Summary
Vi beskriver ett protokoll för en tredimensionell samkultur modell av infekterade luftvägar, med hjälp av CFBE41o- celler, THP-1 makrofager och Pseudomonas aeruginosa, som fastställts vid luft-flytande gränssnittet. Denna modell ger en ny plattform för att samtidigt testa antibiotikaeffekt, epitelial barriärfunktion och inflammatoriska markörer.
Abstract
fDrug forskning för behandling av lunginfektioner går mot prediktiva in vitro-modeller av hög komplexitet. Den mångfacetterade närvaron av bakterier i lungmodeller kan åter anpassa epitelarrangemang, medan immunceller samordnar ett inflammatoriskt svar mot bakterierna i mikromiljö. Medan in vivo-modeller har varit valet för att testa nya anti-infectives i samband med cystisk fibros, de fortfarande inte exakt efterlikna in vivo villkor av sådana sjukdomar hos människor och behandlingsresultaten. Komplexa in vitro-modeller av de infekterade luftvägarna baserade på mänskliga celler (bronkial epitelial och makrofager) och relevanta patogener skulle kunna överbrygga denna klyfta och underlätta översättningen av nya anti-infectives till kliniken. För sådana ändamål har en co-kultur modell av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o- och THP-1 monocyte-derived makrofager har fastställts, härma en infektion i människors bronkial slemhinna av P. aeruginosa vid luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor. Denna modell är inställd i sju dagar, och följande parametrar samtidigt bedömas: epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakteriell överlevnad, och inflammation. Det föreliggande protokollet beskriver ett robust och reproducerbart system för utvärdering av läkemedelseffekt och värdsvar som kan vara relevanta för att upptäcka nya anti-infectives och optimera deras aerosolleverans till lungorna.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa är en relevant patogen vid cystisk fibros (CF) som bidrar till nedsatt lungvävnad1. Produktionen av polysackarider, såsom alginat och andra mucoid exopolysackarider, samordnar sjukdomsförloppet, vilket leder till envis bakteriell följsamhet, begränsar leveransen av antibiotika till bakterier och skyddar bakterierna mot värd immunsystemet2. Övergången av P. aeruginosa från planktonstadiet till biofilmbildning är en kritisk fråga i detta sammanhang, vilket också underlättar förekomsten av antibiotikatolerans.
I samband med CF har musen främst använts som modell. Möss, dock inte spontant utveckla denna sjukdom med införandet av CF mutationer3. De flesta av de bakteriella biofilm utveckling och läkemedel känslighet studier har utförts på abiotiska ytor, såsom Petriskålar. Detta tillvägagångssätt representerar dock inte in vivo-komplexiteten. Till exempel är viktiga biologiska hinder frånvarande, inklusive immunceller samt slemhinnan epitel. Även P. aeruginosa är ganska giftigt för epitelceller, vissa grupper har lyckats samodla en tidigare P. aeruginosa biofilm med mänskliga bronkial celler. Dessa celler härstammar från patienter med cystisk fibros med CFTR-mutation (CFBE41o- celler)4 och som tillåts bedömaantibiotikaeffekt 5 eller bedöma korrigeringen av CFTR-proteinet under infektion6. En sådan modell visade sig förbättra förutsägbarheten av läkemedelseffekt, förutom att möjliggöra karakterisering av problem med läkemedel som misslyckades i senare faser av läkemedelsutveckling7.
I lungan utsätts dock slemhinnans epitel för luft. Dessutom immunceller som finns i luftvägarna, som vävnad makrofager, spelar en viktig roll mot inhalerade patogener eller partiklar8. Makrofager migrera genom de olika cellskikten för att nå bronkiallumen och bekämpa infektionen. Vidare, inandningsläkemedel måste också klara av förekomsten av slem som en ytterligare icke-cellulära inslag av pulmonell luft-blod barriär9. Flera komplexa tredimensionella (3D) in vitro-modeller har faktiskt utvecklats, som syftar till att öka in vivo relevans. Samkultur system inte bara öka komplexiteten i in vitro-system för läkemedelsupptäckt men också göra det möjligt att studera cell-cell interaktioner. Sådan komplexitet har tagits upp i studier om makrofag migration10, frisättningen av antimikrobiella peptider av neutrofiler11, rollen av slem i infektion9, och epitelial cell reaktion på överdriven skada12. Men en pålitlig CF-infekterade in vitro-modell som har den genetiska mutationen i CF, som utsätts för luften (ökad fysiologiska tillstånd), och integrerar immunceller saknas fortfarande.
För att överbrygga denna klyfta beskriver vi ett protokoll för stabil mänsklig 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna. Modellen är konstituerad av mänskliga CF bronkial epitelceller och makrofager, infekterade med P. aeruginosa och kan representera både en diffusional och immunologiska barriär. Med målet att testa anti-infectives på någorlunda hög genomströmning, var denna samkultur etablerad på permeabla filtermembranet av väl platta skär, med hjälp av två mänskliga cellinjer: CFBE41o- och THP-1 monocyt-härledda makrofager. Dessutom, för att så småningom studera nedfallet av aerosolized anti-infectives13, modellen fastställdes vid luft-flytande gränssnittet (ALI) snarare än flytande täckta villkor (LCC).
Som vi rapportera här, denna modell gör det möjligt att bedöma inte bara bakteriell överlevnad på en antibiotikabehandling utan också cell cytotoxicitet, epitelial barriär integritet, makrofag transmigration och inflammatoriska svar, som är väsentliga parametrar för läkemedelsutveckling.
