Summary
Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.
Abstract
La investigación fDrug para el tratamiento de infecciones pulmonares está progresando hacia modelos predictivos in vitro de alta complejidad. La presencia multifacética de bacterias en los modelos pulmonares puede volver a adaptar la disposición epitelial, mientras que las células inmunitarias coordinan una respuesta inflamatoria contra las bacterias en el microambiente. Si bien los modelos in vivo han sido la opción de probar nuevos antiinfecciosos en el contexto de la fibrosis quística, todavía no imitan con precisión las condiciones in vivo de tales enfermedades en los seres humanos y los resultados del tratamiento. Los modelos complejos in vitro de las vías respiratorias infectadas a base de células humanas (epiteliales bronquiales y macrófagos) y patógenos relevantes podrían cerrar esta brecha y facilitar la traducción de nuevos antiinfecciosos a la clínica. Para ello, se ha establecido un modelo de cultivo de co-cultivo de la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o- y de los macrófagos derivados de monocitos THP-1, imitando una infección de la mucosa bronquial humana por P. aeruginosa en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este modelo se configura en siete días, y los siguientes parámetros se evalúan simultáneamente: integridad de la barrera epitelial, transmigración de macrófagos, supervivencia bacteriana e inflamación. El presente protocolo describe un sistema robusto y reproducible para evaluar la eficacia de los fármacos y las respuestas del huésped que podrían ser relevantes para descubrir nuevos antiinfecciosos y optimizar su entrega de aerosoles a los pulmones.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno relevante en la fibrosis quística (CF) que contribuye al deterioro del tejido pulmonar1. La producción de polisacáridos, como el alginato y otros exopolísacáridos mucoides, coordina el progreso de la enfermedad, que conduce a la adherencia bacteriana tenaz, limita la entrega de antibióticos a las bacterias y protege las bacterias contra el sistema inmunitario huésped2. La transición de P. aeruginosa de la etapa planctónica a la formación de biopelículas es un tema crítico en este contexto, facilitando también la aparición de tolerancia a antibióticos.
En el contexto de CF, el ratón se ha utilizado principalmente como modelo. Los ratones, sin embargo, no desarrollan espontáneamente esta enfermedad con la introducción de mutaciones DE CF3. La mayoría de los estudios de biopelícula bacteriana y susceptibilidad a fármacos se han realizado en superficies abióticas, como los platos Petri. Sin embargo, este enfoque no representa la complejidad in vivo. Por ejemplo, hay barreras biológicas importantes, incluidas las células inmunitarias, así como el epitelio mucoso. Aunque P. aeruginosa es bastante tóxico para las células epiteliales, algunos grupos han logrado co-cultivar un biofilm anterior de P. aeruginosa con células bronquiales humanas. Estas células se originaron en pacientes con fibrosis quística con mutación CFTR (CFBE41o- células)4 y permitieron evaluar la eficacia de los antibióticos5 o evaluar la corrección de la proteína CFTR durante la infección6. Se demostró que este modelo mejora la previsibilidad de la eficacia de los fármacos, además de permitir la caracterización de problemas con fármacos que fracasaron en fases posteriores del desarrollo de fármacos7.
Sin embargo, en el pulmón, el epitelio muesca está expuesto al aire. Además, las células inmunitarias presentes en las vías respiratorias, como los macrófagos tisulares, desempeñan un papel esencial contra los patógenos o partículas inhalados8. Los macrófagos migran a través de las diferentes capas celulares para alcanzar el lumen bronquial y combatir la infección. Además, los medicamentos inhalados también tienen que hacer frente a la presencia de moco como un elemento no celular adicional de la barrera pulmonar aire-sangre9. De hecho, se han desarrollado varios modelos tridimensionales complejos (3D) in vitro, con el objetivo de aumentar la relevancia in vivo. Los sistemas de co-cultivo no sólo aumentan la complejidad de los sistemas in vitro para el descubrimiento de fármacos, sino que también permiten estudiar las interacciones células celulares. Tal complejidad se ha abordado en estudios sobre la migración de macrófagos10, la liberación de péptidos antimicrobianos por neutrófilos11, el papel de la mucosidad en la infección9, y la reacción de células epiteliales al daño excesivo12. Sin embargo, todavía falta un modelo in vitro infectado por CF fiable que presenta la mutación genética en CF, que está expuesta al aire (aumento de la condición fisiológica), e integra las células inmunitarias.
Para cerrar esta brecha, describimos un protocolo para el co-cultivo humano estable en 3D de las vías respiratorias infectadas. El modelo está constituido por células epiteliales bronquiales y macrófagos humanos, infectados con P. aeruginosa y capaces de representar una barrera difusa e inmunológica. Con el objetivo de probar los antiinfecciosos a un rendimiento razonablemente alto, este co-cultivo se estableció en la membrana de filtro permeable de las plaquitas de pozos, utilizando dos líneas celulares humanas: CFBE41o- y THP-1 monophages derivados de monocitos. Además, para estudiar finalmente la deposición de los antiinfecciosos aerosolizados13, el modelo se estableció en la interfaz aire-líquido (ALI) en lugar de en condiciones de cobertura líquida (LCC).
Como informamos aquí, este modelo permite evaluar no sólo la supervivencia bacteriana sobre un tratamiento antibiótico, sino también la citotoxicidad celular, la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos y las respuestas inflamatorias, que son parámetros esenciales para el desarrollo de fármacos.
