Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.
Abstract
תרבות החיים לשעבר של קרדיומיוציטים יונקים בוגרים (CMs) מציגה את המערכת הניסיונית הרלוונטית ביותר למחקר במבחנה של ביולוגיה לבבית. CMs יונקים בוגרים הם תאים מובדילים סופנית עם קיבולת התפשטות מינימלית. המצב שלאחר המיטוטיקה של CMs למבוגרים לא רק מגביל את התקדמות מחזור תא cardiomyocyte, אלא גם מגביל את התרבות היעילה של CMs. יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים היא הכרחית עבור מחקרים רבים, כגון התפשטות CM וניתוח של ביטוי גנים.
העכבר והעכברוש הם שתי חיות המעבדה המועדפות ביותר שישמשו לבידוד קרדיומיוציט. בעוד התרבות ארוכת הטווח של CMs חולדה אפשרית, CMs עכבר מבוגר רגישים למוות ולא ניתן לתרע יותר מחמישה ימים בתנאים נורמליים. לכן, יש צורך קריטי לייעל את בידוד התא ואת פרוטוקול תרבות לטווח ארוך עבור CMs murine למבוגרים. עם פרוטוקול זה שונה, ניתן לבודד בהצלחה ותרבות הן עכבר בוגר ועכברוש CMs במשך יותר מ 20 ימים. יתר על כן, יעילות הטרנס-תום-רוחב של סי.אם מבודד גדלה באופן משמעותי בהשוואה לדוחות קודמים. עבור בידוד CM עכבר מבוגר, שיטת perfusion Langendorff מנוצל עם פתרון אנזים אופטימלי ומספיק זמן עבור דיסוציאציה מטריצה extracellular מלא. על מנת להשיג CMs חדרי טהור, שני atria נותקו והושלכו לפני שהמשיך עם ההתנתקות והציפוי. התאים פוזרו על צלחת מצופה למימינין, מה שאפשר חיבור יעיל ומהיר. CMs הורשו להסתפק 4-6 שעות לפני תירגם siRNA. מדיה תרבות היה רענן כל 24 שעות במשך 20 ימים, ולאחר מכן, CMs היו קבועים ומוכתמים עבור סמנים ספציפיים לב כגון טרופונין סמנים של מחזור תא כגון KI67.
Introduction
מחלות לב הן אחת הסיבות המובילות למוות ברחבי העולם. כמעט כל סוגי פגיעת לב לגרום לאובדן משמעותי של cardiomyocytes למבוגרים (CMs). לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים לתקן את פציעת הלב שלהם בשל אופיו הרגיש של CM1 הבוגר. לכן, כל עלבון ללב היונקים הבוגרים גורם לאובדן קבוע של CMs, המוביל לתפקוד לב מופחת ואי ספיקת לב. שלא כמו יונקים בוגרים, בעלי חיים קטנים כמו דגי זברה ולבבות ניוט יכולים לחדש את פגיעת הלב שלהםבאמצעות התפשטותCM קיימת 2,3,4. מאמץ עולמי הוא מתמשך למצוא התערבות טיפולית חדשנית עבור פגיעה לב באמצעות גישות הן proliferative ולא התפשטות. בעשורים האחרונים פותחו סוגים שונים של מודלים של עכברים גנטיים כדי ללמוד פגיעה ותיקון לב. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים vivo ממשיך להיות גישה יקרה עם המורכבות הנוספת כדי לפענח מנגנון תא אוטונומי מאפקטים משניים. חוץ מזה, במערכות vivo מאתגרים לנתח CM השפעות ספציפיות של התערבות תרופתית הגורם איתות cardioprotective מן CM.
יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים יש צורך לבצע ניתוחי התפשטות CM. CM התפשטות assays דורשים מינימום של 4-5 ימים עבור תאים להיות מושרה לתוך מחזור התא ולקבל נתונים מדויקים לאחר מכן. בנוסף, מחקרים המשתמשים CMs מבודדים עבור מחקרים אלקטרופיזיולוגיים, סינון סמים, מחקרי רעילות, ו Ca++ מחקרי הומסטאזיס כולם זקוקים למערכת תרבות משופרת5,6,7. יתר על כן, מחקרים אחרונים מראים את המשמעות cardioprotective של ציטוקינות הפרשת CMs (cardiokines)8,,9. על מנת לחקור את התפקיד הטיפולי ואת המנגנון המולקולרי של קרדיוקין אלה במהלך תיקון לב והתחדשות, נדרשת תרבות ממושכת.
מלשינים של חולדות בוגרות חזקים מספיק לבידוד חד-תאי ולתרבות ארוכת טווחבמערכת חוץ-חוץ-10,,11,,12. עם זאת, CMs עכבר מבוגר הם עניין רב עבור חוץ חוץ, בשל הזמינות של מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטית, המאפשר עיצוב וביצוע של ניתוחים חדשניים שונים שאינם אפשריים עם חולדה CM13. בניגוד לבידוד CM חולדה למבוגרים, זה די מאתגר לקבל השעיה חד-תאית מלבבות עכבר מבוגר, ואת התרבות לטווח ארוך של CMs עכבר מבוגר בתרבות הוא אפילו יותר מאתגר.