Detta protokoll kombinerar två relevanta celltyper för inhalationsterapi av lungvägarna: makrofager och CF bronkial epitel. Dessa celler är seedade på motsatta sidor av genomsläppliga stödinsatser, vilket möjliggör cellexponering för luft (kallas luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor). Denna samkultur av värdceller är därefter infekterad med P. aeruginosa. Båda värd cellinjer är av mänskligt ursprung: epitelceller representerar cystisk fibros bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o-), och THP-114 celler är en väl karakteriserad makrofag-liknande cellinje. Ett konfluentepitelskikt får först bildas på den övre sidan av brunnsplåtsinsatser innan de makrofagliknande cellerna tillsätts till det motsatta facket. När samkulturen är etablerad vid ALI, systemet är inokuleras med P. aeruginosa vid den apikala sidan. Detta infekterade co-culture system används sedan för att bedöma effekten av ett antibiotikum, t ex tobramycin. Följande end-points analyseras: epitelial barriärintegritet vad gäller transepitelialt elektriskt motstånd (TEER), visualisering av cell-cell- och cell-bakterieinteraktioner genom confocal laserscanningsmikroskopi (CLSM), bakterieöverlevnad genom räkning av kolonibildande enheter (CFU), värdcellsöverlevnad (cytotoxicitet) och cytokinfrisättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt och differentiering av celler i genomsläppliga stödinsatser
- Odla CFBE41o- i en T75-kolv med 13 mL av minimum essentiellt medium (MEM) som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% icke-essentiella aminosyror och 600 mg/L glukos vid 37 °C med 5 % CO2-atmosfär. Lägg till färskt medium till cellerna var 2–3 dag.
- Lossa cellerna efter att ha nått 70% sammanflödet i kolven med 3 mL trypsin- Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37°C i 15 min. Tillsätt 7 mL färsk MEM och centrifugera cellerna vid 300 x g i 4 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och tillsätt nya 10 mL MEM samtidigt som du stör klumparna genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Räkna cellerna med en automatiserad cellräknare eller hemocytometerkammare. Fröceller med en densitet på 2 x 105 celler/brunn i 12-brunnsplattor med genomsläppliga stöd (porstorlek på 3 μm, se Tabell över material).
OBS: Den automatiserade cellräknaren bestämmer cellernas antal, storleksfördelning och livsduglighet för cellerna (se Tabell över material). Genomsläppliga stöd med en porstorlek på 0,4 μm skulle kunna användas här; makrofager, i detta tillstånd, bör dock läggas direkt till den apikala sidan, och deras transcellulära migration kommer inte att bedömas i detta fall. - Fröceller vid flytande-flytande skick (LLC) genom att tillsätta 500 μL av cellupphängningen på den apikala sidan av det permeabla stödet och 1,5 mL färskt medium i den basolaterala sidan. Inkubera sedan celler vid 37°C under 5%CO 2, i 72 h.
- För att skifta till den luft-flytande gränssnitt (ALI) kultur, på den tredje dagen efter sådd, ta bort mediet från den basolaterala sidan först, sedan från den apikala sidan. Till den basolaterala sidan, tillsätt 500 μL färsk MEM och ändra mediet varannan dag tills cellerna bildar en konfluent monolayer.
OBS: För de förhållanden som används i detta protokoll, den CFBE41o- celler är vanligtvis konfluenta efter 3-7 dagar i kultur. - Bedöm epitelbarriäregenskaperna dag 7 genom att inkubera CFBE41o- celler med 500 μL-cellmedium i den apikala sidan och 1,5 mL i basolateralsidan i 1 h, vid 37°C under 5% CO2.
- Mät barriäregenskaper via transepithelial elektriskt motstånd (TEER), med en STX2 chopstick elektrod och en epitelial volt-ohmmeter; efter 7 dagar är detta högre än 300 Ω×cm².
OBS: Så småningom, i vissa membraninsatser, cellerna har låg TEER. Därför används inte permeabla skär med TEER < 300 Ω×cm².
- För att odla THP-1-celler, odla dem i en T75-kolv med 13 mL Av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletterat med 10% FCS, och inkubera vid 37 ° C under 5% CO2. Dela celler varannan dag genom att så 2 x 106 celler/mL-celler i en ny T75-kolv.
OBS: Icke-differentierade THP-1-celler odlas som monocyter i suspension.- Differentiera THP-1-cellerna enligt följande. Centrifugeringsinnehållet i en T75 vid 300 x g i 4 min. Kasta supernatanten, resuspend pelleten i färskt medium och lägg i en ny T75. Lägg 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) inkubera cellerna i RPMI i 48 h vid 37 °C och 5% CO2 atmosfär15.
OBS: Efter differentieringen med PMA förökar sig inte celler längre och fäster på kolven. - För att lösgöra THP-1 makrofagliknande celler, tvätta en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 °C och inkubera med 3 mL cellavlossningslösning (t.ex. accutase) som innehåller 0,5 mM EDTA i 10 min vid rumstemperatur.
- Inspektera cellerna under ett inverterat mikroskop för att leta efter cellavlossning. Tillsätt 7 mL färskt medium och centrifug vid 300 x g i 4 min vid RT.
OBS: Makrofager kan också lösgöras med trypsin-EDTA, 37 °C i 20 min. Trypsin är dock hårdare mot makrofager än den valda cellavlossningslösningen (se Tabell över material). - När du har tagit bort supernatanten räknar du åter upp makrofagcellerna i 3 mL av THP-1-medium till ett koniskt rör på 15 mL, räkna cellerna enligt beskrivningen i 1.1.2. och inkubera i högst 1 h vid 37 °C under 5 % CO2 innan samkulturen sätts upp.