Este protocolo combina dos tipos celulares relevantes para la terapia de inhalación de las vías respiratorias pulmonares: macrófagos y epitelio bronquial CF. Estas células se siembran en lados opuestos de inserciones de soporte permeables, lo que permite la exposición celular al aire (llamadas condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este co-cultivo de células huésped se infecta posteriormente con P. aeruginosa. Ambas líneas celulares del huésped son de origen humano: las células epiteliales representan el epitelio bronquial de fibrosis quística, con una mutación en el canal CF (CFBE41o-), y las células THP-114 son una línea celular bien caracterizada similar a un macrófago. Primero se permite que una capa epitelial confluente se forme en la parte superior de las inserciones de placas de pozo antes de que las células similares a los macrófagos se añadan al compartimiento opuesto. Una vez establecida la cocultura en ALI, el sistema se inocula con P. aeruginosa en el lado apical. Este sistema de co-cultivo infectado se utiliza entonces para evaluar la eficacia de un antibiótico, por ejemplo, tobramicina. Se analizan los siguientes puntos finales: integridad de la barrera epitelial en términos de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), visualización de interacciones células celulares y células-bacterias mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), supervivencia bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (CFU), supervivencia de células huésped (citotoxicidad) y liberación de citoquinas.
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Protocol
1. Crecimiento y diferenciación de células en plaquitas de soporte permeable
- Cultivar CFBE41o- en un matraz T75 con 13 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales y 600 mg/L de glucosa a 37oC con una atmósfera de 5 % de CO2. Agregue un medio fresco a las células cada 2-3 días.
- Separar las células después de alcanzar el 70% de confluencia en el matraz con 3 ml de ácido etilenocrifaminatetraacético (EDTA) a 37oC durante 15 min. Añadir 7 ml de MEM fresco y centrifugar las células a 300 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y agregue nuevos 10 ml de MEM mientras interrumpe los grumos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Cuente las células con un contador de células automatizado o una cámara de hemocitoómetro. Células de semillas con una densidad de 2 x 105 células/pozo en placas de 12 pocillos con soportes permeables (tamaño de poro de 3 m, ver Tabla de materiales).
NOTA: El contador de celdas automatizado determina el número de celda, la distribución del tamaño y la viabilidad de las celdas (consulte Tabla de materiales). Los soportes permeables con un tamaño de poro de 0,4 m se pueden utilizar aquí; sin embargo, los macrófagos, en esta condición, deben añadirse directamente al lado apical, y su migración transcelular no se evaluará en este caso. - Células de semillas en condición líquido-líquido (LLC) mediante la adición de 500 l de la suspensión celular en el lado apical del soporte permeable y 1,5 ml de medio fresco en el lado basolateral. A continuación, incubar las células a 37oC por debajo del 5% deCO2,durante 72 h.
- Para cambiar a la cultura de interfaz aire-líquido (ALI), al tercer día después de la siembra, retire el medio del lado basolateral primero, luego del lado apical. En el lado basolateral, agregue 500 l de MEM fresco y cambie el medio cada segundo día hasta que las células formen una monocapa confluente.
NOTA: Para las condiciones utilizadas en este protocolo, las células CFBE41o- generalmente son confluentes después de 3-7 días en el cultivo. - Evaluar las propiedades de la barrera epitelial en el día 7 incubando las células CFBE41o- con un medio celular de 500 ml en el lado apical y 1,5 ml en el lado basolateral durante 1 h, a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Mida las propiedades de la barrera a través de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), con un electrodo de palillo STX2 y un volt-ohmímetro epitelial; después de 7 días, esto es superior a 300 cm2.
NOTA: Eventualmente, en algunos insertos de membrana, las células tienen un TEER bajo. Por lo tanto, no se utilizan plaquitas permeables con TEER < 300 cm2.
- Para cultivar células THP-1, cultivarlas en un matraz T75 usando 13 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio complementado con 10% FCS, e incubar a 37oC bajo 5% CO2. Divida las células cada segundo día sembrando 2 x 10células/ml de células en un nuevo matraz T75.
NOTA: Las células THP-1 no diferenciadas se cultivan como monocitos en suspensión.- Diferencie las células THP-1 de la siguiente manera. Centrifugar el contenido de un T75 a 300 x g durante 4 min. Deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en medio fresco y poner en un nuevo T75. Añadir 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate incubar las células en RPMI durante 48 h a 37 oC y 5% CO2 atmósfera15.
NOTA: Después de la diferenciación con PMA, las células ya no proliferan y se unen al matraz. - Para separar las células similares a los macrófagos THP-1, lave una vez con solución salina tamponada al fosfato (PBS) a 37 oC e incubar con 3 ml de solución de desprendimiento celular (por ejemplo, accutasa) que contenga 0,5 mM de EDTA durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Inspeccione las células bajo un microscopio invertido para buscar el desprendimiento celular. Añadir 7 ml de medio fresco y centrífuga a 300 x g durante 4 min en RT.
NOTA: Los macrófagos también se pueden separar con tripina-EDTA, 37 oC durante 20 min. Sin embargo, la tripina es más dura para los macrófagos que la solución de desprendimiento de células elegida (ver Tabla de materiales). - Después de retirar el sobrenadante, volver a suspender las células de macrófagos en 3 ml de medio THP-1 en un tubo cónico de 15 ml, contar las células como se describe en 1.1.2. e incubar durante un máximo de 1 h a 37oC por debajo del 5% de CO2 antes de establecer el cocultura.
NOTA: Las células THP-1 en suspensión se pueden teñir con tintes de viabilidad para imaginar más el cultivo conjunto. En este paso, utilice el procedimiento siguiente (paso 1.2.5). - Se pueden manchar los macrófagos con 10 m de un tinte de viabilidad celular (basado en la conversión de mitades de acetato por esterasas intracelulares, véase Tabla de materiales)en el que se aplica 3 l del tinte de viabilidad celular a la suspensión celular. Incubar las células durante 20 min a 37oC, 5% CO2,luego lavar 1x con PBS 37oC para eliminar el tinte.
