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Immunology and Infection

पी एरुगिनोसा एंटी-इन्फेक्टिव्स के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए एयर-लिक्विड इंटरफेस पर ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज की संक्रमित 3डी सह-संस्कृति

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61069
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 4, 3, 1, 1, 1,2
1Department of Drug Delivery, Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), 2Department of Pharmacy, Saarland University, 3Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Department of Internal Medicine V - Pulmonology, Allergology, Respiratory Intensive Care Medicine, Saarland University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

हम एयर-लिक्विड इंटरफेस पर स्थापित CFBE41o -कोशिकाओं,टीएचपी-1 मैक्रोफेज, और स्यूडोमोनास एरुगिनोसाका उपयोग करके संक्रमित एयरवेज के त्रि-आयामी सह-संस्कृति मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल एक साथ एंटीबायोटिक प्रभावकारिता, एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन और भड़काऊ मार्कर का परीक्षण करने के लिए एक नया मंच प्रदान करता है।

Abstract

फेफड़ों के संक्रमण के उपचार के लिए एफड्रग अनुसंधान उच्च जटिलता के इन विट्रो मॉडल में भविष्य कहनेवाला की दिशा में प्रगति कर रहा है। फेफड़ों के मॉडल में बैक्टीरिया की बहुमुखी उपस्थिति एपिथेलियल व्यवस्था को फिर से अनुकूलित कर सकती है, जबकि प्रतिरक्षा कोशिकाएं माइक्रोएनवायरमेंट में बैक्टीरिया के खिलाफ भड़काऊ प्रतिक्रिया का समन्वय करती हैं। जबकि वीवो मॉडल में सिस्टिक फाइब्रोसिस के संदर्भ में नए एंटी-इन्फेक्टिव्स के परीक्षण के लिए विकल्प रहे हैं, वे अभी भी मनुष्यों में ऐसी बीमारियों की वीवो स्थितियों और उपचार परिणामों की सही नकल नहीं करते हैं। मानव कोशिकाओं (ब्रोंकियल एपिथेलियल और मैक्रोफेज) और प्रासंगिक रोगजनकों के आधार पर संक्रमित वायुमार्ग के जटिल इन विट्रो मॉडल इस अंतर को पाट सकते हैं और क्लिनिक में नए एंटी-इन्फेक्टिव्स के अनुवाद को सुविधाजनक बना सकते हैं। ऐसे उद्देश्यों के लिए, मानव सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल- लाइन CFBE41o-और THP-1 मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का एक सह-संस्कृति मॉडल स्थापित किया गया है, जो एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) स्थितियों में पी एरुगिनोसा द्वारा मानव ब्रोंकियल म्यूकोसा के संक्रमण की नकल कर रहा है । यह मॉडल सात दिनों में स्थापित किया गया है, और निम्नलिखित मापदंडों का एक साथ मूल्यांकन किया जाता है: एपिथेलियल बैरियर अखंडता, मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन, बैक्टीरियल सर्वाइवल और सूजन। वर्तमान प्रोटोकॉल दवा प्रभावकारिता और मेजबान प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत और प्रजनन प्रणाली का वर्णन करता है जो नए एंटी-इन्फेक्टिव्स की खोज और फेफड़ों में उनके एयरोसोल डिलीवरी को अनुकूलित करने के लिए प्रासंगिक हो सकता है।

Introduction

स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) में एक प्रासंगिक रोगजनक है जो फेफड़ों के ऊतकों की हानि में योगदान देता है1। पॉलीसैकराइड्स का उत्पादन, जैसे एल्गिनेट और अन्य म्यूकोइड एक्सोपॉलीसैकराइड्स, रोग की प्रगति का समन्वय करता है, जिससे दृढ़ जीवाणु पालन होता है, बैक्टीरिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के वितरण को सीमित करता है और बैक्टीरिया को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के खिलाफ बचाता है2। प्लैंकटोनिक चरण से बायोफिल्म गठन तक पी एरुगिनोसा का संक्रमण इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, जो एंटीबायोटिक सहिष्णुता की घटना को भी सुविधाजनक बनाता है।

सीएफ के संदर्भ में, माउस मुख्य रूप से एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। चूहों, हालांकि, सीएफ म्यूटेशन3की शुरुआत के साथ अनायास इस बीमारी का विकास नहीं करते हैं। अधिकांश जीवाणु बायोफिल्म विकास और दवा संवेदनशीलता अध्ययन अजैविक सतहों पर किए गए हैं, जैसे पेट्री व्यंजन। हालांकि, यह दृष्टिकोण वीवो जटिलता में प्रतिनिधित्व नहीं करता है। उदाहरण के लिए, महत्वपूर्ण जैविक बाधाएं अनुपस्थित हैं, जिनमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ म्यूकोसल एपिथेलियम भी शामिल हैं। हालांकि पी एयरोगिनोसा एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए काफी विषाक्त है, कुछ समूह मानव ब्रोंकियल कोशिकाओं के साथ पहले पी एरुगिनोसा बायोफिल्म को सह-खेती करने में कामयाब रहे हैं। इन कोशिकाओं की उत्पत्ति सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों से सीएफटीआर उत्परिवर्तन (CFBE41o-कोशिकाओं)4 से हुई और एंटीबायोटिक प्रभावकारिता 5 का आकलन करने या संक्रमण 6 के- दौरान सीएफटीआर प्रोटीन के सुधार का आकलन करने की अनुमति दी गई ।6 इस तरह के एक मॉडल दवा प्रभावकारिता की पूर्वानुमेयता में सुधार करने के लिए दिखाया गया था, दवा विकास7के बाद के चरणों में विफल दवाओं के साथ मुद्दों के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के अलावा ।

हालांकि, फेफड़ों में, म्यूकोसल एपिथेलियम हवा के संपर्क में आता है। इसके अलावा, वायुमार्ग में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाएं, ऊतक मैक्रोफेज की तरह, सांस रोगजनकों या कणों8के खिलाफ एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। मैक्रोफेज ब्रोंकियल ल्यूमेन तक पहुंचने और संक्रमण से लड़ने के लिए विभिन्न कोशिका परतों के माध्यम से प्रवास करते हैं। इसके अलावा, साँस लेने वाली दवाओं को फेफड़े के वायु-रक्त बाधा 9 के अतिरिक्त गैर-सेलुलर तत्व के रूप में बलगम की उपस्थिति काभी सामनाकरना पड़ता है। दरअसल, विट्रो मॉडल में कई जटिल त्रि-आयामी (3 डी) विकसित किए गए हैं, जिसका लक्ष्य वीवो प्रासंगिकता में वृद्धि करना है। सह-संस्कृति प्रणालियां न केवल दवा की खोज के लिए इन विट्रो प्रणालियों की जटिलता को बढ़ाती हैं बल्कि सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने में भी सक्षम होती हैं। इस तरह की जटिलता को मैक्रोफेज माइग्रेशन10के बारे में अध्ययनों में दूर किया गया है , न्यूट्रोफिल11द्वारा एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स की रिहाई , संक्रमण9में बलगम की भूमिका और अत्यधिक क्षति के प्रति एपिथेलियल सेल प्रतिक्रिया12. हालांकि, एक विश्वसनीय CF-इन विट्रो मॉडल है कि CF में आनुवंशिक उत्परिवर्तन सुविधाएं, कि हवा (वृद्धि हुई शारीरिक स्थिति) के संपर्क में है, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एकीकृत अभी भी कमी है ।

इस अंतर को पाटने के लिए, हम संक्रमित वायुमार्ग के स्थिर मानव 3 डी सह-संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल मानव CF ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज का गठन किया गया है, जो पी एरुगिनोसा से संक्रमित है और एक प्रसार और प्रतिरक्षा बाधा दोनों का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम है। काफी उच्च थ्रूपुट पर एंटी-इन्फेक्टिव्स का परीक्षण करने के लक्ष्य के साथ, इस सह-संस्कृति को दो मानव सेल लाइनों का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट आवेषण की पारगम्य फिल्टर झिल्ली पर स्थापित किया गया था: CFBE41o- और टीएचपी-1 मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज। इसके अलावा, अंततः एयरोसोलाइज्ड एंटी-इन्फेक्टिव्स13के बयान का अध्ययन करने के लिए, मॉडल को तरल कवर शर्तों (एलसीसी) के बजाय एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में स्थापित किया गया था।