OBS: THP-1 celler i suspension kan färgas med livsdugliga färgämnen för att avbilda samkulturen ytterligare. I detta steg använder du proceduren nedan (steg 1.2.5). - Stain makrofager med 10 μM av en cell viabilitet färgämne (baserat på omvandling av acetat moieties av intracellulära esteraser, se Tabell över material) där 3 μL av cellen viabilitet färgämnet appliceras på cellen suspension. Inkubera celler i 20 min vid 37 °C, 5% CO2, tvätta sedan 1x med PBS 37°C för att avlägsna färgämnet.
OBS: Centrifugera cellerna för att avlägsna färgämnet vid 300 x g i 4 min vid rumstemperatur (RT).
- Differentiera THP-1-cellerna enligt följande. Centrifugeringsinnehållet i en T75 vid 300 x g i 4 min. Kasta supernatanten, resuspend pelleten i färskt medium och lägg i en ny T75. Lägg 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) inkubera cellerna i RPMI i 48 h vid 37 °C och 5% CO2 atmosfär15.
2. Upprättande av en epitelial-makrofagsamkultur på genomsläppliga stöd
- Använd CFBE41o- monolayers vid ALI med TEER ≥ 300 Ω×cm² (steg 1.1.6.). Ta bort mediet från den nedre kammaren, försiktigt invertera stödet inuti en steril glas Petriskål (50 mm x 200 mm), och ta bort cellerna övervuxna genom membranet porerna på undersidan av membranet med hjälp av en cell skrapa.
OBS: På grund av porstorleken på 3 μm tenderar epitelceller att växa genom porerna mot den basolaterala sidan. Därför måste man ta bort dem innan du lägger till makrofager på denna sida. CFBE41o- lungepitelceller kan färgas vid detta steg. Förfarandet i steg 1.2.5 kan användas; dock istället för en cell suspension, färgämnet lösning i MEM tillämpas (500 μL apikala sidan endast) på den följsamma cellerna på permeabla stöd. - Använd 2 x 105 celler/brunn (i 200 μL RPMI) från cellupphängningen av PMA-differentierade THP-1-makrofager och placera cellerna på den inverterade skärens basolaterala sida.
- Stäng petriskålarna försiktigt och inkubera i 2 h vid 37 °C under 5 % CO2.
- Placera skären tillbaka i 12-brunnsmikroplattorna och tillsätt 500 μL MEM-medium i den genomsläppliga skärssidans basolaterala sida för att bibehålla ALI-förhållanden. Cellerna är nu redo för infektion.
3. Infektion av P. aeruginosa
OBS: Alla följande steg härifrån måste göras i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2).
- Inokulera 15 mL lysogeny buljong (LB) kompletterad med 300 μg/mL ampicillin i en Erlenmeyerkolv (50 mL) med en enda koloni av P. aeruginosa PAO1-GFP.
OBS: Andra stammar av P. aeruginosa kan också användas här, till exempel, PAO1 vild typ, PA14, eller kliniska stammar, efter sina egna odlingsprotokoll. - Inkubera bakterierna i 18 h vid 37°C, skakningar vid 180 rpm.
- Överför innehållet efter 18 h till ett 50 mL koniskt rör och centrifug vid 3850 x g i 5 min. Kassera supernatanten och tillsätt 10 mL steril PBS vid 37°C.
- Mät optisk densitet på en spektrofotometer vid våglängd 600 nm och justera koncentrationen av bakterier med hjälp av cellodlingsmediet till en slutkoncentration på 2 x 105 CFU/mL. Detta motsvarar en multiplicity av infektion (MOI) av en bakterie per epitelcell.
- Tillsätt 100 μL bakterie suspension till den apikala sidan av det permeabla stödet (steg 2.4.) och inkubera vid 37 °C under 5% CO2 i 1 h, för att tillåta bakterier fastsättning till cellerna. Ta sedan bort apikal vätska försiktigt med en pipett för att återställa ALI-förhållanden. Håll vissa prover oinfekterade som en kontroll.
OBS: I detta skede bör de bifogade bakterierna pläterades i LB-agar (se steg 5.4/5.5) för att bestämma de initiala bakteriernas inokulat. - Inkubera läkemedlet av intresse efter bakteriell vidhäftning i cellerna. För behandlingsexperiment, tillsätt 500 μL av en läkemedelslösning utspädd i cellmedium (i detta protokoll användes tobramycin 6 μg/mL) till den apikala sidan. Tillsätt 1 500 μL cellmedium utan läkemedel på basolateralsidan.
OBS: Istället för att ingjuta drogerna som en lösning, kan modellen också anpassas till aerosoldeposition. För sådana ändamål matas cellerna vid ALI från den basolaterala sidan med 500 μL cellmedium. Läkemedlet är sedan först nebuliserade och får deponera i den apikala facken av en lämplig enhet (inte beskrivs här). Det infekterade och behandlade provet kan kontrolleras för de ändpunkter som beskrivs i avsnitten 4–7. Från detta steg kan genomsläppliga stöd användas för att skapa antingen bilder (avsnitt 4) eller för att få resultat av bakterietillväxt och däggdjurscellens livskraft, bland andra (avsnitt 5–7).
4. Provförberedelse för konfokal laser-scanning mikroskopi (CLSM)
- Efter inrättandet av den samkultur, infektion och läkemedelsbehandling, ta bort alla medium från den apikala och basolaterala sidan. Tvätta 1x med PBS vid 37°C och fixera sedan cellerna med 3% paraformaldehyd (PFA) i 1 h vid RT (300 μL på apikakal/600 μL på basolateral). Cellkärnor färgas med 5 μg/mL av DAPI-PBS i 30 min vid rumstemperatur.
VAR FÖRSIKTIG: PFA är farligt. - Kapa membranen med hjälp av en skalpell och placera dem mellan två 12 mm mikroskopikåpaglas med hjälp av ett monteringsmedium (se Tabell of Materials). Låt den torka inuti flödesbänken i 30 min före förvaring vid 4 °C. Visualisera genom confocal scanning mikroskopi.