NOTA: Centrifugar las células para eliminar el tinte a 300 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Diferencie las células THP-1 de la siguiente manera. Centrifugar el contenido de un T75 a 300 x g durante 4 min. Deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en medio fresco y poner en un nuevo T75. Añadir 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate incubar las células en RPMI durante 48 h a 37 oC y 5% CO2 atmósfera15.
2. Establecimiento de una cocultura epitelial-macrofago en apoyos permeables
- Utilice CFBE41o- monocapas en ALI con TEER a 300 x cm2 (paso 1.1.6.). Retire el medio de la cámara inferior, invierta cuidadosamente el soporte dentro de una placa de petri de vidrio estéril (50 mm x 200 mm), y retire las células que crecen en exceso a través de los poros de membrana en la parte inferior de la membrana utilizando un rascador celular.
NOTA: Debido al tamaño de los poros de 3 m, las células epiteliales tienden a crecer a través de los poros hacia el lado basolateral. Por lo tanto, uno necesita eliminarlos antes de agregar los macrófagos en este lado. CFBE41o- Las células epiteliales pulmonares se pueden teñir en este paso. Se puede utilizar el procedimiento en el paso 1.2.5; sin embargo, en lugar de una suspensión celular, se aplica la solución de tinte en MEM (solo en el lado apical de 500 l) en las células adheridas en el soporte permeable. - Utilice 2 x 105 células/pozo (en 200 l de RPMI) de la suspensión celular de los macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y coloque las células en el lado basolateral de las plaquitas invertidas.
- Cierre cuidadosamente los platos de Petri e incubar durante 2 h a 37 oC por debajo del 5% deCO2.
- Vuelva a colocar las plaquitas en las microplacas de 12 pocicos y añada 500 ml de medio MEM en el lado basolateral de la plaquita permeable para mantener las condiciones de ALI. Las células ya están listas para la infección.
3. Infección por P. aeruginosa
NOTA: Todos los pasos siguientes a partir de aquí deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL2).
- Inocular 15 ml de caldo de lisogenia (LB) complementado con 300 g/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer (50 mL) con una sola colonia de P. aeruginosa PAO1-GFP.
NOTA: Otras cepas de P. aeruginosa también podrían utilizarse aquí, por ejemplo, CEPAs silvestres PAO1, PA14 o cepas clínicas, siguiendo sus propios protocolos de cultivo. - Incubar las bacterias durante 18 h a 37oC, agitando a 180 rpm.
- Transfiera el contenido después de las 18 h a un tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 3850 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 10 ml de PBS estéril a 37oC.
- Mida la densidad óptica en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm y ajuste la concentración de bacterias utilizando el medio de cultivo celular a una concentración final de 2 x 105 CFU/ml. Esto corresponde a una multiplicidad de infección (MOI) de una bacteria por célula epitelial.
- Añadir 100 l de suspensión bacteriana al lado apical del soporte permeable (paso 2.4.) e incubar a 37 oC por debajo del 5% de CO2 durante 1 h, para permitir la unión de bacterias a las células. A continuación, retire el líquido apical cuidadosamente con una pipeta para restaurar las condiciones de ALI. Mantenga algunas muestras no infectadas como control.
NOTA: En esta etapa, las bacterias unidas deben estar chapadas en agar LB (ver pasos 5.4/5.5) para determinar el inóculo inicial de las bacterias. - Incubar el fármaco de interés después de la adhesión bacteriana en las células. Para los experimentos de tratamiento, añada 500 l de una solución farmacológica diluida en medio celular (en este protocolo se utilizó tobramicina 6 g/ml) al lado apical. Añadir 1.500 l de medio celular sin medicamento en el lado basolateral.
NOTA: En lugar de inculcar los medicamentos como solución, el modelo también se puede adaptar a la deposición de aerosoles. Para tales propósitos, las células en ALI se alimentan desde el lado basolateral con 500 l de medio celular. El medicamento se nebuliza primero y se le permite depositar en el compartimiento apical por un dispositivo apropiado (no descrito aquí). La muestra infectada y tratada se puede comprobar para los puntos finales descritos en las secciones 4–7. A partir de este paso, se pueden utilizar soportes permeables para crear imágenes (sección 4) o para obtener resultados del crecimiento de bacterias y la viabilidad de las células de los mamíferos, entre otros (secciones 5–7).
4. Preparación de muestras para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)
- Después del establecimiento del co-cultivo, la infección y el tratamiento farmacológico, eliminar todo el medio del lado apical y basolateral. Lavar 1x con PBS a 37oC y luego fijar las células con un 3% de paraformaldehído (PFA) durante 1 h a RT (300 ml en apical/600 l en basolateral). Los núcleos celulares se tiñen con 5 g/ml de DAPI-PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
ADVERTENCIA: PFA es peligroso. - Corte las membranas con un bisturí y colóquelas entre dos portaobjetos de cubierta de microscopía de 12 mm utilizando un medio de montaje (ver Tabla de materiales). Dejar secar dentro del banco de flujo durante 30 minutos antes de guardarlo a 4oC. Visualice mediante microscopía de escaneo confocal.
NOTA: Después del co-cultivo y antes del montaje, se puede realizar una inmunostaining de unión estrecha. Para eso, las células se fijan con paraformaldehído 3% durante 30 min, se lavan de nuevo con PBS, y se permeabilizan con saponina 0.05%/BSA 1% en PBS. En este protocolo, la proteína zonula occludens (ZO-1) se detectó a través del anticuerpo anticasmán DE ratón ZO-1 (1:400, incubación a 4oC durante la noche). Las muestras fueron incubadas durante 2 horas en RT con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 633 (1:2000 en rojo). Los núcleos se teñiron con DAPI (1 g/ml) y se montaron con medio de montaje en los cubreobjetos. - Utilice un microscopio confocal para tomar imágenes de las membranas almacenadas. Elija objetivos de inmersión en agua de 25x o 63x y láseres a 405, 488, 505 o 633 nm para la detección. Las imágenes deben tener una resolución de 1024 x 1024 píxeles.
