Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.
Abstract
fDie Arzneimittelforschung zur Behandlung von Lungeninfektionen schreitet zu prädiktiven In-vitro-Modellen von hoher Komplexität bei. Die vielfältige Präsenz von Bakterien in Lungenmodellen kann die epitheliale Anordnung wieder anpassen, während Immunzellen eine Entzündungsreaktion gegen die Bakterien in der Mikroumgebung koordinieren. Während In-vivo-Modelle die Wahl waren, um neue Anti-Infektiva im Zusammenhang mit Mukoviszidose zu testen, imitieren sie immer noch nicht genau die In-vivo-Bedingungen solcher Krankheiten beim Menschen und die Behandlungsergebnisse. Komplexe In-vitro-Modelle der infizierten Atemwege auf der Grundlage menschlicher Zellen (Bronchialepithel und Makrophagen) und relevanter Krankheitserreger könnten diese Lücke überbrücken und die Übersetzung neuer Antiinfektiva in die Klinik erleichtern. Zu diesem Zweck wurde ein Kokulturmodell der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und THP-1-Monozyten-abgeleiteten Makrophagen etabliert, das eine Infektion der menschlichen Bronchialschleimhaut durch P. aeruginosa unter Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) nachahmt. Dieses Modell wird in sieben Tagen eingerichtet, und die folgenden Parameter werden gleichzeitig bewertet: Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, bakterielles Überleben und Entzündungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares System zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und wirtsreaktionen, die für die Entdeckung neuer Antiinfektiva und die Optimierung ihrer Aerosolzufuhr in die Lunge relevant sein könnten.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa ist ein relevanter Erreger bei Mukoviszidose (CF), der zur Beeinträchtigung des Lungengewebes beiträgt1. Die Produktion von Polysacchariden, wie Alginat und anderen Mukoid-Exopolysacchariden, koordiniert den Krankheitsverlauf, der zu einer hartnäckigen bakteriellen Haftung führt, die Abgabe von Antibiotika an Bakterien begrenzt und die Bakterien vor dem Wirtsimmunsystem schützt2. Der Übergang von P. aeruginosa vom planktonischen Stadium zur Biofilmbildung ist in diesem Zusammenhang ein kritisches Thema, das auch das Auftreten von Antibiotikatoleranz erleichtert.
Im Kontext von CF wurde die Maus in erster Linie als Modell verwendet. Mäuse entwickeln diese Krankheit jedoch nicht spontan mit der Einführung von CF-Mutationen3. Die meisten bakteriellen Biofilm-Entwicklung und Arzneimittelanfälligkeit Studien wurden auf abiotischen Oberflächen durchgeführt, wie Petri-Gerichte. Dieser Ansatz stellt jedoch nicht die In-vivo-Komplexität dar. So fehlen wichtige biologische Barrieren, darunter Immunzellen sowie das Schleimhautepithel. Obwohl P. aeruginosa ziemlich toxisch für Epithelzellen ist, haben es einige Gruppen geschafft, einen früheren P. aeruginosa Biofilm mit menschlichen Bronchialzellen zu kultivieren. Diese Zellen stammten von Mukoviszidose-Patienten mitCFTR-Mutation (CFBE41o - Zellen)4 und erlaubten es, die Wirksamkeit von Antibiotika5 zu bewerten oder die Korrektur des CFTR-Proteins während der Infektion6zu bewerten. Ein solches Modell wurde gezeigt, um die Vorhersehbarkeit der Wirksamkeit von Arzneimitteln zu verbessern, zusätzlich zur Aktivierung der Charakterisierung von Problemen mit Medikamenten, die in späteren Phasen der Arzneimittelentwicklung versagten7.
In der Lunge wird das Schleimhautepithel jedoch der Luft ausgesetzt. Darüber hinaus spielen Immunzellen in den Atemwegen, wie Gewebemakrophagen, eine wesentliche Rolle gegen eingeatmete Krankheitserreger oder Partikel8. Makrophagen wandern durch die verschiedenen Zellschichten, um das Bronchiallumen zu erreichen und die Infektion zu bekämpfen. Darüber hinaus müssen inhalierte Medikamente auch mit dem Vorhandensein von Schleim als zusätzliches nichtzelluläres Element der Lungenluft-Blut-Barriere9zurechtkommen. Tatsächlich wurden mehrere komplexe dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt, die darauf abzielen, die In-vivo-Relevanz zu erhöhen. Co-Kultursysteme erhöhen nicht nur die Komplexität von In-vitro-Systemen für die Arzneimittelentdeckung, sondern ermöglichen auch die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Diese Komplexität wurde in Studien über Makrophagenmigration10, die Freisetzung von antimikrobiellen Peptiden durch Neutrophile11, die Rolle des Schleims beiInfektionen 9, und die Epithelzellreaktion auf übermäßige Schäden12behandelt. Ein zuverlässiges CF-infiziertes In-vitro-Modell, das die genetische Mutation in CF aufweist, der Luft ausgesetzt ist (erhöhter physiologischer Zustand), und Immunzellen integriert, fehlt noch.
Um diese Lücke zu überbrücken, beschreiben wir ein Protokoll für eine stabile menschliche 3D-Kokultur der infizierten Atemwege. Das Modell besteht aus menschlichen CF-Bronchialepithelzellen und Makrophagen, die mit P. aeruginosa infiziert sind und sowohl eine diffusionale als auch eine immunologische Barriere darstellen können. Mit dem Ziel, Anti-Infektiva bei einem relativ hohen Durchsatz zu testen, wurde diese Co-Kultur auf der durchlässigen Filtermembran von Wellplatteneinsätzen unter Verwendung von zwei menschlichen Zelllinien etabliert: CFBE41o- und THP-1 Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Darüber hinaus wurde das Modell zur Untersuchung der Ablagerung von aerosolisierten Antiinfektiva13an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) und nicht an liquiden abgedeckten Bedingungen (LCC) etabliert.
Wie wir hier berichten, ermöglicht dieses Modell nicht nur die Beurteilung des bakteriellen Überlebens bei einer Antibiotikabehandlung, sondern auch die Zellzytotoxizität, die Integrität der Epithelbarriere, die Makrophagentransmigration und die Entzündungsreaktionen, die wesentliche Parameter für die Arzneimittelentwicklung sind.
