Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.
Abstract
Ex vivo cultuur van de volwassen zoogdier cardiomyocyten (CMs) presenteert de meest relevante experimentele systeem voor de in vitro studie van cardiale biologie. Volwassen zoogdier-CMs zijn terminaal gedifferentieerde cellen met een minimale proliferative capaciteit. De post-mitotische toestand van volwassen CMs beperkt niet alleen cardiomyocyte celcyclusprogressie, maar beperkt ook de efficiënte cultuur van CMs. Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk voor veel studies, zoals CM-proliferatie en analyse van genexpressie.
De muis en de rat zijn de twee meest geprefereerde proefdieren die worden gebruikt voor cardiomyocyte isolatie. Hoewel de langetermijncultuur van ratten-OEM's mogelijk is, zijn volwassen muis-OEM's gevoelig voor de dood en kunnen ze niet langer dan vijf dagen onder normale omstandigheden worden gekweekt. Daarom is er een kritische behoefte om de celisolatie en het langetermijncultuurprotocol voor volwassen murine-OEM's te optimaliseren. Met dit gewijzigde protocol is het mogelijk om zowel volwassen muis- als ratten-OEM's gedurende meer dan 20 dagen succesvol te isoleren en te verlenen. Bovendien is de siRNA transfectie-efficiëntie van geïsoleerde CM aanzienlijk toegenomen in vergelijking met eerdere rapporten. Voor de CM-isolatie van de volwassen muis wordt de Langendorff-perfusiemethode gebruikt met een optimale enzymoplossing en voldoende tijd voor volledige extracellulaire matrixdissociatie. Om zuivere ventriculaire CMs te verkrijgen, werden beide atria ontleed en weggegooid alvorens verder te gaan met de dissociatie en beplating. Cellen werden verspreid op een laminine gecoate plaat, die het mogelijk gemaakt voor een efficiënte en snelle bevestiging. CMs mochten genoegen nemen met 4-6 uur voor siRNA transfectie. Cultuur media werd vernieuwd om de 24 uur voor 20 dagen, en vervolgens, CMs werden vastgesteld en gekleurd voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin en markers van celcyclus zoals KI67.
Introduction
Hartziekten zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Bijna alle vormen van hartletsel resulteren in een aanzienlijk verlies van volwassen cardiomyocyten (CMs). Volwassen zoogdier harten zijn niet in staat om hun hartletsel te herstellen als gevolg van de senescente aard van de volwassen CM1. Dus, elke belediging van de volwassen zoogdierhart resulteert in een permanent verlies van CMs, wat leidt tot verminderde hartfunctie en hartfalen. In tegenstelling tot volwassen zoogdieren kunnen kleine dieren zoals zebravissen en nieuwe harten hun hartletsel regenereren door bestaande CM proliferatie2,3,4. Een wereldwijde inspanning is aan de gang om een nieuwe therapeutische interventie voor hartletsel te vinden via zowel proliferative en niet-proliferative benaderingen. In de afgelopen decennia zijn verschillende soorten genetische muismodellen ontwikkeld om hartletsel en reparatie te bestuderen. Het gebruik van in vivo diermodellen blijft echter een dure benadering met de extra complexiteit om een celautonoom mechanisme te ontcijferen aan secundaire effecten. Bovendien zijn in vivo systemen een uitdaging om CM-specifieke effecten van een farmacologische interventie te analyseren die cardioprotectieve signalering van de CM induceert.
Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk om CM-proliferatieanalyses uit te voeren. CM proliferatie testen vereisen een minimum van 4-5 dagen voor cellen worden geïnduceerd in de celcyclus en om nauwkeurige gegevens te verkrijgen na dat. Bovendien, studies die gebruik maken van geïsoleerde CMs voor elektrofysiologische studies, drug screening, toxiciteit studies, en Ca++ homeostase studies zijn allemaal behoefte aan een verbeterde cultuur systeem5,6,7. Bovendien tonen recente studies de cardioprotectieve betekenis aan van cytokinen die zijn afgescheiden van CMs (cardiokines)8,9. Om de therapeutische rol en het moleculaire mechanisme van deze cardiokines tijdens hartreparatie en regeneratie te onderzoeken, is een langdurige cultuur vereist.