בידוד CM למבוגרים מלבבות עכבר וחולדות באמצעות מערכת Langendorff הוקמה בעבר כדי ללמוד CMפונקציה 5,14,15. כאן, תיארנו בפירוט את הפרוטוקולים לבידוד CM למבוגרים הן חולדות ועכברים, כמו גם תרבות ארוכת טווח שונה, transfection, והתפשטות CM של תאים מבודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). כל הפרוטוקולים המוצגים בסרטון אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה.
1. הכנה לפני חילוץ לב מעכברים בוגרים (וחולדות)
- הכינו את הפתרונות המתאימים, האנזימים והפסקת הפתרונות, בהתאם למתכונים שניתנו בטבלה 1 ובטבלה 2, לבידוד חולדות ועכברים, בהתאמה. לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm כדי להסיר כל זיהום או חלקיקים לא פתורים.
- נקה וחטא את כלי הניתוח על ידי השריה ב-70% אלכוהול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים כפולים. השאירו את הכלים לאוויר יבש על מגבת נייר נקייה.
- מחממים מראש את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס.
- נקה את אפליקציית ההתבות על-ידי ריצה עם 70% אלכוהול למשך 5 דקות.
הערה: הגדל את קצב הזרימה, המסייע לנקות את הצינורות. - לאחר זרימת האלכוהול, נקה את שאריות האלכוהול על ידי הפעלת מים מזוקקים כפולים במשך 10 דקות.
- להגדיר 3 פוליסטירן חד פעמי בגודל בינוני שוקל כלים כדי לנקות את הלב לאחר החתך. מלאו את הכלים ב-20 מ"ל של חוצץ מיוצ'יט.
- מוסיפים 2-3 טיפות של הפרין לכל מנה בעזרת פסטר פיפטה ומערבבים היטב על ידי התזת מספר פעמים.
- קח מזרק של 10 מ"ל עם נולה מחט קהה.
הערה: ניתן להכין חוט מחט קהה על ידי חיתוך קצה מחט נקייה וסטרילית. מחט 21 G ומחט 14 G שימשו כדי להפוך את הנולה עבור העכבר והעכברוש, בהתאמה. - מלא את המזרק במאגר סב(טבלה 1). מוציאים את כל בועות האוויר מהמזרק וממקמים אותו במנה השלישית בתנוחה זוויתית. תאבטחו את זה עם סרט הדבקה.
הערה: עבור חולדות, פתרון A (טבלה 2) שימש במקום מאגר התזת מיוצייט. - הכן קשר רופף עם תפר כירורגי והניע אותו סביב המחט.
- להזריק את העכבר עם הפרין (100 יחידות USP / עכבר) על ידי הזרקת תוך אפרטינול, 20 דקות לפני הזרקת ההרדמה.
- הפיצו את מאגר התזת המיוציטים (טבלה 1) דרך מערכת ההתזמה. הפחת את קצב הזרימה ל- 3 מ"ל/דקה.
הערה: עבור חולדות, פתרון A (טבלה 2) שימש במקום מאגר התזת מיוצייט. - לאחר 5 דקות, החלף את מאגר הזיתות בתמיסת האנזים(טבלה 1). הרוויה בתמיסת האנזימים בחמצן במהלך התהליך. השתמש בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה.
הערה: עבור בידוד CM חולדה, השתמש בפתרון E (טבלה 2) במקום זאת. - להרדים את העכבר על ידי הזרקת הרדמה תוך-אפרטונית. השתמש במינון המתאים של הרדמה, מומלץ על ידי IACUC, לניתוח מסוף.
- אשר עומק מספיק של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת בהון. לאחר מכן, שים את העכבר על הפלטפורמה הכירורגית.
2. חילוץ לב מעכברים בוגרים (וחולדות)
- לחטא את העור על ידי ניגוב עם 70% אלכוהול.
- פתח בזהירות את התיבה.
- תמחק את הלב. הימנע מרקמות שאינן לב במהלך החתך.
- מניחים את הלב על המנה הראשונה, מלאה במאגר התועה(שולחן 1).
הערה: השתמש בפתרון A עבור החולדה (טבלה 2). - לנקות את הדם מהלב על ידי לסחוט בעדינות.
- מעבירים את הלב למנה השנייה.
- לנקות את הדם מהלב ולהסיר רקמות שאינן לב. לאחר מכן, להעביר את הלב למנה השלישית.
- לקצץ את הריאות ורקמות אחרות שמסביב ולנקות דרך עורקים עולה. יש לבצע הליך זה במהירות האפשרית (<5 דקות) כדי לשפר את האיכות והכמות של CM.
