Summary
We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.
Abstract
fDrug onderzoek voor de behandeling van longinfecties vordert naar voorspellende in vitro modellen van hoge complexiteit. De veelzijdige aanwezigheid van bacteriën in longmodellen kan de epitheliale opstelling opnieuw aanpassen, terwijl immuuncellen een ontstekingsreactie tegen de bacteriën in de microomgeving coördineren. Hoewel in vivo modellen de keuze zijn geweest voor het testen van nieuwe anti-infectiemiddelen in de context van cystische fibrose, bootsen ze nog steeds niet nauwkeurig de in vivo omstandigheden van dergelijke ziekten bij de mens en de behandelingsresultaten na. Complexe in vitro modellen van de geïnfecteerde luchtwegen op basis van menselijke cellen (bronchiale epitheel en macrofagen) en relevante ziekteverwekkers kunnen deze kloof overbruggen en de vertaling van nieuwe anti-infectiemiddelen in de kliniek vergemakkelijken. Voor dergelijke doeleinden is een co-cultuurmodel van de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o- en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen vastgesteld, die een infectie van het menselijk bronchiale slijmvlies nabootsen door P. aeruginosa bij lucht-vloeibare interface (ALI) voorwaarden. Dit model is opgezet in zeven dagen, en de volgende parameters worden tegelijkertijd beoordeeld: epitheelbarrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriële overleving, en ontsteking. Het huidige protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar systeem voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen en reacties die relevant kunnen zijn voor het ontdekken van nieuwe anti-infectiemiddelen en het optimaliseren van hun aerosol levering aan de longen.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is een relevante ziekteverwekker bij cystische fibrose (CF) die bijdraagt aan longweefselstoornissen1. De productie van polysaccharides, zoals alginaat en andere mucoid exopolysadiaden, coördineert de voortgang van de ziekte, wat leidt tot hardnekkige bacteriële therapietrouw, beperkt de levering van antibiotica aan bacteriën en beschermt de bacteriën tegen het immuunsysteem van de gastheer2. De overgang van P. aeruginosa van het planktonische stadium naar biofilmvorming is in deze context een kritiek punt, waardoor ook het optreden van antibioticatolerantie wordt vergemakkelijkt.
In het kader van CF is de muis voornamelijk als model gebruikt. Muizen ontwikkelen deze ziekte echter niet spontaan met de introductie van CF-mutaties3. De meeste van de bacteriële biofilm ontwikkeling en drug gevoeligheid studies zijn uitgevoerd op abiotische oppervlakken, zoals petrischaaltjes. Deze benadering vertegenwoordigt echter niet de complexiteit in vivo. Zo ontbreken belangrijke biologische barrières, waaronder immuuncellen en het mucosale epitheel. Hoewel P. aeruginosa is vrij giftig voor epitheliale cellen, sommige groepen zijn erin geslaagd om co-cultiveren een eerdere P. aeruginosa biofilm met menselijke bronchiale cellen. Deze cellen zijn afkomstig van patiënten met cystische fibrose met CFTR-mutatie (CFBE41o- cellen)4 en konden de werkzaamheid van antibioticabeoordelen 5 of de correctie van het CFTR-eiwit tijdens infectie beoordelen6. Een dergelijk model bleek de voorspelbaarheid van de werkzaamheid van geneesmiddelen te verbeteren, naast het mogelijk maken van karakterisering van problemen met geneesmiddelen die faalden in latere fasen van de ontwikkeling van geneesmiddelen7.
Echter, in de long, het mucosale epitheel wordt blootgesteld aan lucht. Bovendien spelen immuuncellen die in de luchtwegen aanwezig zijn, zoals weefselmacrofagen, een essentiële rol tegen ingeademde ziekteverwekkers of deeltjes8. Macrofagen migreren door de verschillende cellagen om het bronchiale lumen te bereiken en de infectie te bestrijden. Bovendien hebben ingeademde geneesmiddelen ook te maken met de aanwezigheid van slijm als een extra niet-cellulair element van de longluchtbloedbarrière9. Er zijn inderdaad verschillende complexe driedimensionale (3D) in vitro modellen ontwikkeld, gericht op het vergroten van de in vivo relevantie. Co-cultuur systemen verhogen niet alleen de complexiteit van in vitro systemen voor het ontdekken van geneesmiddelen, maar ook in staat om celcelinteracties te bestuderen. Deze complexiteit is aangepakt in studies over macrofaagmigratie10, het vrijkomen van antimicrobiële peptiden door neutrofielen11, de rol van slijm bij infectie9, en de epitheelcelreactie op overmatige schade12. Echter, een betrouwbare CF-geïnfecteerde in vitro model dat de genetische mutatie in CF functies, dat wordt blootgesteld aan de lucht (verhoogde fysiologische aandoening), en integreert immuuncellen ontbreekt nog steeds.
Om deze kloof te overbruggen, beschrijven we een protocol voor stabiele menselijke 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen. Het model bestaat uit menselijke CF bronchiale epitheelcellen en macrofagen, besmet met P. aeruginosa en in staat om zowel een diffusional als immunologische barrière te vertegenwoordigen. Met het doel om anti-infectieve stoffen te testen bij een redelijk hoge doorvoer, werd deze co-cultuur vastgesteld op het doorlatende filtermembraan van putplaatinserts, met behulp van twee menselijke cellijnen: CFBE41o- en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen. Bovendien, om uiteindelijk de depositie van aerosolized anti-infectives13te bestuderen, werd het model gevestigd op de lucht-vloeibare interface (ALI) in plaats van vloeibare bedekte omstandigheden (LCC).