Volwassen rat-CMs zijn robuust genoeg voor eencellige isolatie en cultuur op lange termijn in een in vitrosysteem10,11,12. Echter, volwassen muis CMs zijn van groot belang voor in vitro testen, als gevolg van de beschikbaarheid van een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde muis modellen, die het mogelijk maakt voor het ontwerp en de uitvoering van verschillende innovatieve analyses die niet mogelijk zijn met rat CM13. In tegenstelling tot volwassen rat CM isolatie, is het heel uitdagend om een eencellige suspensie te verkrijgen van volwassen muis harten, en de lange termijn cultuur van volwassen muis CMs in de cultuur is nog uitdagender.
Volwassen CM isolatie van muis- en rattenharten met behulp van een Langendorff-systeem is eerder opgezet om CM-functie5,14,,15te bestuderen . Hier hebben we in detail de protocollen beschreven voor volwassen CM-isolatie van zowel ratten als muizen, evenals een gewijzigde langetermijncultuur, transfectie en CM-proliferatie van geïsoleerde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door het Amerikaanse National Institute of Health (NIH). Alle protocollen weergegeven in de video werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati, College of Medicine.
1. Voorbereiding vóór hartextractie van volwassen muizen (en ratten)
- Bereid de overeenkomstige perfusie-, enzym- en stopoplossingen volgens de recepten in tabel 1 en tabel 2voor respectievelijk ratten- en muizenisolement. Filtreer de oplossingen door een filter van 0,22 μm om verontreinigingen of onopgeloste deeltjes te verwijderen.
- Reinig en steriliseer de chirurgische instrumenten door ze 15 minuten in 70% alcohol te weken en vervolgens te wassen met dubbel gedestilleerd water. Laat het gereedschap drogen op een schone papieren handdoek.
- Verwarm het waterbad voor op 37 ºC. Controleer het waterpeil in het waterbad om tijdens de procedure een ononderbroken circulatie van warm water door het perfusieapparaat te garanderen.
- Reinig het perfusieapparaat door 5 min.
OPMERKING: Verhoog de stroomsnelheid, wat helpt om de slang schoon te maken. - Na de alcohol flowthrough, reinig de resten van alcohol door het uitvoeren van dubbele gedestilleerd water gedurende 10 min.
- Stel 3 middelgrote wegwerp polystyreen weegschotels op om het hart schoon te maken na excisie. Vul de gerechten met 20 mL myocyte buffer.
- Voeg 2-3 druppels heparine toe aan elke schotel met behulp van Pasteur pipet en meng goed door meerdere keren te pipetten.
- Neem een spuit van 10 mL met een stompe naald canule.
LET OP: Een stompe naald canule kan worden bereid door het snijden van de punt van een schone, steriele naald. Een 21 G naald en 14 G naald werden gebruikt om de canule voor de muis en rat te maken, respectievelijk. - Vul de spuit met perfusiebuffer(tabel 1). Verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit en plaats deze in de derde schotel in een schuine positie. Beveilig het met tape.
OPMERKING: Voor ratten werd oplossing A(tabel 2)gebruikt in plaats van myocyte perfusiebuffer. - Bereid een losse knoop met een chirurgische hechting en plaats het rond de naald.
- Injecteer de muis met heparine (100 USP-eenheden/muis) door intraperitoneale injectie, 20 min voor de anesthesie-injectie.
- Circuleert de myocyte perfusiebuffer(tabel 1)door het perfusieapparaat. Verlaag de debiet tot 3 mL/min.
OPMERKING: Voor ratten werd oplossing A(tabel 2)gebruikt in plaats van myocyte perfusiebuffer. - Vervang na 5 min de perfusiebuffer door de enzymoplossing(tabel 1). Verzadig de enzymoplossing met zuurstof tijdens het proces. Gebruik een stroomsnelheid van 3 mL/min.