Dieses Protokoll kombiniert zwei relevante Zelltypen für die Inhalationstherapie der Lungenwege: Makrophagen und CF-Bronchialepithel. Diese Zellen werden auf gegenüberliegenden Seiten von durchlässigen Stützeinsätzen gesät, wodurch die Zellexposition gegenüber Luft (sogenannte Air-Liquid Interface (ALI)-Bedingungen) möglich ist. Diese Kokultur der Wirtszellen wird anschließend mit P. aeruginosainfiziert. Beide Wirtszelllinien sind menschlicher Herkunft: Die Epithelzellen stellen das mukovisenfibrosebronchiale Epithel dar, mit einer Mutation auf dem CF-Kanal (CFBE41o- ),und die THP-114-Zellen sind eine gut charakterisierte Makrophage-ähnliche Zelllinie. Eine konfluente Epithelschicht darf sich zunächst auf der Oberseite von Brunnenplatteneinsätzen bilden, bevor die makrophageähnlichen Zellen dem gegenüberliegenden Fach hinzugefügt werden. Sobald die Kokultur bei ALI etabliert ist, wird das System mit P. aeruginosa an der apikalen Seite geimpft. Dieses infizierte Co-Kultursystem wird dann verwendet, um die Wirksamkeit eines Antibiotikums, z. B. Tobramycin, zu bewerten. Folgende Endpunkte werden analysiert: epitheliale Barriereintegrität in Bezug auf transepitheliale elektrische Resistenz (TEER), Visualisierung von Zell-Zell- und Zell-Bakterien-Wechselwirkungen durch konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM), bakterielles Überleben durch Zählung koloniebildender Einheiten (CFU), Überleben der Wirtszellen (Zytotoxizität) und Zytokinfreisetzung.
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Protocol
1. Wachstum und Differenzierung von Zellen in durchlässigen Stützeinsätzen
- CFBE41o kultivieren- in einem T75-Kolben mit 13 ml minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS), 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 600 mg/L Glukose bei 37 °C mit 5 %CO2-Atmosphäre. Fügen Sie den Zellen alle 2–3 Tage frisches Medium hinzu.
- Lösen Sie die Zellen nach Erreichen von 70% Zusammenfluss im Kolben mit 3 ml Trypsin- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37°C für 15 min. Fügen Sie 7 ml frisches MEM hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie neue 10 ml MEM hinzu, während Sie die Klumpen durch sanftes Pipettieren nach oben und unten stören.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometerkammer. Samenzellen mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen/Gut in 12-Well-Platten mit durchlässigen Stützen (Porengröße von 3 m, siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der automatisierte Zellenzähler bestimmt die Zellenzahl, die Größenverteilung und die Lebensfähigkeit der Zellen (siehe Tabelle der Materialien). Hier könnten durchlässige Stützen mit einer Porengröße von 0,4 m verwendet werden; Die Makrophagen sollten jedoch in diesem Zustand direkt zur apikalen Seite hinzugefügt werden, und ihre transzelluläre Migration wird in diesem Fall nicht bewertet. - Samenzellen in flüssig-flüssigem Zustand (LLC) durch Zugabe von 500 l der Zellsuspension auf der apikalen Seite des durchlässigen Trägers und 1,5 ml frisches Medium in der basolateralen Seite. Dann brüten Zellen bei 37°C unter 5%CO2,für 72 h.
- Um zur Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) Kultur zu wechseln, am dritten Tag nach der Aussaat, entfernen Sie das Medium von der basolateralen Seite zuerst, dann von der apikalen Seite. Auf der basolateralen Seite 500 l frisches MEM hinzufügen und das Medium jeden zweiten Tag ändern, bis Zellen eine konfluente Monoschicht bilden.
HINWEIS: Für die in diesem Protokoll verwendeten Bedingungen sind die CFBE41o-Zellen in der Regel nach 3-7 Tagen in kultur konfluent. - Bewerten Sie die epithelialen Barriereeigenschaften an Tag 7, indem Sie CFBE41o- Zellen mit 500 l Zellmedium in der apikalen Seite und 1,5 ml in der basolateralen Seite für 1 h, bei 37°C unter 5%CO2inkubieren.
- Messen Sie die Barriereeigenschaften über den transepitheliaalen elektrischen Widerstand (TEER), mit einer STX2-Essstäbchenelektrode und einem epithelialer Volt-Ohmmeter; nach 7 Tagen ist dies höher als 300 x cm2.
HINWEIS: Schließlich haben die Zellen in einigen Membraneinsätzen einen niedrigen TEER. Daher werden keine durchlässigen Einsätze mit TEER < 300 x cm2 verwendet.
- Um THP-1-Zellen zu kultivieren, wachsen Sie sie in einem T75-Kolben mit 13 ml des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, ergänzt mit 10% FCS, und inkubieren bei 37°C unter 5%CO2. Teilen Sie Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie 2 x 106 Zellen/ml-Zellen in einem neuen T75-Kolben aussäen.
HINWEIS: Nicht differenzierte THP-1-Zellen werden als Monozyten in Suspension angebaut.- Unterscheiden Sie die THP-1-Zellen wie folgt. Zentrifugengehalt eines T75 bei 300 x g für 4 min. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in frischem Medium wieder auf und legen Sie ihn in einen neuen T75. Fügen Sie 10 ng/mL Phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA) inkubieren die Zellen in RPMI für 48 h bei 37 °C und 5%CO2-Atmosphäre 15.
HINWEIS: Nach der Differenzierung mit PMA vermehren sich die Zellen nicht mehr und heften sich an den Kolben an. - Um THP-1-Makrophagen-ähnliche Zellen zu lösen, einmal mit Phosphat-gepufferter Salin (PBS) bei 37 °C waschen und mit 3 ml Zellablösung (z.B. Accutase) mit 0,5 mM EDTA 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Prüfen Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um nach einer Zellablösung zu suchen. 7 ml frisches Medium und Zentrifuge bei 300 x g für 4 min bei RT hinzufügen.
HINWEIS: Makrophagen können auch mit Trypsin-EDTA, 37 °C für 20 min abgenommen werden. Trypsin ist jedoch härter als die gewählte Zellablösung (siehe Materialtabelle). - Nach dem Entfernen des Überstandes, re-suspend Makrophagenzellen in 3 ml THP-1 Medium in einem 15 ml konischen Rohr, zählen Sie die Zellen wie in 1.1.2 beschrieben. und für maximal 1 h bei 37 °C unter 5%CO2 vor dem Aufbau der Co-Kultur inkubieren.
HINWEIS: THP-1-Zellen in Suspension können mit Lebensfähigkeitsfarbstoffen gefärbt werden, um die Co-Kultur weiter abzubilden. Verwenden Sie in diesem Schritt das folgende Verfahren (Schritt 1.2.5). - Stain Makrophagen mit 10 'M eines Zelllebensfähigkeitfarbstoffs (basierend auf der Umwandlung von Acetat-Moieties durch intrazelluläre Esterasen, siehe Materialtabelle), in denen 3 l des Zelllebensfähigkeitfarbstoffs auf die Zellsuspension aufgebracht werden. Brützellen für 20 min bei 37 °C, 5%CO2,dann 1x mit PBS 37°C waschen, um den Farbstoff zu entfernen.
