Summary
당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
f폐감염의 치료를 위한 약물 연구는 높은 복잡성의 시험관 내 모델을 향해 진행되고 있다. 폐 모형에 있는 박테리아의 다각적인 존재는 면역 세포가 마이크로 환경에서 박테리아에 대하여 선동적인 반응을 조정하는 동안 상피 배열을 재적응할 수 있습니다. 생체 내 모델은 낭포성 섬유증의 맥락에서 새로운 항 감염제를 테스트하기위한 선택이지만, 그들은 여전히 인간과 치료 결과에 그러한 질병의 생체 내 상태를 정확하게 모방하지 않습니다. 인간 세포 (기관지 상피 및 대식세포)와 관련 병원체에 기초한 감염된 기도의 복잡한 시험관 내 모형은 이 간격을 다리를 내고 진료소로 새로운 항 감염제의 번역을 용이하게 할 수 있었습니다. 이러한 목적을 위해, 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및- THP-1 단낭세포 유래 대식세포의 공동 배양 모델이 설립되어 공기 액체 인터페이스(ALI) 조건에서 P. aeruginosa에 의한 인간 기관지 점막의 감염을 모방하였다. 이 모델은 7 일 안에 설정되며, 다음과 같은 매개 변수는 동시에 평가됩니다 : 상피 장벽 무결성, 대식 세포 간 변형, 세균 생존 및 염증. 본 프로토콜은 새로운 항 감염제를 발견하고 폐에 에어로졸 납품을 최적화하는 것과 관련이 있을 수 있는 약물 효능 및 호스트 반응을 평가하기 위한 견고하고 재현 가능한 시스템을 설명합니다.
Introduction
슈도모나스 아에루기노사는 낭포성 섬유증(CF)의 관련 병원체로 폐 조직 장애1에기여한다. 알자네이트 및 기타 점액 외극성 과 같은 다당류의 생산은, 끈질긴 세균 준수로 이끌어 내는 질병의 진행을 조정하고, 박테리아에 대한 항생제의 전달을 제한하고 숙주 면역 계통에 대하여 박테리아를 보호합니다2. 판자에서 생물막 형성으로의 P. aeruginosa의 전환은 이러한 맥락에서 중요한 문제이며, 또한 항생제 내성의 발생을 용이하게합니다.
CF의 맥락에서 마우스는 주로 모델로 사용되었습니다. 마우스는, 그러나, CF 돌연변이3의도입과 함께 자발적으로 이 질병을 개발하지 않는다. 대부분의 세균성 생물막 개발 및 약물 감수성 연구는 페트리 접시와 같은 무생물 표면에서 수행되었습니다. 그러나 이 방법은 생체 내 복잡성을 나타내지는 않습니다. 예를 들면, 중요한 생물학 장벽은 면역 세포 뿐만 아니라 점막 상피를 포함하여 결석합니다. P. aeruginosa는 상피 세포에 아주 유독하더라도, 몇몇 단은 인간 기관지 세포와 이전 P. aeruginosa 생물막을 공동 경작하는 것을 관리했습니다. 이들 세포는 CFTR 돌연변이(CFBE41o-세포)를 가진- 낭포성4 섬유증 환자로부터 유래하고 항생제 효능5을 평가하거나 감염6시 CFTR 단백질의 교정을 평가할 수 있었다. 이러한 모델은 약물 개발7의 후기 단계에서 실패한 약물문제의 특성화를 가능하게 하는 것 외에도 약물 효능의7예측 가능성을 향상시키는 것으로 나타났다.
그러나 폐에서는 점막 상피가 공기에 노출됩니다. 더욱이, 기도에 존재하는 면역 세포는 조직 대식세포같이, 흡입한 병원체 또는 입자에 대하여 필수적인 역할을합니다 8. 대식세포는 기관지 루멘에 도달하고 감염을 싸우기 위하여 다른 세포 층을 통해 이동합니다. 더욱이, 흡입된 약은 또한 폐 공기-혈액 장벽9의추가 비세포 원소로서 점액의 존재에 대처해야 한다. 실제로 생체 외 모델의 복잡한 3차원(3D)이 개발되어 생체 내 관련성을 높이는 것을 목표로 하고 있다. 공동 배양 시스템은 약물 발견을 위한 체외 시스템의 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다. 이러한 복잡성은 대식세포이동(10),호중구(11)에의한 항균 펩티드의 방출, 감염9에서점액의 역할, 및 과도한손상(12)에대한 상피 세포 반응에 대한 연구에서 해결되었다. 그러나, CF의 유전돌연변이를 특징으로 하는 신뢰할 수 있는 CF-감염 체외 모델, 공기에 노출되는 (생리학적 상태 증가), 면역 세포를 통합하는 것은 여전히 부족하다.
이 격차를 해소하기 위해 감염된 기도의 안정적인 인간 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 P. aeruginosa에 감염되고 확산 및 면역 학적 장벽을 모두 나타내는 인간 CF 기관지 상피 세포 및 대식세포의 구성이다. 합리적으로 높은 처리량에서 항 감염제를 테스트하는 것을 목표로, 이 공동 배양은 두 개의 인간 세포주를 사용하여 웰 플레이트 인서트의 투과성 필터 멤브레인에 설립되었습니다: CFBE41o- 및 THP-1 단백세포 유래 대식세포. 더욱이, 결국 에어로졸화항감염제(13)의증착을 연구하기 위해, 이 모델은 액체 가루 조건(LCC)이 아닌 공기-액체 인터페이스(ALI)에 확립되었다.