जैसा कि हम यहां रिपोर्ट करते हैं, यह मॉडल न केवल एंटीबायोटिक उपचार पर बैक्टीरियल अस्तित्व का आकलन करने की अनुमति देता है बल्कि सेल साइटोटॉक्सिकिटी, एपिथेलियल बैरियर इंटीग्रिटी, मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं भी देता है, जो दवा विकास के लिए आवश्यक पैरामीटर हैं।

यह प्रोटोकॉल पल्मोनरी एयरवेज की साँस लेने की चिकित्सा के लिए दो प्रासंगिक सेल प्रकारों को जोड़ती है: मैक्रोफेज और सीएफ ब्रोंकियल एपिथेलियम। इन कोशिकाओं को पारम करने योग्य समर्थन आवेषण के विपरीत पक्षों पर वरीयता प्राप्त है, जिससे हवा के लिए सेल एक्सपोजर (जिसे एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) की स्थिति कहा जाता है) की अनुमति मिलती है। मेजबान कोशिकाओं की यह सह-संस्कृति बाद में पी एरुगिनोसासे संक्रमित होती है। दोनों मेजबान सेल लाइनें मानव मूल की हैं: एपिथेलियल कोशिकाएं सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियम का प्रतिनिधित्व करती हैं, सीएफ चैनल (CFBE41o- पर उत्परिवर्तनके साथ),और टीएचपी-114 कोशिकाएं एक अच्छी तरह से विशेषता वाली मैक्रोफेज-जैसी सेल लाइन हैं। एक कॉन्फ्ल्यूटी एपिथेलियल परत को पहले मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को विपरीत डिब्बे में जोड़ने से पहले अच्छी तरह से प्लेट आवेषण के ऊपरी हिस्से पर बनाने की अनुमति है। एक बार सह संस्कृति अली में स्थापित है, प्रणाली apical पक्ष में पी aeruginosa के साथ टीका लगाया है । इस संक्रमित सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग एंटीबायोटिक की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए टोब्रामाइसिन। निम्नलिखित अंत-बिंदुओं का विश्लेषण किया जाता है: ट्रांसपेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर), सेल-सेल और सेल-बैक्टीरिया इंटरैक्शन का दृश्य, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएलएफओ), होस्ट सेल सर्वाइवल (साइटोटोक्लिशिसिटी) और साइटोकिन रिलीज की गिनती करके बैक्टीरियल सर्वाइवल।

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Protocol

1. पारमी समर्थन आवेषण में कोशिकाओं का विकास और भेदभाव

  1. सीएफबीई41ओ की खेतीकरें - न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के 13 एमएल के साथ एक T75 फ्लास्क में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और 5% सीओ2 वायुमंडल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 600 मिलीग्राम/एल ग्लूकोज शामिल है। हर 2-3 दिनों में कोशिकाओं में ताजा माध्यम जोड़ें।
    1. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (EDTA) के 3 मिलील के साथ फ्लास्क में 70% संगम तक पहुंचने के बाद कोशिकाओं को अलग करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए ताजा एमईएम के 7 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को त्यागें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके झुरमुट को बाधित करते हुए एमईएम के नए 10 एमएल जोड़ें।
    2. एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर कक्ष के साथ कोशिकाओं की गणना करें। 2 x 105 कोशिकाओं के घनत्व के साथ बीज कोशिकाओं/अच्छी तरह से पारम करने योग्य समर्थन के साथ 12 अच्छी तरह से प्लेटों में (3 माइक्रोन का पोर आकार, सामग्री की मेजदेखें) ।
      नोट: स्वचालित सेल काउंटर कोशिका संख्या, आकार वितरण और कोशिकाओं की व्यवहार्यता निर्धारित करता है (सामग्री की तालिकादेखें)। 0.4 माइक्रोन के पोर आकार के साथ पारमेबल समर्थन यहां इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इस स्थिति में मैक्रोफेज को सीधे एपिकल साइड में जोड़ा जाना चाहिए, और इस मामले में उनके ट्रांससेलुलर माइग्रेशन का आकलन नहीं किया जाएगा।
    3. तरल-तरल स्थिति (एलएलसी) में बीज कोशिकाओं को पारमशील समर्थन के एपिकल साइड पर सेल सस्पेंशन के 500 माइक्रोन और बसोलेटरल साइड में ताजा माध्यम के 1.5 एमएल जोड़कर। फिर 72 घंटे के लिए 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. सीडिंग के बाद तीसरे दिन एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) कल्चर में शिफ्ट करने के लिए, मीडियम को पहले बसोल्टरल साइड से निकालें, फिर एपिकल साइड से । बेसोटेरल साइड में, ताजा एमईएम के 500 माइक्रोन जोड़ें और हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें जब तक कि कोशिकाएं एक कॉन्फ्ल्यूटी मोनोलेयर न बनाएं।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली शर्तों के लिए, CFBE41o- कोशिकाएं आमतौर पर संस्कृति में 3-7 दिनों के बाद शांत होती हैं।
    5. 7 दिन पर एपिथेलियल बैरियर गुणों का आकलन करें CFBE41o- कोशिकाओं को एपिकल साइड में 500 माइक्रोन सेल माध्यम और 1 घंटे के लिए बेसोलाटरल साइड में 1.5 एमएल के साथ, 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) के माध्यम से बाधा गुणों को मापें, एक STX2 चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड और एक एपिथेलियल वोल्ट-ओममीटर के साथ; 7 दिनों के बाद यह 300 से अधिक हैω × cm²।
      नोट: अंततः, कुछ झिल्ली आवेषण में, कोशिकाओं में कम टीयर होता है। इसलिए TEER और लेफ्टिनेंट के साथ पार पार पारीय आवेषण; 300 Ω × cm² का उपयोग नहीं किया जाता है।
  2. THP-1 कोशिकाओं की खेती करने के लिए, उन्हें रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) 1640 मध्यम 10% FCS के साथ पूरक के 13 मिलीएल का उपयोग कर एक T75 फ्लास्क में विकसित करें, और 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक नए T75 फ्लास्क में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल कोशिकाओं बोने से हर दूसरे दिन कोशिकाओं को विभाजित करें ।
    नोट: गैर विभेदित THP-1 कोशिकाओं निलंबन में मोनोसाइट्स के रूप में उगाया जाता है ।
    1. टीएचपी-1 कोशिकाओं को इस प्रकार अलग करें। 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर T75 की सेंट्रलाइज सामग्री। सुपरनैंट को त्यागें, ताजा माध्यम में गोली को फिर से खर्च करें और एक नए T75 में डाल दें। 10 एनजी/एमएल फोर्बोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) आरएमआई में कोशिकाओं को ४८ घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 वायुमंडल15में इनक्यूबेटिग जोड़ें ।
      नोट: पीएमए के साथ भेदभाव के बाद, कोशिकाएं अब और नहीं बढ़ती हैं और फ्लास्क से जुड़ती हैं।
    2. टीएचपी-1 मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को टुकड़ी में लाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धोएं और कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.5 m M EDTA युक्त सेल टुकड़ी समाधान (जैसे एक्यूटेस) के 3 एमएल के साथ इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिका टुकड़ी की तलाश के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। आरटी में 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ताजा माध्यम और अपकेंद्रित्र के 7 एमएल जोड़ें।
      नोट: मैक्रोफेज को ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ भी अलग किया जा सकता है, 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। हालांकि, ट्रिप्सिन चुने गए सेल टुकड़ी समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) की तुलना में मैक्रोफेज के लिए कठोर है।
    4. सुपरनैंट को हटाने के बाद, टीएचपी-1 माध्यम के 3 एमएल में मैक्रोफेज कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में फिर से निलंबित करें, कोशिकाओं को 1.1.2 में वर्णित करें। और सह-संस्कृति की स्थापना से पहले 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: निलंबन में THP-1 कोशिकाओं को सह संस्कृति आगे छवि के लिए व्यवहार्यता रंगों के साथ दाग किया जा सकता है । इस चरण में, नीचे दी गई प्रक्रिया (चरण 1.2.5) का उपयोग करें।
    5. एक सेल व्यवहार्यता डाई के 10 माइक्रोन के साथ दाग मैक्रोफेज (इंट्रासेलुलर एस्टेरेस द्वारा एसीटेट मोइटीज के रूपांतरण के आधार पर, सामग्री की तालिकादेखें) जिसमें कोशिका व्यवहार्यता डाई के 3 माइक्रोन को सेल निलंबन पर लागू किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस, 5%सीओ2 पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं, तो डाई को हटाने के लिए पीबीएस 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 1x धोने।
      नोट: कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर डाई को हटाने के लिए कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।

