører nogle af de særlige kendetegn ved sygdommen i modellen. Mutationen af cystisk fibrose transmembrane konditation regulator (CFTR) er direkte relateret til dysregulering af epitelvæske transport i lungerne. Desuden resulterer mutationer i CF-genet, såsom ΔF508, i tyk slim, med betændelse og alvorlige lungeskader ved infektion med P. aeruginosa4. Disse patologiske manifestationer forårsaget af dysfunktionel CFTR potentielt involverer autofagi svækkelse som en vigtig cellulær mekanisme forbundet med patogenesen af CF lungesygdom18. Men CFBE41o- undlader at hemmelige slim, hvilket er en begrænsning af denne cellelinje. Hvis det er hensigten at undersøge slimets rolle mere specifikt, kan protokollen tilpasses ved hjælp af andre bronkiale cellelinjer (f.eks.
Et afgørende skridt til at oprette denne protokol er kombinationen af epitel- og immunceller og den efterfølgende infektion med P. aeruginosa hos ALI. Infektionen af CFBE41o- ved P. aeruginosa in vitro er allerede blevet beskrevet, primært ved hjælp af et flow-celle kammer, suppleret med arginin i kulturmediet, for at forbedre epitelcelleoverlevelse og støtte biofilmdannelse19. Den nuværende protokol sigtede mod en ny model, der kun anvender menneskelige celler, som desuden kunne dyrkes i ALI på gennemtrængelige brøndpladeindsatser for højere prøveoverførselshastighed. Inddragelsen af THP-1 differentierede makrofager som en menneskelig udødeliggjort cellelinje, i stedet for at være afhængig af at opnå reproducerbare primære celler fra donorer, er en anden fordel ved vores model. Ved at tilføje disse makrofager til basolateral side af gennemtrængelige membran støtte, blev det observeret, at makrofager fremsiges og i sidste ende transmigrerede til den apikale side af filter-dyrket epitelbarriere. En variation af denne protokol kunne være tilføjelsen af makrofager direkte på den apikale side på toppen af epitelcellerne, som beskrevet af Kletting et al. 14.Samkulturen af ikke-humane immun- og lungeceller er allerede blevet beskrevet før. Ding et al. 10 brugt mus Lewis lunge karcinom celler på gennemtrængelige indsætte støtter i kombination med makrofager på basolateral side og inficeret med S. aureus, en anden kritisk patogen af kronisk infektion i CF patienter. Men i denne undersøgelse, der var ingen fokus på cystisk fibrose eller til at bruge co-kultur som en platform for evaluering af lægemidlets effektivitet. Vores protokol kan tilpasses til andre bakterielle infektioner, såsom Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, eller Burkholderia cepacia- vigtige patogener i CF lunge.
Et andet kritisk skridt er tilføjelsen af THP-1 makrofager til cellerne ved at vende de gennemtrængelige skær på hovedet (afsnit 2). Dette er afgørende for at vurdere makrofag transmigration gennem brønden til siden af infektion. Den senere billeddannelsesproces fra 3D-modellerne med z-stakke og tværsnitsvisning kan udføres for at observere indersiden af makrofager og detektere bakterieoptagelse (Figur 3). Ved 1 hpi vandrer bakterier på den apikale side gennem membranen, mens makrofagmigration og optagelse kun finder sted ved 3 hpi. Efter 1 h infektion var det derfor hensigtsmæssigt at starte behandlingen med tobramycin og have mulighed for at tage fat på både værtscelle- og bakterieoverlevelse i en længere periode (20 timer). I løbet af protokollen er opretholdelse af sterilitet et kritisk spørgsmål på grund af de mange trin, der hver især indebærer risiko for kontaminering. Ikke desto mindre vil erfarne cellekulturpersonale kunne følge denne protokol efter passende forberedelse og uddannelse. Cellemediet bør kontrolleres regelmæssigt for kontaminering, helst efter alle kritiske trin.