OPMERKING: Gebruik voor de isolatie van rat CM in plaats daarvan oplossing E (Tabel 2). - Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van anesthesie. Gebruik de juiste dosis anesthesie, aanbevolen door IACUC, voor de terminale operatie.
- Bevestig voldoende diepte van anesthesie door het ontbreken van een reactie op een teensnuifje. Zet vervolgens de muis op het chirurgische platform.
2. Extractie van hart van volwassen muizen (en ratten)
- Steriliseren van de huid door af te vegen met 70% alcohol.
- Open voorzichtig de borst.
- Accijns het hart. Vermijd niet-hartweefsels tijdens excisie.
- Leg het hart op de eerste schotel, gevuld met perfusiebuffer(Tabel 1).
LET OP: Gebruik oplossing A voor de rat(tabel 2). - Maak het bloed uit het hart door zachtjes te knijpen.
- Breng het hart naar het tweede gerecht.
- Reinig het bloed uit het hart en verwijder niet-cardiale weefsels. Breng vervolgens het hart over naar het derde gerecht.
- Knip longen en ander omringend weefsel af en kanule via de opgaande aorta. Deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd (<5 min) om de kwaliteit en kwantiteit van CM te verbeteren.
3. Vertering van het hart
- Spijsvertering van het muishart
OPMERKING: Alle oplossingen/buffers die door het muizenhart circuleren, moeten tijdens de procedure worden zuurstofrijk.- Verwijder de afzuignaald voorzichtig uit de spuit en sluit deze aan op het Langendorff perfusieapparaat.
- Vermijd luchtbellen die in het hart gaan, wat de doorstroom van de enzymoplossing en de spijsvertering kan beïnvloeden.
- Verplaats de waterjas omhoog om een homogene omgeving aan het hart te bieden. Laat de enzymoplossing met een snelheid van 2-3 mL/min door het hart stromen.
OPMERKING: De snelheid van de passerende oplossing is van cruciaal belang en heeft een aanzienlijke impact op de uitkomst van CM kwantiteit en kwaliteit. - Laat de enzymoplossing 2 min door het hart stromen.
- Voeg op 2 min 40 μL van 100 μM CaCl2-oplossing toe aan de enzymoplossing en meng. Laat de enzymoplossing nog 10-15 minuten door het hart gaan.
OPMERKING: Zodra de stroom glad wordt, wordt het hart bruinachtig en zacht, wat de gelijkmatige verdeling van het collagenase-enzym en de juiste vertering van het hart aangeeft.
- Spijsvertering van het rattenhart
OPMERKING: Alle oplossingen/buffers die door het rattenhart circuleren, moeten tijdens de procedure worden zuurstofrijk.- Verwijder de afzuignaald voorzichtig uit de spuit en sluit deze aan op het Langendorff perfusieapparaat.
- Vermijd luchtbellen die in het hart gaan, wat de doorstroom van de enzymoplossing en de spijsvertering kan beïnvloeden.
- Verplaats de waterjas omhoog om een homogene omgeving aan het hart te bieden.
- Start de stroom van oplossing A met een snelheid van 2-3 mL/min gedurende 3-5 min om bloed uit het hart te verwijderen.
OPMERKING: De snelheid van de passerende oplossing is van cruciaal belang en heeft een aanzienlijke impact op de uitkomst van CM-kwaliteit. - Zodra het bloed uit het hart is gewist, schakelt u over van oplossing A naar oplossing E(tabel 2). Titreeroplossing E met CaCl2 zoals hieronder aangegeven voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM in oplossing:
- Voeg na 10 min perfusie 12,5 μL 0,1 M CaCl2toe.
- Voeg na 15 min perfusie 25 μL van 0,1 M CaCl2toe.
- Laat de enzymoplossing nog 30-40 minuten door het hart gaan, totdat de stroom snel wordt en het hart buigzaam is.