2. पारमशील समर्थन पर एक एपीथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृति की स्थापना

  1. CFBE41o का उपयोग करें- अली में एकालेयर के साथ TEER 300 Ω × cm² (चरण 1.1.6.)। निचले कक्ष से माध्यम निकालें, ध्यान से एक बाँझ ग्लास पेट्री डिश (50 मिमी x 200 मिमी) के अंदर समर्थन उलटा, और एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर झिल्ली के नीचे की ओर झिल्ली छिद्रों के माध्यम से उग आया कोशिकाओं को हटा दें।
    नोट: 3 माइक्रोन के पोर आकार के कारण, एपिथेलियल कोशिकाएं बेसोलेटरियल साइड की ओर छिद्रों के माध्यम से बढ़ती हैं। इसलिए, इस तरफ मैक्रोफेज जोड़ने से पहले उन्हें हटाने की आवश्यकता है। CFBE41o- फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं को इस कदम पर दाग दिया जा सकता है। चरण 1.2.5 में प्रक्रिया का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, सेल निलंबन के बजाय, एमईएम में डाई समाधान पारमी समर्थन पर पालन कोशिकाओं पर (केवल 500 माइक्रोन एपिकल साइड) लागू किया जाता है।
  2. पीएमए-विभेदित टीएचपी-1 मैक्रोफेज के सेल सस्पेंशन से 2 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से (आरपीएमआई के 200 माइक्रोन में) का उपयोग करें और कोशिकाओं को उल्टे आवेषण के बेसोटेरल साइड पर रखें।
  3. पेट्री व्यंजनों को ध्यान से बंद करें और 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर2घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. आवेषण को 12-वेल माइक्रोप्लेट में वापस रखें और अली स्थितियों को बनाए रखने के लिए पारगम्य डालने के बेसोलेटरल साइड में एमईएम माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें। अब कोशिकाएं संक्रमण के लिए तैयार हैं।

3. पी एरुगिनोसा द्वारा संक्रमण

नोट: यहां से सभी निम्नलिखित कदम एक जैवसेफ्टी स्तर 2 (BSL2) प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए ।

  1. ग्लिसोजेनी शोरबा (एलबी) के 15 एमएल को पी एरुगिनोसा पाओ1-जीएफपी की एक कॉलोनी के साथ एर्लेनमेयर फ्लास्क (50 एमएल) में 300 माइक्रोन/एमएल एम्पिसिलिन के साथ पूरक किया गया।
    नोट: पी एयरोगिनोसा के अन्य उपभेदों का उपयोग यहां भी किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, PAO1 जंगली प्रकार, PA14, या नैदानिक उपभेदों, अपनी खेती प्रोटोकॉल का पालन करते हुए।
  2. 180 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए बैक्टीरिया को इनक्यूबेट करें।
  3. 18 घंटे के बाद सामग्री को 50 एमएल शंकु नली और सेंट्रलाइज को 5 मिनट के लिए 3850 x g पर स्थानांतरित करें। सुपरनेट को त्यागें और 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें।
  4. तरंगदैर्ध्य 600 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें और कोशिका संस्कृति माध्यम का उपयोग करके बैक्टीरिया की एकाग्रता को 2 x 105 सीएलयू/एमएल की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें। यह एपिथेलियल सेल प्रति जीवाणु के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता से मेल खाती है।
  5. पारमीय समर्थन (चरण 2.4.) के एपिकल साइड में बैक्टीरियल सस्पेंशन का 100 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को बैक्टीरिया को लगाव की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, अली स्थितियों को बहाल करने के लिए एक पिपेट के साथ एपिकल तरल को ध्यान से हटा दें। कुछ नमूनों को नियंत्रण के रूप में असंक्रमित रखें।
    नोट: इस स्तर पर, संलग्न बैक्टीरिया एलबी एगर में चढ़ाया जाना चाहिए (कदम 5.4/5.5 देखें) प्रारंभिक बैक्टीरिया इनोकुलम निर्धारित करने के लिए ।
  6. कोशिकाओं में बैक्टीरियल आसंजन के बाद ब्याज की दवा को इनक्यूबेट करें। उपचार प्रयोगों के लिए, सेल माध्यम में पतला दवा समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें (इस प्रोटोकॉल में टोब्रामाइसिन 6 μg/mL का उपयोग किया गया था) एपिकल साइड में। बेसलेटरल साइड पर दवा के बिना सेल मीडियम के 1,500 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: दवाओं को समाधान के रूप में पैदा करने के बजाय, मॉडल को एयरोसोल बयान के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। ऐसे उद्देश्यों के लिए, अली में कोशिकाओं को बेसोलेटरल साइड से सेल माध्यम के 500 माइक्रोन के साथ खिलाया जाता है। दवा को पहले नेबुलाइज्ड किया जाता है और एक उपयुक्त डिवाइस (यहां वर्णित नहीं) द्वारा एपिकल डिब्बे में जमा करने की अनुमति दी जाती है। संक्रमित और इलाज किए गए नमूने को 4-7 वर्गों में उल्लिखित अंत बिंदुओं के लिए जांचा जा सकता है। इस चरण से, पारम करने योग्य समर्थन का उपयोग या तो छवियों (धारा 4) बनाने या बैक्टीरिया के विकास और स्तनधारी कोशिका व्यवहार्यता के परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, दूसरों के बीच (वर्ग 5-7)।

4. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) के लिए नमूना तैयारी

  1. सह-संस्कृति, संक्रमण और दवा उपचार की स्थापना के बाद, एपिकल और बेसोटेरल पक्ष से सभी माध्यमों को हटा दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ 1x धोएं और फिर आरटी में 1 एच के लिए 3% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (बेसोलाटरल पर एपिकल/600 माइक्रोन पर 300 माइक्रोन)। सेल नाभिक कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए DAPI-PBS के 5 μg/mL के साथ दाग रहे हैं ।
    सावधानी: पीएफए खतरनाक है।
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करके झिल्ली को काटें और उन्हें बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके दो 12 मिमी माइक्रोस्कोपी कवर स्लाइड के बीच रखें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले 30 मिनट के लिए प्रवाह पीठ के अंदर सूखने दें। कॉन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करें।
    नोट: सह-संस्कृति के बाद और बढ़ते से पहले, तंग जंक्शनों इम्यूनोस्टेपिंग किया जा सकता है। इसके लिए, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड 3% के साथ तय किया जाता है, पीबीएस के साथ फिर से धोया जाता है, और पीबीएस में सैपोनिन 0.05%/बीएसए 1% के साथ व्याप्त होता है। इस प्रोटोकॉल में, ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स प्रोटीन (जेडओ-1) को माउस एंटी-ह्यूमन जेडओ-1 एंटीबॉडी (1:400, इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर) के माध्यम से पता चला था। नमूनों तो बकरी विरोधी माउस IgG एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर ६३३ (लाल रंग में 1:2000) के साथ आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड थे । नाभिक DAPI (1 μg/mL) के साथ दाग और कवरस्लिप पर बढ़ते माध्यम के साथ घुड़सवार थे ।
  3. संग्रहित झिल्ली इमेजिंग के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। पता लगाने के लिए 405, 488, 505 या 633 एनएम पर 25x या 63x पानी विसर्जन उद्देश्यों और लेजर चुनें। इमेजेज में 1024 x 1024 पिक्सल रेजोल्यूशन होना चाहिए।
    नोट: लेजर इस्तेमाल दाग के अनुसार चुना जाता है।
  4. एपिकल और क्रॉस-सेक्शन दृश्य प्राप्त करें, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके त्रि-आयामी मॉडल के निर्माण के लिए ज़ेटा-स्टैक मोड (10-15 स्टैक) का उपयोग करें।

5. कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएलयू) के माध्यम से जीवाणु प्रसार का मापन

  1. गैर-संलग्न बैक्टीरिया के सीएलयू का आकलन करने के लिए एपिकल और बेसोटेरल माध्यम (बैक्टीरिया युक्त) को इकट्ठा करें। एपिकल और बेसोटेरल साइड्स से 500 माइक्रोन ले लीजिए और उन्हें पूल करें।
    नोट: इस निलंबन का उपयोग सीधे बैक्टीरिया (चरण 5.4) या अपकेंद्रित्र पर 21,250 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सुपरनेट (सेक्शन 6) से लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज़ (एलडीएच) का मूल्यांकन करने के लिए करें और/या पीबीएस में फिर से निलंबित करने के लिए अतिरिक्त बैक्टीरिया (चरण ५.४) की गिनती ।
  2. पारमणीय समर्थन के प्रत्येक डिब्बे में बाँझ deionized ठंडे पानी के ५०० μL जोड़कर कोशिकाओं में संलग्न और/या आंतरिक बैक्टीरिया के अस्तित्व का आकलन करें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    नोट: नमूनों को या तो पौंड एगर पर चढ़ाया जा सकता है (चरण 5.4 देखें) या बाद में चढ़ाना के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए (पूरे डालने की थाली के रूप में) ।
  3. अनुयायी/आंतरिक बैक्टीरिया के CFU का आकलन करने के लिए, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गल नमूने (यदि जमे हुए) । प्रत्येक अच्छी तरह से पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, सभी पालन सामग्री को हटाने के लिए झिल्ली की सतह और पिपेट को ऊपर और नीचे परिमार्जन करें।
    नोट: इस कदम पर, सभी एपिथेलियल कोशिकाओं को lysed कर रहे है और अनुयायी/आंतरिक बैक्टीरिया एक निलंबन के रूप में उपलब्ध है चढ़ाया जाएगा ।
  4. दोनों अंशों से बैक्टीरियल निलंबन के साथ, पीबीएस में ट्वीन-80 0.05% का उपयोग करके 1/10 सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और एलबी एगर प्लेटों पर बैक्टीरिया को प्लेट करें।
    नोट: 1 से 10 के बीच में कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। बैक्टीरिया को सबसे ज्यादा कमजोर पड़ने में गिना जाना चाहिए, जहां पहले सिंगल कॉलोनियों की पहचान की जाती है।
  5. कालोनियों की गिनती करने के लिए 16-72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटें इनक्यूबेट, और तदनुसार CFU की गणना करें।
    नोट: प्लेट इनक्यूबेशन के समय 30 डिग्री सेल्सियस का तापमान इलाज-नमूनों के लिए और कालोनियों के विलंबित-विकास का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है।

6. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज़ परख के माध्यम से सेल साइटोटॉक्सीसिटी का मूल्यांकन

  1. एलडीएच परख16के लिए कोशिका व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए बैक्टीरिया (चरण 5.1 से) युक्त संक्रमित कोशिकाओं के सुपरनेट का उपयोग करें। बैक्टीरिया को गोली मारने और अंततः बाकी कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 21,250 x ग्राम पर सुपरनेट को अपकेंद्री करें। LDH रिलीज को मापने के लिए बैक्टीरिया मुक्त सुपरनेट का उपयोग करें।
    नोट: इस परख से LDH को मापने से पहले सुपरनेट को फ्रीज नहीं किया जाना चाहिए ।
  2. सुपरनैंट के 100 माइक्रोन को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और एलडीएच परख समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)। अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, तो ४९२ एनएम पर अवशोषण पढ़ें ।

7. मानव साइटोकिन्स की रिहाई का आकलन

  1. साइटोकिन क्वांटिफिकेशन के लिए, एलिसा या साइटोमेट्रिक मनका सरणी इम्यूनोसे17 (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करें। इसके लिए, 10 मिनट के लिए 21,250 x ग्राम पर चरण 5.1 से अपकेंद्रित्र सुपरनिटेंट और विश्लेषण तक 15 दिनों तक या तो तुरंत या स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस को मापें।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट के साथ सुपरनेटेंट का मूल्यांकन करें।
    नोट: प्रक्रिया निर्माण निर्देशों का पालन करती है, जिसमें कैप्चर एंटीबॉडी के साथ प्लेटों की कोटिंग, नमूनों (100 माइक्रोन) और साइटोकिन मानकों, इनक्यूबेशन, धोने और साइटोकिन उपस्थिति का एक कोलोरिमेट्रिक माप प्रदान करने के लिए डिटेक्शन एंटीबॉडी के अलावा शामिल हैं। वैकल्पिक रूप से, प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) के माध्यम से साइटोकिन्स को मापने के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

चित्रा 1A क्रमशः पारगम्य समर्थन के एपिकल और बेसोलेटरल पक्ष पर 24 घंटे के लिए दोनों के लिए बढ़ने के बाद मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज की उत्पनशील सह-संस्कृति की आकृति विज्ञान को दर्शाता है। एपिथेलियल बैरियर इंटीग्रिटी को हायर टीईआर (834 ω × सेमी2)और सीएलएम द्वारा टाइट जंक्शन प्रोटीन जेडओ-1(चित्रा 1बी)के लिए इम्यूनोस्टेटिंग करके दिखाया गया है। असंक्रमित CFBE41o की बाधा अखंडता के संदर्भ में देखा गया एक हीपरिणाम- मोनोकल्चर असंक्रमित एपिथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृतियों में देखा जा सकता है।

एक जीवाणु संक्रमण मॉडल के लिए, पी aeruginosa CFBE41o-कोशिकाओं पर 1:1 की- संक्रमण (MOI) की बहुलता पर टीका लगाया गया था । संक्रमण के छह घंटे बाद(चित्रा 2 ए),सह-संस्कृति के एपिकल साइड पर मैक्रोफेज देखे गए । संक्रमण के बाद, टीईईआर 834 से 250 250 तक गिर गया ω × सेमी2,एक समझौता एपिथेलियल बैरियर का संकेत देता है, साथ ही ZO-1 धुंधला(चित्रा 2B)द्वारा भी कल्पना की गई है।

चित्रा 3 पारगम्य झिल्ली छिद्रों और बैक्टीरिया के माध्यम से मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन से पता चलता है कि एपिकल साइड पर टीएचपी-1 कोशिकाओं द्वारा तेज । नमूनों को स्वतंत्र प्रयोगों से 1, 3 और 6 घंटे के बाद इनक्यूबेशन तय किया गया था । टीएचपी-1 मोनोकल्चर(चित्रा 3ए-सी)में, मैक्रोफेज माइग्रेशन को 1 घंटे के रूप में देखा गया था, जबकि सह-संस्कृति(चित्रा 3डी-एफ)में, यह 3 एच संक्रमण के बाद देखा गया था। टीएचपी-1 में बैक्टीरिया तेज संक्रमण के 3 घंटे के बाद देखा गया था, दोनों मोनोकल्चर और सह संस्कृति में । CFBE41o द्वारा कोई जीवाणु तेज नहीं देखा जा सकता है । क्रॉस-सेक्शनल दृश्य ऐसे रखे गए थे कि पारमीय झिल्ली समर्थन बीच में एपिकल और बेसोटेरल डिब्बे के अलगाव के रूप में था।