HINWEIS: Zentrifugieren Sie die Zellen, um den Farbstoff bei 300 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT) zu entfernen.
- Unterscheiden Sie die THP-1-Zellen wie folgt. Zentrifugengehalt eines T75 bei 300 x g für 4 min. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in frischem Medium wieder auf und legen Sie ihn in einen neuen T75. Fügen Sie 10 ng/mL Phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA) inkubieren die Zellen in RPMI für 48 h bei 37 °C und 5%CO2-Atmosphäre 15.
2. Etablierung einer Epithel-Makrophagen-Kokultur auf durchlässigen Stützen
- Verwenden Sie CFBE41o- Monolayer bei ALI mit TEER bei 300 x cm2 (Schritt 1.1.6.). Entfernen Sie das Medium aus der unteren Kammer, umkehren Sie vorsichtig die Stütze in einer sterilen Glas Petrischale (50 mm x 200 mm), und entfernen Sie die Zellen, die durch die Membranporen an der Unterseite der Membran mit einem Zellschaber überwuchert sind.
HINWEIS: Aufgrund der Porengröße von 3 m neigen Epithelzellen dazu, durch die Poren zur basolateralen Seite zu wachsen. Daher muss man sie entfernen, bevor sie die Makrophagen auf dieser Seite hinzufügen. CFBE41o- Lungenepithelzellen können in diesem Schritt gefärbt werden. Das Verfahren in Schritt 1.2.5 kann verwendet werden; Anstelle einer Zellsuspension wird jedoch die Farbstofflösung in MEM (nur 500 l apikal) auf die aufhaftenden Zellen auf die durchlässige Stütze aufgetragen. - Verwenden Sie 2 x 105 Zellen/Well (in 200 l RPMI) aus der Zellsuspension von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und platzieren Sie die Zellen auf der basolateralen Seite der invertierten Einsätze.
- Schließen Sie die Petri-Gerichte sorgfältig und brüten für 2 h bei 37 °C unter 5% CO2.
- Legen Sie die Einsätze wieder in die 12-Well-Mikroplatten und fügen Sie 500 l MEM-Medium in die basolaterale Seite des durchlässigen Einsatzes ein, um die ALI-Bedingungen beizubehalten. Die Zellen sind nun bereit für eine Infektion.
3. Infektion durch P. aeruginosa
HINWEIS: Alle folgenden Schritte von hier aus müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) durchgeführt werden.
- Impfung 15 ml Lysogeny-Brühe (LB), ergänzt mit 300 g/ml Ampicillin in einem Erlenmeyerkolben (50 ml) mit einer einzigen Kolonie von P. aeruginosa PAO1-GFP.
HINWEIS: Auch andere Stämme von P. aeruginosa könnten hier verwendet werden, z. B. PAO1-Wildtyp, PA14 oder klinische Stämme, nach ihren eigenen Anbauprotokollen. - Die Bakterien 18 h bei 37 °C bebrüten und bei 180 Umdrehungen von 180 Umdrehungen min schütteln.
- Den Inhalt nach dem 18 h in ein 50 ml kegelförmiges Rohr und zentrifugieren bei 3850 x g für 5 min übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml steriles PBS bei 37 °C hinzu.
- Messen Sie die optische Dichte auf einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm und passen Sie die Konzentration von Bakterien mithilfe des Zellkulturmediums auf eine Endkonzentration von 2 x 105 KBE/ml an. Dies entspricht einer Vielzahl von Infektionen (MOI) eines Bakteriums pro Epithelzelle.
- Fügen Sie 100 l bakterielle Suspension auf die apikale Seite des durchlässigen Trägers (Schritt 2.4.) und inkubieren bei 37 °C unter 5%CO2 für 1 h, um Bakterien an den Zellen anhängen zu lassen. Dann entfernen Sie die apikale Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette, um die ALI-Bedingungen wiederherzustellen. Halten Sie einige Proben als Kontrolle nicht infiziert.
HINWEIS: In diesem Stadium sollten die anhaftenden Bakterien in LB-Agar plattiert werden (siehe Schritte 5.4/5.5), um die anfänglichen Bakterien inoculum zu bestimmen. - Inkubieren Sie das Medikament von Interesse nach bakteriellen Adhäsion in den Zellen. Für Behandlungsexperimente fügen Sie der apikalen Seite 500 l einer im Zellmedium verdünnten Wirkstofflösung (in diesem Protokoll wurde Tobramycin 6 g/ml verwendet) bei. Fügen Sie 1.500 L Zellmedium ohne Medikament auf der basolateralen Seite hinzu.
HINWEIS: Anstatt die Medikamente als Lösung zu insleben, kann das Modell auch an die Aerosolablagerung angepasst werden. Zu diesem Zweck werden die Zellen bei ALI von der basolateralen Seite mit 500 l Zellmedium zugeführt. Das Medikament wird dann zuerst vernebelt und erlaubt, im apiischen Fach durch eine geeignete Vorrichtung (hier nicht beschrieben) zu deponieren. Die infizierte und behandelte Probe kann auf die in den Abschnitten 4 bis 7 beschriebenen Endpunkte überprüft werden. Von diesem Schritt an können durchlässige Stützen verwendet werden, um entweder Bilder zu erstellen (Abschnitt 4) oder um Ergebnisse des Bakterienwachstums und der Zelllebensfähigkeit von Säugetieren zu erhalten ,,Abschnitte 5–7).
4. Probenvorbereitung für konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM)
- Nach der Etablierung der Kokultur, Infektion und medikamentöse Behandlung, entfernen Sie alle Medien von der apikalen und basolateralen Seite. 1x mit PBS bei 37°C waschen und dann die Zellen mit 3% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei RT (300 l auf apikal/600 l auf basolateral) fixieren. Zellkerne werden 30 min bei Raumtemperatur mit 5 g/ml DAPI-PBS gefärbt.
VORSICHT: PFA ist gefährlich. - Schneiden Sie die Membranen mit einem Skalpell und legen Sie sie zwischen zwei 12 mm Mikroskopie-Abdeckungsschlitten mit einem Montagemedium (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie es in der Fließbank 30 min trocknen, bevor Sie bei 4 °C lagern. Visualisieren Sie durch konfokale Scanmikroskopie.