우리가 여기에서 보고하는 바와 같이, 이 모형은 약 발달을 위한 필수적인 매개 변수인 항생 처리에 세균성 생존뿐 아니라 세포 세포 독성, 상피 장벽 무결성, 대식세포 변환 및 선동적인 반응에 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜은 폐기도의 흡입 치료를 위한 두 가지 관련 세포 유형을 결합합니다: 대식세포및 CF 기관지 상피. 이 세포는 투과성 지지 인서트의 반대쪽에 시드되어 공기에 세포 노출을 허용합니다(공기-액체 인터페이스(ALI) 조건이라고 합니다. 숙주 세포의 이러한 공동 배양은 이후에 P. aeruginosa에감염된다. 두 숙주 세포주 모두 인간 기원입니다: 상피 세포는 CF 채널(CFBE41o-)에 돌연변이를 가진 낭포성-섬유증 기관지 상피를 나타내며, THP-114 세포는 잘 특징적인 대식세포와 같은 세포주이다. 동천상피층은 대식세포와 같은 세포가 반대 구획에 추가되기 전에 웰 플레이트 인서츠의 상부에 형성될 수 있게 된다. ALI에서 공동 문화가 확립되면, 시스템은 apical 측에 P. aeruginosa와 접종된다. 이 감염된 공동 배양 시스템은 항생제, 예를 들어 토브라마이신의 효능을 평가하기 위해 사용됩니다. 다음 종점은 분석된다: 상피 방벽 무결성 경피성 전기 저항 (TEER), 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 의한 세포 세포 및 세포 박테리아 상호 작용의 시각화), 식민지 형성 단위 (CFU), 숙주 세포 생존 (세포 독성) 및 사이토카인 방출의 계산에 의한 세균 생존.
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Protocol
1. 투과성 지원 인서치에서 세포의 성장과 분화
- CFBE41o 재배- 10% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 최소 필수 배지(MEM)의 13mL을 함유한 T75 플라스크에서, 1% 비필수 아미노산과 600 mg/L 포도당에서 37°C에서 5%CO2 분위기를 이룬다. 2-3일마다 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
- 플라스크에서 70% 합류한 후 3mL의 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 15분 동안 37°C로 분리한다. 7mL의 신선한 MEM을 추가하고 실온(RT)에서 4분 동안 300 x g의 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 MEM의 새로운 10mL를 추가하면서 덩어리를 부드럽게 위아래로 피펫으로 막습니다.
- 자동 세포 카운터 또는 혈혈계 챔버로 세포를 계산합니다. 투과성 지지대가 있는 12웰 플레이트에서 2 x 105 셀/웰의 밀도를 가진 종자 세포(3 μm의 모공 크기, 재료 표참조).
참고: 자동화된 셀 카운터는 셀수, 크기 분포 및 셀의 생존 가능성을 결정합니다(재료 표참조). 0.4 μm의 모공 크기의 투과성 지지대가 여기에서 사용될 수 있습니다. 그러나, 대식세포는, 이 조건에서, apical 측에 직접 추가되어야 하고, 그들의 세포간 이동은 이 경우에 평가되지 않을 것입니다. - 액체 액체 상태(LLC)의 종자 세포는 포과성 지지체의 정압 측에 셀 서스펜션의 500 μL과 바소포측에 있는 신선한 배지의 1.5mL를 첨가함으로써. 그런 다음 세포를 5% CO2미만의 37°C에서 72h로 배양합니다.
- 파종 후 3일째에 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 이동하려면 먼저 바소포측에서 배지를 제거한 다음, 정물측에서 제거한다. 바소쪽 측에 신선한 MEM 500 μL을 추가하고 세포가 컨물수 단일 층을 형성 할 때까지 매 2 일마다 배지를 변경합니다.
참고 : 이 프로토콜에 사용되는 조건의 경우 CFBE41o- 세포는 일반적으로 배양에서 3-7 일 후에 수렴됩니다. - 7일째 CFBE41o-정면에서 500 μL 세포- 배지를 가진 세포와 1시간 동안 바편측에 1.5mL, 5% CO2미만의 37°C에서 상피 장벽 특성을 평가한다.
- STX2 젓가락 전극과 상피 볼트-옴미터를 통해 경피성 전기 저항(TEER)을 통해 장벽 특성을 측정합니다. 7 일 후이것은 300 Ω × cm² 보다 높습니다.
참고 : 결국, 일부 멤브레인 삽입에서 세포는 낮은 TEER를 가지고 있습니다. 따라서 TEER & lt, 300 Ω×cm²를 사용한 투과성 인서트는 사용되지 않습니다.
- THP-1 세포를 재배하기 위해, 13mL의 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 배지를 사용하여 T75 플라스크에서 성장하여 10 % FCS로 보충하고 5 % CO2미만의 37 ° C에서 배양하십시오. 새로운 T75 플라스크에서 2 x 106 세포/mL 세포를 시드하여 매 2일마다 셀을 분할합니다.
참고: 비분화 THP-1 세포는 현탁액의 단핵구로 재배됩니다.- THP-1 세포를 다음과 같이 분화한다. T75의 원심 분리기 내용은 300 x g에서 4 분 동안. 상체를 버리고, 펠릿을 신선한 매체로 재보설하고, 새로운 T75에 넣습니다. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 37 °C에서 48 h및 5 % CO2 대기15에대한 RPMI에서 세포를 인큐베이터.
참고: PMA와의 분화 후 세포는 더 이상 증식하지 않고 플라스크에 부착하지 않습니다. - THP-1 대식세포와 같은 세포를 분리하려면 37°C에서 인산염 완충식식염수(PBS)로 한 번 세척하고 실온에서 0.5mM EDTA를 함유하는 세포 분리 용액 3mL(예: accutase)로 배양한다.
- 반전된 현미경으로 세포를 검사하여 세포 분리를 찾습니다. RT에서 4분 동안 300 x g에 신선한 중간 및 원심분리기 7mL을 추가합니다.
참고: 대식세포는 트립신-EDTA, 37°C로 20분 동안 분리할 수도 있습니다. 그러나 트립신은 선택한 셀 분리 용액보다 대식세포에 가혹합니다(재료표참조). - 상체를 제거한 후, THP-1 배지의 3mL에서 대식세포 세포를 15mL 원심관으로 재중단한 후, 1.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 계산한다. 공동 배양을 설정하기 전에 5 % CO2 에서 37 °C에서 최대 1 시간 동안 배양하십시오.
참고: 현탁액내의 THP-1 세포는 생존성 염료로 염색되어 공동 배양을 더 이미지화할 수 있다. 이 단계에서는 아래 절차(1.2.5 단계)를 사용합니다. - 세포 생존 성 염료의 10 μM을 가진 얼룩 대식세포 (세포 내 에스테라아에 의한 아세테이트 모이티의 변환에 기초하여, 재료의 표참조) 있는 세포 생존성 염료의 3 μL이 세포 현탁액에 적용됩니다. 37°C에서 20분 동안 세포를 배양한 다음, 5% CO2로세포를 배양한 다음 PBS 37°C로 1x를 세척하여 염료를 제거합니다.