चित्रा 4 संक्रमित सह संस्कृतियों (CFBE41o-+THP-1) के साथ या 6 घंटे के लिए tobramycin के बिना इलाज के confocal स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोपी चित्रों से पताचलता है (चित्रा 4ए, बी)या 20 घंटे(चित्रा 4सी, डी)। उपचार के बिना, एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज दोनों की मृत्यु 20 एच संक्रमण(चित्रा 4C)के बाद हुई। हालांकि, टोब्रामाइसिन उपचार पर, मेजबान कोशिकाओं को 20 घंटे के बाद संरक्षित किया जाता है; फिर भी, संस्कृति में कुछ बैक्टीरिया देखे जा सकते हैं। माइक्रोस्कोपी चित्रों(चित्र 4 बी)में उपचार के 6 घंटे के बाद देखे जाने के बावजूद, बैक्टीरिया चित्र 4 ईमें सीआईएफयू में मनाए गए अनुसार पैदा नहीं हुआ । फिर भी, 20 घंटे के उपचार के बाद, बैक्टीरिया ने प्रसार क्षमता को बरामद किया, जैसा कि सीएफयू परख(चित्रा 4F)में उपनिवेशों द्वारा देखा गया है। ठंडे पानी और स्क्रैपिंग के साथ सेल लाइसिस प्रोटोकॉल बैक्टीरिया को संलग्न और संभवतः कोशिकाओं में आंतरिक छोड़ सकता है। इसके साथ ही कोशिकाओं को नष्ट कर दिया जाताहै (अनुपूरक चित्रा S1A, B)। एपिथेलियल कोशिकाओं (300 x ग्राम)या बैक्टीरिया (21,250 x ग्राम)के लिए इस पेपर में उपयोग किए जाने वाले अपकेंद्रित्र चरणों ने दोनों(अनुपूरक आंकड़े S1C, D)की व्यवहार्यता में बाधा नहीं डाली। सभी सीएलयू परख -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करके किया गया था, इसके बाद विगलन और चढ़ाना। इस प्रक्रिया ने ताजा नमूनों(अनुपूरक चित्रा S1E)की तुलना में बैक्टीरिया की संख्या को 2-लॉग से कम कर दिया। चूंकि यह प्रक्रिया विभिन्न समय बिंदुओं पर सभी प्रयोगात्मक समूहों (उपचारित और अनुपचारित) के लिए एक साथ की जाती है, इसलिए इस कमी को अंतिम परिणामों(अनुपूरक चित्रा S1E)में शामिल किया जाएगा। इसके अलावा, यहां उपयोग की जाने वाली टोब्रामाइसिन की एकाग्रता ने असंक्रमित कोशिकाओं(अनुपूरक चित्रा S2A)के लिए कोई विषाक्तता नहीं दिखाई और आगे कोई भड़काऊ प्रतिक्रिया(अनुपूरक चित्रा S2B)भी नहीं। हालांकि, यह पी एरुगिनोसाको मारने के लिए न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता की सीमा के भीतर था।

चित्रा 5 ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) और सेल फिजिबिलिटी को दर्शाता है। चित्रा 5ए-बी मोनोकल्चर और सह-संस्कृतियों के टीयर को दिखाता है। सीएफबी41ओ कीसह-संस्कृति - टीएचपी-1 के साथ कोशिकाओं ने मोनोकल्चर (लाल सलाखों) की तुलना में एपिथेलियल बैरियर अखंडता में कोई परिवर्तन नहीं किया। संक्रमण पर, टीईईआर मूल्य गिरा (ग्रीन बार)। संक्रमण के 1 घंटे के बाद, कुछ नमूनों एंटीबायोटिक टोब्रामाइसिन (ब्लू बार) के साथ इलाज किया गया, 6 या 20 घंटे के लिए । उपचार ने एपिथेलियल बैरियर अखंडता को संरक्षित किया, जैसा कि उच्च टीईईआर द्वारा मनाया गया था। चित्रा 5C 6 घंटे के बाद संक्रमण और टोब्रेमाइसिन उपचार पर सेल विषाक्तता के संकेत के रूप में LDH रिलीज का प्रतिशत दिखाता है । सह-संस्कृति ने ही एलडीएच की रिहाई को प्रेरित किया, जो संक्रमित कोशिकाओं (लगभग 20%) के लिए समान था । संक्रमण के 20 घंटे बाद, LDH के कोई संकेत का पता नहीं लगाया जा सका। दीर्घकालिक संक्रमण के लिए LDH विश्वसनीयता साबित करने के लिए, PAO1-GFP के साथ और संबंधित असंक्रमित नियंत्रण(अनुपूरक आंकड़ा S2C) कीतुलना में LDH 1 U/mL के बिना मध्यम में इनक्यूबेटेड था । एलडीएच सिग्नल पी एरुगिनोसाके साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन (20 एच) के बाद खो गया था, यह दर्शाता है कि संक्रमित संस्कृतियों में इनक्यूबेशन समय में LDH केवल स्थिर है ।

चित्रा 6 एलिसा के माध्यम से पता चला समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की काइनेटिक्स से पता चलता है । CFBE41o-और THP-1 कोशिकाओं की एक संक्रमित सह-संस्कृति का लाभ समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उच्च स्राव के साथ देखा गयाथा। संक्रमित सह-संस्कृति(चित्रा6 सी) में कुछ समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव या तो समान (आईएल-6) या उच्च (आईएल-8, टीएनएफ-α, आईएल-10) था।Figures 6A-B अप्रत्याशित रूप से, टीएचपी-1 मोनोकल्चर(चित्रा 6B)में कुछ साइटोकिन संक्रमित नमूनों (आईएल-8, टीएनएफए, आईएल-1) में डाउनरेगुए गए हैं।

चित्रा 7 फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के माध्यम से मापा टोब्रामाइसिन के साथ संक्रमण और उपचार पर मोनो और सह संस्कृतियों में साइटोकिन्स की रिहाई को दर्शाता है। मोनोकल्चर की तुलना में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन आईएल-8(चित्रा 7 ए)और एंटी-भड़काऊ साइटोकिन आईएल-10(चित्रा 7F)का स्राव एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज की सह-संस्कृतियों में अधिक था। हालांकि, अन्य सभी साइटोकिन्स (आईएल-1 α, आईएल-12p40, आईएल-23 और जीएम-सीएसएफ)(आंकड़े 7B-E)के लिए, साइटोकिन स्राव का स्तर सह-संस्कृति में अधिक नहीं था जो संबंधित मोनोकल्चर में था।