Zoals we hier rapporteren, maakt dit model het mogelijk om niet alleen bacteriële overleving bij een behandeling met antibiotica te beoordelen, maar ook celcytotoxiciteit, epitheliale barrière-integriteit, macrofaagtransmigratie en ontstekingsreacties, die essentiële parameters zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Dit protocol combineert twee relevante celtypen voor inademingstherapie van de longluchtwegen: macrofagen en CF bronchiale epitheel. Deze cellen zijn gezaaid aan weerszijden van doorlatende steun inserts, waardoor cel blootstelling aan lucht (de zogenaamde lucht-vloeistof interface (ALI) voorwaarden). Deze co-cultuur van gastheercellen wordt vervolgens besmet met P. aeruginosa. Beide gastheercellijnen zijn van menselijke oorsprong: de epitheelcellen vertegenwoordigen het cystische fibrose bronchiale epitheel, met een mutatie op het CF-kanaal (CFBE41o-) en de THP-114 cellen zijn een goed gekarakteriseerde macrofaag-achtige cellijn. Een confluent epitheellaag mag zich eerst vormen aan de bovenzijde van putplaatwisselplaten voordat de macrofaagachtige cellen aan het tegenovergestelde compartiment worden toegevoegd. Zodra de co-cultuur is gevestigd op ALI, wordt het systeem ingeënt met P. aeruginosa aan de apicale kant. Dit geïnfecteerde co-cultuursysteem wordt vervolgens gebruikt om de werkzaamheid van een antibioticum te beoordelen, bijvoorbeeld tobramycine. De volgende eindpunten worden geanalyseerd: epitheelbarrière-integriteit in termen van transepitheliale elektrische resistentie (TEER), visualisatie van celcel- en celbacteriëninteracties door confocale laserscansmicroscopie (CLSM), bacteriële overleving door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU), overleving van gastheercellen (cytotoxiciteit) en cytokine-release.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei en differentiatie van cellen in doorlaatbare steunwisselplaten
- Cultiveren CFBE41o- in een T75-kolf met 13 mL minimaal essentieel medium (MEM) met 10% foetale kalfsserum (FCS), 1% niet-essentiële aminozuren en 600 mg/L glucose bij 37 °C met 5 % CO2-atmosfeer. Voeg elke 2-3 dagen vers medium toe aan de cellen.
- Maak de cellen na het bereiken van 70% samenvloeiing in de kolf los met 3 mL trypsine- Ethyleenediaminetetraacetic zuur (EDTA) bij 37°C gedurende 15 minuten. Voeg 7 mL verse MEM toe en centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en voeg nieuwe 10 mL MEM toe terwijl je de klonten verstoort door zachtjes op en neer te pipetten.
- Tel de cellen met een geautomatiseerde celteller of hemocytometerkamer. Zaadcellen met een dichtheid van 2 x 105 cellen/put in 12-put platen met doorlatende steunen (poriegrootte van 3 μm, zie Tabel van Materialen).
OPMERKING: De geautomatiseerde celteller bepaalt celnummer, grootteverdeling en levensvatbaarheid van de cellen (zie Tabel met materialen). Doorlatende steunen met een poriegrootte van 0,4 μm kunnen hier worden gebruikt; de macrofagen in deze toestand moeten echter rechtstreeks aan de apicale zijde worden toegevoegd en hun transcellulaire migratie zal in dit geval niet worden beoordeeld. - Zaadcellen in vloeistof-vloeibare toestand (LLC) door toevoeging van 500 μL van de celsuspensie aan de apicale kant van de permeabele steun en 1,5 mL vers medium in de basolaterale kant. Vervolgens incuberen cellen bij 37°C onder 5% CO2, voor 72 uur.
- Om over te schakelen naar de lucht-vloeibare interface (ALI) cultuur, op de derde dag na het zaaien, verwijder het medium van de basolaterale kant eerst, dan van de apicale kant. Voeg aan de basolaterale zijde 500 μL verse MEM toe en verander het medium elke tweede dag totdat cellen een confluent monolayer vormen.
OPMERKING: Voor de omstandigheden die in dit protocol worden gebruikt, zijn de CFBE41o- cellen meestal samenvloeibaar na 3-7 dagen in cultuur. - Beoordeel de epitheelbarrière-eigenschappen op dag 7 door CFBE41o uit te broeden- cellen met 500 μL-celmedium in de apicale zijde en 1,5 mL in de basolaterale zijde gedurende 1 uur, bij 37°C onder 5% CO2.
- Meet barrière-eigenschappen via transepitheliale elektrische weerstand (TEER), met een STX2 eetstokelektrode en een epitheelvolmmeter; na 7 dagen is dit hoger dan 300 Ω×cm².
OPMERKING: Uiteindelijk hebben de cellen in sommige membraaninserts een lage TEER. Daarom worden doorlatende wisselplaten met TEER < 300 Ω×cm² niet gebruikt.
- Om THP-1 cellen te cultiveren, kweek ze in een T75 kolf met behulp van 13 mL van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% FCS, en uitbroeden bij 37°C onder 5% CO2. Splits cellen elke tweede dag door 2 x 106 cellen/mL cellen in een nieuwe T75 kolf te zaaien.
OPMERKING: Niet-gedifferentieerde THP-1 cellen worden gekweekt als monocyten in suspensie.- Onderscheid de THP-1 cellen als volgt. Centrifuge inhoud van een T75 op 300 x g gedurende 4 min. Gooi de supernatant weg, zet de pellet opnieuw op in een vers medium en doe er een nieuwe T75 in. Voeg 10 ng/mL Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toe en incubatig de cellen in RPMI voor 48 uur bij 37 °C en 5% CO2 atmosfeer15.
OPMERKING: Na de differentiatie met PMA vermenigvuldigen cellen zich niet meer en hechten ze zich aan de kolf. - Om THP-1 macrofaagachtige cellen los te maken, was dan eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 °C en incubeer met 3 mL celloslatingsoplossing (bijvoorbeeld accutase) met 0,5 mM EDTA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Inspecteer de cellen onder een omgekeerde microscoop om te zoeken naar celloslating. Voeg 7 mL vers medium en centrifuge toe bij 300 x g gedurende 4 minuten bij RT.
LET OP: Macrofagen kunnen ook worden losgemaakt met trypsin-EDTA, 37 °C voor 20 min. Trypsine is echter harder voor macrofagen dan de gekozen celloslatingsoplossing (zie Tabel met materialen). - Na het verwijderen van de supernatant, opnieuw op te schorten macrofaag cellen in 3 mL van THP-1 medium in een 15 mL conische buis, tellen de cellen zoals beschreven in 1.1.2. en voor een maximum van 1 h bij 37 °C onder 5% CO2 voor het opzetten van de co-cultuur.