Som med enhver model, den inficerede co-kultur har også nogle begrænsninger; integrationen af de makrofaglignende celler. Her var det vigtigt at have makrofager på basolateral side; manipulation af indsatsen med et tidligere dyrket epitellag kan dog have givet tidlig skade og forstyrrelser i samkulturen. Selv om den gennemtrængelige støtte model forudsat høj-throughput egenskaber, som ikke er blevet observeret i tidligere co-kulturer af CF inficerede lunge20,21. Med dette, yderligere eksperimenter nødt til at vurdere begrænsningerne ved at bruge THP-1 som makrofag erstatning. Mens denne cellelinje er meget udbredt, er det mindre lydhøre over for LPS22, og det mangler fuld aktivering og hele befolkningen er ikke differentieret fra monocytter til makrofag-lignende celler23. En anden begrænsning er manglen på andre vigtige komponenter i CF-infektion og lægemiddellevering. CFBE41o- celle linje ikke besidder cilier heller ikke producere slim, som normalt sker 20-30 dages cellekultur på ALI. Da dette ikke var tilfældet for CFBE41o- cellelinje, brugte vi cellerne efter syv dage, hvor en stram epitelbarriere blev dannet. Mucociliary clearance ændrer bopæl betingelser for enten mikrober24 eller narkotika partikler9,25 og in vitro modeller vurdere lunge deposition bør tage hensyn til dette. Anderledes end hvad der observeres af andre celler, vævskulturen indsætter belægning med en ekstracellulær matrix materiale (som fibronectin eller kollagen I) viser ikke en væsentlig forskel for CFBE41o-for eksempel i TEER26. Derfor blev gennemtrængelige filtre ikke belagt med et ekstracellulært matrixmateriale i denne protokol.
Med den protokol, der er beskrevet her, mono og co-kulturer efter 6 h infektion giver tilstrækkelig cytokin frigivelse til at blive brugt som en måling i fremtidige test af lægemidler. Den co-kultur bringer en fordel af celle samarbejde i modellering immunrespons. Tobramycins ineffektivitet i reduktionen af inflammation var forventet, da ikke alle bakterier blev elimineret under behandlingen (Figur 4E, F). Ikke desto mindre, modellering reaktionen på tobramycin i en CF model er afgørende, som tobramycin (i højere koncentrationer) kan være effektiv i P. aeruginosa hæmning, selv på biofilm19,27. En mulighed for yderligere brug af denne protokol er at integrere anti-inflammatoriske lægemidler i behandlingen. Den overordnede anbefaling vedrørende inflammatoriske reaktioner ville være at bruge den korte varighed behandling (6 h), som stadig har værtscellen og bakterier til stede. Efter dette tidspunkt ødelægges værtscellerne i ubehandlede prøver. Både ELISA og FACS kan anvendes til at måle frigivelsen af cytokiner. Hvis prøverne opbevares længere end 15 dage ved -80 °C, anbefales det endelig at kontrollere cytokines pålideligheden ved f.eks.
Nogle ændringer af protokollen er mulige. For eksempel kan den nuværende protokol udvides til at være anvendelsen af forstøvede lægemidler (trin 3.6). Dette er nødvendigt at modellere pulmonal lægemiddellevering via oral indånding. Nebulization af vandopløselige lægemidler, som tobramycin, eller nano-bærere heraf, såsom liposomal colistin, er relativt ligetil ved kommercielt tilgængelige enheder rutinemæssigt anvendes i klinikken. Der er også flere kommercielt tilgængelige enheder til at deponere aerosoler på cellekultur skær. Hertil kommer, som den model, der er beskrevet her er baseret på gennemtrængelige membran støtter, det kunne også anvendes til nogle moderne microfluidic (f.eks "lunge på en chip") enheder, for eksempel for at studere indflydelsen af vejrtrækning og den relaterede mekaniske stretching og ændringer i luftstrømmen. Desuden kan denne protokol ændres ved tilsætning af slim eller erstatning med primære celler afhængigt af det videnskabelige spørgsmål, der skal behandles. Et andet interessant næste skridt ville være afprøvning af nanomedicin, især da nanoteknologi gør fremskridt i udviklingen af nye anti-infektiøs28, CF correctors29 og co-levering af antibiotika og pathoblockers30. Samlet set kan den nuværende protokol opfattes som nyttig til vurdering af bakteriel overlevelse ved antibiotikabehandling i et komplekst system sammen med nogle værtsrelaterede udlæsninger: cellecytotoksicitet, epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigration og inflammatorisk respons. Disse er væsentlige parametre for udvikling af lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde modtog støtte fra DEN Europæiske Unions HORIZON 2020-program for forskning, teknologisk udvikling og demonstration i henhold til tilskudsaftale nr. Vi takker Dr. Ana Costa og Dr. Jenny Juntke for den store støtte til udviklingen af co-kultur, Olga Hartwig, for den videnskabelige illustration, Anja Honecker, for ELISA assays, Petra König, Jana Westhues og Dr. Chiara De Rossi for støtte til cellekultur, analyse og mikroskopi. Vi takker også Chelsea Thorn for korrekturlæsning af vores manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