3. עיכול הלב
- עיכול לב העכבר
הערה: כל הפתרונות/מאגרים המוסדורים דרך לב העכבר צריכים להיות מחומצנים לאורך כל ההליך.- בזהירות להסיר את מחט הקנולטה מהמזרק ולחבר אותו ל-Langendorff perfusion app app apparatus.
- הימנע מבועות אוויר שנכנסות ללב, מה שעשוי להשפיע על הזרימה של תמיסת האנזים והעיכול.
- הזז את מעיל המים למעלה כדי לספק סביבה הומוגנית ללב. אפשר לתמיסת האנזים לזרום דרך הלב במהירות של 2-3 מ"ל/דקה.
הערה: המהירות של הפתרון החולף היא קריטית ויש לה השפעה משמעותית על התוצאה של כמות ואיכות CM. - תן לתמיסת האנזים לזרום דרך הלב במשך 2 דקות.
- ב 2 דקות, להוסיף 40 μL של 100 μM CaCl2 פתרון אנזים ולערבב. תנו לתמיסת האנזים לעבור דרך הלב עוד 10-15 דקות.
הערה: ברגע שהזרימה הופכת חלקה, הלב הופך חום ורך, מה שמצביע על התפלגות שווה של אנזים הקולגן ועיכול תקין של הלב.
- עיכול לב העכברוש
הערה: כל הפתרונות/מאגרים המסתובבים דרך לב החולדה צריכים להיות מחומצנים לאורך כל ההליך.- בזהירות להסיר את מחט הקנולטה מהמזרק ולחבר אותו ל-Langendorff perfusion app app apparatus.
- הימנע מבועות אוויר שנכנסות ללב, מה שעשוי להשפיע על הזרימה של תמיסת האנזים והעיכול.
- הזז את מעיל המים למעלה כדי לספק סביבה הומוגנית ללב.
- התחל את זרימת תמיסה A במהירות של 2-3 מ"ל/דקה למשך 3-5 דקות כדי להסיר דם מהלב.
הערה: מהירות הפתרון העובר היא קריטית ויש לה השפעה משמעותית על התוצאה של איכות CM. - לאחר ניקוי הדם מהלב, עבור מפתרון א' לפתרון E(שולחן 2). תמיסת Titrate E עם CaCl2 כפי שצוין להלן עבור ריכוז סופי של 0.1 mM בפתרון:
- לאחר 10 דקות של עירוי, להוסיף 12.5 μL של 0.1 M CaCl2.
- לאחר 15 דקות של תב, להוסיף 25 μL של 0.1 M CaCl2.
- תנו לתמיסת האנזים לעבור דרך הלב עוד 30-40 דקות, עד שהזרימה הופכת מהירה והלב גמיש.
4. הכנת מתלה חד-תאי CM
- הכנת מתלה חד-תאי CM (עכבר)
- הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים אותה לצלחת פטרי 60 מ"מ מלאה בתמיסת אנזימים ב-5 מ"ל ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
הערה: הקפיטו עיכול לב מספיק לפני הסרת הלב ממערכת ההתזמה לנגנדורף. זמן העיכול תלוי בפעילות האנזימים, בזרימת התמיסה ובגודל הלב. - לבצע כל הפרדה מכנית נוספת בשכונה בטיחות ביולוגית כדי להבטיח עקירות ולהימנע מזיהום.
- בזהירות להסיר את atria (1/4th של חלק הלב בסיס) ורקמות שומן נוספות.
- טחון את הלב עם מפס לחתיכות בסדר.
- קח פיפטת פסטר סטרילית וחתוך את הקצה שלה בזווית של 45º.
- השתמש פיפטה פסטר זה כדי לחלק את רקמת הלב בהשעיה של תא יחיד על ידי pipetting עדין. עיכול אופטימלי מספק השעיה של קרדיומיוקיטים חד-תאיים.
הערה: הסר את החלק התחתון הצר של צינור ההעברה כדי להפחית את נזקי CM עקב צנרת מכנית. - לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של פתרון עצירה כדי לעצור את פעילות האנזימים, אשר מונע את האפשרות של עיכול יתר.
- קח חסום 50 מ"ל טרי ולהניח מסננת תא סטרילית 100 μm על זה.
- להעביר את מתלה cardiomyocyte דרך מסננת התא כדי להסיר את נתח הרקמה. שוטפים את צלחת פטרי ומסננת עם עוד 5 מ"לשל תמיסת עצירה ( שולחן 1) כדי לאסוף את כל cardiomyocytes שנשאר מחובר מסננת.
- הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים אותה לצלחת פטרי 60 מ"מ מלאה בתמיסת אנזימים ב-5 מ"ל ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
- הכנת מתלה חד-תאי CM (חולדה)
- הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים את הלב לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-5 מ"ל של תמיסה א' ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
הערה: הקפיטו עיכול לב מספיק לפני הסרת הלב ממערכת ההתזמה לנגנדורף. זמן העיכול תלוי בפעילות האנזימים, בזרימת התמיסה ובגודל הלב. - לבצע כל הפרדה מכנית נוספת בשכונה בטיחות ביולוגית כדי להבטיח עקירות ולהימנע מזיהום.