OPMERKING: THP-1 cellen in suspensie kunnen worden gekleurd met levensvatbaarheid kleurstoffen om de co-cultuur verder beeld. Gebruik bij deze stap de onderstaande procedure (stap 1.2.5). - Vlek macrofagen met 10 μM van een cel levensvatbaarheid kleurstof (op basis van de omzetting van acetaat moieties door intracellulaire esterasen, zie Tabel van Materialen) waarin 3 μL van de cel levensvatbaarheid kleurstof wordt toegepast op de cel suspensie. Incubeercellen gedurende 20 minuten bij 37 °C, 5% CO2,was vervolgens 1x met PBS 37°C om de kleurstof te verwijderen.
OPMERKING: Centrifugeer de cellen om de kleurstof te verwijderen op 300 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Onderscheid de THP-1 cellen als volgt. Centrifuge inhoud van een T75 op 300 x g gedurende 4 min. Gooi de supernatant weg, zet de pellet opnieuw op in een vers medium en doe er een nieuwe T75 in. Voeg 10 ng/mL Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toe en incubatig de cellen in RPMI voor 48 uur bij 37 °C en 5% CO2 atmosfeer15.
2. Oprichting van een epitheel-macrofaag co-cultuur op doorlatende steunen
- Gebruik CFBE41o- monolagen bij ALI met TEER ≥ 300 Ω×cm² (stap 1.1.6.). Verwijder het medium uit de onderste kamer, draai de steun voorzichtig om in een steriele glazen petrischaal (50 mm x 200 mm) en verwijder de cellen die door de membraanporiën aan de onderkant van het membraan worden overwoekerd met behulp van een celschraper.
OPMERKING: Door de poriegrootte van 3 μm hebben epitheelcellen de neiging om door de poriën naar de basolaterale kant te groeien. Daarom moet men ze verwijderen voordat u de macrofagen aan deze kant toevoegt. CFBE41o- longepepitheelcellen kunnen bij deze stap worden bereikt. De procedure in stap 1.2.5 kan worden gebruikt; In plaats van een celsuspensie wordt de kleurstofoplossing in mem echter toegepast (alleen 500 μL apicale zijde) op de aangehangen cellen op de doorlaatbare ondersteuning. - Gebruik 2 x 105 cellen/put (in 200 μL RPMI) van de celsuspensie van PMA-gedifferentieerde THP-1 macrofagen en plaats de cellen op de basolaterale kant van de omgekeerde wisselplaten.
- Sluit de petrischaaltjes zorgvuldig en broed gedurende 2 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
- Plaats de wisselplaten terug in de 12-well microplates en voeg 500 μL MEM-medium toe aan de basolaterale kant van de permeabele wisselplaat om ALI-omstandigheden te behouden. De cellen zijn nu klaar voor infectie.
3. Infectie door P. aeruginosa
LET OP: Alle volgende stappen vanaf hier moeten worden gedaan in een bioveiligheid niveau 2 (BSL2) laboratorium.
- Inoculate 15 mL lysogeny bouillon (LB) aangevuld met 300 μg/mL ampicilline in een Erlenmeyer-kolf (50 mL) met één kolonie P. aeruginosa PAO1-GFP.
OPMERKING: Andere stammen van P. aeruginosa kunnen hier ook worden gebruikt, bijvoorbeeld PAO1 wild type, PA14, of klinische stammen, volgens hun eigen teeltprotocollen. - Broed de bacteriën 18 uur bij 37°C, schudden bij 180 tpm.
- Breng de inhoud na 18 uur over op een 50 mL conische buis en centrifuge op 3850 x g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en voeg 10 mL steriele PBS toe bij 37°C.
- Meet de optische dichtheid op een spectrofotometer op golflengte 600 nm en pas de concentratie bacteriën aan met behulp van het celkweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 2 x 105 CFU/mL. Dit komt overeen met een veelheid van infectie (MOI) van één bacterie per epitheelcel.
- Voeg 100 μL bacteriële suspensie toe aan de apicale kant van de doorlatende ondersteuning (stap 2.4.) en incubaal bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 1 uur, zodat bacteriën zich aan de cellen kunnen gehechtmaken. Verwijder vervolgens apicale vloeistof voorzichtig met een pipet om ALI-omstandigheden te herstellen. Houd een aantal monsters niet besmet als een controle.
OPMERKING: In dit stadium moeten de bacteriën die zijn bevestigd in LB agar (zie stap 5.4/5.5) worden verguld om het initiële bacterieenoculum te bepalen. - Broed het medicijn van belang na bacteriële hechting in de cellen. Voor behandelingsexperimenten voegt u 500 μL van een in celmedium verdund medicijnoplossing toe (in dit protocol werd tobramycine 6 μg/mL gebruikt) aan de apicale kant. Voeg 1.500 μL celmedium zonder medicijn toe aan de basolaterale kant.
OPMERKING: In plaats van de medicijnen als oplossing bij te brengen, kan het model ook worden aangepast aan aerosoldepositie. Voor dergelijke doeleinden worden de cellen bij ALI gevoed vanaf de basolaterale kant met 500 μL celmedium. Het medicijn wordt dan eerst verneveld en mag in het apicale compartiment worden afgezet door een geschikt apparaat (hier niet beschreven). Het geïnfecteerde en behandelde monster kan worden gecontroleerd op de eindpunten die in de secties 4–7 zijn beschreven. Vanaf deze stap kunnen doorlatende steunen worden gebruikt om beelden te maken (sectie 4) of om resultaten te krijgen van bacteriëngroei en levensvatbaarheid van zoogdierencellen, onder andere (secties 5–7).
4. Monstervoorbereiding voor confocale laserscanning microscopie (CLSM)
- Na de oprichting van de co-cultuur, infectie en medicamenteuze behandeling, verwijder alle medium van de apicale en basolaterale kant. Was 1x met PBS bij 37°C en bevestig de cellen vervolgens met 3% paraformaldehyde (PFA) voor 1 uur bij RT (300 μL op apical/600 μL op basolateraal). Celkernen zijn gekleurd met 5 μg/mL DAPI-PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: PFA is gevaarlijk. - Snijd de membranen met behulp van een scalpel en plaats ze tussen twee 12 mm microscopie cover glijbanen met behulp van een montagemedium (zie Tabel van materialen). Laat het 30 minuten drogen in de flowbank voor opslag bij 4 °C. Visualiseren door confocale scanning microscopie.