NOTA: Los láseres se eligen de acuerdo con la mancha utilizada. - Adquiera vistas apicales y transversales, y utilice el modo zeta-stack (10-15 pilas) para la construcción de un modelo tridimensional mediante software de imágenes.
5. Medición de la proliferación bacteriana a través de unidades formadoras de colonias (CFU)
- Recoger el medio apical y basolateral (que contiene bacterias) para evaluar la UFC de bacterias no asociadas. Recoger 500 l de los lados apical y basolateral y agruparlos.
NOTA: Utilice esta suspensión directamente para contar bacterias (paso 5.4) o centrífuga a 21.250 x g durante 10 minutos para evaluar lactato deshidrogenasa (LDH) desde el sobrenadante (sección 6) y/o re-suspendida en PBS para contar bacterias extracelulares (paso 5.4). - Evaluar la supervivencia de las bacterias unidas y/o internalizadas en las células añadiendo 500 l de agua fría desionizada estéril en cada compartimiento del soporte permeable. Incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Las muestras pueden ser chapadas en el agar LB (ver paso 5.4) o congeladas (como placa de inserción completa) a -20 oC para el enchapado más adelante. - Para evaluar la CFU de bacterias adherentes/internalizadas, descongele las muestras a 37oC durante 10 min (si están congeladas). Usando puntas de pipeta para cada pozo, raspe la superficie de la membrana y pipetee hacia arriba y hacia abajo para eliminar todo el contenido adherido.
NOTA: En este paso, todas las células epiteliales están se lesidas y las bacterias adherentes/internalizadas están disponibles como suspensión a chapar. - Con la suspensión bacteriana de ambas fracciones, realice una dilución en serie de 1/10 utilizando Tween-80 0.05% en PBS y placar las bacterias en placas de agar LB.
NOTA: Se recomiendan diluciones entre 1 y 10. Las bacterias deben contarse en la dilución más alta, donde se identifican por primera vez colonias individuales. - Incubar las placas de agar a 30oC durante 16–72 h para contar colonias, y calcular la CFU en consecuencia.
NOTA: Una temperatura de 30oC en el momento de la incubación de la placa es esencial para las muestras tratadas y para observar el crecimiento retardado de las colonias.
6. Evaluación de la citotoxicidad celular mediante el ensayo de lactato deshidrogenasa
- Utilice el sobrenadante de células infectadas que contienen bacterias (del paso 5.1) para la evaluación de la viabilidad celular para el ensayo LDH16. Centrifugar el sobrenadante a 21.250 x g durante 10 minutos para peletizar las bacterias y eventualmente el resto de las células. Utilice el sobrenadante libre de bacterias para medir la liberación de LDH.
NOTA: El sobrenadante no debe congelarse antes de medir LDH mediante este ensayo. - Transfiera 100 l del sobrenadante a una placa de 96 pocillos, y añada 100 l de la solución de ensayo LDH (véase la Tabla de materiales). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad, luego leer la absorbancia a 492 nm.
7. Evaluar la liberación de citoquinas humanas
- Para la cuantificación de citoquinas, utilice ELISA o inmunoensayo de matriz de cuentascitométricas 17(véase la Tabla de Materiales). Para ello, el sobrenadante centrífugo del paso 5.1 a 21.250 x g durante 10 min y medir inmediatamente o almacenar -80 oC durante un máximo de 15 días hasta el análisis.
- Evalúe los sobrenadantes con un kit ELISA disponible en el comercio.
NOTA: El procedimiento sigue las instrucciones de fabricación, que incluyen el recubrimiento de placas con el anticuerpo de captura, la adición de las muestras (100 l) y las normas de citoquinas, incubación, lavado y adición de anticuerpos de detección para proporcionar una medición colorimétrica de la presencia de citoquinas. Alternativamente, la citometría de flujo se puede utilizar para medir citoquinas a través de kits disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales).
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Representative Results
La Figura 1A muestra la morfología del coculo resultante de células epiteliales bronquiales humanas y macrófagos después de crecer durante 24 h en el lado apical y basolateral de los soportes permeables, respectivamente. La integridad de la barrera epitelial se muestra con UNER más alto (834 x cm 2 ) y CLSMmediantela inmunostaining para la proteína de unión estrecha ZO-1(Figura 1B). Los mismos resultados observados en términos de integridad de barrera de CFBE41o no infectado- monocultivo se podían ver en los co-cultivos epiteliales-macófagos no infectados.
Para modelar una infección bacteriana, P. aeruginosa se inoculó en una multiplicidad de infección (MOI) de 1:1 en lascélulas CFBE41o. Seis horas después de la infección (Figura 2A), se observaron macrófagos en el lado apical del cocultivo. Después de la infección, el TEER cayó de 834 a 250 cm2,lo que indica una barrera epitelial comprometida, como también se visualiza por la tinción ZO-1(Figura 2B).
La Figura 3 muestra la transmigración de macrófagos a través de los poros de membrana permeables y la absorción de bacterias por las células THP-1 en el lado apical. Las muestras se fijaron en 1, 3 y 6 h después de la incubación de experimentos independientes. En los monocultivos THP-1(Figura 3A–C),se observó la migración de macrófagos ya en 1 h, mientras que en el cocultivo (Figura 3D-F), esto se observó después de 3 h de infección. La absorción de bacterias en THP-1 se observó después de 3 h de infección, tanto en monocultivo como en co-cultivo. No se pudo ver ninguna absorción bacteriana por CFBE41o. Las vistas transversales se colocaron de tal manera que el soporte de membrana permeable estaba en el medio como una separación del compartimento apical y basolateral.