참고: 실온(RT)에서 4분 동안 300 x g에서 염료를 제거하는 세포를 원심분리합니다.
- THP-1 세포를 다음과 같이 분화한다. T75의 원심 분리기 내용은 300 x g에서 4 분 동안. 상체를 버리고, 펠릿을 신선한 매체로 재보설하고, 새로운 T75에 넣습니다. 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 37 °C에서 48 h및 5 % CO2 대기15에대한 RPMI에서 세포를 인큐베이터.
2. 투과성 지원에 대한 상피 대식세포 공동배양 수립
- CFBE41o사용 - TEER ≥ 300 Ω × cm² (단계 1.1.6.)와 ALI에서 단층. 하부 챔버에서 배지를 제거하고 멸균 유리 페트리 접시 내부의 지지체(50mm x 200mm)를 조심스럽게 반전시키고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 멤브레인 모공을 통해 자란 세포를 제거한다.
참고: 3 μm의 모공 크기로 인해 상피 세포는 기공을 통해 바소포측쪽으로 자라는 경향이 있습니다. 따라서 이 쪽의 대식대를 추가하기 전에 제거해야합니다. CFBE41o- 폐 상피 세포는이 단계에서 얼룩질 수 있습니다. 단계 1.2.5의 절차를 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포 현탁액 대신, MEM의 염료 용액은 투과성 지지체에 부착된 셀에(500 μL apical 측만)가 적용됩니다. - PMA 분화 THP-1 대식세포의 세포 현탁액으로부터 2 x 105 셀/웰(RPMI의 200μL)을 사용하고 세포를 반전 된 인서트의 바칼랄 측에 놓습니다.
- 페트리 요리를 조심스럽게 닫고 5 % CO2에서 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 인서트를 12웰 마이크로플레이트에 다시 넣고 ALI 조건을 유지하기 위해 투과성 인서트의 바소쪽 측에 500 μL의 MEM 배지를 추가합니다. 세포는 지금 감염을 위한 준비가 되었습니다.
3. P. 아루기노사에 의한 감염
참고: 여기에서 다음 단계는 모두 생물 안전 수준 2(BSL2) 실험실에서 수행해야 합니다.
- P. aeruginosa PAO1-GFP의 단일 식민지와 에렌 마이어 플라스크 (50 mL)에서 300 μg / mL 암피실린으로 보충 된 리소제니 국물의 접종 15 mL (LB).
참고: P. aeruginosa의 그밖 긴장은 또한 그들의 자신의 재배 프로토콜에 따라, PAO1 야생 모형, PA14, 또는 임상 긴장과 같은 여기에서 사용될 수 있었습니다. - 37°C에서 18시간 동안 박테리아를 배양하고 180rpm에서 흔들어 보배합니다.
- 18h 이후의 내용을 50mL 원물 튜브로 옮기고 원심분리기는 3850 x g에서 5분 동안 전송합니다. 상체를 버리고 37 °C에서 멸균 PBS 10mL를 추가하십시오.
- 파장 600 nm에서 분광계에 대한 광학 밀도를 측정하고 세포 배양 배지를 사용하여 박테리아의 농도를 2 x 105 CFU/mL의 최종 농도로 조절한다. 이것은 상피 세포 당 1개의 박테리아의 감염 (MOI)의 복합성에 해당합니다.
- 1시간 동안 5%CO2 하에서 37°C에서 투과성 지지체(step 2.4.)의 정립측에 세균현탁액 100μL을 첨가하여 박테리아가 세포에 부착되도록 한다. 그런 다음 파이펫으로 정액액체를 조심스럽게 제거하여 ALI 조건을 복원합니다. 일부 샘플을 대조군으로 감염되지 않도록 유지합니다.
참고: 이 단계에서 부착된 박테리아는 초기 박테리아 접종을 결정하기 위해 LB 한천(단계 5.4/5.5 참조)에서 도금되어야 합니다. - 세포내 세균성 유착 후 관심 있는 약물을 배양한다. 치료 실험의 경우, 세포 배지에서 희석된 약물 용액의 500 μL을 추가(이 프로토콜에서 토브라마이신 6 μg/mL사용)을 apical 측에 추가한다. 바소포측에 약물없이 세포 배지 1,500 μL을 추가합니다.
참고: 약물을 용액으로 주입하는 대신 에어로졸 증착에도 적용할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, ALI의 세포는 세포 배지의 500 μL을 가진 바소포측으로부터 공급된다. 약물은 다음 먼저 분수 및 적절한 장치에 의해 정류 구획에 입금 할 수 있습니다 (여기에 설명되지 않음). 감염된 처리된 견본은 섹션 4-7에 설명된 끝점을 검사할 수 있습니다. 이 단계에서 투과성 지지체는 이미지(섹션 4)를 만들거나 박테리아 성장과 포유류 세포 생존가능성의 결과를 얻기 위해 사용될 수 있다(섹션 5-7).
4. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 대한 샘플 준비
- 공동 배양, 감염 및 약물 치료가 수립된 후, 모든 배지를 정문 및 바소측으로부터 제거한다. PBS로 1x를 37°C로 세척한 다음 3% 파라포름데히드(PFA)로 세포를 RT(바소포탈의 경우 apical/600 μL에서 300 μL)로 고정합니다. 세포 핵은 실온에서 30 분 동안 DAPI-PBS의 5 μg /mL로 염색됩니다.
주의: PFA는 위험합니다. - 메스를 사용하여 멤브레인을 자르고 장착 매체를 사용하여 두 개의 12mm 현미경 커버 슬라이드 사이에 배치합니다(재료 표참조). 4 °C에서 보관하기 전에 30 분 동안 유동 벤치 내부를 건조시키십시오. 공초점 스캐닝 현미경 검사로 시각화합니다.