HINWEIS: Nach der Co-Kultur und vor der Montage können enge Knoten Immunstaining durchgeführt werden. Dazu werden die Zellen 30 min lang mit Paraformaldehyd 3% fixiert, wieder mit PBS gewaschen und mit Saponin 0,05%/BSA 1% in PBS permeabilisiert. In diesem Protokoll wurde das Zonula-Occludens-Protein (ZO-1) über mausfeindlichen ZO-1-Antikörper (1:400, Inkubation bei 4 °C über Nacht) nachgewiesen. Die Proben wurden dann für 2 h bei RT mit Ziegenanti-Maus-IgG-Antikörper Alexa Fluor 633 (1:2000 in rot) inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI (1 g/ml) gebeizt und mit Montagemedium auf Abdeckungen montiert. - Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Abbildung der gespeicherten Membranen. Wählen Sie 25x oder 63x Wasser-Immersion-Objektive und Laser bei 405, 488, 505 oder 633 nm zur Detektion. Bilder sollten eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln haben.
HINWEIS: Die Laser werden nach dem verwendeten Fleck ausgewählt. - Erfassen Sie apikale Ansichten und Querschnittsansichten, und verwenden Sie den Zeta-Stack-Modus (10–15 Stacks) für die Konstruktion eines dreidimensionalen Modells mit Bildgebungssoftware.
5. Messung der bakteriellen Proliferation über koloniebildende Einheiten (KBE)
- Sammeln Sie das apikale und basolaterale Medium (enthaltende Bakterien), um die KBE von nicht angeschlossenen Bakterien zu bewerten. Sammeln Sie 500 L von den apiischen und basolateralen Seiten und poolen Sie sie.
HINWEIS: Verwenden Sie diese Suspension direkt, um Bakterien (Schritt 5.4) oder Zentrifuge bei 21.250 x g für 10 min zu zählen, um die Laktatdehydrogenase (LDH) aus dem Überstand (Abschnitt 6) zu bewerten und/oder in PBS erneut suspendiert zu werden, um extrazelluläre Bakterien zu zählen (Schritt 5.4). - Bewerten Sie das Überleben von Bakterien, die in den Zellen befestigt und/oder internalisiert sind, indem Sie in jedem Fach des durchlässigen Trägers 500 l sterilen entionisierten kalten Wassers hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Die Proben können entweder auf LB-Agar (siehe Schritt 5.4) oder gefroren (als ganze Einsatzplatte) bei -20 °C zur späteren Beschichtung beschichtet werden. - Zur Beurteilung der KBE von anhaftenden/internalisierten Bakterien, Tauproben bei 37°C für 10 min (wenn gefroren). Mit Pipettenspitzen für jeden Brunnen die Membranoberfläche und Pipette nach oben und unten kratzen, um alle haftenden Inhalte zu entfernen.
HINWEIS: In diesem Schritt werden alle Epithelzellen lysiert und anhaftende/internalisierte Bakterien stehen als Suspension zur Plattimitieren zur Verfügung. - Mit der bakteriellen Suspension aus beiden Fraktionen, führen Sie eine 1/10 serielle Verdünnung mit Tween-80 0,05% in PBS und Platte die Bakterien auf LB Agar Platten.
HINWEIS: Verdünnungen zwischen 1 und 10 werden empfohlen. Die Bakterien sollten in der höchsten Verdünnung gezählt werden, wo einzelne Kolonien zuerst identifiziert werden. - Agarplatten bei 30°C für 16–72 h inkubieren, um Kolonien zu zählen, und cFU entsprechend berechnen.
HINWEIS: Eine Temperatur von 30 °C zum Zeitpunkt der Platteninkubation ist für behandelte Proben und zur Beobachtung des verzögerten Wachstums von Kolonien unerlässlich.
6. Bewertung der Zellzytotoxizität mittels Lactat-Dehydrogenase-Assay
- Verwenden Sie den Überstand infizierter Zellen, die Bakterien (ab Schritt 5.1) für die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit für den LDH-Test16verwenden. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 21.250 x g für 10 min, um die Bakterien und schließlich den Rest der Zellen zu pellet. Verwenden Sie den bakteriellen Überstand, um die LDH-Freisetzung zu messen.
HINWEIS: Der Überstand sollte nicht eingefroren werden, bevor LDH durch diesen Test gemessen wird. - Übertragen Sie 100 l des Überstandes auf eine 96-Well-Platte, und fügen Sie 100 l der LDH-Assay-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln, dann Lesen Absorbieren bei 492 nm.
7. Beurteilung der Freisetzung menschlicher Zytokine
- Für die Cytokin-Quantifizierung verwenden Sie entweder ELISA oder cytometrischer Adad-Array-Immunoassay17(siehe Materialtabelle). Zentrifugenüberstand ab Schritt 5.1 bei 21.250 x g für 10 min und messen entweder sofort oder lagern -80 °C bis zur Analyse bis zu 15 Tage.
- Bewerten Sie Überstand mit einem handelsüblichen ELISA-Kit.
HINWEIS: Das Verfahren folgt den Herstellungsanweisungen, die die Beschichtung von Platten mit dem Aufnahmeantikörper, die Zugabe der Proben (100 l) und Zytokinstandards, die Inkubation, das Waschen und die Zugabe von Detektionsantikörpern umfassen, um eine farbmetrische Messung des Zytokinvorhandenseins zu ermöglichen. Alternativ kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um Zytokine über handelsübliche Kits zu messen (siehe Tabelle der Materialien).
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Representative Results
Abbildung 1A zeigt die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen, nachdem sie sowohl für 24 h auf der apikalen bzw. basolateralen Seite durchlässiger Stützen gewachsen sind. Die Epithelbarriereintegrität wird durch höhere TEER (834 x2) und CLSM durch Immunfärbung für das enge Knotenprotein ZO-1 (Abbildung 1B) gezeigt. Die gleichen Ergebnisse, die in Bezug auf die- Barriereintegrität nicht infizierter CFBE41o- Monokulturen beobachtet wurden, konnten in den nicht infizierten Epithel-Makrophagen-Kokulturen beobachtet werden.
Um eine bakterielle Infektion zu modellieren, wurde P. aeruginosa bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1:1 auf CFBE41o- Zellen geimpft. Sechs Stunden nach der Infektion (Abbildung 2A) wurden Makrophagen auf der apikalen Seite der Kokultur beobachtet. Nach der Infektion fiel der TEER von 834 auf 250 x2, was auf eine kompromittierte Epithelbarriere hindeutet, wie auch durch ZO-1-Färbung visualisiert wird (Abbildung 2B).