La Figura 4 muestra imágenes de microscopía láser de barrido confocal de co-cultivos infectados (CFBE41o- + THP-1) tratados con o sin tobramicina durante 6 h (Figura 4A, B) o 20 h ( Figura4C,D). Sin tratamiento, tanto las células epiteliales como los macrófagos murieron después de 20 h de infección(Figura 4C). Sin embargo, tras el tratamiento con tobramicina, las células huésped se conservan después de 20 h; todavía, algunas bacterias se pueden observar en el cultivo. A pesar de ser observadas después de 6 h de tratamiento en las imágenes de microscopía (Figura 4B), las bacterias no proliferaron como se observa en los ensayos de CFU en la Figura 4E. Sin embargo, después del tratamiento de 20 h, las bacterias recuperaron la capacidad de proliferación, como las observan las colonias en el ensayo de la CFU(Figura 4F). El protocolo de la lysis celular con agua fría y raspado puede liberar bacterias unidas y posiblemente internalizadas en las células. Al mismo tiempo, las células se destruyen(Figura suplementaria S1A, B). Los pasos de centrifugación utilizados en este papel para células epiteliales (300 x g)o bacterias (21.250 x g)no obstaculizaron la viabilidad de ambas (Figuras Suplementarias S1C, D). Todos los ensayos de CFU se realizaron congelando las muestras a -20oC, seguidos de descongelación y chapado. Este procedimiento redujo el número de bacterias en 2 registros, en comparación con muestras frescas(Figura suplementaria S1E). Dado que este procedimiento se realiza simultáneamente para todos los grupos experimentales (tratados y no tratados) en diferentes momentos, esta reducción se incorporará en los resultados finales(Figura Complementaria S1E). Además, la concentración de tobramicina utilizada aquí no mostró toxicidad para las células no infectadas(Figura suplementaria S2A)y tampoco ninguna respuesta inflamatoria adicional (Figura suplementaria S2B). Sin embargo, estaba dentro del rango de la concentración inhibitorina mínima para matar A. aeruginosa.
La Figura 5 muestra la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la viabilidad celular. La Figura 5A–B ilustra el TEER de los monocultivos y coculturas. El cocultivo de las células CFBE41ocon THP-1 no indujo ningún cambio en la integridad de la barrera epitelial en comparación con el monocultivo (barras rojas). Tras la infección, el valor TEER bajó (barra verde). Después de 1 h de infección, algunas muestras fueron tratadas con el antibiótico tobramicina (barra azul), durante 6 o 20 h. El tratamiento conservó la integridad de la barrera epitelial, como lo observó el TEER más alto. La Figura 5C muestra el porcentaje de liberación de LDH como indicación de toxicidad celular tras la infección y el tratamiento con tobramicina después de 6 h. El propio co-cultivo indujo una liberación de LDH, que era la misma para las células infectadas (alrededor del 20%). Después de 20 h de infección, no se pudo detectar ninguna señal de LDH. Para demostrar la fiabilidad de LDH para la infección a largo plazo, PAO1-GFP se incuba en medio con y sin LDH 1 U/mL en comparación con los respectivos controles no infectados(Figura Suplementaria S2C). La señal LDH se perdió después de una incubación prolongada (20 h) con P. aeruginosa,lo que indica que LDH sólo es estable en tiempos de incubación más cortos en cultivos infectados.
La Figura 6 muestra la cinética de las citoquinas proinflamatorias detectadas a través de ELISA. La ventaja de un co-cultivo infectado de células CFBE41o- y THP-1 se observó con. las secreciones más altas de las citoquinas proinflamatorias. La secreción de algunas citoquinas proinflamatorias fue similar (IL-6) o superior (IL-8, TNF-o, IL-1) en el cocultivo infectado (Figura 6C) que en los monocultivos correspondientes (Figuras 6A-B). Inesperadamente, algunas citoquinas en los monocultivos de THP-1 (Figura 6B) se regulan hacia abajo en muestras infectadas (Il-8, TNF, IL-1).
La Figura 7 demuestra la liberación de citoquinas en monocultivos y cocultivos tras la infección y el tratamiento con tobramicina medida mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). La secreción de la citoquina proinflamatoria IL-8 (Figura 7A) y la citoquina antiinflamatoria IL-10 (Figura 7F) fue mayor en los co-cultivos de células epiteliales y macrófagos, en comparación con los monocultivos. Sin embargo, para todas las demás citoquinas (IL-1, IL-12p40, IL-23 y GM-CSF) (Figuras 7B-E), los niveles de secreción de citoquinas no fueron más altos en el co-cultivo que en los monocultivos respectivos.