Figure 1
चित्रा 1: असंक्रमित एपिथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृति के क्रॉस-सेक्शन और एपिकल दृश्य। (A)असंक्रमित 24 एच एपिथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृति के क्रॉस व्यू । CFBE41o- नीले रंग में पीले और नाभिक (DAPI) में लाल, THP-1 मैक्रोफेज दाग। (ख)जेडओ-1 (लाल) के लिए असंक्रमित CFBE41o-मोनोलेयर इम्यूनो-दाग के एपिकल दृश्य । DAPI: नाभिक। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: संक्रमित एपिथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृति के क्रॉस-सेक्शन और एपिकल दृश्य। (A) पी एरुगिनोसा PAO1-GFP के साथ 6 घंटे के बाद संक्रमण (एचपीआई) पर एपिथेलियल-मैक्रोफेज सह-संस्कृति का क्रॉस व्यू और(बी)एपिकल व्यू । CFBE41o- लाल रंग में दाग, पीले रंग में टीएचपी-1 मैक्रोफेज, नीले रंग में नाभिक (DAPI) और पी एरुगिनोसा PAO1-GFP हरे रंग में। (ख)6 घंटे संक्रमित CFBE41o-मोनोलेयर के एपिकल व्यू । स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन और बैक्टीरिया के काइनेटिक्स 3 डी मॉडल के क्रॉस-सेक्शन द्वारा कल्पना तेज करते हैं। PAO1-GFP संक्रमण THP-1 मैक्रोफेज(ए-सी)या सह संस्कृति(डी-एफ)की मोनोकल्चर में काइनेटिक्स । टीएचपी-1 मैक्रोफेज लाल रंग में दाग रहे हैं, नीले रंग में एपिथेलियल कोशिकाओं के नाभिक (DAPI), और पी एरुगिनोसा हरे रंग में (GFP) । प्रत्येक आकृति को एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों में विभाजित किया जाता है, बीच में जगह को झिल्ली माना जाता है, जो CFBE41o- कॉन्फ्लोटेंट लेयर (डी-एफ) द्वारा खाली या कब्जा कर लिया जाता है। आंकड़ों में आवेषण अलग-अलग समय (ए-एफ) में मैक्रोफेज द्वारा बैक्टीरिया तेज दिखाते हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: टोब्रामाइसिन में PAO1-GFP अस्तित्व का लक्षण वर्णन-सह-संस्कृतिई. (ए-डी) कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ सह-संस्कृतियों के साथ और उपचार के बिना। (A)संक्रमण के 6 एच के बाद अनुपचारित सह-संस्कृति । (ख)संक्रमित सह-संस्कृति 6 एच के लिए टोब्रामाइसिन 6 माइक्रोग्राम/एमएल (टोब) के साथ इलाज किया जाता है ।(C)अनुपचारित सह-संस्कृति 20 घंटे के बाद संक्रमण,(डी)संक्रमित सह संस्कृति टोब्रामाइसिन 6 μg/mL के साथ 20 घंटे के लिए इलाज किया । नाभिक DAPI (नीला), मैक्रोफेज (लाल) और पी एरुगिनोसा जीएफपी (हरा) के साथ दाग। (ई)6 के बाद अनुयायी/आंतरिक बैक्टीरिया की कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीआईएफओ) और टोब्रामाइसिन 6 माइक्रोग्राम/एमएल उपचार के साथ(एफ)20 घंटे। खाली झिल्ली डालने का उपयोग PAO1-GFP विकसित करने के लिए एक अजैविक सब्सट्रेट के रूप में किया जाता था। तुकी के कई तुलना परीक्षण (# नो कॉलोनाइजर) के साथ दो-तरह से एनोवा का उपयोग किया गया था, * पी एंड एलटी; 0.05; पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.001; पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001; एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है, n = 9-27 3-9 स्वतंत्र प्रयोगों की प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बाधा अखंडता और मोनो और सह संस्कृति की व्यवहार्यता का मूल्यांकन । निम्नलिखित सह-संस्कृति स्थितियों का आकलन किया गया: असंक्रमित (ग्रे बार), संक्रमित (हरी सलाखों), या संक्रमित और टोब्रामाइसिन (नीली सलाखों) के साथ इलाज किया गया। (A)मोनो-कल्चर्स (CFBE41o-Bऔर THP-1) और सह-संस्कृति में- संक्रमण के 6 घंटे के बाद ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस । (ग)एलडीएच के माध्यम से मापा गया मोनो और सह-संस्कृति की साइटोटेक्सिटी संक्रमण के बाद 6 घंटे जारी करता है। तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA का उपयोग किया गया था; * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05; पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001; एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है; n = 9 तीन स्वतंत्र प्रयोगों की प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: असंक्रमित और संक्रमित मोनो-और सह-संस्कृति सुपरनेटेंट की साइटोकिन रिलीज की काइनेटिक्स एलिसा के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। एलिसा किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। (A)CFBE41o-,(B)THP-1, और(C)सह संस्कृति आईएल-8, TNF-α, आईएल-1, और आईएल-6 जारी । त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। n = 2 स्वतंत्र प्रयोगों की 6 प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: साइटोकिन पैनल के सुपरनैंट परिणाम 6 घंटे के बाद संक्रमण के लिए 6 μg/mL के साथ और बिना FACS के माध्यम से मापा जाता है । 6 एच पोस्ट-इंफेक्शन के बाद मोनो और सह-संस्कृति के सुपरनेटेंट्स संबंधित साइटोकिन्स आईएल-8(ए),आईएल-1α(B),IL12p40(C),IL-23(D),जीएम-सीएसएफ(ई)और आईएल-10(एफ)का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । त्रुटि बार मानक विचलन को इंगित करता है, एन = 9 3 स्वतंत्र प्रयोगों की प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S1: प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों के लिए नियंत्रण प्रयोग। (A, B) CFBE41o के माइक्रोग्राफ-24-अच्छी तरह से 2 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर 2 दिनों के लिए उगाया प्लेटों में कोशिकाओं/ (A)CFBE41o-पीबीएस में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं, और(बी)पानी से शोधित कोशिकाओं को एक पिपेट के साथ स्क्रैप करने के बाद 30 मिनट के बाद । (ग)अपकेंद्रित्र के बाद स्तनधारी कोशिकाओं की व्यवहार्यता। CFBE41o-कोशिकाओं T75 सेल संस्कृति फ्लास्क से हटा दिया गया था के रूप में कदम १.१.१ और १.१.२ में वर्णित है । 10 एमएल आइसोटोनिक समाधान में परिणामी सेल निलंबन के 100 माइक्रोन का विश्लेषण किया गया था। एकल कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग किया गया था। फिर, संबंधित सेल निलंबन 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र किया गया, फिर से निलंबित कर दिया गया और फिर से गिना गया। त्रुटि सलाखों मानक विचलन, n = 6 2 व्यक्तिगत प्रयोगों के विभिन्न फ्लास्क इंगित करता है। (घ)अपकेंद्रित्र के बाद PAO1-GFP की व्यवहार्यता । PAO1-GFP बैक्टीरिया सेल माध्यम में OD = 0.01 करने के लिए पतला किया गया। सीआईयू का मूल्यांकन 10 गुना कमजोर पड़ने वाली पंक्ति और एलबी प्लेटों के माध्यम से 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया गया था । संबंधित प्लास्टिक ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 21,250 x ग्राम पर अपकेंद्री किया गया था और मध्यम में फिर से निलंबित कर दिया गया था। सीएलयू का आकलन फिर से किया गया । दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट, * पी एंड एलटी; ०.०३३ । त्रुटि बार मानक विचलन को इंगित करता है, n = 6 के 2 प्रयोग। (ई)ठंड के बाद बैक्टीरिया की व्यवहार्यता। PAO1-GFP बैक्टीरिया में (डी) के रूप में तैयार किया गया था और CFU का विश्लेषण किया गया था, तो प्लास्टिक ट्यूबों पर एक दिन के लिए जमे हुए थे-20 डिग्री सेल्सियस और CFU फिर से आकलन करने के लिए गल । दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट, *** पी एंड एलटी; 0.001। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है, n = 6 दो प्रयोगों के । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S2: एलडीएच व्यवहार और टोब्रामाइसिन के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियंत्रण प्रयोग। (ए)6 μg/ml tobramycin के साथ इनक्यूबेशन के 20 घंटे के बाद साइटोटॉक्सिकिटी का आकलन करने के लिए नियंत्रण प्रयोग । मोनो और सह संस्कृति के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था, लेकिन कोशिकाओं को 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर 2 दिनों के लिए उगाया गया था और THP-1 कोशिकाओं apically वरीयता प्राप्त किया गया । 6 μg/mL tobramycin या नियंत्रण के साथ कोशिकाओं को 20 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया । वन-वे इनोवा, तुकी की कई तुलना परीक्षण, *** पी एंड एलटी; 0.001। त्रुटि बार मानक विचलन को इंगित करता है, एन = 6 के 2 प्रयोग (CFBE41o-), n = 3 एक प्रयोग (टीएचपी-1 और सह-संस्कृति)। (ख)मोनो के सुपरनेटेंट का नियंत्रण-एलिसा-और सह-संस्कृति के साथ/बिना टोब्रामाइसिन । सेल संस्कृति (ए) के अनुसार किया गया था ताकि सभी स्थितियों के लिए नियंत्रण की तुलना में कोई साइटोकिन रिलीज न हो। एलिसा चरण ७.१ और ७.२ में किया गया था, 10 μg/mL (एलपीएस) नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था, एलपीएस के लिए आईएल-8 रिलीज-THP-1 युक्त नियंत्रण का इलाज किया गया था पता लगाने योग्य से अधिक था । दो तरह से ANOVA, Tukey के कई तुलना परीक्षण, एनएस पी > 0.12; * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.033; पी एंड एलटी; 0.001। त्रुटि सलाखों मानक विचलन, n = दो प्रयोगों के 6, एन = 3 एक प्रयोग (एलपीएस नियंत्रण) का संकेत मिलता है। (ग)अत्यधिक PAO1-GFP प्रसार के कारण एलडीएच क्षरण । एलडीएच को एमईएम माध्यम में 1 यू/एमएल की एकाग्रता में जोड़ा गया था । या तो एलडीएच माध्यम या नियंत्रण माध्यम का उपयोग कोशिकाओं को ओडी = 0.01 (1 x 108 सीएलयू/एमएल से मेल खाती है) के लिए किया जाता था और फिर 20 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया जाता था । एलडीएच परख के रूप में धारा 6 में वर्णित किया गया था । वन-वे एनोवा, तुकी की कई तुलना परीक्षण, एनएस पी > 0.12; पी एंड एलटी; 0.001। त्रुटि बार मानक विचलन को इंगित करता है, n = 8-9 तीन अलग-अलग प्रयोगों में से। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पेपर संक्रमित वायुमार्ग की 3 डी सह-संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मानव सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइन CFBE41o-और मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज सेल लाइन टीएचपी-1 द्वारा गठित किया गया है। प्रोटोकॉल एपिथेलियल बैरियर अखंडता, मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन, बैक्टीरिया अस्तित्व और सूजन के आकलन की अनुमति देता है, जो दवा प्रभावकारिता और मेजबान प्रतिक्रियाओं का एक साथ परीक्षण करते समय महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। मॉडल में नवीनता तीव्र जीवाणु संक्रमण (यानी पी एरुगिनोसा)के साथ एपिथेलियल कोशिकाओं (यानी मानव सीएफ सेल लाइन और मैक्रोफेज) के समावेश के भीतर निहित है। एपिथेलियल कोशिकाओं में तीव्र संक्रमण को एंटीबायोटिक (यानी टोब्रामाइसिन) द्वारा नियंत्रित करने के लिए प्रदर्शित किया जाता है। एक मानव सीएफ सेल लाइन के उपयोग के अलावा, पूरे मॉडल अली स्थितियों में स्थापित किया गया है, जो सीएफ में शारीरिक स्थितियों के काफी करीब है । सीएफ सेल लाइन का उपयोग मॉडल में रोग की कुछ विशेषताओं को लागू करता है । सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) का उत्परिवर्तन सीधे फेफड़ों में एपिथेलियल फ्लूइड ट्रांसपोर्ट के डिस्रेगुलेशन से संबंधित है। इसके अलावा, सीएफ जीन में उत्परिवर्तन, जैसे कि 3F508, पी एरुगिनोसा4के साथ संक्रमण पर सूजन और गंभीर फेफड़ों की क्षति के साथ मोटी बलगम में परिणाम देता है। बेकार सीएफटीआर के कारण होने वाली इन रोगव्यवस्थाओं में संभावित रूप से सीएफ फेफड़ों की बीमारी18के रोगजनकों से जुड़े एक महत्वपूर्ण सेलुलर तंत्र के रूप में ऑटोफैगी हानि शामिल है । हालांकि, CFBE41o- गुप्त बलगम में विफल है, जो इस सेल लाइन की एक सीमा है। यदि यह बलगम की भूमिका का अधिक विशेष रूप से अध्ययन करने का इरादा है, तो प्रोटोकॉल को अन्य ब्रोंकियल सेल लाइनों (जैसे, कैलू-3) का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एपिथेलियल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का संयोजन और अली में पी एरुगिनोसा के साथ बाद में संक्रमण है। CFBE41o के- संक्रमण-प्रोइट्रो में पी एयरोजिनोसा द्वारा पहले से ही वर्णित किया गया है, मुख्य रूप से एक प्रवाह सेल चैंबर का उपयोग कर, संस्कृति मीडिया में arginine के साथ पूरक, एपीथेलियल सेल अस्तित्व में सुधार लाने के लिए और जैव फिल्मगठन 19का समर्थन । वर्तमान प्रोटोकॉल केवल मानव कोशिकाओं का उपयोग कर एक नए मॉडल के लिए उद्देश्य है, जो इसके अलावा, उच्च नमूना थ्रूपुट के लिए पारमीय अच्छी तरह से प्लेट आवेषण पर अली में उगाया जा सकता है । दाताओं से प्रजनन योग्य प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने पर निर्भर होने के बजाय, एक मानव अमर कोशिका रेखा के रूप में THP-1 विभेदित मैक्रोफेज का समावेश, हमारे मॉडल का एक और लाभ है। इन मैक्रोफेज को पारगम्य झिल्ली समर्थन के बेसोटेरल पक्ष में जोड़कर, यह देखा गया कि मैक्रोफेज फैल गए और अंततः फिल्टर-विकसित एपिथेलियल बैरियर के एपिकल साइड में स्थानांतरित हो गए। इस प्रोटोकॉल की भिन्नता एपिथेलियल कोशिकाओं के शीर्ष पर सीधे एपिकल साइड पर मैक्रोफेज का जोड़ हो सकता है, जैसा कि क्लाटिंग एट अलद्वारा वर्णित है। 14. गैर मानव प्रतिरक्षा और फेफड़ों की कोशिकाओं की सह संस्कृति पहले से ही वर्णित किया गया है । डिंग एट अल। 10 पारगम्य डालने पर माउस लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं का इस्तेमाल किया बेसोटेरल पक्ष पर मैक्रोफेज के साथ संयोजन में समर्थन करता है और एस ऑरियस,CF रोगियों में पुराने संक्रमण का एक और महत्वपूर्ण रोगजनक से संक्रमित । हालांकि, इस अध्ययन में, सिस्टिक फाइब्रोसिस पर कोई ध्यान नहीं दिया गया था या दवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक मंच के रूप में सह-संस्कृति का उपयोग करने के लिए। हमारे प्रोटोकॉल को अन्य जीवाणु संक्रमणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे स्टेफिलोकोकस ऑरियस, माइकोबैक्टीरियम फोड़ा, या बर्कहोल्डरिया सेपेसिया- सीएफ फेफड़ों में महत्वपूर्ण रोगजनक।