- בזהירות להסיר את atria (1/4th של חלק הלב בסיס) ורקמות שומן נוספות.
- טחון את הלב עם מפס לחתיכות בסדר.
- קח פיפטת פסטר סטרילית וחתוך את הקצה שלה בזווית של 45º.
- השתמש פיפטה פסטר זה כדי לחלק את רקמת הלב בהשעיה חד-תאית על ידי pipetting עדין. עיכול אופטימלי מספק השעיה של קרדיומיוקיטים חד-תאיים.
הערה: הסר את החלק התחתון הצר של צינור ההעברה כדי להפחית את נזקי CM עקב צנרת מכנית. - הוסף 5 מ"ל של פתרון B(טבלה 2)להתליית CM ולהעביר את הפתרון דרך מסננת תא 100 μm כדי להסיר את כל חתיכות שנותרו של שומן או רקמה אחרת שאינה מעכלת.
- לאסוף את הסינון בבקתון חרסי טרי 50 מ"ל.
- השתמש עוד 5 מ"ל של פתרון B כדי לשטוף את צלחת פטרי וכל CM שנותר דרך מסננת התא.
- הסר את הלב ממערכת התזת לנגנדורף. מעבירים את הלב לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-5 מ"ל של תמיסה א' ומעבירים את המנה למכסה המנוע של ה-biosafety.
5. הסרת הודעות שאינן CMs
- הסרת הודעות שאינן הודעות CMs מהמתלה של תא יחיד למבוגרים (עכבר)
- צנטריפוגה מתלה התא ב 20 x g במשך 3 דקות.
- בטל את supernatant והשתמש מחדש את התאים ב- 10 מ"ל של פתרון עצירה (טבלה 1).
הערה: הגדלת הריכוז של BSA בפתרון העצירה תגביר את צמיגותה ותפחית את קצב המפסקים של משתמשים שאינם CMs. - תוסתר מחדש את נותן MS על ידי היפוך עדין של הצינור 3-5 פעמים.
- במרווחי זמן של 3 דקות, הוסף 10 μL של 100 μM CaCl2 פתרון ולערבב. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
- לאחר התוספת הרביעית, צנטריפוגה מתלה cardiomyocyte ב 20 x g במשך 3 דקות.
- זרוק את הסופרנטנט.
- תוסתור מחדש ב-CMs מחום מראש (37 ºC), מדיית ציפוי CM עכבר מבוגר(טבלה 3).
- הסרת הודעות שאינן הודעות מ- CMs מהמתלים של תאים בודדים למבוגרים (חולדה)
- כדורי ב 20 x g במשך 3 דקות ב 25 ºC.
- בטל את supernatant וכנס מחדש את התאים לתוך 25 מ"ל של פתרון B(טבלה 2).
- מערבבים את התאים על ידי היפוך עדין ולמקם אותו בעמדה צינור כדי לאפשר CM להתיישב תחת כוח הכבידה.
- השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
- לתוספות מחדש את התאים טרי 25 מ"ל של פתרון B ו titrate זה 1.0 mM CaCl2 על ידי תוספת צעד של 50 μL, 75 μL, ו 100 μL של 0.1 M CaCl2 במרווחי 3-5 דקות.
הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בריכוז גבוה יותר של BSA בפתרון B. הגדלת הריכוז של BSA בפתרון B מגבירה את צמיגות ובכך, מפחיתה את קצב המ המום של משתמשים שאינם CMs. - כדוריות ב 20 x g עבור 3 דקות ב 25 ºC, לשאוף supernatant, ולהוסיף את הנפח הרצוי של מדיה תרבות תא חולדה למבוגרים(טבלה 4).
- זרעים CMs על צלחת מצופה למימינין.
הערה: ניתן להשתמש בציפוי מראש של CMs על לוח תרבות שאינו מצופה כדי למזער את הזיהום של תאים שאינם CM.
6. ציפוי CM למבוגרים
- ציפוי מראש
- תוסתה מחדש את הקרדיומיוציטים לתקשורת התרבות.
- מראש צלחת התאים לתוך צלחת 60 מ"מ או 100 מ"מ עבור עכבר או חולדה CM, בהתאמה.
- דגירה CMs עבור 2 שעות באינקובטור בתוספת 5% CO2 ב 37 ºC.
- במהלך הדגירה pre-plate, לכסות את צלחות תרבות התא עם למינין (10 μg / מ"ל ב PBS) עבור תרבות CM לטווח ארוך.
- לאחר 2 שעות של ציפוי מראש, לאסוף CMs בבקתון חסוני 50 מ"ל.
- לאסוף את התאים מהצלחת וצלחת מחדש אותם לתוך למינין מצופה 24 צלחת תרבות גם לניסויים טרנסאפציה.