참고: 공동 배양 후 및 장착 전에, 단단한 접합 면역 스테인닝을 수행 할 수 있습니다. 이를 위해, 세포는 30분 동안 파라포름알데히드3%로 고정되고, PBS로 다시 세척하고, PBS에서 사포닌 0.05%/BSA 1%로 투과화된다. 이 프로토콜에서, 조눌라 폐백 단백질(ZO-1)은 마우스 항인간 ZO-1 항체(1:400, 하룻밤 사이에 4°C에서 배양)를 통해 검출되었다. 샘플은 염소 항마우스 IgG 항체 알렉사 플루어 633 (빨간색 1:2000)와 RT에서 2 시간 동안 배양되었다. 핵은 DAPI (1 μg/mL)로 염색하고 커버립에 장착 매체로 장착되었습니다. - 저장된 멤브레인을 이미징하기 위해 공초점 현미경을 사용합니다. 검출을 위해 405, 488, 505 또는 633 nm에서 25x 또는 63x 수분 침수 목표 및 레이저를 선택합니다. 이미지에는 1024 x 1024 픽셀 해상도가 있어야 합니다.
참고 : 레이저는 사용되는 얼룩에 따라 선택됩니다. - 어포형 및 단면 뷰를 획득하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 3차원 모델을 구성하기 위해 제타 스택 모드(10-15 스택)를 사용합니다.
5. 식민지 형성 단위 (CFU)를 통한 세균 증식 측정
- 비 부착 된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 apical 및 바식측 배지 (박테리아 함유)를 수집합니다. 정압및 바소포측에서 500 μL을 수집하고 풀을 구부리라.
참고: 이 현탁액을 직접 사용하여 박테리아(5.4단계) 또는 원심분리기를 10분 동안 21,250 x g에서 계산하여 슈퍼나티(섹션 6)에서 젖산 탈수소효소(LDH)를 평가하고/또는 PBS에서 다시 일시 중단하여 세포외 균(단계 5.4)을 계산합니다. - 투과성 지지체의 각 구획에 멸균 분멸 된 차가운 물의 500 μL을 추가하여 세포에 부착 및 / 또는 내측화 된 박테리아의 생존을 평가합니다. 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
참고: 샘플은 LB 한천(5.4단계 참조) 또는 나중에 도금할 경우 -20°C에서 냉동(전체 삽입 플레이트 참조)에 도금될 수 있습니다. - 응신/내수화된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 샘플을 37°C에서 10분 동안 해동하십시오(냉동된 경우). 각 웰에 대한 파이펫 팁을 사용하여 멤브레인 표면과 파이펫을 위아래로 긁어 부착된 모든 콘텐츠를 제거합니다.
참고: 이 단계에서, 모든 상피 세포는 용해되고 부착/내부화 된 박테리아는 도금될 현탁액으로 유효합니다. - 두 분수에서 세균 현탁액으로, PBS에서 Tween-80 0.05 %를 사용하여 1/10 직렬 희석을 수행하고 LB 천판에 박테리아를 플레이트.
참고: 1에서 10 사이 의 희석을 권장 합니다. 박테리아는 단일 식민지가 처음 확인된 가장 높은 희석에서 계산되어야 합니다. - 16-72h의 30°C에서 한천 판을 배양하여 식민지를 계산하고 그에 따라 CFU를 계산합니다.
참고: 플레이트 인큐베이션 시 30°C의 온도는 처리된 시료와 콜로니의 지연된 성장을 관찰하는 데 필수적입니다.
6. 젖산 탈수소 효소 분석기를 통한 세포 독성 평가
- LDH분석16에대한 세포 생존 가능성에 대한 박테리아(5.1단계로부터)를 함유하는 감염된 세포의 상체를 사용한다. 상심분리기는 박테리아와 결국 나머지 세포를 펠릿하기 위해 10 분 동안 21,250 x g에서 상피합니다. 박테리아가 없는 상체를 사용하여 LDH 방출을 측정합니다.
참고: 이 분석으로 LDH를 측정하기 전에 상체를 동결해서는 안 됩니다. - 상체의 100 μL을 96웰 플레이트로 옮기고 LDH 분석 용액의 100 μL을 추가합니다(재료 표참조). 어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 배양 한 다음 492 nm에서 흡광도를 읽습니다.
7. 인간 사이토카인의 방출 평가
- 사이토카인 정량화의 경우 ELISA 또는 세포 측정 비드 어레이 면역분석17(재료 표 참조)을 사용하십시오. 이를 위해 원심분리기 는 5.1 단계에서 21,250 x g에서 10분 동안 즉시 측정하거나 분석전까지 최대 15일 동안 -80°C를 저장합니다.
- 상용 ELISA 키트로 수퍼네이츠를 평가합니다.
참고: 이 절차는 포획 항체를 가진 플레이트의 코팅, 시료(100 μL) 및 사이토카인 표준의 추가, 인큐베이션, 세척 및 검출 항체의 첨가를 포함하는 제조 지침을 따르며 사이토카인의 존재에 대한 색측정을 제공한다. 또는, 유동 세포측정은 시판되는 키트를 통해 사이토카인을 측정하는 데 사용될 수 있다(재료표참조).
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Representative Results
도 1A는 투과성 지지의 정맥 및 바소포측에서 24시간 동안 모두 성장한 후 인간 기관지 상피 세포 및 대식세포의 결과공동배양체의 형태를 각각 나타낸다. 상피 장벽 무결성은 단단한 접합 단백질 ZO-1(도 1B)에대한 면역 염색에 의해 더 높은 TEER (834 Ω × cm2)및 CLSM에 의해 표시됩니다. 감염되지 않은 CFBE41o의 장벽 무결성 측면에서 관찰된 동일한결과- 단일 문화권은 감염되지 않은 상피 대식세포 공동 배양에서 볼 수 있었다.
세균 감염을 모델링하기 위하여는, P. aeruginosa는 CFBE41o- 세포에 1:1의 감염 (MOI)의 복합성에서 접종되었다. 감염 후 6시간(도2A),대식세포는 공동배시의 정면에서 관찰되었다. 감염 후 TEER는 834에서 250 Ω×cm2로떨어졌으며, ZO-1염색(도 2B)에의해 도2로 시각화된 손상된 상피 장벽을 나타낸다.