Figura 1: Secciones transversales y vistas apicales de la cocultura epitelial-macrófago no infectada. (A) Vistas cruzadas de la cocultura epitelial-macrofago no infectada 24 h. CFBE41o- rojo teñido, macrófagos THP-1 en amarillo y núcleos en azul (DAPI). (B) Vistas apicales de la inmuno-stained cfBE41o- monocapa no infectada para ZO-1 (rojo). DAPI: núcleos. Barras de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Secciones transversales y vistas apicales de la cocultura epitelial-macrofago infectada. (A) Vistas cruzadas y (B) vista apical del coculo epitelial-macrofágico a las 6 horas después de la infección (hpi) con P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- teñido en rojo, macrófagos THP-1 en amarillo, núcleos en azul (DAPI) y P. aeruginosa PAO1-GFP en verde. (B) Vistas apicales de la 6 h infectada CFBE41o- monocapa. Barras de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cinética de la transmigración de macrófagos y absorción de bacterias visualizada por sección transversal del modelo 3D. Cinética de la infección POR PAO1-GFP en monocultivos de macrófagos THP-1 (A–C) o cocultivo (D–F). Los macrófagos THP-1 se tiñen en rojo, núcleos de células epiteliales en azul (DAPI) y P. aeruginosa en verde (GFP). Cada figura se divide en lados apicales y basolaterales, el espacio en el medio se considera la membrana, que está vacía u ocupada por la cfBE41o- capa confluente (D-F). Los insertos en las figuras muestran la absorción de bacterias por macrófagos en diferentes momentos (A–F). Barras de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de la supervivencia de PAO1-GFP en co-culturesos tratados con tobramicinae. (A–D) Co-cultivos de micrografías con y sin tratamiento. (A) Co-cultivo no tratado después de 6 h de infección. (B) Co-cultivo infectado tratado con tobramicina 6 g/ml (Tob) durante 6 h. (C) Co-cultivo no tratado 20 h post-infección, (D) co-cultivo infectado tratado con tobramicina 6 g/ml durante 20 h. Núcleos manchados con DAPI (azul), macrófagos (rojo) y P. aeruginosa GFP (verde). (E) Unidades formadoras de colonias (CFU) de bacterias adherentes/internalizadas después de 6 y (F) 20 h con tratamiento de tobramicina 6 g/ml. El inserto de membrana vacía se utilizó como sustrato abiótico para cultivar PAO1-GFP. Se utilizó ANOVA bidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (sin colonias), *p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; ns: no es significativo. Las barras de error indican la desviación estándar, n á 9–27 réplicas de 3-9 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Integridad de barreras y evaluación de la viabilidad de la monocultura y la cocultura. Se evaluaron las siguientes condiciones de cultivo conjunto: no infectado (barras grises), infectado (barras verdes) o infectado y tratado con tobramicina (barras azules). (A) Resistencia eléctrica transepitelial después de 6 h y (B) 20 h de infección en monocultivos (CFBE41o- y THP-1) y co-cultivo. (C) Citotoxicidad del monocultivo y cocultivo medido a través de LDH liberación 6 h post-infección. Se utilizó ANOVA bidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey; *p < 0.05; p < 0.0001; ns: no es significativo. Las barras de error indican la desviación estándar; n 9 réplicas de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cinética de la liberación de citoquinas de sobrenadantes mono-y co-cultivo infectados no infectados evaluados a través de ELISA. ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit. (A) CFBE41o-,( B) THP-1 y (C) co-cultivo liberando IL-8, TNF-, IL-1, e IL-6. Las barras de error indican la desviación estándar. n 6 réplicas de 2 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Resultados sobrenadantes del panel de citoquinas medidos a través de FACS con y sin tobramicina 6 g/ml para 6 h después de la infección. Supernadantes de mono-y co-cultivo después de 6 h post-infección utilizadas para analizar las respectivas citoquinas IL-8 (A), IL-1o (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) e IL-10 (F). La barra de errores indica la desviación estándar, n a 9 réplicas de 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Controle los experimentos para los pasos críticos del protocolo. (A, B) Micrografías de células CFBE41o en placas de 24 pozos cultivadas durante 2 días a una densidad de 2 x 105 células/pozo. (A) Células CFBE41o en PBS durante 30 min, y (B) células tratadas con agua después de 30 minutos después del raspado con una pipeta. (C) Viabilidad de las células de los mamíferos después de la centrifugación. Las células CFBE41o- se eliminaron del matraz de cultivo celular T75 como se describe en los pasos 1.1.1 y 1.1.2. Se analizaron 100 l de suspensión celular resultante en solución isotónica de 10 ml. Se utilizó un contador de células automatizado para evaluar la viabilidad de las células individuales. Luego, las respectivas suspensiones celulares se centrifugaron a 300 x g durante 4 min, se suspendieron y se contaron de nuevo. Las barras de error indican la desviación estándar, n a 6 matraces diferentes de 2 experimentos individuales. (D) Viabilidad de PAO1-GFP después de la centrifugación. Las bacterias PAO1-GFP se diluyeron a OD a 0,01 en medio celular. La CFU se evaluó a través de una fila de dilución de 10 veces y las placas DE LB incubadas durante la noche a 30 oC. Los tubos de plástico respectivos se centrifugaron a 21.250 x g durante 10 min y se volvieron a suspender en medio. La CFU se evaluó en consecuencia de nuevo. Prueba t del estudiante de dos colas, * p < 0.033. La barra de errores indica la desviación estándar, n a 6 de 2 experimentos. (E) Viabilidad de las bacterias después de la congelación. Se prepararon las bacterias PAO1-GFP como en (D) y se analizó la CFU, luego se congelaron los tubos de plástico durante un día a -20 oC y se descongelaron para evaluar de nuevo la CFU. Prueba t del estudiante de dos colas, *** p < 0.001. Las barras de error indican la desviación estándar, n.o 6 de dos experimentos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Experimentos de control para evaluar el comportamiento de LDH y la influencia de la tobramicina. (A) Experimento de control para evaluar la citotoxicidad después de 20 h de incubación con 6 g/ml de tobramicina. El mono-y el co-cultivo se hicieron como se describe en el protocolo, pero las células se cultivaron durante 2 días en placas de 24 pozos y las células THP-1 se siembran de manera apóptica. Las células con tobramicina o controles de 6 g/ml fueron incubadas