LET OP: Na de co-cultuur en voor de montage kunnen strakke verbindingen immunostaining worden uitgevoerd. Daarvoor worden cellen vastgesteld met paraformaldehyde 3% voor 30 min, opnieuw gewassen met PBS en permeabiliseerd met saponine 0,05%/BSA 1% in PBS. In dit protocol werd het zonula occludens eiwit (ZO-1) gedetecteerd via muisanti-menselijk ZO-1-antilichaam (1:400, incubatie bij 4 °C 's nachts). De monsters werden vervolgens 2 uur bij RT geïncubeerd met geitantimuis IgG-antilichaam Alexa Fluor 633 (1:2000 in het rood). Kernen waren bevlekt met DAPI (1 μg/mL) en gemonteerd met montagemedium op coverslips. - Gebruik een confocale microscoop voor het beeldvorming van de opgeslagen membranen. Kies 25x of 63x wateronderdompeling doelstellingen en lasers op 405, 488, 505 of 633 nm voor detectie. Afbeeldingen moeten een resolutie van 1024 x 1024 pixels hebben.
LET OP: De lasers worden gekozen op basis van de gebruikte vlek. - Verwerf apicale en dwarsdoorsnedeweergaven en gebruik de zeta-stack-modus (10-15-stacks) voor de bouw van een driedimensionaal model met behulp van beeldsoftware.
5. Meting van bacteriële proliferatie via kolonievormende eenheden (CFU)
- Verzamel het apicale en basolaterale medium (met bacteriën) om CFU van niet-aangesloten bacteriën te beoordelen. Verzamel 500 μL van de apicale en basolaterale zijkanten en verpool ze.
OPMERKING: Gebruik deze suspensie direct om bacteriën (stap 5.4) of centrifuge bij 21.250 x g gedurende 10 minuten te tellen om lactaatdehydrogenase (LDH) van het supernatant (punt 6) te evalueren en/of opnieuw opgehangen in PBS om extracellulaire bacteriën te tellen (stap 5.4). - Beoordeel de overleving van bacteriën die in de cellen zijn bevestigd en/of geïnternaliseerd door 500 μL steriel gedeïmiseerd koud water toe te voegen in elk compartiment van de doorlaatbare steun. Incubeercellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De monsters kunnen worden verguld op LB agar (zie stap 5.4) of bevroren (als hele wisselplaat) bij -20 °C voor beplating later. - Voor de beoordeling van CFU van aanhangende/geïnternaliseerde bacteriën, dooimonsters bij 37°C gedurende 10 min (indien bevroren). Met behulp van pipet tips voor elke put, schraap het membraan oppervlak en pipet op en neer om alle aangehangen inhoud te verwijderen.
LET OP: Bij deze stap zijn alle epitheelcellen lysed en zijn aanhangende/geïnternaliseerde bacteriën beschikbaar als een suspensie om te verguld worden. - Met de bacteriële suspensie van beide breuken voert u een 1/10 seriële verdunning uit met Tween-80 0,05% in PBS en de vervolgens de bacteriën op LB agar-platen.
LET OP: Verdunningen tussen 1 tot 10 worden aanbevolen. De bacteriën moeten worden geteld in de hoogste verdunning, waar enkele kolonies voor het eerst worden geïdentificeerd. - Incubeer agar platen op 30°C voor 16-72 uur om kolonies te tellen, en bereken CFU dienovereenkomstig.
OPMERKING: Een temperatuur van 30°C op het moment van plaatincubatie is essentieel voor behandelde monsters en om vertraagde groei van kolonies waar te nemen.
6. Evaluatie van celcytotoxiciteit via lactaatdehydrogenasetest
- Gebruik de supernatant van geïnfecteerde cellen die bacteriën bevatten (vanaf stap 5.1) voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen voor LDH-test16. Centrifuge de supernatant op 21.250 x g gedurende 10 min om de bacteriën pellet en uiteindelijk de rest van de cellen. Gebruik de bacterievrije supernatant om ldh-afgifte te meten.
OPMERKING: De supernatant mag niet worden ingevroren voordat het LDH meten door deze test. - Breng 100 μL van het supernatant over naar een 96-putplaat en voeg 100 μL van de LDH-testoplossing toe (zie de tabel met materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker en lees vervolgens absorptie op 492 nm.
7. Beoordeling van het vrijkomen van menselijke cytokinen
- Voor cytokine kwantificering gebruikt u ELISA of cytometrische kraalarray immunoassay17(zie de tabel van materialen). Hiervoor is centrifuge supernatant van stap 5.1 op 21.250 x g gedurende 10 min en meet onmiddellijk of bewaar -80 °C gedurende maximaal 15 dagen tot analyse.
- Evalueer supernatants met een commercieel verkrijgbaar ELISA-kit.
OPMERKING: De procedure volgt de fabricage-instructies, waaronder de coating van platen met het afvangantilichaam, toevoeging van de monsters (100 μL) en cytokinenormen, incubatie, wassen en toevoeging van detectieantilichaam om een colorimetrische meting van de aanwezigheid van cytokine te bieden. Als alternatief kan flow cytometrie worden gebruikt om cytokinen te meten via commercieel beschikbare kits (zie Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont de morfologie van de resulterende co-cultuur van menselijke bronchiale epitheelcellen en macrofagen na het kweken van beide voor 24 uur aan de apicale en basolaterale kant van permeabele ondersteunt, respectievelijk. De epitheelbarrière integriteit wordt aangetoond door hogere TEER (834 Ω ×cm2) en CLSM door immunostaining voor de strakke kruising eiwit ZO-1 (Figuur 1B). Dezelfde resultaten waargenomen in termen van barrière integriteit van niet-geïnfecteerde CFBE41o- monocultuur kon worden gezien in de niet-geïnfecteerde epitheel-macrofaag co-culturen.
Om een bacteriële infectie te modelleren, werd P. aeruginosa ingeënt bij een veelheid van infectie (MOI) van 1:1 op CFBE41o- cellen. Zes uur na infectie (Figuur 2A), werden macrofagen waargenomen aan de apicale kant van de co-cultuur. Na de infectie daalde de TEER van 834 naar 250 Ω×cm2, wat duidt op een gecompromitteerde epitheliale barrière, zoals ook gevisualiseerd door ZO-1 kleuring (Figuur 2B).