도 3은 투과성 막 모공 및 박테리아 섭취량을 통해 대식세포 전이를 나타내며, APICAL 측의 THP-1 세포에 의한 것이다. 샘플은 독립적인 실험으로부터 1, 3 및 6h 후 배양으로 고정되었다. THP-1 단문화(도3A-C)에서대식세포 이동은 1시간 일찍 관찰되었으며, 공동배양(도3D-F)에서는3h 감염 후 본 적이 있었다. THP-1의 박테리아 섭취량은 단일 문화와 공동 배양 모두에서 감염3 시간 후에 관찰되었습니다. CFBE41o-에 의한 세균성 섭취량은 보이지 않았다. 단면 뷰는 투과성 멤브레인 지지체가 정문 및 바식측 구획의 분리로서 중간에 배치되었다.
도 4는 6h(도 4A, B)또는 20h(도 4C, D)에대한 토브라마이신또는 없이 처리된 감염된 공동 배양(CFBE41o- + THP-1)의 공초점 스캐닝 레이저 현미경 사진을 나타낸다. 치료 없이 상피 세포와 대식세포는 20h 감염 후사망했다(도 4C). 그러나, 토브라마이신 치료에 따라, 숙주 세포는 20 시간 후에 보존됩니다; 여전히, 일부 박테리아는 문화권에서 관찰 될 수 있습니다. 현미경사진(도 4B)에서6h의 치료 후 볼 수 있음에도 불구하고, 박테리아는 도 4E에서CFU 소에서 관찰된 바와 같이 증식하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 20시간 치료 후, 박테리아는 CFU분석(도 4F)에서콜로니에 의해 보인 바와 같이 증식 능력을 회복시켰다. 차가운 물과 긁는 세포 리시스 프로토콜은 세포에 부착되고 아마도 내면화 된 박테리아를 방출 할 수 있습니다. 동시에, 세포는 파괴된다(보충 도면 S1A, B). 상피 세포 (300 x g)또는 박테리아 (21,250 x g)에대해이 논문에서 사용되는 원심 분리 단계는 둘 다의 생존을 방해하지 않았다(보충 피규어 S1C, D). 모든 CFU 소는 -20°C에서 샘플을 동결하고 해동 및 도금하여 수행하였다. 이 절차는 신선한 샘플(보충 도 S1E)에비해 박테리아의 수를 2 로그에 의해 감소. 이 절차는 다른 시점에서 모든 실험 군(치료 및 치료되지 않은)에 대해 동시에 수행되기 때문에, 이러한 감소는 최종결과(보충 도 S1E)에통합된다. 더욱이, 여기에 사용되는 토브라마이신의 농도는 감염되지 않은세포(보충 도도 S2A)에대한 독성이 없었으며 또한 더 이상 염증 반응(보충도도 S2B)이없었다. 그러나, P. aeruginosa를죽이는 최소 억제 농도의 범위 내에 있었다.
도 5는 전피전기저항(TEER) 및 세포 생존가능성을 나타낸다. 그림 5A-B는 단일 문화와 공동 문화의 TEER를 보여줍니다. CFBE41o-THP-1을 가진 세포는 단배(red bar)에 비해 상피 장벽 무결성에 어떤 변화도 유도하지 않았다.- 감염 시 TEER 값이 떨어졌습니다(녹색 막대). 감염 의 1 h 후, 일부 샘플은 항생제 토브라마이신 (블루 바),에 대한 6 또는 20 시간 치료되었다. 치료는 상피 장벽 무결성을 보존, 높은 TEER에 의해 관찰. 도 5C는 6h 이후 감염 및 토브라마이신 치료에 따른 세포 독성의 표시로서 LDH 방출의 백분율을 나타낸다. 공동 배양 자체는 감염된 세포(약 20%)에 대해 동일했던 LDH의 방출을 유도하였다. 감염의 20 시간 후에, LDH의 아무 신호도 검출될 수 없었습니다. 장기 감염에 대한 LDH 신뢰성을 증명하기 위해 PAO1-GFP는 각각의 감염되지 않은 대조군(보충도 S2C)에비해 LDH 1 U/mL의 유무에 관계없이 중간에서 배양되었습니다. LDH 신호는 P. aeruginosa와장기간 된 잠복 (20 시간) 후에 분실되었습니다, LDH가 감염된 배양에 있는 짧은 잠복기에서 만 안정하다는 것을 나타내는.
도 6은 ELISA를 통해 검출된 염증성 사이토카인의 운동을 나타낸다. CFBE41o 및 THP-1 세포의 감염된 공동 배양의 장점은 프로 염증성 사이토카인의 더 높은 분비물로관찰되었다. 일부 프로 염증 성 사이토카인의 분비액은 감염된 공동 배양(도6C)에서유사한(IL-6) 또는 그 이상(IL-8, TNF-α, IL-1β)이 해당 단일배양(그림6A-B)보다유사하였다. 예기치 않게, THP-1 단배배(도 6B)에서일부 사이토카인은 감염된 샘플 (Il-8, TNFα, IL-1β)에서 다운 규제된다.
도 7은 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 측정된 토브라마이신을 통한 감염 및 치료에 따른 모노 및 공동 배양에서 사이토카인의 방출을 입증한다. 프로 염증 성 사이토카인 IL-8(도 7A)과항염증성 사이토카인 IL-10(도7F)의분비량은 단배에 비해 상피 세포 및 대식세포의 공동 배양에서 더 높았다. 그러나, 다른 모든 사이토카인(IL-1 α, IL-12p40, IL-23 및 GM-CSF)(그림7B-E)의경우, 사이토카인 분비의 수준은 각각의 단일배양에서 높은 수준이 아니었다.