Abbildung 3 zeigt die Makrophagentransmigration durch die durchlässigen Membranporen und die Bakterienaufnahme durch THP-1-Zellen auf der apikalen Seite. Die Proben wurden nach der Inkubation nach der Inkubation auf 1, 3 und 6 h nach der Inkubation aus unabhängigen Experimenten fixiert. In den THP-1-Monokulturen (Abbildung 3A-C) wurde die Makrophagenmigration bereits um 1 h beobachtet, während in der Kokultur (Abbildung 3D-F) dies nach einer 3-h-Infektion beobachtet wurde. Die Aufnahme von Bakterien in THP-1 wurde nach 3 h Infektion beobachtet, sowohl in der Monokultur als auch in der Kokultur. Es war keine bakterielle Aufnahme durch CFBE41o- zu sehen. Querschnittsansichten wurden so platziert, dass sich die durchlässige Membranstütze in der Mitte als Trennung des apikalen und basolateralen Fachs befand.
Abbildung 4 zeigt konfokale Scanning-Lasermikroskopiebilder infizierter Kokulturen (CFBE41o- + THP-1), die mit oder ohne Tobramycin für 6 h behandelt wurden (Abbildung 4A, B) oder 20 h ( Abbildung4C,D). Ohne Behandlung starben sowohl die Epithelzellen als auch die Makrophagen nach 20 h Infektion (Abbildung 4C). Bei der Behandlung mit Tobramycin werden die Wirtszellen jedoch nach 20 h konserviert; noch, einige Bakterien können in der Kultur beobachtet werden. Obwohl sie nach 6 h Behandlung in den Mikroskopiebildern gesehen wurden (Abbildung 4B), vermehrten sich die Bakterien nicht, wie in KBE-Assays in Abbildung 4Ebeobachtet. Dennoch, nach 20 h Behandlung, die Bakterien erholten sich die Proliferationsfähigkeit, wie von den Kolonien in der KFU-Assay gesehen (Abbildung 4F). Das Zelllyseprotokoll mit kaltem Wasser und Abkratzen kann Bakterien freisetzen, die in Zellen befestigt und möglicherweise verinnerlicht werden. Gleichzeitig werden die Zellen zerstört (Zusatzfigur S1A, B). Die in diesem Papier verwendeten Zentrifugationsschritte für Epithelzellen (300 x g)oder Bakterien (21.250 x g) behinderten die Lebensfähigkeit beider (Zusatzabbildungen S1C, D) nicht. Alle CFU-Assays wurden durch Einfrieren der Proben bei -20°C, gefolgt vom Auftauen und Beschichten durchgeführt. Dieses Verfahren reduzierte die Anzahl der Bakterien um 2-Logs im Vergleich zu frischen Proben(Zusatzabbildung S1E). Da dieses Verfahren gleichzeitig für alle Versuchsgruppen (behandelt und unbehandelt) zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt wird, wird diese Verringerung in die Endergebnisse aufgenommen (Ergänzende Abbildung S1E). Darüber hinaus zeigte die hier verwendete Tobramycinkonzentration keine Toxizität für die nicht infizierten Zellen (Zusatzfigur S2A) und auch keine weitere Entzündungsreaktion (Zusatzabbildung S2B). Jedoch, Es war im Bereich der minimalen hemmenden Konzentration Zu töten P. aeruginosa.
Abbildung 5 zeigt den transepitheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) und die Zelllebensfähigkeit. Abbildung 5A–B zeigt den TEER von Monokulturen und Kokulturen. Die Co-Kultur von CFBE41o- Zellen mit THP-1 induzierte keine Veränderung der Epithelbarriereintegrität im Vergleich zur Monokultur (rote Balken). Bei der Infektion sank der TEER-Wert (grüner Balken). Nach 1 h Infektion wurden einige Proben mit dem Antibiotikum Tobramycin (blauer Riegel) für 6 oder 20 h behandelt. Die Behandlung bewahrte die Epithelbarriereintegrität, wie sie vom höheren TEER beobachtet wurde. Abbildung 5C zeigt den Prozentsatz der LDH-Freisetzung als Hinweis auf Zelltoxizität bei Infektion und Tobramycin-Behandlung nach 6 h. Die Kokultur selbst induzierte eine Freisetzung von LDH, die für die infizierten Zellen gleich war (ca. 20%). Nach 20 h Infektion konnte kein LDH-Signal erkannt werden. Um die LDH-Zuverlässigkeit bei Langzeitinfektionen zu beweisen, wurde PAO1-GFP mittelweit mit und ohne LDH 1 U/ml im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Kontrollen inkubiert (Zusatzabbildung S2C). Das LDH-Signal ging nach längerer Inkubation (20 h) mit P. aeruginosaverloren, was darauf hindeutet, dass LDH nur in kürzeren Inkubationszeiten in infizierten Kulturen stabil ist.
Abbildung 6 zeigt die Kinetik von proinflammatorischen Zytokinen, die über ELISA nachgewiesen wurden. Der Vorteil einer infizierten Kokultur von CFBE41o- und THP-1-Zellen wurde mit den höheren Sekreten von pro-inflammatorischen Zytokinenbeobachtet. Die Sekretion einiger pro-inflammatorischer Zytokine war entweder ähnlich (IL-6) oder höher (IL-8, TNF-, IL-1) in der infizierten Kokultur (Abbildung 6C) als in den entsprechenden Monokulturen (Abbildungen 6A-B). Unerwarteterweise werden einige Zytokine in THP-1-Monokulturen (Abbildung 6B) in infizierten Proben (Il-8, TNF, IL-1) herunterreguliert.
Abbildung 7 zeigt die Freisetzung von Zytokinen in Mono- und Kokulturen bei Infektion und Behandlung mit Tobramycin, gemessen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Die Sekretion des pro-inflammatorischen Zytokins IL-8 (Abbildung 7A) und des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 (Abbildung 7F) war in den Kokulturen von Epithelzellen und Makrophagen höher als in den Monokulturen. Bei allen anderen Zytokinen (IL-1, IL-12p40, IL-23 und GM-CSF)(Abbildungen 7B–E)waren die Zytokinsekretionen in der Kokultur nicht höher als in den jeweiligen Monokulturen.