Figuur 3 toont macrofaagtransmigratie door de permeabele membraanporiën en bacteriënopname door THP-1 cellen aan de apicale kant. De monsters werden vastgesteld op 1, 3 en 6 uur na incubatie van onafhankelijke experimenten. In de THP-1 monoculturen (figuur 3A-C) werd macrofagen migratie al al vanaf 1 uur waargenomen, terwijl dit in de co-cultuur (figuur 3D-F)werd waargenomen na 3 uur infectie. Bacteriën opname in THP-1 werd waargenomen na 3 uur infectie, in zowel monocultuur en co-cultuur. Geen bacteriële opname door CFBE41o- kon worden gezien. Dwarsdoorsnede standpunten werden geplaatst zodanig dat de permeabele membraan steun was in het midden als een scheiding van de apicale en basolaterale compartiment.
Figuur 4 toont confocale scanning lasermicroscopie foto's van geïnfecteerde co-culturen (CFBE41o- + THP-1) behandeld met of zonder tobramycine voor 6 uur(Figuur 4A, B) of 20 uur ( Figuur4C, D). Zonder behandeling stierven zowel de epitheelcellen als de macrofagen na 20 uur infectie(figuur 4C). Echter, bij tobramycine behandeling, de gastheer cellen worden bewaard na 20 uur; nog steeds kunnen sommige bacteriën worden waargenomen in de cultuur. Ondanks het feit dat gezien na 6 uur van de behandeling in de microscopie foto's (Figuur 4B), de bacteriën niet vermenigvuldigen zoals waargenomen in CFU testen in figuur 4E. Niettemin, na 20 h behandeling, de bacteriën herstelde de proliferatie vermogen, zoals gezien door de kolonies in de CFU test (Figuur 4F). Het cellyseprotocol met koud water en schrapen kan bacteriën vrijmaken die in cellen zijn bevestigd en eventueel geïnternaliseerd. Tegelijkertijd worden de cellen vernietigd (aanvullende figuur S1A, B). De centrifugatiestappen die in dit document worden gebruikt voor epitheliale cellen (300 x g)of bacteriën (21.250 x g) belemmerden de levensvatbaarheid van beide niet (Aanvullende cijfers S1C, D). Alle CFU-tests werden uitgevoerd door de monsters bij -20°C te bevriezen, gevolgd door ontdooiing en beplating. Deze procedure verminderde het aantal bacteriën met 2-logs, in vergelijking met verse monsters (Aanvullende figuur S1E). Aangezien deze procedure gelijktijdig wordt uitgevoerd voor alle experimentele groepen (behandeld en onbehandeld) op verschillende tijdstippen, zal deze vermindering worden opgenomen in de eindresultaten(aanvullende figuur S1E). Bovendien vertoonde de hier gebruikte concentratie tobramycine geen toxiciteit voor de niet-geïnfecteerde cellen(aanvullende figuur S2A) en ook geen verdere ontstekingsreactie (aanvullende figuur S2B). Het was echter binnen het bereik van de minimale remmende concentratie om P. aeruginosate doden.
Figuur 5 toont de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en de levensvatbaarheid van cellen. Figuur 5A–B illustreert de TEER van monoculturen en coculturen. De co-cultuur van CFBE41o- cellen met THP-1 hebben geen verandering teweeggewogen in de epitheliale barrièreintegriteit ten opzichte van de monocultuur (rode balken). Bij de infectie daalde de TEER-waarde (groene balk). Na 1 uur infectie werden sommige monsters behandeld met het antibioticum tobramycine (blauwe staaf), gedurende 6 of 20 uur. De behandeling bewaarde de epitheelbarrière integriteit, zoals waargenomen door de hogere TEER. Figuur 5C toont het percentage LDH-afgifte als indicatie van celtoxiciteit bij infectie en tobramycinebehandeling na 6 uur. De co-cultuur zelf veroorzaakte een release van LDH, die hetzelfde was voor de geïnfecteerde cellen (ongeveer 20%). Na 20 uur infectie kon geen signaal van LDH worden gedetecteerd. Om de betrouwbaarheid van LDH voor langdurige infectie te bewijzen, werd PAO1-GFP op middellange met en zonder LDH 1 U/mL geïncubeerd in vergelijking met de respectievelijke niet-geïnfecteerde controles(aanvullende figuur S2C). Het LDH-signaal ging verloren na langdurige incubatie (20 uur) met P. aeruginosa, wat aangeeft dat LDH alleen stabiel is in kortere incubatietijden in geïnfecteerde culturen.
Figuur 6 toont de kinetiek van pro-inflammatoire cytokinen die via ELISA worden gedetecteerd. Het voordeel van een geïnfecteerde co-cultuur van CFBE41o- en THP-1 cellen werd waargenomen met de hogere afscheidingen van pro-inflammatoire cytokinen. De afscheiding van sommige pro-inflammatoire cytokinen was vergelijkbaar (IL-6) of hoger (IL-8, TNF-α, IL-1β) in de geïnfecteerde co-cultuur (Figuur 6C) dan in de overeenkomstige monoculturen (Figuren 6A-B). Onverwacht zijn sommige cytokinen in THP-1 monoculturen (figuur 6B) downregulated in geïnfecteerde monsters (Il-8, TNFα, IL-1β).
Figuur 7 toont het vrijkomen van cytokinen in mono- en coculturen bij infectie en behandeling met tobramycine gemeten via fluorescentie geactiveerde celsorde (FACS). De afscheiding van de pro-inflammatoire cytokine IL-8(figuur 7A)en de ontstekingsremmende cytokine IL-10 (figuur 7F)was hoger in de co-culturen van epitheliale cellen en macrofagen, in vergelijking met de monoculturen. Voor alle andere cytokinen (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 en GM-CSF)(figuren 7B-E)waren de niveaus van cytokinesecretie echter niet hoger in de co-cultuur die in de respectieve monoculturen.