- תאי תרבות באינקובטור ב 37 ºC בתוספת 5% עם CO2. 4-6 שעות מספיק כדי לדבוק cardiomyocytes עם פני השטח, ולכן, transfection יכול להתבצע 6 שעות לאחר ציפוי.
הערה: מדיום הציפוי המכיל FBS משמש בדרך כלל ומראה תאימות טובה יותר עם מחקרי התפשטות. עם זאת, אמצעי ללא סרום יכול לשמש לניסויים שבהם גורמים הפרשה מנותחים.
7. תברה
- דגירה CMs לצלחת תרבות התא מצופה למינין במשך 4-6 שעות.
- ארבע שעות לאחר זריעת CM על הלוח מצופה למימינין, להחבת תאים עם siRNAs (50 nM) של עניין באמצעות ריאגנט transfection (למשל, Lipofectamine RNAiMAX) על פי פרוטוקול היצרן.
- שנה מדיה 24 שעות לאחר הטרנס-תעבורה וכל 24 שעות לאחר מכן למשך עד 20 יום.
- לאחר 20 ימים, לתקן תאים עם 4% PFA ב PBS עבור יישומים במורד הזרם, כולל immunocytochemistry עבור סמנים ספציפיים לב כגון Troponin כדי להבטיח cardiomyocytes חיים היו תרבותיים בהצלחה לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הנוכחי שונה מאפשר בידוד יעיל ותרבות של חולדות ועכברים CMs במבחנה. עבור חולדה CM בידוד, בסך הכל 3 מבוגר (12 שבועות) זכר פישר 344 חולדות שימשו בהליך. איור 1 מציג את הגדרות הציוד הכירורגי והבידוד הנדרשות בהליך; כל חלק סומן ותואר במקרא הדמות. קולגנס סוג 2 שימש לעיכול, אשר מניב כמות גבוהה של CMs באיכות גבוהה מבידוד מוצלח (איור 2A). 24 שעות לאחר הבידוד, תאים אלה היו טרנסגאד עם מחזור תאים וגורם siRNAs ספציפי נגד Rb1 ו Meis2, ואילו, cel-miR-67 שימש כפקד transfectionבניסוי 11. CMs נשמרו בתרבות במשך שבעה ימים(איור 2B)או עד עשרים ימים(איור 2C)כדי לצפות בשינויים מורפולוגיים. כדי להבקיע עבור פעילות מחזור התא, CMs תוקנו ביום 7 ומוכתמים עבור סמן ספציפי לב Troponin-I, סמן מיטוטי KI67, ו גרעין היה חזותי באמצעות DAPI (איור 2D-F). עלייה משמעותית KI67 cardiomyocytes חיובי נצפתה עם siRb1 + siMeis2 טיפול בהשוואה לשליטה11. יתר על כן, cardiomyocytes חולדה היו מכות (פונקציית כיווץ) בתרבות ביום השביעי לאחר ציפוי, שהוא סימן ההיכר מאפיין של cardiomyocytes בריא11.
עבור בידוד CM בעכברים, בסך הכל 3 זכר ו 3 נקבה בוגרת (12 שבועות בן) C57BL/6 עכברים שימשו בהליך. בדומה למחקר העכברושים, קולגנאז סוג 2 שימש לעיכול הקולגן והמטריקס ה extracellular של הלב של העכברים הבוגרים. עכברים בוגרים CM הוא שביר יחסית לבידוד ותרבות במבחנה; לכן, פרוטוקול זה משתמש blebbistatin כדי לשפר את הכדאיות של CM העכבר הבוגר. בידוד מוצלח מניב >70-80% CMs צורת מוט בריא, אשר ניתן לתמרץ עד 20 ימים(איור 3A-C)ולשמור על הלב שלהם Troponin-I כתמים וccility(איור 3C). בניסויים נפרדים, ארבע שעות לאחר הבידוד, CMs עכבר היו transfected עם מחזור תא גורם siRNA קוקטייל כמתואר עבור CM החולדה. בקצרה, עכברים CM היה בו זמנית transfected עם siRNAs ספציפי נגד Rb1 ו Meis2, ושליטה (cel-miR-67). לאחר הטרנס-תחליף היו כפופים להדמיית קורס זמן במשך 10 ימים המציגים את השינויים המורפולוגיים (איור 4) ולאחר מכןתוואי התפשטות (איור 5). ביום 10, כתמי חיסון פלואורסצנט עבור Troponin-I, KI67, ו DAPI בוצע כפי שתואר קודם לכן. עלייה משמעותית KI67 cardiomyocytes חיובי נצפתה עם siRb1 + siMeis2 טיפול בהשוואה לשליטה(איור 5A-C).