durante 20 h. One-Way ANOVA, Prueba de comparaciones múltiples de Tukey, *** p < 0.001. La barra de error indica la desviación estándar, n a 6 de 2 experimentos (CFBE41o-), n a 3 de un experimento (THP-1 y cocultura). (B) Control-ELISA de sobrenadantes de mono- y co-cultivo con/sin tobramicina. El cultivo celular se hizo de acuerdo con (A) para no mostrar liberación de citoquinas en comparación con los controles para todas las condiciones. ELISA se realizó en los pasos 7.1 y 7.2, se añadieron 10 g/ml (LPS) como control, la versión IL-8 para los controles tratados con LPS que contenían THP-1 fue mayor que detectable. ANOVA bidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey, ns p > 0.12; * p < 0.033; p < 0.001. Las barras de error indican la desviación estándar, n a 6 de dos experimentos, n a 3 de un experimento (control LPS). (C) Degradación de LDH debido a la proliferación excesiva paO1-GFP. LDH se añadió a una concentración de 1 U/ml al medio MEM. Se utilizó un medio de LDH o un medio de control para diluir las células a OD a 0,01 (corresponde a 1 x 108 UFC/ml) y luego se incubaron durante 20 h. Se realizó el ensayo LDH como se describe en la sección 6. One-Way ANOVA, Prueba de comparaciones múltiples de Tukey, ns p > 0.12; p < 0.001. La barra de errores indica la desviación estándar, n a 8–9 de tres experimentos individuales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este artículo describe un protocolo para un cocultivo 3D de las vías respiratorias infectadas, constituido por la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o- y la línea celular de macrófagos derivados de monocitos humanos THP-1. El protocolo permite evaluar la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos, la supervivencia de las bacterias y la inflamación, que son parámetros importantes al probar simultáneamente la eficacia de los fármacos y las respuestas del huésped. La novedad en el modelo reside en la incorporación de células epiteliales (es decir, línea celular CF humana y macrófagos) con infección bacteriana aguda (es decir, P. aeruginosa). Se ha demostrado que la infección aguda en las células epiteliales se controla mediante un antibiótico (es decir, tobramicina). Además del uso de una línea celular CF humana, todo el modelo se configura en condiciones ALI, que está considerablemente más cerca de las condiciones fisiológicas en CF. El uso de una línea celular CF implementa algunas de las características de la enfermedad en el modelo. La mutación del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) está directamente relacionada con la desregulación del transporte de líquidos epiteliales en los pulmones. Además, las mutaciones en el gen CF, como el F508, dan lugar a moco grueso, con inflamación y daño pulmonar grave tras la infección por P. aeruginosa4. Estas manifestaciones patológicas causadas por CFTR disfuncional potencialmente implican deterioro de la autofagia como un mecanismo celular importante asociado con la patogénesis de la enfermedad pulmonar CF18. Sin embargo, el CFBE41o- no secretar la mucosidad, que es una limitación de esta línea celular. Si se pretende estudiar el papel de la mucosidad más específicamente, el protocolo se puede adaptar mediante el uso de otras líneas celulares bronquiales (por ejemplo, Calu-3).
Un paso crítico para establecer este protocolo es la combinación de células epiteliales e inmunitarias y la posterior infección con P. aeruginosa en ALI. La infección de CFBE41o- por P. aeruginosa in vitro ya ha sido descrita, utilizando principalmente una cámara de células de flujo, complementada con arginina en los medios de cultivo, para mejorar la supervivencia celular epitelial y apoyar la formación de biopelícula19. El presente protocolo tenía como objetivo un nuevo modelo utilizando sólo células humanas, que además, podrían cultivarse en ALI en plaquitas de placas de pozo permeables para un mayor rendimiento de la muestra. La inclusión de los macrófagos diferenciados THP-1 como una línea celular inmortalizada humana, en lugar de depender de la obtención de células primarias reproducibles de donantes, es otra ventaja de nuestro modelo. Al añadir estos macrófagos al lado basolateral del soporte permeable de la membrana, se observó que los macrófagos sobresalieron y eventualmente se transmitieron al lado apical de la barrera epitelial cultivada por el filtro. Una variación de este protocolo podría ser la adición de macrófagos directamente en el lado apical en la parte superior de las células epiteliales, como se describe por Kletting et al. 14.El co-cultivo de células inmunitarias y pulmonares no humanas ya ha sido descrito anteriormente. Ding et al. 10 células de carcinoma pulmonar Lewis de ratón utilizadas en soportes de inserción permeables en combinación con macrófagos en el lado basolateral e infectados con S. aureus,otro patógeno crítico de la infección crónica en pacientes con FQ. Sin embargo, en este estudio, no hubo enfoque en la fibrosis quística o en utilizar el co-cultivo como plataforma para la evaluación de la eficacia de los fármacos. Nuestro protocolo se puede adaptar para otras infecciones bacterianas, como Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus o Burkholderia cepacia,patógenos importantes en el pulmón CF.
Otro paso crítico es la adición de macrófagos THP-1 a las células volteando las plaquitas permeables al revés (sección 2). Esto es crucial para evaluar la transmigración de macrófagos a través del pozo al lado de la infección. El proceso de diagnóstico por imágenes posterior de los modelos 3D con pilas z, y vista transversal, se puede realizar para observar el interior de los macrófagos y detectar la absorción de bacterias (Figura 3). A 1 hpi, las bacterias aplicadas en el lado apical migran a través de la membrana, mientras que la migración y absorción de macrófagos solo tienen lugar a 3 hpi. Por lo tanto, después de 1 h de infección, fue apropiado iniciar el tratamiento con tobramicina y tener la posibilidad de abordar tanto la supervivencia de células huésped como bacterias durante un largo período (20 h). En el curso del protocolo, mantener la esterilidad es un problema crítico debido a la multitud de pasos que cada uno conlleva el riesgo de contaminación. Sin embargo, el personal experimentado de cultivo celular podrá seguir este protocolo después de la preparación y capacitación apropiadas. El medio celular debe ser revisado regularmente para detectar contaminación, preferiblemente después de todos los pasos críticos.