그림 1: 감염되지 않은 상피 대식세포 공동 배양의 단면 및 정계 보기. (A)감염되지 않은 24h 상피 대식세포 공동배양의 교차 보기. CFBE41o- 스테인드 레드, THP-1 대식세포는 노란색및 핵으로 파랑(DAPI). (b)ZO-1(red)을 위해 감염되지 않은 CFBE41o-단층 면역 염색의 정압적 보기. DAPI: 핵. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 감염된 상피 대식세포 공동 배양의 단면 및 정계 보기. (A) P. aeruginosa PAO1-GFP와 6h 후 감염 (hpi)에서 상피 대식체 공동 배양의 교차 보기 및(B)정평보기. CFBE41o- 녹색으로 빨간색, THP-1 대식세포, 파란색 (DAPI) 및 녹색P. aeruginosa PAO1-GFP의 핵에 얼룩. (B)6h 감염 CFBE41o-단층의 어포형 뷰. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 3D 모델의 단면에 의해 시각화된 대식세포 환원 및 박테리아 섭취의 역학. THP-1대식세포(A-C)또는 공동배양(D-F)의 단일배양식에서 PAO1-GFP 감염 역학.D–F THP-1 대식세포는 녹색(GFP)의 상피 세포의 적색, 상피 세포의 핵(DAPI), 및 P. 아루기노사에 염색된다. 각 수치는 정문 및 바소측으로 나뉘며, 그 사이의 공간은 CFBE41o-컨물수 층(D-F)에 의해 비어 있거나 점유되는 멤브레인으로 간주된다.- 수치에 삽입은 다른 시간에 대식세포에 의한 박테리아 섭취를 보여줍니다 (A-F). 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 토브라마이신 처리 공동 컬터 e. (A-D) 공초점 현미경 현미경 의 공동 배양에 있는 PAO1-GFP 생존의 특성화및 치료 없이 공동 배양. (A)감염 6시간 후 치료되지 않은 공동배양. (B)토브라마이신 6μg/mL(Tob)로 처리된 감염된 공동배양은 6h.(C)처리되지 않은 공동배양 20h 감염,(D)토브라마이신 6 μg/mL로 처리된 감염된 공동배양문화20h. 핵은 DAPI (파란색), 대식세포 (빨간색) 및 P. aeruginosa GFP (녹색)로 염색. (E)6 후 부착/내재화 박테리아의 콜로니 형성 단위(CFU)와(F)20h 토브라마이신 6 μg/mL 치료. 빈 멤브레인 삽입은 PAO1-GFP를 성장시키기 위해 무생물 기판으로 사용되었습니다. 투키의 다중 비교 테스트(#no colonies)를 사용한 양방향 ANOVA가 사용되었습니다. p < 0.001; p < 0.0001; ns: 중요하지 않습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타내고, n = 9-27은 3-9 개의 독립적 인 실험을 복제합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 모노 및 공동 문화의 생존 가능성에 대한 장벽 무결성 및 평가. 다음과 같은 공동 배양 조건은 평가되었다: 감염되지 않은 (회색 막대), 감염 (녹색 막대), 또는 감염 및 토브라마이신으로 치료 (블루 바). (A)6h 후 의 전피 전기 저항 및(B)20 h의 단일 배양 (CFBE41o- 및 THP-1) 및 공동 배양. (C)LDH 방출 6h 감염 후 LDH를 통해 측정된 모노 및 공동 배양의 세포독성. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 양방향 ANOVA가 사용되었습니다. *p&05; p < 0.0001; ns: 중요하지 않습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. n = 9세 개의 독립적인 실험을 복제합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ELISA를 통해 평가된 감염되지 않고 감염된 모노 및 공동 배양 슈퍼나티의 세포카인 방출의 역학. ELISA는 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. (A)CFBE41o-,(B)THP-1,(C)공동 배양 방출 IL-8, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. n = 6 복제 2 개의 독립적 인 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 6h 감염 후: 6h 감염에 대한 토브라마이신 6 μg/mL의 유무에 관계없이 FACS를 통해 측정된 사이토카인 패널의 상수 결과. 6h 후 의 모노 및 공동 배양의 초량은 각각의 사이토카인IL-8(A),IL-1α(B),IL12p40(C),IL-23(D),GM-CSF(E)및 IL-10(F)을분석하는 데 사용되었다. 오류 표시줄은 표준 편차를 나타내고, n = 9복제는 3개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 S1: 프로토콜의 중요한 단계에 대한 실험 제어. (A, B) 2x105 세포의 밀도로 2일 동안 재배된 24웰 플레이트의 CFBE41o-세포의 현미경 사진. (A)CFBE41o-PBS에서 30분 동안,(B)피펫으로 긁힌 후 30분 후에 수처리 된 세포를 한다. (C)원심분리 후 포유류 세포의 생존가능성. CFBE41o-세포는 1.1.1 및 1.2 단계에서 설명된 바와 같이 T75 세포 배양 플라스크로부터 제거되었다. 결과 세포 현탁액의 100 μL은 10mL 이소토닉 용액으로 분석되었다. 자동화된 셀 카운터는 단일 셀의 생존가능성을 평가하는 데 사용되었습니다. 이어서, 각각의 세포 현탁액은 300 x g에서 4분 동안 원심분리되었고, 다시 일시 중단되고 다시 계산되었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타내고, n = 2개의 개별 실험의 6가지 플라스크를 나타냅니다. (D)원심분리 후 PAO1-GFP의 생존 가능성. PAO1-GFP 박테리아는 세포 배지에서 OD = 0.01로 희석하였다. CFU는 30°C에서 하룻밤 동안 배양된 10배 희석행 및 LB 플레이트를 통해 평가하였다. 각각의 플라스틱 튜브는 10분 동안 21,250 x g에서 원심분리되었고 중간 크기로 다시 중단되었습니다. CFU는 그에 따라 다시 평가되었다. 두 꼬리 학생의 t-테스트, * p < 0.033. 오류 표시줄은 표준 편차를 나타내며, n = 2개의 실험 중 6개가 표시됩니다. (E)동결 후 박테리아의 생존 가능성. PAO1-GFP 박테리아는 (D) 및 CFU에서와 같이 제조되었고, 그 후 플라스틱 튜브는 -20°C에서 하루 동안 동결되고 CFU를 다시 평가하기 위해 해동하였다. 