הפרוטוקול הנוכחי מדגים כי חולדות בוגרות ועכברים CMs יכול להיות תרבותי לטווח ארוך במבחנה עד 20 ימים ואולי יותר. לאחר 20 ימים, CMs לשמור על הכתמת Troponin-I שלהם, כמו גם כיווץ אם המעכבים מוסרים מהתקשורת.
| הרכב מאגר Myocyte, pH 7.4 (הכן ותוכנן לאחסן ב- 4 °C ) | |||
| מגיב | ריכוז, mM | מולקולר WT. | לליטר אחד |
| נ.א.ק. | 113 | 58.44 | 6.6037 גר' |
| קיי.סי.איי. | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 מ"ג |
| MGSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 מ"ג |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 מ"ג |
| נה2ת.פ.4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 מ"ג |
| מאגר עירוי, pH 7.4 (להכין טרי לכל בידוד) | |||
| ריכוז, mM | מולקולר WT. | הסכום הנדרש | |
| מאגר מיוצ'יט | 250 מ"ל | ||
| הפס (הפס) | 10 | 238.3012 | 595.75 מ"ג |
| 2,3-butanedione מונוקסימין | 10 | 101.105 | 252.775 מ"ג |
| 3טרי | 1.6 | 84.007 | 33.6028 מ"ג |
| טאורין פרש | 30 | 125.15 | 938.625 מ"ג |
| גלוקוז טרי | 20 | 180.156 | 900.775 מ"ג |
| פתרון אנזים | |||
| תחסה מניות. | עובד Conc. | הנדרש | |
| מאגר מיוצ'יט | 50 מ"ל | 50 מ"ל | |
| קולגנאז סוג 2 | 330 U/מ"ג | 620 U/mL | 93 מ"ג |
| פרוטאז הארבעה-ארבעה | >3.5 U/מ"ג | 0.104 U/mL | 1.48 מ"ג |
| DNase I כיתה ב' | 0.015 מ"ג/מ"ל | ||
| עצור מאגר A | |||
| תחסה מניות. | עובד Conc. | הנדרש | |
| מאגר מיוצ'יט | 30 מ"ל | ||
| BSA (12) | 2.50% | 0.75 גר' | |
| ק.א.ל.2 | 100 מיליון מ' | 0.1 מיליון מ' | 30 μL |
| עצור מאגר B | |||
| תחסה מניות. | עובד Conc. | הנדרש | |
| מאגר מיוצ'יט | 30 מ"ל | ||
| BSA (12) | 5.00% | 1.5 גר' | |
| ק.א.ל.2 | 100 מיליון מ' | 0.1 מיליון מ' | 30 μL |
טבלה 1: פתרונות הנדרשים לבידוד קרדיומיוציט עכבר מבוגר.
| 10x KHB פתרון מניות (נפח כולל = 1L) |
מגיב | שן טוחנת (mM) | סכום (ז) |
| נ.א.ק. | 1180 | 68.9 גר' | |
| קיי.סי.איי. | 48 | 3.5 גר' | |
| הפס (הפס) | 250 | 59.7 גר' | |
| MGSO4 | 12.5 | 1.4 גר' | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2.1 גר' | |
| כוונון pH ל- 7.4 עם 4 M NaOH (~ 20 מ"ל), חנות ב- 4 °C | |||
| פתרון KHB, 500 מ"ל | מגיב | כמות | |
| 10x KHB | 50 מ"ל | ||
| גלוקוז | 0.99 גר' | ||
| טאורין | 0.31 גר' | ||
| הוסף H2O כדי להביא את עוצמת הקול ל- 500 מ"ל, ו- pH צריך להיות ~ 7.35 | |||
| פתרון א' | מגיב | כמות | |
| פתרון KHB | 500 מ"ל (10 מ') | ||
| BDM (BDM) | 0.5 גר' | ||
| חמצן עם 100% O2 וחם עד 37 °C | |||
| פתרון ב', 50 מ"ל | מגיב | כמות | |
| פתרון א' | 50 מ"ל | ||
| BSA (12) | 0.5 גר' | ||
| 0.1 M CaCl2 (Ca++= 0.1 מ') | 50 μL | ||
| פתרון E, 50 מ"ל | מגיב | כמות | |
| פתרון א' | 50 מ"ל | ||
| BSA (12) | 0.05 גר' | ||
| קולגנאז סוג II (263 יחידות/מ"ג) | 35 מ"ג | ||
| היאלורונידאז (סוג I-S) | 10 מ"ג | ||
| 0.1 M CaCl2 מניות | 12.5 μL | ||
| מערבבים היטב | |||
| מלאי CaCl2, 0.1M | מגיב | כמות | |
| ק.א.ל.2 | 7.35 גר' | ||
| H2O | 500 מ"ל | ||
| חנות ב- 4 °C | |||
טבלה 2: פתרונות הנדרשים לבידוד קרדיומיוציט חולדה למבוגרים.