OBS: Efter samkulturen och före monteringen kan snäva korsningar immunfärgning utföras. För det är celler fixerade med paraformaldehyd 3% i 30 min, tvättas igen med PBS, och permeabilized med saponin 0,05%/BSA 1% i PBS. I detta protokoll upptäcktes zonula occludens protein (ZO-1) via mus anti-human ZO-1 antikropp (1:400, inkubation vid 4 °C över natten). Proverna inkuberades sedan i 2 h vid RT med get anti-mus IgG antikropp Alexa Fluor 633 (1:2000 i rött). Kärnor var färgas med DAPI (1 μg/mL) och monteras med montering medium på coverslips. - Använd ett konfokalmikroskop för avbildning av de lagrade membranen. Välj 25x eller 63x vatten-nedsänkning mål och lasrar på 405, 488, 505 eller 633 nm för detektion. Bilder ska ha en 1024 x 1024 pixelupplösning.
OBS: Lasrarna väljs enligt den fläck som används. - Skaffa apikala och tvärsnittsvyer, och använd zeta-stack-läget (10–15 stackar) för konstruktion av en tredimensionell modell med hjälp av bildhanteringsprogram.
5. Mätning av bakteriespridning via kolonibildande enheter (CFU)
- Samla det apikala och basolaterala mediet (innehållande bakterier) för att bedöma CFU av icke-bifogade bakterier. Samla 500 μL från de apikala och basolaterala sidorna och poola dem.
OBS: Använd denna suspension direkt för att räkna bakterier (steg 5.4) eller centrifug vid 21.250 x g för 10 min för att utvärdera laktat dehydrogenas (LDH) från supernatanten (avsnitt 6) och/ eller åter upphängd i PBS för att räkna extracellulära bakterier (steg 5.4). - Bedöm överlevnaden av bakterier som fästs och/eller internaliserats i cellerna genom att tillsätta 500 μL sterilt avjoniserat kallt vatten i varje fack i det genomsläppliga stödet. Inkubera celler i 30 min i rumstemperatur.
OBS: Proverna kan antingen pläterades på LB-agar (se steg 5.4) eller frysas (som hela insatsplattan) vid -20 °C för bordläggning längre fram. - För bedömning av CFU av vidhäftande/internaliserade bakterier, tina prov vid 37°C i 10 min (om de är frysta). Använda pipettspetsar för varje brunn, skrapa membranytan och pipetten upp och ner för att ta bort allt följs innehåll.
OBS: Vid detta steg är alla epitelceller lyst och vidhäftande/internaliserade bakterier finns som en suspension som ska pläteras. - Med bakterieupphängningen från båda fraktionerna, utför en 1/10 serieutspädning med hjälp av Tween-80 0,05% i PBS och platta bakterierna på LB-agarplattor.
OBS: Spädningar i mellan 1 till 10 rekommenderas. Bakterierna ska räknas i den högsta utspädningen, där enstaka kolonier först identifieras. - Inkubera agarplattor i 30°C i 16–72 h för att räkna kolonier, och beräkna CFU därefter.
OBS: En temperatur på 30°C vid tidpunkten för pläteras inkubation är väsentlig för behandlade-prover och för att observera fördröjd-tillväxt av kolonier.
6. Utvärdering av cellcyttoxicitet via laktat dehydrogenasanalys
- Använd supernatanten för infekterade celler som innehåller bakterier (från steg 5.1) för bedömning av cellens bärkraft för LDH-analys16. Centrifugera supernatanten på 21 250 x g i 10 min för att pelleta bakterierna och så småningom vila av cellerna. Använd den bakteriefria supernatanten för att mäta LDH-frisättning.
OBS: Supernatanten ska inte frysas innan du mäter LDH genom denna analys. - Överför 100 μL av supernatanten till en 96-brunnsplatta, och tillsätt 100 μL av LDH-analyslösningen (se tabellen över material). Inkubera i rumstemperatur i 5 min i mörker, läs sedan av absorbans vid 492 nm.
7. Bedöma frisättningen av humancytokiner
- För cytokinkkvantifiering, använd antingen ELISA eller cytometric bead array immunoassay17 (se tabellen över material). För detta, centrifugera supernatant från steg 5.1 vid 21.250 x g för 10 min och mäta antingen omedelbart eller lagra -80 °C i upp till 15 dagar fram till analys.
- Utvärdera supernatanter med ett ELISA-kit som finns kommersiellt.
OBS: Förfarandet följer tillverkningsanvisningarna, som omfattar beläggning av plattor med avskiljningsantikroppen, tillsats av proverna (100 μL) och cytokinstandarder, inkubation, tvättning, och tillsats av detektionsantikropp för att ge en kolorimetrisk mätning av cytokin närvaro. Alternativt kan flödescytometri användas för att mäta cytokiner via kommersiellt tillgängliga kit (se Table of Materials).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar morfologin av den resulterande samkulturen av mänskliga bronkial epitelceller och makrofager efter växande både för 24 h på den apikala och basolaterala sidan av permeabla stöd, respektive. Epitelial barriärintegriteten visas genom högre TEER (834 Ω×cm2) och CLSM genom immunfärgning för den snäva korsningen proteinET ZO-1 (Bild 1B). Samma resultat som observerats i termer av barriärintegritet av oinfekterade CFBE41o- monokultur kunde ses i de oinfekterade epitelial-makrofag-co-kulturer.
För att modellera en bakteriell infektion, P. aeruginosa var inokuleras vid en multiplicity av infektion (MOI) av 1:1 på CFBE41o- celler. Sex timmar efter infektion (Figur 2A), var makrofager observerades på den apikala sidan av samkulturen. Efter infektionen sjönk TEER från 834 till 250 Ω×cm2, vilket indikerar en komprometterad epitelbarriär, som också visualiseras genom ZO-1-färgning (Figur 2B).