Al igual que con cualquier modelo, la cocultura infectada también tiene algunas limitaciones; por ejemplo, la integración de las células similares a los macrófagos. Aquí, era importante tener macrófagos en el lado basolateral; sin embargo, la manipulación de la plaquita con una capa epitelial previamente cultivada puede haber proporcionado daños y perturbaciones tempranas al cultivo de co-cultivo. Aunque, el modelo de soporte permeable proporcionaba características de alto rendimiento, que no se ha observado en co-cultivos anteriores del pulmón infectado por el CF20,,21. Con esto, es necesario que otros experimentos evalúen las limitaciones del uso de THP-1 como sustituto de los macrófagos. Si bien esta línea celular es ampliamente utilizada, es menos sensible a LPS22 y carece de activación completa y toda la población no se diferencia de los monocitos a las células similares a los macrófagos23. Otra limitación es la falta de otros componentes clave en la infección por CF y la administración de medicamentos. La líneacelular CFBE41o no posee cilios ni produce moco, lo que suele ocurrir 20-30 días de cultivo celular en ALI. Como este no fue el caso de la líneacelular CFBE41o, usamos las células después de siete días cuando se formó una barrera epitelial apretada. El aclaramiento mucociliar altera las condiciones de residencia de los microbios24 o de las partículas de drogas9,25 y los modelos in vitro que evalúen la deposición pulmonar deben tener esto en cuenta. A diferencia de lo observado por otras células, el cultivo de tejido inserta recubrimiento con un material de matriz extracelular (como fibronectina o colágeno I) no muestran una diferencia significativa para CFBE41o-, por ejemplo en TEER26. Por lo tanto, los filtros permeables no estaban recubiertos con un material de matriz extracelular en este protocolo.
Con el protocolo descrito aquí, mono y co-cultivos después de 6 h infección proporcionan suficiente liberación de citoquinas para ser utilizado como una medida en futuras pruebas de drogas. El co-cultivo aporta una ventaja de la cooperación celular en el modelado de la respuesta inmune. Se esperaba la ineficacia de la tobramicina en la reducción de la inflamación, ya que no todas las bacterias fueron eliminadas durante el tratamiento(Figura 4E, F). Sin embargo, modelar la respuesta a la tobramicina en un modelo DE CF es crucial, ya que la tobramicina (en concentraciones más altas) puede ser eficaz en la inhibición de P. aeruginosa, incluso en biopelícula19,27. Una posibilidad para el uso posterior de este protocolo es integrar los antiinflamatorios en el tratamiento. La recomendación general con respecto a las respuestas inflamatorias sería utilizar el tratamiento de corta duración (6 h), que todavía tiene la célula huésped y las bacterias presentes. Después de este punto de tiempo, las células anfitrionas se destruyen en muestras no tratadas. Tanto ELISA como FACS podrían utilizarse para medir la liberación de citoquinas. Por último, si las muestras se almacenan más de 15 días a -80 oC, se recomienda comprobar la fiabilidad de las citoquinas mediante, por ejemplo, un control positivo de muestras frescas (por ejemplo, células estimuladas con LPS).
Algunas modificaciones del protocolo son posibles. Por ejemplo, el protocolo actual se puede ampliar a la aplicación de fármacos nebulizados (paso 3.6). Esto es necesario para modelar la administración de medicamentos pulmonares por inhalación oral. La nebulización de medicamentos solubles en agua, como la tobramicina, o nanoportadoras de los mismos, como la colistina liposomal, es relativamente directa por los dispositivos disponibles comercialmente utilizados habitualmente en la clínica. Además, hay varios dispositivos disponibles comercialmente para depositar aerosoles en inserciones de cultivo celular. Además, como el modelo descrito aquí se basa en soportes de membrana permeables, también podría ser adoptado a algunos dispositivos microfluídicos contemporáneos (por ejemplo, "pulmón en un chip"), por ejemplo, para estudiar la influencia de la respiración y el estiramiento mecánico relacionado y los cambios en el flujo de aire. Además, este protocolo podría modificarse mediante la adición de moco o el reemplazo por células primarias dependiendo de la cuestión científica a abordar. Otro paso interesante sería la prueba de nanomedicinas, especialmente como la nanotecnología está avanzando en el desarrollo de nuevos antiinfecciosos28,correctores CF29 y co-entrega de antibióticos y pathoblockers30. En general, el protocolo actual puede ser percibido como útil para evaluar la supervivencia bacteriana sobre el tratamiento antibiótico en un sistema complejo, junto con algunas lecturas relacionadas con el huésped: citotoxicidad celular, integridad de barrera epitelial, transmigración de macrófagos y respuesta inflamatoria. Estos son parámetros esenciales para el desarrollo de fármacos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo recibió financiación del Programa HORIZON 2020 de la Unión Europea para la investigación, el desarrollo tecnológico y la demostración en virtud del acuerdo de subvención No 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Diseño y Desarrollo de Nanomedicinas avanzadas para superar las barreras biológicas y tratar enfermedades graves. Agradecemos a la Dra. Ana Costa y a la Dra. Jenny Juntke el gran apoyo en el desarrollo de la cocultura, Olga Hartwig, por la ilustración científica, Anja Honecker, por los ensayos ELISA, Petra Konig, Jana Westhues y la Dra. Chiara De Rossi por el apoyo en el cultivo celular, la analítica y la microscopía. También agradecemos a Chelsea Thorn por revisar nuestro manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
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