| הרכב מדיה ציפוי, pH 7.4 | |||
| ריכוז עבודה | WT מולקולרי. | הסכום הנדרש | |
| תקשורת תרבות ללא בבלביסטין | 50 מ"ל | ||
| BDM (BDM) | 10 m | 101.105 גרם/מול | 50.55 מ"ג |
| FBS (אף.בי. | 5% | 2.5 גר' | |
| הרכב מדיה תרבות, pH 7.4 | |||
| מגיב | ריכוז עבודה | WT מולקולרי. | הסכום הנדרש |
| DMEM (100) | פי 1 | 250 מ"ל | |
| אינסולין | 1 μg/ מ"ל | 0.25 מ"ג | |
| העברה ב | 0.55 μg/mL | 0.138 מ"ג | |
| סלניום | 0.5 ng/mL | 0.125 μg | |
| פניצילין (U/mL)-סטרפטומיצין (g/mL) | 100-100 | 2.5 מיליון ל'. | |
| הפס (הפס) | 10 m | 238.3012 גרם/מול | 595.753 מ"ג |
| *FBS | 10% | 25 מיליון ל'. | |
| *BSA | 0.20% | 0.5 גר' | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 גרם/מול | 1.8271 מ"ג |
| *השתמש בכל אחד מהם, לפי הדרישה הניסיונית. # Aliquot התקשורת התרבות להכין מדיה ציפוי לפני הוספת Blebbistatin. הערה: להכין 200 מ"ל של מדיה תרבות. הערה: הכן 50 מ"ל של מדיה ציפוי. |
|||
טבלה 3: קומפוזיציה מדיה עבור ציפוי קרדיומיוציט עכבר מבוגר ותרבות.
| הרכב מדיה תרבות, pH 7.4 | ||
| מגיב | ריכוז עבודה | הסכום הנדרש |
| DMEM (100) | 1x | 250 מ"ל |
| פניצילין (U/mL)-סטרפטומיצין (g/mL) | 100-100 | 2.5 מיליון ל'. |
| *FBS | 10% | 25 מיליון ל'. |
טבלה 4: קומפוזיציה תקשורתית עבור ציפוי קרדיומיוציט חולדה למבוגרים ותרבות.
איור 1: כיוונון נהלים וציוד. (א) ייצוג סכמטי של התפרה. (II) כלי ניתוח ומחט תחכלת. (III) מכלול עירוי לב: ז'קטחימום. ב)כלי כפול של ז'קט מים בקיר. ג)מזרים מים מחוממים. ד)שקע מים מחומם במחזור. E)תמיסת עירוי לב. F)משאבת מחזור G ) צינורפתרון זבר. צינוראספקת חמצן. אני)במחזור אמבטיית מים. J)מחט תחה עם לב, מחוברת לשקע ההתפתלות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בידוד ס"מ של חולדה למבוגרים, תירגם ותרבות ארוכת טווח. A) חולדה בוגרת CM, מיד לאחר הבידוד. ב)חולדה בוגרת CM ביום 7 לאחר הבידוד. ג)חולדה בוגרת CM ביום 20. מה אתה עושה כאן? KI67 חולדה חיובית CM ביום 7 לאחר siRb1 +siMeis2 טרנסאפציה. טרופונין-I = ירוק; DAPI = כחול; KI67 = אדום. כל הניסויים בוצעו בכפילויות וחזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: בידוד ס"מ עכבר מבוגר ותרבות לטווח ארוך. A) עכברים בוגרים CM, מיד לאחר הבידוד. ב)עכברים בוגרים CM ביום 7 לאחר הבידוד. C) עכברים בוגרים CM מוכתם לב Troponin-I = ירוק ביום 20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פירוק די-בידול של ס"מ של עכבר מבוגר. עכברים בוגרים CM המציג שינויים מורפולוגיים במהלך תרבות לטווח ארוך (יום 0 עד יום 10) במדיה DMEM-HG, בתוספת 10%FBS. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תירור והתפשטות של ס"מ של עכבר מבוגר. מה אתה עושה כאן? KI67 עכבר חיובי CM ביום 10 לאחר siRb1 + siMeis2 transfection. טרופונין-I = ירוק; DAPI = כחול; KI67 = אדום. D) גרף עמודות מראה עלייה משמעותית ב- KI67 CMs עכבר מבוגר חיובי בקבוצה transfected קוקטייל siRNA לעומת שליטה. התוצאות מוצגות כ-±SEM; * = ערך p ≤0.05. ערך p ≤0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית. כל הניסויים בוצעו בשלושה רישיות (n = 3 זכר, 3 נקבה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש צורך קריטי להקים פרוטוקול לבידוד cardiomyocyte למבוגרים ותרבות לטווח ארוך כדי לבצע מחקרים מכניים ספציפיים לתא. יש רק כמה דיווחים דנים פרוטוקולי בידוד CM למבוגרים, ואפילו פחות מהם משמשים לתרבות ארוכת טווח של עכברים בוגרים CM15,16,17. זה הראו כי CM חולדה למבוגרים יש סובלנות גבוהה יותר בתרבות המבחנה מאשר העכברים הבוגרים CM10,11,12. בדו"ח זה, אנו מקימים פרוטוקול עבור חולדה בוגרת ועכברים CM בידוד, טרנס-פקציה siRNA, תרבות לטווח ארוך, וניתוח במורד הזרם של התפשטות מושרה, עם שינויים מינימליים בפרוטוקולים בשימוש קבוע.