Figur 3 visar makrofagtransmigration genom de permeabla membranet porerna och bakterier upptag av THP-1 celler på den apikala sidan. Proverna fastställdes till 1, 3 och 6 h post-inkubation från oberoende experiment. I monokulturerna THP-1 (figur 3A–C) observerades makrofagers migration så tidigt som 1 h, medan man i samkulturen (Figur 3D–F) sågs detta efter 3 h infektion. Bakterier upptag i THP-1 observerades efter 3 h av infektion, i både monokultur och co-kultur. Ingen bakterieupptag av CFBE41o- kunde ses. Tvärsnittsvyer placerades så att det permeabla membranstödet var i mitten som en separation av det apikala och basolaterala delfacket.
Bild 4 visar konfokala scanninglasermikroskopibilder av infekterade samkulturer (CFBE41o- + THP-1) som behandlats med eller utan tobramycin i 6 h (Figur 4A, B) eller 20 h ( Figur4C,D). Utan behandling dog både epitelcellerna och makrofagerna efter 20 h infektion (Figur 4C). Vid tobramycinbehandling bevaras dock värdcellerna efter 20 h; fortfarande kan vissa bakterier observeras i kulturen. Trots att de sågs efter 6 h behandling i mikroskopibilderna (Figur 4B) förökade sig inte bakterierna som observerats i CFU-analyser i figur 4E. Trots detta återhämtade sig bakterierna efter 20 h-behandling proliferationsförmågan, vilket kan ses av kolonierna i CFU-analysen (Figur 4F). Celllysprotokollet med kallt vatten och skrapning kan frigöra bakterier som bifogas och eventuellt internaliseras i celler. Samtidigt förstörs cellerna ( KompletterandeFigur S1A, B). Centrifugationsstegen som används i detta papper för epitelceller (300 x g) eller bakterier (21,250 x g) hindrade inte livskraften hos båda (Tilläggsfigurer S1C, D). Alla CFU-analyser utfördes genom att man fryser in proverna vid -20°C, följt av upptining och plätering. Detta förfarande minskade antalet bakterier med 2-stockar, jämfört med färska prover (Kompletterande Figur S1E). Eftersom detta förfarande görs samtidigt för alla försöksgrupper (behandlade och obehandlade) vid olika tidpunkter kommer denna minskning att införlivas i de slutliga resultaten (Kompletterande figur S1E). Koncentrationen av tobramycin som används här visade dessutom ingen toxicitet för de ickeinfekterade cellerna (Kompletterande Figur S2A) och inte heller något ytterligare inflammatoriskt svar (Kompletterande Figur S2B). Det var dock inom intervallet för den minsta hämmande koncentrationen att döda P. aeruginosa.
I figur 5 visas det transepiteliella elektriska motståndet (TEER) och cellens livskraft. Figur 5A–B illustrerar monokulturers och samkulturers TEER. Samkulturen av CFBE41o- celler med THP-1 inte inducera någon förändring i epitelial barriär integritet jämfört med monokultur (röda staplar). Vid infektionen sjönk TEER-värdet (grön stapel). Efter 1 h av infektion, vissa prover behandlades med antibiotika tobramycin (blå bar), för 6 eller 20 h. Behandlingen bevarade epitelial barriär integritet, som observerats av den högre TEER. Figur 5C visar procentandelen LDH-frisättning som en indikation på celltoxicitet vid infektion och tobramycinbehandling efter 6 h. Samkulturen i sig inducerade en frisättning av LDH, vilket var detsamma för de infekterade cellerna (cirka 20%). Efter 20 h av infektion, ingen signal av LDH kunde upptäckas. För att bevisa LDH tillförlitlighet för långvarig infektion, PAO1-GFP inkuberades på medellång med och utan LDH 1 U/mL jämfört med respektive oinfekterade kontroller (Kompletterande Figur S2C). LDH-signalen förlorades efter långvarig inkubation (20 h) med P. aeruginosa, vilket indikerar att LDH endast är stabilt i kortare inkubationstider i infekterade kulturer.
Figur 6 visar kinetiken för proinflammatoriska cytokiner som detekterats via ELISA. Fördelen med en infekterad samkultur av CFBE41o- och THP-1-celler observerades med de högre sekret av proinflammatoriska cytokiner. Utsöndring av vissa proinflammatoriska cytokiner var antingen likartad (IL-6) eller högre (IL-8, TNF-α, IL-1β) i den infekterade samkulturen (Figur 6C) än i motsvarande monokulturer (Figurerna 6A-B). Oväntat är vissa cytokiner i THP-1 monokulturer (Figur 6B) nedreglerade i infekterade prover (Il-8, TNFα, IL-1β).
Figur 7 visar frisättningen av cytokiner i mono- och samkulturer vid infektion och behandling med tobramycin mätt via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Utsöndring av den proinflammatoriska cytokin IL-8 (Figur 7A) och den antiinflammatoriska cytokin IL-10 (Figur 7F) var högre i co-kulturer epitelceller och makrofager, jämfört med monokulturerna. Men för alla andra cytokiner (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 och GM-CSF) (Figurerna 7B–E) var halterna av cytokinsekretion inte högre i den samkultur som i respektive monokulturer.