Figuur 1: Dwarsdoorsnedes en apicale opvattingen van de niet-geïnfecteerde epitheel-macrofaag co-cultuur. (A) Kruis standpunten van niet-geïnfecteerde 24 h epitheel-macrofaag co-cultuur. CFBE41o- gekleurd rood, THP-1 macrofagen in geel en kernen in blauw (DAPI). (B) Apicale opvattingen van de niet-geïnfecteerde CFBE41o- monolayer immuno-gekleurd voor ZO-1 (red). DAPI: kernen. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Dwarsdoorsnedes en apicale opvattingen over de geïnfecteerde epitheel-macrofaag co-cultuur. (A) Kruismeningen en (B) apicale weergave van epitheliale-macrofaag co-cultuur op 6 uur na infectie (hpi) met P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- gekleurd in rood, THP-1 macrofagen in geel, kernen in blauw (DAPI) en P. aeruginosa PAO1-GFP in het groen. (B) Apicale opvattingen van de 6 h besmette CFBE41o- monolayer. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kinetiek van macrofaagtransmigratie en bacterieopname gevisualiseerd door dwarsdoorsnede van het 3D-model. PAO1-GFP infectie kinetiek in monoculturen van THP-1 macrofagen(A-C) of co-cultuur(D-F). THP-1 macrofagen zijn gekleurd in rood, kernen van epitheelcellen in blauw (DAPI) en P. aeruginosa in groen (GFP). Elk cijfer is verdeeld in apicale en basolaterale kanten, wordt de ruimte tussen beschouwd als het membraan, dat leeg is of bezet door CFBE41o- samenvloeiende laag (D-F). Inserts in de cijfers tonen bacteriën opname door macrofagen op verschillende tijdstippen (A-F). Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van PAO1-GFP survival in tobramycine-behandelde co-culture. (A-D) Confocale micrografen co-culturen met en zonder behandeling. (A) Onbehandelde co-cultuur na 6 uur infectie. (B) Geïnfecteerde co-cultuur behandeld met tobramycine 6 μg/mL (Tob) voor 6 uur (C) Onbehandelde co-cultuur 20 uur na infectie, (D) geïnfecteerde co-cultuur behandeld met tobramycine 6 μg/mL voor 20 uur. Kernen gekleurd met DAPI (blauw), macrofagen (rood) en P. aeruginosa GFP (groen). (E) Kolonievormende eenheden (CFU) van aanhangende/geïnternaliseerde bacteriën na 6 en (F) 20 uur met tobramycine 6 μg/mL behandeling. Lege membraan insert werd gebruikt als een abiotische substraat om PAO1-GFP groeien. Two-way ANOVA met Tukey's multiple comparisons test (# no colonies) werd gebruikt, *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: niet significant. Foutbalken geven standaarddeviatie aan, n = 9–27 replicaties van 3-9 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Barrièreintegriteit en evaluatie van de levensvatbaarheid van mono- en co-cultuur. De volgende co-cultuur voorwaarden werden beoordeeld: niet-geïnfecteerde (grijze balken), besmet (groene balken), of besmet en behandeld met tobramycine (blauwe balken). (A) Transepithelial electrical resistance after 6 h and (B) 20 h of infection in mono-cultures (CFBE41o- and THP-1) and co-culture. (C) Cytotoxiciteit van mono- en co-cultuur gemeten via LDH release 6 uur na infectie. Twee-weg ANOVA met tukey's meerdere vergelijkingen test werd gebruikt; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: niet significant. Foutbalken geven standaarddeviatie aan; n = 9 replica's van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Kinetiek van cytokine-afgifte van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde mono- en co-cultuursupernatants die via ELISA worden beoordeeld. ELISA werd gedaan volgens het protocol van de kitfabrikant. (A) CFBE41o-, (B) THP-1, en (C) co-cultuur vrijgeven IL-8, TNF-α, IL-1β, en IL-6. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. n = 6 replica's van 2 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Supernatante resultaten van cytokinepaneel gemeten via FACS met en zonder tobramycine 6 μg/mL voor 6 uur na infectie. Supernatants van mono- en co-cultuur na 6 uur na infectie gebruikt om de respectieve cytokines IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23(D),GM-CSF (E) en IL-10 (F) te analyseren. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, n = 9 replica's van 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Controle-experimenten voor kritieke stappen van het protocol. (A, B) Micrografen van CFBE41o- cellen in 24-well platen gekweekt gedurende 2 dagen bij een dichtheid van 2 x 105 cellen/put. (A) CFBE41o- cellen in PBS gedurende 30 min, en (B) met water behandelde cellen na 30 minuten na het schrapen met een pipet. (C) Levensvatbaarheid van zoogdiercellen na centrifugatie. CFBE41o- cellen werden verwijderd uit T75 celkweekkolf zoals beschreven in stap 1.1.1 en 1.1.2. 100 μL van de resulterende celsuspensie werd geanalyseerd in 10 mL isotone oplossing. Een geautomatiseerde celteller werd gebruikt om de levensvatbaarheid van enkele cellen te beoordelen. Vervolgens werden de respectieve celsuspensies gecentrifugeerd op 300 x g gedurende 4 minuten, opnieuw opgehangen en opnieuw geteld. Foutbalken geven standaarddeviatie aan, n = 6 verschillende kolven van 2 individuele experimenten. (D) Levensvatbaarheid van PAO1-GFP na centrifugatie. PAO1-GFP bacteriën werden verdund tot OD = 0,01 in celmedium. CFU werd beoordeeld via een 10-voudige verdunningsrij en LB-platen die 's nachts bij 30 °C werden geïncubeerd. De respectievelijke kunststof buizen werden gecentrifugeerd met 21.250 x g gedurende 10 minuten en opnieuw opgehangen in medium. CFU werd opnieuw dienovereenkomstig beoordeeld. T-test van twee staarten, * p < 0,033. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, n = 6 van de 2 experimenten. (E) Levensvatbaarheid van bacteriën na het invriezen. PAO1-GFP bacteriën werden bereid zoals in (D) en CFU werd geanalyseerd, vervolgens werden plastic buizen voor één dag bevroren bij -20 °C en ontdooid om CFU opnieuw te beoordelen. T-test van een student met twee staarten, *** p < 0,001. Foutbalken geven standaarddeviatie aan, n = 6 van de twee experimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Controle-experimenten om LDH-gedrag en invloed van tobramycine te beoordelen. (A) Controle-experiment om cytotoxiciteit te beoordelen na 20 uur incubatie met 6 μg/mL tobramycine. Mono- en co-cultuur werd gedaan zoals beschreven in het protocol, maar cellen werden gekweekt voor 2 dagen op 24-well platen en THP-1 cellen werden apically gezaaid. Cellen met 6 μg/mL tobramycine of besturingselementen werden 20 uur geïncubeerd. One-Way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, *** p < 0.001. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, n = 6 van de 2 experimenten (CFBE41o-), n = 3 van één experiment (THP-1 en co-cultuur). (B) Control-ELISA van supernatants van mono- en co-cultuur met/zonder tobramycine. Celcultuur werd gedaan volgens (A) om geen cytokine release te tonen in vergelijking met controles voor alle voorwaarden. ELISA werd gedaan in stap 7.1 en 7.2, 10 μg/mL (LPS) werd toegevoegd als controle, IL-8 release voor LPS-behandelde controles met THP-1 was hoger dan detecteerbaar. Two-Way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, ns p > 0.12; * p < 0,033; p < 0,001. Foutbalken geven standaarddeviatie aan, n = 6 van de twee experimenten, n = 3 van één experiment (LPS-besturingselement). (C) LDH-afbraak als gevolg van overmatige PAO1-GFP-proliferatie. LDH werd bij concentratie van 1 U/mL toegevoegd aan het MEM-medium. Ofwel LDH medium of controlemedium werd gebruikt om cellen te verdunnen tot OD = 0,01 (komt overeen met 1 x 108 CFU/mL) en vervolgens geïncubeerd voor 20 h. LDH test werd gedaan zoals beschreven in sectie 6. One-Way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, ns p > 0.12; p < 0,001. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, n = 8–9 van drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document beschrijft een protocol voor een 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen, gevormd door de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o- en de menselijke monocyten-afgeleide macrofaag cellijn THP-1. Het protocol maakt de beoordeling van epitheliale barrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriën overleving, en ontsteking, die belangrijke parameters bij het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en gastheer-reacties tegelijkertijd. De nieuwigheid in het model ligt in de integratie van epitheliale cellen (d.w.z. menselijke CF-cellijn en macrofagen) met acute bacteriële infectie (d.w.z. P. aeruginosa). De acute infectie in de epitheelcellen wordt aangetoond te worden gecontroleerd door een antibioticum (d.w.z. tobramycine). Naast het gebruik van een menselijke CF-cellijn, is het hele model opgezet onder ALI-omstandigheden, wat aanzienlijk dichter bij de fysiologische omstandigheden in CF ligt. Het gebruik van een CF-cellijn implementeert enkele kenmerken van de ziekte in het model. De mutatie van de cystische fibrose transmembrane geleidingsregulator (CFTR) is direct gerelateerd aan de ontregeling van epitheliaal vloeistoftransport in de longen. Bovendien leiden mutaties in het CF-gen, zoals de ΔF508, tot dik slijm, met ontsteking en ernstige longschade bij infectie met P. aeruginosa4. Deze pathologische manifestaties veroorzaakt door disfunctionele CFTR kunnen autofagie stoornissen als een belangrijk cellulair mechanisme geassocieerd met de pathogenese van CF longziekte18. Echter, de CFBE41o- niet in het geheim slijm, dat is een beperking van deze cellijn. Als het de bedoeling is om de rol van slijm specifieker te bestuderen, kan het protocol worden aangepast met behulp van andere bronchiale cellijnen (bijvoorbeeld Calu-3).
Een cruciale stap om dit protocol op te zetten is de combinatie van epitheliale en immuuncellen en de daaropvolgende infectie met P. aeruginosa bij ALI. De infectie van CFBE41o- door P. aeruginosa in vitro is al beschreven, voornamelijk met behulp van een flow-cel kamer, aangevuld met arginine in de kweekmedia, om epitheliale cel overleving te verbeteren en ondersteuning biofilm vorming19. Het huidige protocol was gericht op een nieuw model met alleen menselijke cellen, die bovendien bij ALI op doorlaatbare putplaatwisselplaten voor een hogere monsterdoorvoer konden worden geteeld. De opname van THP-1 gedifferentieerde macrofagen als een menselijke vereeuwigde cellijn, in plaats van afhankelijk te zijn van het verkrijgen van reproduceerbare primaire cellen van donoren, is een ander voordeel van ons model. Door deze macrofagen toe te voegen aan de basolaterale kant van permeabele membraansteun, werd opgemerkt dat macrofagen uitsjoegden en uiteindelijk oversmeerden naar de apicale kant van de door filter gekweekte epitheliale barrière. Een variatie van dit protocol zou de toevoeging van macrofagen direct aan de apicale kant bovenop de epitheelcellen kunnen zijn, zoals beschreven door Kletting et al.. 14. De co-cultuur van niet-menselijke immuun- en longcellen is al eerder beschreven. Ding et al. 10 gebruikte muis Lewis longcarcinoom cellen op permeabele insert ondersteunt in combinatie met macrofagen aan de basolaterale kant en besmet met S. aureus, een andere kritische ziekteverwekker van chronische infectie bij CF-patiënten. In deze studie was er echter geen focus op cystische fibrose of om de co-cultuur te gebruiken als een platform voor de evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen. Ons protocol kan worden aangepast voor andere bacteriële infecties, zoals Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, of Burkholderia cepacia- belangrijke ziekteverwekkers in CF long.
Een andere kritieke stap is de toevoeging van THP-1 macrofagen aan de cellen door het omdraaien van de doorlatende wisselplaten ondersteboven (sectie 2). Dit is van cruciaal belang voor het beoordelen van macrofaagtransmigratie via de put naar de zijkant van de infectie. Het latere beeldvormingsproces van de 3D-modellen met z-stacks en dwarsdoorsnedeweergave kan worden uitgevoerd om de binnenkant van macrofagen te observeren en de opname van bacteriën te detecteren(figuur 3). Bij 1 hpi migreren bacteriën aan de apicale kant door het membraan, terwijl macrofaagmigratie en opname slechts bij 3 hpi plaatsvinden. Daarom was het na 1 uur infectie aangewezen om de behandeling met tobramycine te starten en de mogelijkheid te hebben om zowel de overleving van de gastheercel als de bacteriën gedurende een lange periode (20 uur) aan te pakken. In de loop van het protocol is het handhaven van steriliteit een kritiek probleem vanwege de veelheid aan stappen die elk het risico van besmetting met zich meebrengen. Niettemin zal ervaren celcultuurpersoneel dit protocol kunnen volgen na een passende voorbereiding en opleiding. Celmedium moet regelmatig worden gecontroleerd op besmetting, bij voorkeur na alle kritieke stappen.