פרוטוקולים זמינים לבידוד CM למבוגרים מבוססים על השימוש בשני אנזימים ידועים, קולגנאז ו liberase, עבור מטריצה חוץ תאית (ECM)עיכול 18,19. קולגנס הוא אנזים נפוץ בפרוטוקולים בידוד CM למבוגרים. קולגנאז מעכל את סיבי הקולגן ב-ECM, מה שופך לניתוק רקמת הלב בס"מ חד-תאי. באופן דומה, ליברס מעכל את ה-ECM. Liberase היא האלטרנטיבה המטוהרת קולגנס, אשר מראה פעילות גבוהה יותר ולכן דורש דיוק גבוה יותר במהלך בידוד CM כדי להשיג בידוד מוצלח בהשוואה קולגנס. יתר על כן, בהליך, שמנו לב כי CM מבודד עם ליבראז אינו שורד בתרבות לטווח ארוך. עם זאת, CM מבודד עם קולגנאז משפר את אריכות ימים של CM בתנאי התרבות.
בנוסף, השתמשנו מעכב מיובין II ספציפי בשם blebbistatin בתקשורת התרבות לתרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר CM20,21. בעבר, 2,3-butanedione מונוקסימין (BDM) שימש לתרבות CM למבוגרים. BDM הוא מעכב ATPase המעכב את תפקוד ההתכווצות באמצעות מנגנון מוגדר היטב הכולל עיכוב של ATPase ומעבר Ca++ לקוי 22. בהשוואה BDM, blebbistatin הוא מעכב ספציפי של מיוסין II ומראה עיכוב משמעותי יותר של תפקוד כיווץ בריכוזים נמוכים יותר מאשר BDM. ציפוי מראש של ס"מ העכבר הבוגר במדיה תרבות, בתוספת 10 mM של BDM ותרבויות עוקבות של CM ב 25 μM blebbistatin בתוספת ומדיה סרום נמוך משפר את הישרדות ומבנה צורת מוט של CM בתרבות לטווח ארוך. עם זאת, ציפוי ישיר של CM העכבר הבוגר במדיה, בתוספת 25 μM blebbistatin ו 10% FBS הוא טוב יותר עבור מחקרים משגשגים. בדומה CM חולדה למבוגרים, אשר מראה מידה רבה של de-בידול בתרבות המבחנה, הבחנו גם de-בידול בעכבר למבוגר CM במידה מסוימת(איור 5). שינויים מורפולוגיים הם הצעד הנחוץ להתפשטות. לכן, מתן סביבה ל-CM למבוגרים המקלה על de-בידול שלהם הוא גורם קריטי לשקול במחקרים כאלה. למרות שבזמן זה, לא ברור איזה מהצעדים או הרכיבים המדויקים המשמשים בפרוטוקול זה אחראי לאריכות ימים משופרת של CMs למבוגרים, אנו מאמינים כי זהו אפקט משולב של reagents בשימוש, השינויים שנעשו בהליך הבידוד, ואולי הכי חשוב את הידיים המאומן.
בדומה לדיווחים הקודמים המציגים את התמרה ויראלית של CM למבוגרים בתקשורת בתוספת blebbistatin, הבחנו גם טרנסאפציה יעילה של תאים אלה עם siRNAs. השתמשנו ב-siRNAs ספציפיים נגד שני גנים הקשורים לסנסנס, Rb1 ו-Meis2, כדי לגרום להתפשטות CM. עבור CM חולדה, ביצענו ניתוח KI67 כדי להעריך את ההתפשטות ביום השביעי לאחר transfection; עם זאת, ההתפשטות ב-CM בוגר העכבר נותחה ביום עשר לאחר הטרנס-תחליף. שונות ביולוגית ספציפית למין יכולה להיות סיבה אפשרית להבדל הזמן שנצפה במחזור התא המושרה כניסה מחדש של חולדה בוגרת ועכבר CM.
בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן מספק הליך משופר, אמין והשוותי לבודד חולדה בוגרת ועכבר CM, ובהתאם תרבות אותם לפי צורך ניסיוני. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר תרבות ארוכת טווח של CM למבוגרים, אשר מספקים מערכת במבחנה לבצע ניתוחים שונים לטווח ארוך כגון התפשטות, גורם פרקרין, תגובת מתח, וכו '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמחלקה לפתולוגיה ורפואה במעבדה, אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה, לד"ר אונור קניסיסק; מענק מהכונים הלאומיים לבריאות (R01HL148598) לד"ר אונור קניסיקאק. ד"ר אונור קניסיקק נתמך על ידי פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי (18CDA34110117). ד"ר Perwez עלאם נתמך על ידי מענק פוסט-ת"ר של איגוד הלב האמריקאי (AHA_20POST35200267). ד"ר מלינה J. Ivey נתמך על ידי מענק NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