두 꼬리 학생의 t-테스트, *** p < 0.001. 오류 막대는 표준 편차를 나타내고, n = 두 가지 실험 중 6개를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S2: LDH 행동과 토브라마이신의 영향을 평가하기 위한 실험 제어. (A)6 μg/mL 토브라마이신으로 인큐베이션 20시간 후 세포 독성을 평가하는 대조실험. 모노 및 공동 배양은 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행되었지만, 세포는 24웰 플레이트및 THP-1 세포에서 2일 동안 재배되었다. 6 μg/mL 토브라마이신 또는 컨트롤을 가진 세포는 20 시간 동안 배양되었다. 단방향 ANOVA, 투키의 여러 비교 테스트, *** p & 0.001. 오류 표시줄은 표준 편차, n = 2개의 실험 중 6개(CFBE41o-), n = 3의 실험(THP-1 및 공동 배양)을 나타낸다. (B)토브라마이신의 모노 및 공동 배양의 초중생제의 제어-ELISA. 세포 배양은 (A)에 따라 수행되어 모든 조건에 대한 대조군과 비교하여 사이토카인 방출이 없음을 나타내지 않았다. ELISA는 7.1 및 7.2, 10 μg/mL(LPS)을 대조군으로 첨가하였고, THP-1을 포함하는 LPS 처리 컨트롤에 대한 IL-8 방출은 검출 가능한 것보다 높았다. 양방향 ANOVA, 투키의 여러 비교 테스트, ns p > 0.12; * p & 0.033; p < 0.001. 오류 막대는 표준 편차를 나타내며, n = 두 실험 중 6개, n = 3개의 실험(LPS 컨트롤)을 나타냅니다. (C)과도한 PAO1-GFP 증식으로 인한 LDH 분해. LDH는 MEM 배지에 1 U/mL의 농도로 첨가되었다. LDH 배지 또는 제어 배지는 세포를 OD = 0.01(1 x 108 CFU/mL에 해당)으로 희석한 다음 20시간 동안 배양한 다음 6항에 설명된 바와 같이 LDH 분석이 수행되었다. 단방향 ANOVA, 투키의 여러 비교 테스트, ns p > 0.12; p < 0.001. 오류 표시줄은 표준 편차를 나타내며, 3개의 개별 실험중 n =8-9를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 논문은 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및 인간 단핵세포세포주 THP-1에 의해 구성된 감염된 기도의 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 약물 효능 및 숙주 반응을 동시에 테스트할 때 중요한 매개 변수인 상피 장벽 무결성, 대식세포 변형, 박테리아 생존 및 염증의 평가를 허용합니다. 모델의 참신은 급성 세균 감염(즉, Aeruginosa)을가진 상피 세포(즉, 인간 CF 세포주 및 대식세포)의 혼입 내에 있다. 상피 세포에 있는 급성 감염은 항생제 (즉, 토브라마이신)에 의해 통제되는 것으로 입증됩니다. 인간 CF 세포주 사용 외에도 전체 모델은 ALI 조건에서 설정되며, 이는 CF의 생리적 조건에 상당히 가깝습니다. 낭포성 섬유증 막 전도도 조절기(CFTR)의 돌연변이는 폐내 상피 유체 수송의 이뇨 조절과 직접적으로 관련이 있다. 더욱이, ΔF508과 같은 CF 유전자의 돌연변이는 P. aeruginosa4를가진 감염시 염증 및 가혹한 폐 손상과 더불어 두꺼운 점액귀귀착됩니다. 기능 장애 CFTR에 기인한 이 병리학적인 표현은 CF 폐 질환의 병인과 관련된 중요한 세포 메커니즘으로서 잠재적으로 자가 식증 장애를포함한다(18). 그러나, CFBE41o는-이 세포주의 한계인 점액을 비밀시키지 못한다. 점액의 역할을 보다 구체적으로 연구하려는 경우, 프로토콜은 다른 기관지 세포주(예를 들어, Calu-3)를 사용하여 적응될 수 있다.
이 프로토콜을 설정하는 한 가지 중요한 단계는 상피 및 면역 세포의 조합과 ALI에서 P. aeruginosa와의 후속 감염입니다. CFBE41o의 감염- 시험관내 P. aeruginosa에 의한 감염은 이미 설명되어 왔으며, 주로 배양 매체에서 아르기닌으로 보충된 유량 세포 챔버를 사용하여 상피 세포 생존을 개선하고 생물막 형성을 지원한다19. 또한, 더 높은 시료 처리량을 위한 투과성 웰 플레이트 인서트에 ALI에서 재배될 수 있는 인간 세포만을 사용하는 새로운 모델을 위한 본 프로토콜. THP-1 분화 된 대식세포가 기증자로부터 재현 가능한 1 차 세포를 얻는 데 의존하는 대신 인간 불멸세포주로서 포함되는 것은 우리의 모델의 또 다른 이점입니다. 이러한 대식세포는 투과성 멤브레인 지지의 바소포측에 첨가함으로써 대식세포가 튀어나와 결국 필터로 자란 상피 장벽의 정압적인 측면으로 이동하는 것을 관찰하였다. 이 프로토콜의 변형은 Kletting et al에의해 설명된 바와 같이 상피 세포의 상단에 정맥 측에 직접 대식세포의 첨가될 수 있다. 14.비인간 면역 및 폐 세포의 공동 배양은 이미 이전에 설명되어 있다. 딩 외. 10 개의 마우스 루이스 폐 암종 세포를 투과성 인서식에 사용하는 것은 바칼라측의 대식세포와 병용하여 지원되며 CF 환자에서 만성 감염의 또 다른 중요한 병원체인 S. 아우레우스에감염됩니다. 그러나, 이 연구에서는 낭포성 섬유증에 초점을 맞추거나 약물 효능의 평가를 위한 플랫폼으로서 공동 배양을 사용하는 것이 없었다. 우리의 프로토콜은 CF 폐에 있는 중요한 병원체 - 황색포도상구균 아우레우스, 진균 농양, 또는 Burkholderia cepacia와같은 그밖 세균성 감염에 적응될 수 있습니다.
또 다른 중요한 단계는 투과성 인서트를 거꾸로 뒤집어서 세포에 THP-1 대식세포를 첨가하는 것입니다(섹션 2). 이것은 감염의 측에 우물을 통해 대식세포 변환을 평가하기 위하여 중요합니다. z-스택 및 단면 보기를 가진 3D 모델으로부터의 후속 이미징 과정은 대식세포 내부를 관찰하고 박테리아 섭취를 검출하기 위해 수행될 수있다(도 3). 1 hpi에서, apical 측에 적용된 박테리아는 막을 통해 이동하는 동안, 대식세포 이동 및 섭취량은 3 hpi에서만 일어난다. 따라서 감염 1시간 후, 토브라마이신으로 치료를 시작하고 장기간(20시간) 숙주 세포와 박테리아 생존을 모두 해결할 수 있는 것이 적절하였다. 프로토콜 의 과정에서, 멸균을 유지하는 것은 각각 오염의 위험을 수행하는 단계의 무리로 인해 중요한 문제입니다. 그럼에도 불구하고 숙련 된 세포 배양 담당자는 적절한 준비 및 교육 후에이 프로토콜을 따를 수 있습니다. 셀 배지는 모든 중요한 단계 후에 오염을 정기적으로 확인해야 합니다.