एक अन्य महत्वपूर्ण कदम पारगम्य आवेषण उल्टा (धारा 2) को फ्लिप करके कोशिकाओं को टीएचपी-1 मैक्रोफेज के अलावा करना है। यह संक्रमण के पक्ष में अच्छी तरह से मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। जेड-स्टैक और क्रॉस-सेक्शन व्यू के साथ 3डी मॉडल से बाद में इमेजिंग प्रक्रिया को मैक्रोफेज के अंदर का निरीक्षण करने और बैक्टीरिया तेज(चित्रा 3)का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। 1 एचपीआई पर, एपिकल साइड पर लागू बैक्टीरिया झिल्ली के माध्यम से माइग्रेट होते हैं, जबकि मैक्रोफेज माइग्रेशन और तेज केवल 3 एचपीआई पर होता है। इसलिए संक्रमण के 1 घंटे के बाद, टोब्रामाइसिन के साथ उपचार शुरू करना उचित था और लंबी अवधि (20 एच) के लिए मेजबान कोशिका और बैक्टीरिया के अस्तित्व दोनों को संबोधित करने की संभावना थी। प्रोटोकॉल के दौरान, बंध्यता को बनाए रखना एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि प्रत्येक में संदूषण का खतरा होता है। फिर भी, अनुभवी सेल-संस्कृति कर्मी उचित तैयारी और प्रशिक्षण के बाद इस प्रोटोकॉल का पालन करने में सक्षम होंगे। सेल माध्यम को नियमित रूप से संदूषण के लिए जांचा जाना चाहिए, अधिमानतः सभी महत्वपूर्ण चरणों के बाद।