Figur 1: Tvärsnitt och apikala vyer av den ickeinfekterade kokulturen epitelial-makrofag. (A) Kors åsikter av oinfekterade 24 h epitelial-makrofag samkultur. CFBE41o- färgas röd, THP-1 makrofager i gult och kärnor i blått (DAPI). (B) Apical åsikter av den icke-infekterade CFBE41o- monolayer immun-färgade för ZO-1 (röd). DAPI: kärnor. Skala barer: 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Tvärsnitt och apikala vyer av den infekterade epitelial-makrofagsamkulturen. (A) Cross åsikter och (B) apikala syn på epitelial-macrophage co-kultur vid 6 h post-infektion (hpi) med P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- färgas i rött, THP-1 makrofager i gult, kärnor i blått (DAPI) och P. aeruginosa PAO1-GFP i grönt. (B) Apical åsikter om 6 h infekterade CFBE41o- monolayer. Skala barer: 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Kinetik av makrofagtransmigration och bakterieupptag som visualiseras med tvärsnitt av 3D-modellen. PAO1-GFP infektionskinetik i monokulturer av THP-1-makrofager (A–C) eller samkultur (D–F). THP-1 makrofager färgas i rött, kärnor av epitelceller i blått (DAPI), och P. aeruginosa i grönt (GFP). Varje figur är uppdelad i apikala och basolaterala sidor, utrymmet däremellan anses vara membranet, som är tomt eller ockuperat av CFBE41o- konfluentskiktet (D–F). Skär i figurerna visar bakterier upptag av makrofager vid olika tidpunkter (A–F). Skala barer: 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av PAO1-GFP överlevnad i tobramycinbehandlade co-culture. (A–D) Konfokala mikrografer co-kulturer med och utan behandling. (A) Obehandlad samkultur efter 6 h av infektion. (B) Infekterad samkultur behandlad med tobramycin 6 μg/mL (Tob) i 6 h. (C) Obehandlad samkultur 20 h post-infektion, (D) infekterad samkultur behandlad med tobramycin 6 μg/mL i 20 h. Kärnor färgas med DAPI (blå), makrofager (röd) och P. aeruginosa GFP (grön). (E) Kolonibildande enheter (CFU) av vidhäftande/internaliserade bakterier efter 6 och (F) 20 h med tobramycin 6 μg/mL-behandling. Tomma membran insats användes som en abiotisk substrat att växa PAO1-GFP. Tvåvägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest (# inga kolonier) användes, *p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; ns: inte betydande. Felstaplar indikerar standardavvikelse, n = 9–27 replikat av 3–9 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Barriärintegritet och utvärdering av livskraften hos mono- och samkultur. Följande samkultur villkor bedömdes: oinfekterade (grå staplar), infekterade (gröna staplar), eller infekterade och behandlas med tobramycin (blå barer). (A) Transepithelial elektriskt motstånd efter 6 h och (B) 20 h av infektion i mono-kulturer (CFBE41o- och THP-1) och samkultur. (C) Cytotoxicitet av mono- och samkultur mätt via LDH frisättning 6 h post-infektion. Tvåvägs ANOVA med Tukeys test av flera jämförelser användes; *p < 0.05; p < 0.0001; ns: inte betydande. Felstaplar anger standardavvikelse; n = 9 replikat av tre oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Kinetik av cytokinfrisättning av icke-infekterade och infekterade mono- och samkultursupertanter bedömda via ELISA. ELISA gjordes enligt kittillverkarens protokoll. (A) CFBE41o-, (B) THP-1, och (C) samkultur släppa IL-8, TNF-α, IL-1β, och IL-6. Felstaplar indikerar standardavvikelse. n = 6 replikat av 2 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Supernatant resultat av cytokinpanel mätt via FACS med och utan tobramycin 6 μg/mL för 6 h post-infektion. Supernatanter av mono- och samkultur efter 6 h post-infektion som används för att analysera respektive cytokiner IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) och IL-10 (F). Felstapel anger standardavvikelse, n = 9 replikat av 3 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Kontrollexperiment för kritiska steg i protokollet. (A, B) Mikrografer av CFBE41o- celler i 24-brunnsplattor som odlas i 2 dagar vid densitet av 2 x 105 celler/brunn. (A) CFBE41o- celler i PBS i 30 min, och (B) vattenbehandlade celler efter 30 min efter skrapning med en pipett. (C) Livsduglighet för däggdjursceller efter centrifugeringen. CFBE41o- celler togs bort från T75 cellodlingskolv enligt beskrivningen i steg 1.1.1 och 1.1.2. 100 μL av resulterande cell suspension analyserades i 10 mL isoton lösning. En automatiserad cellräknare användes för att bedöma livskraften hos enstaka celler. Sedan centrifugerades respektive cell suspensioner vid 300 x g i 4 min, åter upphängda och räknade igen. Felstaplar indikerar standardavvikelse, n = 6 olika kolvar med 2 enskilda experiment. (D) Genom livskraft pao1-GFP efter centrifugeringen. PAO1-GFP-bakterier späddes ut till OD = 0,01 i cellmedium. CFU bedömdes via en 10-faldig utspädningsrad och LB-plattor som inkuberades över natten vid 30 °C. Respektive plaströr centrifugerades vid 21.250 x g för 10 min och åter upphängd i medium. CFU bedömdes därefter igen. Tvåstjärtade elevens t-test, * p < 0.033. Felstapel anger standardavvikelse, n = 6 av 2 experiment. (E) Genom livskraft av bakterier efter frysning. PAO1-GFP bakterier var beredda som i (D) och CFU analyserades, sedan plaströr var fryst för en dag vid -20 °C och tinas för att bedöma CFU igen. Två-tailed studentens t-test, *** p < 0.001. Felstaplar indikerar standardavvikelse, n = 6 av två experiment. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur S2: Kontrollexperiment för att bedöma LDH beteende och påverkan av tobramycin. (A) Kontrollexperiment för att bedöma cytotoxicitet efter 20 h inkubation med 6 μg/mL tobramycin. Mono- och samkultur gjordes som beskrivs i protokollet, men celler odlades i 2 dagar på 24-väl plattor och THP-1 celler var seedade apiskt. Celler med 6 μg/mL tobramycin eller kontroller inkuberades i 20 h. Enkelriktad ANOVA, Tukeys flera jämförelser test, *** p < 0,001. Felstreck anger standardavvikelse, n = 6 av 2 experiment (CFBE41o-), n = 3 av ett experiment (THP-1 och samkultur). (B) Kontroll-ELISA av supernatanter av mono- och samkultur med/utan tobramycin. Cellodling gjordes enligt (A) för att visa ingen cytokin frisättning jämfört med kontroller för alla villkor. ELISA gjordes i steg 7.1 och 7.2, 10 μg/mL (LPS) lades till som kontroll, IL-8 release för LPS-behandlade kontroller som innehåller THP-1 var högre än detekterbara. Two-Way ANOVA, Tukeys test av flera jämförelser, ns p > 0.12; * p < 0,033; p < 0.001. Felstaplar indikerar standardavvikelse, n = 6 av två experiment, n = 3 av ett experiment (LPS-kontroll). (C) LDH-nedbrytning på grund av överdriven PAO1-GFP-spridning. LDH tillsattes vid koncentration av 1 U/mL till MEM Medium. Antingen användes LDH-medium eller kontrollmedium för att späda ut celler till OD = 0,01 (motsvarar 1 x 108 CFU/mL) och sedan inkuberades i 20 h. LDH-analysen gjordes enligt beskrivningen i avsnitt 6. Enkelriktad ANOVA, Tukeys test av flera jämförelser, ns p > 0.12; p < 0.001. Felstapel anger standardavvikelse, n = 8–9 av tre enskilda experiment. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver ett protokoll för en 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna, som utgörs av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o- och den mänskliga monocyte-härledda makrofag cellinje THP-1. Protokollet tillåter bedömning av epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakterier överlevnad, och inflammation, som är viktiga parametrar när man testar läkemedelseffekt och host-svar samtidigt. Nyheten i modellen ligger inom införlivandet av epitelceller (dvs. human CF cellinje och makrofager) med akut bakteriell infektion (dvs. P. aeruginosa). Den akuta infektionen i epitelcellerna påvisas vara kontrollerad av ett antibiotikum (dvs. tobramycin). Förutom bruket av en människa CF-celfodrar, modellerar helheten är uppsättningen upp på ALI villkorar, som är betydligt närmare det fysiologiskt, villkorar i CF. Bruket av en CF-cell fodrar genomför några av kännetecknen av sjukdomen i modellera. Mutationen av cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) är direkt relaterad till dysregulation av epitelvätska transport i lungorna. Vidare resulterar mutationer i CF-genen, såsom ΔF508, i tjockt slem, med inflammation och allvarlig lungskada vid infektion med P. aeruginosa4. Dessa patologiska manifestationer som orsakas av dysfunktionella CFTR potentiellt innebära autofagi nedskrivningar som en viktig cellulär mekanism i samband med patogenesen vid CF lungsjukdom18. Dock, den CFBE41o- misslyckas med att hemliga slem, vilket är en begränsning av denna cellinje. Om det är avsett att studera slemets roll mer specifikt kan protokollet anpassas genom att använda andra luftrörscelllinjer (t.ex.
Ett kritiskt steg för att ställa in detta protokoll är kombinationen av epitelial och immunceller och den efterföljande infektionen med P. aeruginosa vid ALI. Infektionen av CFBE41o- av P. aeruginosa in vitro har redan beskrivits, främst med hjälp av en flow-cell kammare, kompletterad med arginin i odlingsmedierna, för att förbättra epitelial cell överlevnad och stödja biofilmbildas 19. Det föreliggande protokollet syftade till en ny modell med endast mänskliga celler, som dessutom skulle kunna odlas vid ALI på genomsläppliga brunnsplåtsinsatser för högre provgenomströmning. Införandet av THP-1 differentierade makrofager som en mänsklig förevigade cellinje, i stället för att vara beroende av att erhålla reproducerbara primära celler från givare, är en annan fördel med vår modell. Genom att lägga till dessa makrofager till den basolaterala sidan av permeabla membran stöd, det observerades att makrofager utskjutande och så småningom transmigrerade till den apikala sidan av filter-odlade epitelial barriär. En variant av detta protokoll skulle kunna vara tillägg av makrofager direkt på den apikala sidan ovanpå epitelcellerna, som beskrivs av Kletting et al. 14. Samkulturen av icke-mänskliga immun- och lungceller har redan beskrivits tidigare. Ding et al. 10 används mus Lewis lung carcinom celler på permeabel infoga stöder i kombination med makrofager på basolateral sidan och infekterade med S. aureus, en annan kritisk patogen av kronisk infektion i CF patienter. I denna studie fanns dock inget fokus på cystisk fibros eller att använda samkulturen som plattform för utvärdering av läkemedelseffekt. Vårt protokoll kan anpassas för andra bakteriella infektioner, såsom Staphylococcus aureus, Mycobacterium abscessus, eller Burkholderia cepacia— viktiga patogener i CF lunga.
Ett annat kritiskt steg är tillsats av THP-1 makrofager till cellerna genom att vända de genomsläppliga skär upp och ner (avsnitt 2). Detta är avgörande för att bedöma makrofag transmigration genom brunnen till sidan av infektion. Den senare bildframställningsprocessen från 3D-modellerna med z-stackar, och tvärsnittsvy, kan utföras för att observera insidan av makrofager och upptäcka bakterieupptag (Figur 3). Vid 1 hpi migrerar bakterier som appliceras på den apikala sidan genom membranet, medan makrofagmigration och upptagning endast sker vid 3 hpi. Därför efter 1 h av infektion, var det lämpligt att starta behandlingen med tobramycin och har möjlighet att ta itu med både värdcell och bakterier överlevnad under en lång period (20 h). Under protokollets gång är upprätthållande av sterilitet en kritisk fråga på grund av de många steg som var och en bär risken för kontaminering. Trots det kommer erfaren personal inom cell-kultur att kunna följa detta protokoll efter lämplig förberedelse och utbildning. Cellmedium bör regelbundet kontrolleras för kontaminering, helst efter alla kritiska steg.