Abbildung 1: Querschnitte und apikale Ansichten der nicht infizierten Epithel-Makrophagen-Kokultur. (A) Kreuzansichten der nicht infizierten 24 h Epithel-Makrophagen-Kokultur. CFBE41o- rot gebeizt, THP-1 Makrophagen in gelb und Kerne in blau (DAPI). (B) Apische Ansichten des nicht infizierten CFBE41o- monolayer immunostainiert für ZO-1 (rot). DAPI: Kerne. Maßstabsbalken: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Querschnitte und apikale Ansichten der infizierten Epithel-Makrophagen-Kokultur. (A) Kreuzansichten und (B) apikale Ansicht der epitheliaal-makrophagenen Kokultur bei 6 h nach der Infektion (hpi) mit P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- gebeizt in rot, THP-1 Makrophagen in gelb, Kerne in blau (DAPI) und P. aeruginosa PAO1-GFP in grün. (B) Apische Ansichten der 6 h infizierten CFBE41o- Monolayer. Maßstabsbalken: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kinetik der Makrophagentransmigration und Bakterienaufnahme, die durch einen Querschnitt des 3D-Modells visualisiert werden. PAO1-GFP-Infektionskinetik in Monokulturen von THP-1-Makrophagen (A-C) oder Co-Kultur (D–F). THP-1 Makrophagen sind in rot, Kerne von Epithelzellen in blau (DAPI) und P. aeruginosa in grün (GFP) gefärbt. Jede Figur ist in apikale und basolaterale Seiten unterteilt, der Raum dazwischen wird als die Membran betrachtet, die leer ist oder von der CFBE41o- Konfluentschicht (D–F) besetzt ist. Einsätze in den Abbildungen zeigen die Aufnahme von Bakterien durch Makrophagen zu unterschiedlichen Zeiten (A–F). Maßstabsbalken: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Charakterisierung des PAO1-GFP-Überlebens in tobramycin behandelten Co-Kulture. (A-D) Konfokalitätsmikrographen ko-kulturen mit und ohne Behandlung. (A) Unbehandelte Kokultur nach 6 h Infektion. (B) Infizierte Kokultur, die mit Tobramycin 6 g/ml (Tob) für 6 h behandelt wurde. (C) Unbehandelte Kokultur 20 h nach der Infektion, (D) infizierte Kokultur, die 20 h lang mit Tobramycin 6 g/ml behandelt wurde. Kerne mit DAPI (blau), Makrophagen (rot) und P. aeruginosa GFP (grün). (E) Koloniebildnende Einheiten (KBE) von anhaftenden/internalisierten Bakterien nach 6 und (F) 20 h mit Tobramycin 6 g/ml Behandlung. Leere Membraneinsatz wurde als abiotisches Substrat verwendet, um PAO1-GFP zu züchten. Es wurde eine zweiseitige ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet, *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: nicht signifikant. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung an, n = 9–27 Replikationen von 3–9 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Barriereintegrität und Bewertung der Lebensfähigkeit von Mono- und Cokultur. Folgende Kokulturbedingungen wurden bewertet: nicht infiziert (graue Balken), infiziert (grüne Balken) oder infiziert und mit Tobramycin (blaue Balken) behandelt. (A) Transepitheliale elektrische Beständigkeit nach 6 h und (B) 20 h Infektion in Monokulturen (CFBE41o- und THP-1) und Co-Kultur. (C) Zytotoxizität der Mono- und Co-Kultur gemessen durch LDH-Freisetzung 6 h nach der Infektion. Es wurde eine zweiseitige ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: nicht signifikant. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung an; n = 9 Wiederholungen von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Kinetik der Zytokinfreisetzung von nicht infizierten und infizierten Mono- und Co-Kultur-Überräuern, die über ELISA bewertet werden. ELISA wurde nach dem Protokoll des Kitherstellers durchgeführt. (A) CFBE41o-, (B) THP-1 und (C) Co-Kultur, die IL-8, TNF-, IL-1- und IL-6 freigibt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. n = 6 Wiederholungen von 2 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Überwindungsergebnisse des Zytokin-Panels, gemessen über FACS mit und ohne Tobramycin 6 g/ml für 6 h nach der Infektion. Supernatanten der Mono- und Co-Kultur nach 6 h Nachinfektion verwendet, um die jeweiligen Zytokine IL-8 (A), IL-1 , (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) und IL-10 (F) zu analysieren. Fehlerleiste gibt Standardabweichung an, n = 9 Replikationen von 3 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Steuern von Experimenten für kritische Schritte des Protokolls. (A, B) Mikrographien von CFBE41o-Zellen in 24-Well-Platten, die 2 Tage lang bei einer Dichte von 2 x 105 Zellen/Well angebaut wurden. (A) CFBE41o-Zellen in PBS für 30 min und (B) wasserbehandelte Zellen nach 30 min nach dem Abkratzen mit einer Pipette. (C) Lebensfähigkeit von Säugetierzellen nach Zentrifugation. CFBE41o-Zellen wurden aus dem T75-Zellkulturkolben entfernt, wie in Schritt 1.1.1 und 1.1.2 beschrieben. 100 l der resultierenden Zellsuspension wurden in 10 ml isotonischer Lösung analysiert. Ein automatisierter Zellzähler wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit einzelner Zellen zu bewerten. Anschließend wurden die jeweiligen Zellsuspensionen bei 300 x g für 4 min zentrifugiert, wieder aufgehängt und wieder gezählt. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung, n = 6 verschiedene Kolben von 2 Einzelversuchen an. (D) Lebensfähigkeit von PAO1-GFP nach Zentrifugation. PAO1-GFP-Bakterien wurden im Zellmedium auf OD = 0,01 verdünnt. Die CFU wurde über eine 10-fache Verdünnungsreihe und LB-Platten, die über Nacht bei 30 °C inkubiert wurden, bewertet. Entsprechende Kunststoffrohre wurden mit 21.250 x g für 10 min zentrifugiert und mittelgroß wieder aufgehängt. Die CFU wurde erneut entsprechend bewertet. T-Test für Zweischwänze, * p < 0,033. Fehlerleiste gibt Standardabweichung an, n = 6 von 2 Experimenten. (E) Lebensfähigkeit von Bakterien nach dem Einfrieren. PAO1-GFP-Bakterien wurden wie in (D) und CFU analysiert, dann wurden Kunststoffrohre für einen Tag bei -20 °C eingefroren und aufgetaut, um die KBE erneut zu bewerten. T-Test für Zweischwänze, *** p < 0,001. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung an, n = 6 von zwei Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Kontrollexperimente zur Beurteilung des LDH-Verhaltens und des Einflusses von Tobramycin. (A) Kontrollexperiment zur Beurteilung der Zytotoxizität nach 20 h Inkubation mit 6 g/ml Tobramycin. Mono- und Co-Kultur wurde wie im Protokoll beschrieben durchgeführt, aber Zellen wurden für 2 Tage auf 24-Well-Platten angebaut und THP-1-Zellen wurden apisch gesät. Für 20 h wurden Zellen mit 6 g/ml Tobramycin oder Kontrollen inkubiert. One-Way ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest, *** p < 0.001. Fehlerbalken gibt Standardabweichung an, n = 6 von 2 Experimenten (CFBE41o-), n = 3 eines Experiments (THP-1 und Co-Kultur). (B) Control-ELISA von Überräuern der Mono- und Cokultur mit/ohne Tobramycin. Die Zellkultur wurde gemäß (A) durchgeführt, um keine Zytokinfreisetzung im Vergleich zu Kontrollen für alle Bedingungen zu zeigen. ELISA wurde in Schritt 7.1 und 7.2 durchgeführt, 10 g/ml (LPS) wurde als Kontrolle hinzugefügt, IL-8-Freisetzung für LPS-behandelte Kontrollen, die THP-1 enthalten, war höher als nachweisbar. Zwei-Wege-ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest, ns p > 0,12; * p < 0,033; p < 0,001. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung an, n = 6 von zwei Experimenten, n = 3 eines Experiments (LPS-Steuerung). (C) LDH-Abbau durch übermäßige PAO1-GFP-Proliferation. LDH wurde dem MEM Medium in einer Konzentration von 1 U/ml zugesetzt. Entweder LDH-Medium oder Kontrollmedium wurde verwendet, um Zellen auf OD = 0,01 zu verdünnen (entspricht 1 x 108 KBE/ml) und wurde dann für 20 h inkubiert. LDH-Assay wurde wie in Abschnitt 6 beschrieben durchgeführt. One-Way ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest, ns p > 0,12; p < 0,001. Fehlerbalken gibt Standardabweichung an, n = 8–9 von drei Einzelexperimenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt ein Protokoll für eine 3D-Kokultur der infizierten Atemwege, bestehend aus der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und der menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagenzelllinie THP-1. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, des Überlebens von Bakterien und Entzündungen, die wichtige Parameter bei der gleichzeitigen Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und der Wirtsreaktionen sind. Die Neuheit im Modell liegt in der Einbeziehung von Epithelzellen (d.h. menschliche CF-Zelllinie und Makrophagen) mit akuter bakterieller Infektion (z.B. P. aeruginosa). Die akute Infektion in den Epithelzellen wird nachweislich durch ein Antibiotikum (d. h. Tobramycin) kontrolliert. Neben der Verwendung einer menschlichen CF-Zelllinie wird das gesamte Modell unter ALI-Bedingungen aufgebaut, was den physiologischen Bedingungen in CF wesentlich näher kommt. Die Verwendung einer CF-Zelllinie setzt einige der Merkmale der Krankheit im Modell um. Die Mutation des Zystfibrose-Transmembranleitmittelregulators (CFTR) steht in direktem Zusammenhang mit der Dysregulation des epitheliaalen Flüssigkeitstransports in der Lunge. Darüber hinaus führen Mutationen im CF-Gen, wie z.B. f508, zu dickem Schleim, entzündungsstarken entzündungen und schweren Lungenschäden bei einer Infektion mit P. aeruginosa4. Diese pathologischen Manifestationen, die durch dysfunktionale CFTR verursacht werden, beinhalten möglicherweise eine autophagie Beeinträchtigung als einen wichtigen zellulären Mechanismus im Zusammenhang mit der Pathogenese der CF-Lungenerkrankung18. Jedoch, die CFBE41o- nicht zu geheimschleim, die eine Einschränkung dieser Zelllinie ist. Wenn die Rolle des Schleims genauer untersucht werden soll, kann das Protokoll mithilfe anderer Bronchialzelllinien (z. B. Calu-3) angepasst werden.
Ein entscheidender Schritt zur Einrichtung dieses Protokolls ist die Kombination von Epithel- und Immunzellen und die anschließende Infektion mit P. aeruginosa bei ALI. Die Infektion von CFBE41o- von P. aeruginosa in vitro wurde bereits beschrieben, hauptsächlich mit einer Durchflusszellkammer, ergänzt mit Arginin in den Kulturmedien, um das Epithelzellüberleben zu verbessern und die Biofilmbildung zu unterstützen19. Das vorliegende Protokoll zielte auf ein neues Modell ab, das nur menschliche Zellen verwendet, die zudem bei ALI auf durchlässigen Brunnenplatteneinsätzen für einen höheren Probendurchsatz angebaut werden könnten. Die Einbeziehung von THP-1 differenzierten Makrophagen als menschliche verewigte Zelllinie, anstatt von der Gewinnung reproduzierbarer Primärzellen von Spendern abhängig zu sein, ist ein weiterer Vorteil unseres Modells. Durch Hinzufügen dieser Makrophagen zur basolateralen Seite der durchlässigen Membranunterstützung wurde beobachtet, dass Makrophagen hervorragten und schließlich auf die apikale Seite der filtergewachsenen Epithelbarriere transmigrierten. Eine Variation dieses Protokolls könnte die Zugabe von Makrophagen direkt auf der apikalen Seite auf der Oberseite der Epithelzellen sein, wie von Kletting et albeschrieben. 14. Die Kokultur von nichtmenschlichen Immun- und Lungenzellen wurde bereits beschrieben. Ding et al. 10 gebrauchte Maus Lewis Lungenkarzinom-Zellen auf durchlässigen Insert-Stützen in Kombination mit Makrophagen auf der basolateralen Seite und infiziert mit S. aureus, einem weiteren kritischen Erreger der chronischen Infektion bei CF-Patienten. In dieser Studie lag jedoch kein Schwerpunkt auf Mukoviszidose oder die Verwendung der Kokultur als Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln. Unser Protokoll kann für andere bakterielle Infektionen angepasst werden, wie Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, oder Burkholderia cepacia— wichtige Krankheitserreger in der CF-Lunge.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Zugabe von THP-1-Makrophagen zu den Zellen, indem die durchlässigen Inserts auf den Kopf gestellt werden (Abschnitt 2). Dies ist von entscheidender Bedeutung, um die Makrophagentransmigration durch den Brunnen zur Seite der Infektion zu bewerten. Der spätere Bildgebungsprozess aus den 3D-Modellen mit Z-Stacks und Querschnittsansicht kann durchgeführt werden, um das Innere von Makrophagen zu beobachten und die Aufnahme von Bakterien zu erkennen (Abbildung 3). Bei 1 PSi wandern Bakterien, die auf der apikalen Seite aufgetragen werden, durch die Membran, während Makrophagenmigration und -aufnahme nur bei 3 PSi stattfinden. Daher war es nach 1 h Infektion angebracht, die Behandlung mit Tobramycin zu beginnen und die Möglichkeit zu haben, sowohl das Überleben der Wirtszelle als auch der Bakterien über einen langen Zeitraum (20 h) zu adressieren. Im Laufe des Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Sterilität aufgrund der Vielzahl von Schritten, die jeweils das Risiko einer Kontamination mit sich bringen, ein kritisches Problem. Dennoch werden erfahrene Mitarbeiter der Zellkultur in der Lage sein, dieses Protokoll nach entsprechender Vorbereitung und Schulung zu befolgen. Zellmedium sollte regelmäßig auf Kontamination überprüft werden, vorzugsweise nach allen kritischen Schritten.