다른 모델과 마찬가지로, 감염된 공동 배양에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 예를 들어, 대식 세포와 같은 세포의 통합. 여기서, 대식세포가 바소포측에 있는 것이 중요했습니다. 그러나, 이전에 성장된 상피층을 가진 인서트를 조작하면 공동 배양에 조기 손상및 장애를 제공할 수 있다. 비록, 투과성 지원 모델은 CF감염폐(20)의이전 공동 배양에서 관찰되지 않은 높은 처리량특성을제공했다. 이를 통해 THP-1을 대식세포 대체품으로 사용하는 한계를 평가해야 합니다. 이 세포주 널리 사용되는 동안,LPS(22)에 덜 반응하고 전체 활성화가 부족하고 전체 집단은 단핵구에서 대식세포와 같은세포(23)로분화되지 않는다. 또 다른 제한은 CF 감염 및 약물 전달에 있는 그밖 중요한 분대의 부족입니다. CFBE41o- 세포주는 cilia를 소유하지 않으며 일반적으로 ALI에서 세포 배양의 20-30 일 발생 점액을 생성하지 않습니다. 이것은 CFBE41o- 세포주, 우리는 단단한 상피 장벽이 형성된 7 일 후에 세포를 이용했습니다. 점막 클리어런스는 미생물24 또는 약물 입자9,,25에 대한 거주 조건을 변경하고 폐 증착을 평가하는 체외 모델에서 이를 고려해야합니다. 다른 세포에 의해 관찰되는 것과 는 달리, 조직 배양은 세포외 매트릭스 물질(fibronectin 또는 콜라겐 I와 같은)으로 코팅을 삽입하여 CFBE41o에 대해 유의한 차이를 나타내지않는다-예를 들어 TEER26에서. 따라서 투과성 필터는 이 프로토콜에서 세포외 매트릭스 재료로 코팅되지 않았습니다.
여기에 설명된 프로토콜을 통해, 6h 감염 후 모노 및 공동 배양은 향후 약물 검사에서 측정으로 사용될 충분한 사이토카인 방출을 제공한다. 공동 배양은 면역 반응을 모델링하는 세포 협력의 이점을 제공합니다. 염증을 감소시키는 토브라마이신의 효능은 치료 중에 모든 박테리아가 제거되지 않았기 때문에 예상되었다(도4E, F). 그럼에도 불구하고, CF 모델에서 토브라마이신에 대한 반응을 모델링하는 것은 매우 중요하며, 토브라마이신(고농도)은생물막(19,,27)에서도 P. aeruginosa 억제에 효과적일 수 있다. 이 프로토콜의 추가 사용에 대 한 한 가능성 치료에 항 염증 약물을 통합 하는. 염증 반응에 관한 전반적인 권고는 여전히 숙주 세포와 박테리아가 존재하는 짧은 기간 치료 (6 h)를 사용하는 것입니다. 이 시점 이후에 호스트 셀은 처리되지 않은 샘플에서 파괴됩니다. ELISA와 FACS 는 사이토카인의 방출을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 샘플이 -80°C에서 15일 이상 저장되는 경우, 예를 들어, 신선한 시료의 양수 제어(예를 들어 LPS로 자극된 세포)를 사용하여 사이토카인의 신뢰성을 확인하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 일부 수정이 가능합니다. 예를 들어, 현재 프로토콜은 분수약물의 적용으로 확대될 수 있다(단계 3.6). 이것은 경구 흡입을 통해 폐 약물 전달을 모델링하는 데 필요합니다. 리포소말 콜리신과 같은 수용성 약물의 분불화는 클리닉에서 일상적으로 사용되는 시판 가능한 장치에 의해 상대적으로 직선적입니다. 또한 에어로졸을 세포 배양 삽입에 예치하기 위해 여러 가지 상용 장치가 있습니다. 또한, 여기서 설명된 모델은 투과성 멤브레인 지지대를 기반으로 하므로, 또한 일부 현대 미세유체(예: "칩상에 폐") 장치에 채택될 수 있으며, 예를 들어 호흡의 영향과 관련 기계적 스트레칭 및 공기 흐름의 변화를 연구할 수 있다. 더욱이, 이 프로토콜은 해결될 과학적 질문에 따라 1차 세포에 의한 점액 또는 교체의 첨가에 의해 수정될 수 있다. 또 다른 흥미로운 다음 단계는 나노 의약품의 테스트, 특히 나노 기술이 새로운 항 감염제28,CF 교정기(29) 및 항생제 및 병리학자(30)의공동 납품의 개발에 진전을 이루고 있기 때문에. 전반적으로, 현재 프로토콜은 몇몇 호스트 관련 판독기와 더불어 복잡한 시스템에서 항생제 처리에 세균성 생존을 평가하는 데 유용하게 인식될 수 있습니다: 세포 세포 독성, 상피 장벽 무결성, 대식세포 변환 및 선동적인 반응. 이들은 약물 개발을위한 필수 매개 변수입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 연합의 HORIZON 2020 연구, 기술 개발 및 보조금 협정에 따른 데모 프로그램 642020-MSCA-ITN-2014, NABBA - 생물학적 장벽을 극복하고 심각한 질병을 치료하기 위한 첨단 나노의약품의 설계 및 개발에서 자금을 지원받았습니다. 우리는 아나 코스타 박사와 제니 Juntke 박사에게 공동 문화 개발에 큰 지원을 주셔서 감사합니다, 올가 하트비히, 과학 적인 삽화에 대한, 안자 Honecker, ELISA 분석, 페트라 쾨니히, 야나 웨스트 휴스와 박사 키아라 드 로시 세포 문화, 분석, 현미경 검사법에 대한 지원. 우리는 또한 우리의 원고를 교정 첼시 손 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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