किसी भी मॉडल के साथ के रूप में, संक्रमित सह संस्कृति भी कुछ सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं का एकीकरण। यहां, बसोल्टेरल साइड पर मैक्रोफेज होना महत्वपूर्ण था; हालांकि, पहले से उगाई गई एपिथेलियल परत के साथ डालने के हेरफेर ने सह-संस्कृति को जल्दी नुकसान और गड़बड़ी प्रदान की हो सकती है। हालांकि, पारगम्य समर्थन मॉडल ने उच्च-थ्रूपुट विशेषताएं प्रदान की हैं, जो सीएफ संक्रमित फेफड़ों20, 21,21की पिछली सह-संस्कृतियों में नहीं देखी गई हैं। इसके साथ, आगे के प्रयोगों को मैक्रोफेज विकल्प के रूप में टीएचपी-1 का उपयोग करने की सीमाओं का आकलन करने की आवश्यकता है । जबकि इस सेल लाइन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, यह एलपीएस22 के लिए कम उत्तरदायी है और इसमें पूर्ण सक्रियण का अभाव है और पूरी आबादी मोनोसाइट्स से मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में अंतर नहीं है23। एक और सीमा सीएफ संक्रमण और दवा वितरण में अन्य प्रमुख घटकों की कमी है। CFBE41o- सेल लाइन सिलिया के पास नहीं है और न ही यह बलगम का उत्पादन करता है, जो आमतौर पर अली में सेल संस्कृति के 20-30 दिन होता है। चूंकि यह CFBE41o- सेल लाइन के लिए मामला नहीं था, हमने सात दिनों के बाद कोशिकाओं का उपयोग किया जब एक तंग एपिथेलियल बैरियर का गठन किया गया था। म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस या तो रोगाणुओं24 या दवा कणों9,,25 और इन विट्रो मॉडल फेफड़ों के जमाव का आकलन करने के लिए निवास की स्थिति को बदल देता है। अन्य कोशिकाओं द्वारा जो देखा जाता है उससे अलग, ऊतक संस्कृति एक बाह्राश मैट्रिक्स सामग्री (जैसे फाइब्रोनेक्टिन या कोलेजन I) के साथ कोटिंग सम्मिलित करती है,उदाहरण के लिए टीईईआर26में CFBE41o के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती है। इसलिए, पारमी फिल्टर इस प्रोटोकॉल में एक बाह्य मैट्रिक्स सामग्री के साथ लेपित नहीं थे।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, 6 एच संक्रमण के बाद मोनो और सह-संस्कृतियां भविष्य में दवा परीक्षण में माप के रूप में उपयोग करने के लिए पर्याप्त साइटोकिन रिलीज प्रदान करती हैं। सह संस्कृति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मॉडलिंग में सेल सहयोग का एक लाभ लाता है । सूजन को कम करने में टोब्रामाइसिन की अक्षमता की उम्मीद थी क्योंकि उपचार के दौरान सभी बैक्टीरिया समाप्त नहीं हुए थे(चित्रा 4ई, एफ)। फिर भी, सीएफ मॉडल में टोब्रामाइसिन की प्रतिक्रिया को मॉडल करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि टोब्रामाइसिन (उच्च सांद्रता में) पी एरुगिनोसा अवरोध में प्रभावी हो सकता है, यहां तक कि बायोफिल्म19,,27पर भी। इस प्रोटोकॉल के आगे उपयोग के लिए एक संभावना उपचार में विरोधी भड़काऊ दवाओं को एकीकृत करना है। भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बारे में समग्र सिफारिश अल्पावधि उपचार (6 एच) का उपयोग करना होगा, जिसमें अभी भी मेजबान कोशिका और बैक्टीरिया मौजूद हैं। इस समय बिंदु के बाद, मेजबान कोशिकाओं को अनुपचारित नमूनों में नष्ट कर दिया जाता है। एलिसा और एफएस दोनों का उपयोग साइटोकिन्स की रिहाई को मापने के लिए किया जा सकता है। अंत में, यदि नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर 15 दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत किया जाता है, तो उदाहरण के लिए, ताजा नमूनों का सकारात्मक नियंत्रण (उदाहरण के लिए एलपीएस के साथ उत्तेजित कोशिकाओं) का उपयोग करके साइटोकिन्स की विश्वसनीयता की जांच करने की सिफारिश की जाती है।

प्रोटोकॉल के कुछ संशोधन संभव हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल को नेबुलाइज्ड दवाओं (चरण 3.6) के अनुप्रयोग में विस्तारित किया जा सकता है। यह मौखिक साँस लेना के माध्यम से फेफड़े की दवा वितरण मॉडल के लिए आवश्यक है। पानी में घुलनशील दवाओं का नेबुलाइजेशन, जैसे टोब्रामाइसिन, या उसके नैनो-वाहक, जैसे लिपोसोमल कोलिस्टिन, नियमित रूप से क्लिनिक में उपयोग किए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों द्वारा अपेक्षाकृत सीधे आगे है। इसके अलावा, सेल कल्चर आवेषण पर एयरोसोल जमा करने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण हैं। इसके अलावा, जैसा कि यहां वर्णित मॉडल पारगम्य झिल्ली समर्थन पर आधारित है, इसे कुछ समकालीन माइक्रोफ्लुइडिक (जैसे "चिप पर फेफड़े") उपकरणों के लिए भी अपनाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, श्वास के प्रभाव और संबंधित यांत्रिक खींच और एयरफ्लो में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा बलगम या प्रतिस्थापन के अलावा संशोधित किया जा सकता है । एक और दिलचस्प अगला कदम नैनोमेडिसिनों का परीक्षण होगा, खासकर नैनो प्रौद्योगिकी उपन्यास एंटी-इन्फेक्टिव्स28, सीएफ सुधारकों 29और एंटीबायोटिक दवाओं और रोगब्लॉकर्स30के सह-वितरण के विकास में प्रगति कर रही है।29 कुल मिलाकर, वर्तमान प्रोटोकॉल को एक जटिल प्रणाली में एंटीबायोटिक उपचार पर बैक्टीरियल अस्तित्व का आकलन करने में उपयोगी माना जा सकता है, कुछ मेजबान से संबंधित रीडआउट के साथ: सेल साइटोटॉक्सिटी, एपिथेलियल बैरियर अखंडता, मैक्रोफेज ट्रांसमिग्रेशन और भड़काऊ प्रतिक्रिया। ये दवा विकास के लिए आवश्यक पैरामीटर हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० कार्यक्रम से अनुसंधान, तकनीकी विकास और अनुदान समझौते के तहत प्रदर्शन के लिए धन प्राप्त हुआ ६४२०२८ H2020-MSCA-ITN-२०१४, NABBA-डिजाइन, और उन्नत नैनोमेडिसिनों के विकास के लिए जैविक बाधाओं को दूर करने और गंभीर रोगों के इलाज के लिए । हम डॉ एना कोस्टा और डॉ जेनी Juntke सह संस्कृति के विकास पर महान समर्थन के लिए धन्यवाद, ओल्गा हार्टविग, वैज्ञानिक चित्रण के लिए, Anja Honecker, एलिसा परख के लिए, पेट्रा König, जना Westhues और डॉ चियारा डी Rossi सेल संस्कृति, विश्लेषिकी, और माइक्रोस्कोपी पर समर्थन के लिए । हम अपनी पांडुलिपि को प्रूफरीड करने के लिए चेल्सी थॉर्न को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Accutase AT104
Ampicillin Carl Roth, Germany HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer OLS Omni Life Sciences -
CellTrace Far Red Thermo Fischer C34564
Centrifuge Universal 320R Hettich, Germany 1406
CFBE41o- cells 1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich		 1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm World Precision Instruments, Sarasota, USA STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM Leica, Mannheim, Germany TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits Affymetrix eBioscience, USA 15541037
Cytokines Panel I and II LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). 740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche 11644793001
D-(+) Glucose Merck 47829
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fischer D1306
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments, Sarasota, USA EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile Corning, Amsterdam, Netherlands 353181
Fetal calf serum Lonza, Basel, Switzerland DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Invitrogen A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle Roche, Mannheim, Germany 10127230001
LB broth Sigma-Aldrich, Germany L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11140050
P. aeruginosa strain PAO1 American Type Culture Collection 47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP American Type Culture Collection 10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% EMS DIASUM 15710-S
Phosphate buffer solution buffer Thermo Fischer 10010023
Petri dishes Greiner 664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, Germany P8139-1MG
Precision Cover Glasses ThorLabs CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody BD Transduction Laboratories 610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK 11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) Normax, Portugal 5058561
Saponin Sigma-Aldrich, Germany S4521
T75 culture flasks Thermo Fischer 156499
THP-1 cells Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt Sigma T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fischer 25300054
Tween80 Sigma-Aldrich, Germany P1754

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References

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