Wie bei jedem Modell hat auch die infizierte Co-Kultur einige Einschränkungen; z. B. die Integration der makrophagenähnlichen Zellen. Hier war es wichtig, Makrophagen auf der basolateralen Seite zu haben; Die Manipulation des Einsatzes mit einer zuvor gewachsenen Epithelschicht kann jedoch zu frühen Schäden und Störungen der Kokultur gebracht haben. Obwohl, das durchlässige Unterstützungsmodell lieferte hohe Durchsatzeigenschaften, die nicht in früheren Ko-Kulturen der CF-infizierten Lunge beobachtet wurde20,21. Damit müssen weitere Experimente die Grenzen der Verwendung von THP-1 als Makrophagenersatz bewerten. Während diese Zelllinie weit verbreitet ist, ist sie weniger ansprechbar für LPS22 und es fehlt die vollständige Aktivierung und die gesamte Population unterscheidet sich nicht von Monozyten zu Makrophagen-ähnlichen Zellen23. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen anderer Schlüsselkomponenten bei DER CF-Infektion und der Medikamentenabgabe. Die CFBE41o- Zelllinie besitzt weder Zilien noch produziert sie Schleim, was normalerweise 20-30 Tage Zellkultur bei ALI passiert. Da dies bei CFBE41o- Zelllinie nicht der Fall war, verwendeten wir die Zellen nach sieben Tagen, als eine enge Epithelbarriere gebildet wurde. Die mukoziliäre Clearance verändert die Aufenthaltsbedingungen für Mikroben24 oder Arzneimittelpartikel9,,25 und In-vitro-Modelle, die die Lungenabscheidung bewerten, sollten dies berücksichtigen. Anders als bei anderen Zellen weist die Gewebekultur beschichtung mit einem extrazellulären Matrixmaterial (wie Fibronectin oder Kollagen I) keinen signifikanten Unterschied für CFBE41oauf -zum Beispiel in TEER26. Daher wurden die durchlässigen Filter in diesem Protokoll nicht mit einem extrazellulären Matrixmaterial beschichtet.
Mit dem hier beschriebenen Protokoll bieten Mono- und Kokulturen nach 6 h Infektion eine ausreichende Zytokinfreisetzung, um als Messung bei zukünftigen Arzneimitteltests verwendet zu werden. Die Co-Kultur bringt einen Vorteil der Zellkooperation bei der Modellierung der Immunantwort. Die Ineffizienz von Tobramycin bei der Verringerung der Entzündung wurde erwartet, da nicht alle Bakterien während der Behandlung eliminiert wurden (Abbildung 4E, F). Dennoch ist die Modellierung der Reaktion auf Tobramycin in einem CF-Modell von entscheidender Bedeutung, da Tobramycin (in höheren Konzentrationen) bei der P. aeruginosa-Hemmung auch auf Biofilm19,27wirksam sein kann. Eine Möglichkeit für die weitere Verwendung dieses Protokolls besteht darin, entzündungshemmende Medikamente in die Behandlung zu integrieren. Die allgemeine Empfehlung in Bezug auf Entzündungsreaktionen wäre, die Kurzzeitbehandlung (6 h) zu verwenden, die noch die Wirtszelle und Bakterien vorhanden hat. Nach diesem Zeitpunkt werden die Wirtszellen in unbehandelten Proben zerstört. Sowohl ELISA als auch FACS könnten verwendet werden, um die Freisetzung von Zytokinen zu messen. Wenn die Proben länger als 15 Tage bei -80 °C gelagert werden, empfiehlt es sich, die Zuverlässigkeit der Zytokine zu überprüfen, indem beispielsweise eine positive Kontrolle von frischen Proben (z. B. mit LPS stimulierte Zellen) verwendet wird.
Einige Änderungen des Protokolls sind möglich. Beispielsweise kann das aktuelle Protokoll auf die Anwendung vernebelter Medikamente erweitert werden (Schritt 3.6). Dies ist notwendig, um die Abgabe von Lungenarzneimitteln über orale Inhalation zu modellieren. Die Vernebelung von wasserlöslichen Medikamenten, wie Tobramycin, oder Nano-Trägern davon, wie liposomales Colistin, ist relativ geradlinig durch kommerziell erhältliche Geräte, die routinemäßig in der Klinik verwendet werden. Außerdem gibt es mehrere handelsübliche Geräte, um Aerosole auf Zellkultureinsätze zu deponieren. Da das hier beschriebene Modell auf durchlässigen Membranstützen basiert, könnte es auch auf einige moderne mikrofluidische Geräte (z.B. "Lunge auf einem Chip") übernommen werden, um beispielsweise den Einfluss der Atmung und die damit verbundene mechanische Dehnung und Veränderungen im Luftstrom zu untersuchen. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll durch Die Zugabe von Schleim oder Ersatz durch Primärzellen je nach der zu behandelnden wissenschaftlichen Frage geändert werden. Ein weiterer interessanter nächster Schritt wäre die Erprobung von Nanomedikamenten, zumal die Nanotechnologie Fortschritte bei der Entwicklung neuartiger Antiinfektivamacht 28, CF-Korrektoren29 und die Gleichzeitige Lieferung von Antibiotika und Pathoblockers30. Insgesamt kann das aktuelle Protokoll als nützlich bei der Beurteilung des bakteriellen Überlebens bei der Behandlung mit Antibiotika in einem komplexen System angesehen werden, zusammen mit einigen wirtbezogenen Auslesungen: Zellzytotoxizität, Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration und Entzündungsreaktion. Dies sind wesentliche Parameter für die Arzneimittelentwicklung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde aus dem HORIZON 2020-Programm der Europäischen Union für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design und Entwicklung fortgeschrittener Nanoarzneimittel zur Überwindung biologischer Barrieren und zur Behandlung schwerer Krankheiten finanziert. Wir danken Dr. Ana Costa und Dr. Jenny Juntke für die große Unterstützung bei der Entwicklung der Co-Kultur, Olga Hartwig, für die wissenschaftliche Illustration, Anja Honecker, für ELISA-Assays, Petra König, Jana Westhues und Dr. Chiara De Rossi für die Unterstützung in den Fächern Zellkultur, Analytik und Mikroskopie. Wir danken auch Chelsea Thorn für das Korrekturlesen unseres Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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