Som med alla modeller, den infekterade samkulturen har också vissa begränsningar; till exempel integreringen av de makrofagliknande cellerna. Här var det viktigt att ha makrofager på basolateralsidan; dock kan manipuleringen av skäret med ett tidigare odlat epitelskikt ha gett tidiga skador och störningar i samkulturen. Även om, den genomsläppliga stöd modellen som hög genomströmning egenskaper, som inte har observerats i tidigare samkulturer av CF infekterade lung20,21. Med det måste ytterligare experiment bedöma begränsningarna med att använda THP-1 som makrofagersättning. Medan denna cellinje används i stor utsträckning, är det mindre lyhörd för LPS22 och det saknar full aktivering och hela befolkningen är inte differentierad från monocyter till makrofag-liknande celler23. En annan begränsning är bristen på andra viktiga komponenter i CF infektion och drug delivery. DEN CFBE41o- cellinje inte har cilier inte heller producerar slem, som vanligtvis händer 20-30 dagar av cellkultur vid ALI. Eftersom detta inte var fallet för CFBE41o- cellinje, använde vi cellerna efter sju dagar när en stram epitelial barriär bildades. Mucociliary clearance förändrar uppehållsvillkoren för antingen mikrober24 eller läkemedelspartiklar9,25 och in vitro-modeller som bedömer lungdeposition bör ta hänsyn till detta. Annorlunda än vad som observeras av andra celler, vävnadskulturen skär beläggning med en extracellulär matris material (som fibronectin eller kollagen I) inte visar en signifikant skillnad för CFBE41o-, till exempel i TEER26. Därför var de genomsläppliga filtren inte belagda med ett extracellulärt matrismaterial i detta protokoll.
Med det protokoll som beskrivs här, mono och co-kulturer efter 6 h infektion ger tillräcklig cytokin frisättning för att användas som en mätning i framtida drogtester. Samkulturen medför en fördel med cellsamarbete när det gäller att modellera immunsvar. Tobramycins ineffektivitet i att minska inflammation förväntades eftersom inte alla bakterier eliminerades under behandlingen (Figur 4E, F). Ändå modellering svaret på tobramycin i en CF-modell är avgörande, som tobramycin (i högre koncentrationer) kan vara effektiva i P. aeruginosa hämning, även på biofilm19,27. En möjlighet för vidare användning av detta protokoll är att integrera antiinflammatoriska läkemedel i behandlingen. Den övergripande rekommendationen om inflammatoriska reaktioner skulle vara att använda kortvarig behandling (6 h), som fortfarande har värdcellen och bakterierna närvarande. Efter denna tidpunkt förstörs värdcellerna i obehandlade prover. Både ELISA och FACS skulle kunna användas för att mäta frisättningen av cytokiner. Slutligen, om proverna lagras längre än 15 dagar vid -80 °C, rekommenderas att kontrollera tillförlitligheten hos cytokinerna genom att till exempel använda positiv kontroll av färska prover (t.ex. celler som stimuleras med LPS).
Vissa modifieringar av protokollet är möjliga. Det aktuella protokollet kan till exempel utökas till tillämpningen av nebuliserade läkemedel (steg 3.6). Detta är nödvändigt att modellera pulmonell drug leverans via oral inandning. Nebulisering av vattenlösliga läkemedel, som tobramycin, eller nano-bärare därav, såsom liposomal colistin, är relativt rakt fram av kommersiellt tillgängliga enheter rutinmässigt används i kliniken. Det finns också flera kommersiellt tillgängliga enheter för att deponera aerosoler på cellodlingsinsatser. Dessutom, som modellen beskrivs här bygger på genomsläppliga membranstöd, det skulle också kunna antas till vissa samtida mikrofluidiska (t.ex. "lunga på ett chip") enheter, till exempel för att studera påverkan av andning och den relaterade mekanisk stretching och förändringar i luftflödet. Dessutom skulle detta protokoll kunna modifieras genom tillsats av slem eller ersättning av primärceller beroende på vilken vetenskaplig fråga som skall behandlas. Ett annat intressant nästa steg skulle vara testning av nanoläkemedel, särskilt som nanoteknik gör framsteg i utvecklingen av nya anti-infectives28, CF correctors29 och samleverans av antibiotika och patoblockers30. Det nuvarande protokollet kan sammantaget uppfattas som användbart vid bedömning av bakteriell överlevnad vid behandling av antibiotika i ett komplext system, tillsammans med vissa värdrelaterade avläsningar: cellcyttoxicitet, epitelial barriärintegritet, makrofagtransmigration och inflammatoriskt svar. Dessa är väsentliga parametrar för läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick finansiering från EU:s HORIZON 2020-program för forskning, teknisk utveckling och demonstration enligt bidragsavtal nr 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design, and Development of advanced Nanomedicines to overcome Biological Barriers and to treat severe diseases. Vi tackar Dr Ana Costa och Dr Jenny Juntke för det stora stödet för utvecklingen av samkulturen, Olga Hartwig, för den vetenskapliga illustrationen, Anja Honecker, för ELISA analyser, Petra König, Jana Westhues och Dr Chiara De Rossi för stöd på cellkultur, analys och mikroskopi. Vi tackar också Chelsea Thorn för korrekturläsning av vårt manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