Zoals met elk model, de geïnfecteerde co-cultuur heeft ook een aantal beperkingen; bijvoorbeeld de integratie van de macrofaagachtige cellen. Hier was het belangrijk om macrofagen te hebben aan de basolaterale kant; de manipulatie van de wisselplaat met een eerder gekweekte epitheliale laag kan echter vroege schade en verstoringen van de co-cultuur hebben veroorzaakt. Hoewel het doorlaatbare ondersteuningsmodel hoge doorvoerkenmerken bood, die niet zijn waargenomen in eerdere coculturen van de met CF besmette long20,21. Met dat, verdere experimenten moeten de beperkingen van het gebruik van THP-1 als macrofaag substituut te beoordelen. Hoewel deze cellijn op grote schaal wordt gebruikt, reageert het minder op LPS22 en mist het volledige activering en wordt de hele populatie niet onderscheiden van monocyten tot macrofaagachtige cellen23. Een andere beperking is het ontbreken van andere belangrijke componenten in CF-infectie en levering van geneesmiddelen. De CFBE41o- cellijn bezit geen trilharen en produceert geen slijm, wat meestal 20-30 dagen celcultuur bij ALI gebeurt. Omdat dit niet het geval was voor CFBE41o- cellijn, gebruikten we de cellen na zeven dagen toen een strakke epitheliale barrière werd gevormd. Mucociliary klaring verandert de verblijfsomstandigheden voor microben24 of drugsdeeltjes9,,25 en in vitro modellen die longdepositie beoordelen, moeten hiermee rekening houden. Anders dan wat door andere cellen wordt waargenomen, vertoont de weefselkweek coating met een extracellulair matrixmateriaal (zoals fibronectine of collageen I) geen significant verschil voor CFBE41o-bijvoorbeeld in TEER26. Daarom werden de doorlatende filters niet bekleed met een extracellulair matrixmateriaal in dit protocol.
Met het protocol hier beschreven, mono en co-culturen na 6 uur infectie bieden voldoende cytokine release te worden gebruikt als een meting in de toekomst drugstesten. De co-cultuur brengt een voordeel van celsamenwerking bij het modelleren van immuunrespons. De inefficacy van tobramycine bij het verminderen van ontsteking werd verwacht aangezien niet alle bacteriën tijdens de behandeling werden geëlimineerd(Figuur 4E, F). Niettemin is het modelleren van de respons op tobramycine in een CF-model van cruciaal belang, aangezien tobramycine (in hogere concentraties) effectief kan zijn bij P. aeruginosa-remming, zelfs op biofilm19,27. Een mogelijkheid voor verder gebruik van dit protocol is het integreren van ontstekingsremmende geneesmiddelen in de behandeling. De algemene aanbeveling met betrekking tot ontstekingsreacties zou zijn om de korte duur behandeling (6 h), die nog steeds de gastheer cel en bacteriën aanwezig heeft te gebruiken. Na dit tijdstip worden de gastheercellen vernietigd in onbehandelde monsters. Zowel ELISA als FACS kunnen worden gebruikt om het vrijkomen van cytokinen te meten. Ten slotte wordt aanbevolen om, als de monsters langer dan 15 dagen bij -80 °C worden opgeslagen, de betrouwbaarheid van de cytokinen te controleren door bijvoorbeeld een positieve controle van verse monsters te gebruiken (bijvoorbeeld cellen gestimuleerd met LPS).
Sommige wijzigingen van het protocol zijn mogelijk. Het huidige protocol kan bijvoorbeeld worden uitgebreid naar de toepassing van vernevelde geneesmiddelen (stap 3.6). Dit is nodig om de levering van longgeneesmiddelen te modelleren via orale inademing. Verneveling van in water oplosbare geneesmiddelen, zoals tobramycine, of nano-dragers daarvan, zoals liposomale colistin, is relatief eenvoudig door commercieel beschikbare apparaten routinematig gebruikt in de kliniek. Ook zijn er verschillende commercieel beschikbare apparaten om spuitbussen te deponeren op celcultuur inserts. Bovendien, zoals het hier beschreven model is gebaseerd op permeabele membraansteunen, kan het ook worden aangenomen aan een aantal hedendaagse microfluïde (bijvoorbeeld "long op een chip") apparaten, bijvoorbeeld om de invloed van de ademhaling en de bijbehorende mechanische stretching en veranderingen in de luchtstroom te bestuderen. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd door de toevoeging van slijm of vervanging door primaire cellen, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt. Een andere interessante volgende stap zou het testen van nanogeneeskunde zijn, vooral omdat nanotechnologie vooruitgang boekt bij de ontwikkeling van nieuwe anti-infectiva28, CF-correctoren29 en co-delivery van antibiotica en pathoblockers30. Over het algemeen kan het huidige protocol worden beschouwd als nuttig bij het beoordelen van bacteriële overleving bij behandeling met antibiotica in een complex systeem, samen met enkele hostgerelateerde uitlezingen: celcytotoxiciteit, epitheelbarrière-integriteit, macrofaagtransmigratie en ontstekingsreactie. Dit zijn essentiële parameters voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk ontving financiering van het HORIZON 2020-programma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie in het kader van subsidieovereenkomst nr. Wij danken Dr. Ana Costa en Dr. Jenny Juntke voor de grote steun aan de ontwikkeling van de co-cultuur, Olga Hartwig, voor de wetenschappelijke illustratie, Anja Honecker, voor ELISA-tests, Petra König, Jana Westhues en Dr. Chiara De Rossi voor de ondersteuning van celcultuur, analyse en microscopie. We danken Ook Chelsea Thorn voor het nalezen van ons manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