4. Voorbereiding van CM-eencellige suspensie
- Voorbereiding van de CM eencellige suspensie (muis)
- Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het naar een petrischaal van 60 mm gevuld met 5 mL enzymoplossing en breng de schotel over op een bioveiligheidskap.
OPMERKING: Zorg voor voldoende hartvertering voordat u het hart uit het Langendorff perfusiesysteem verwijdert. De spijsverteringstijd is afhankelijk van de enzymactiviteit, de stroom van oplossing en de grootte van het hart. - Voer verdere mechanische disaggregatie uit in een bioveiligheidskap om steriliteit te garanderen en besmetting te voorkomen.
- Verwijder voorzichtig de atria (1/4e van het basale hartgedeelte) en extra vetweefsel.
- Hak het hart met tangen in fijne stukken.
- Neem een steriele Pasteur pipet en snijd de punt in een hoek van 45º.
- Gebruik deze Pasteur pipet om het hartweefsel in een eencellige suspensie af te geven door zachte pipetting. Optimale spijsvertering zorgt voor een opschorting van eencellige cardiomyocyten.
LET OP: Verwijder het smalle, onderste gedeelte van de transferpipet om CM-schade als gevolg van mechanische schroeien te verminderen. - Voeg vervolgens 5 mL stopoplossing toe om de enzymactiviteit te stoppen, waardoor de mogelijkheid van overdigestie wordt vermeden.
- Neem een verse conische 50 mL conisch en plaats een steriele 100 μm cel zeef op.
- Geef de cardiomyocyte suspensie door de celzeef om het weefselbrok te verwijderen. Was de petrischaal en zeef met nog eens 5 mL stopoplossing(Tabel 1) om cardiomyocyten te verzamelen die aan de zeef blijven zitten.
- Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het naar een petrischaal van 60 mm gevuld met 5 mL enzymoplossing en breng de schotel over op een bioveiligheidskap.
- Voorbereiding van de CM eencellige suspensie (rat)
- Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het hart naar een 100 mm petrischaal gevuld met 5 mL oplossing A en verplaats de schotel naar een bioveiligheidskap.
OPMERKING: Zorg voor voldoende hartvertering voordat u het hart uit het Langendorff perfusiesysteem verwijdert. De spijsvertering tijd hangt af van de enzymactiviteit, de stroom van de oplossing, en de grootte van het hart. - Voer verdere mechanische disaggregatie uit in een bioveiligheidskap om steriliteit te garanderen en besmetting te voorkomen.
- Verwijder voorzichtig de atria (1/4e van het basale hartgedeelte) en extra vetweefsel.
- Hak het hart met tangen in fijne stukken.
- Neem een steriele Pasteur pipet en snijd de punt in een hoek van 45º.
- Gebruik deze Pasteur pipet om het hartweefsel in eencellige suspensie af te geven door zachte pipetting. Optimale spijsvertering zorgt voor een opschorting van eencellige cardiomyocyten.
LET OP: Verwijder het smalle, onderste gedeelte van de transferpipet om CM-schade als gevolg van mechanische schroeien te verminderen. - Voeg 5 mL oplossing B(tabel 2) toe aan de CM-suspensie en geef de oplossing door een celzeef van 100 μm om de resterende stukken vet of ander niet-verteerd weefsel te verwijderen.
- Verzamel filtraat in een verse 50 mL conische flacon.
- Gebruik nog eens 5 mL oplossing B om de petrischaal en eventuele resterende CM door de celzeef te wassen.
- Verwijder het hart uit het Langendorff perfusiesysteem. Verplaats het hart naar een 100 mm petrischaal gevuld met 5 mL oplossing A en verplaats de schotel naar een bioveiligheidskap.
5. Verwijdering van niet-CM's
- Verwijdering van niet-CMs uit de schorsing voor één cel voor volwassenen (muis)
- Centrifuge de celsuspensie op 20 x g gedurende 3 minuten.
- Gooi de supernatant weg en plaats de cellen opnieuw in 10 mL stopoplossing(tabel 1).
OPMERKING: Het verhogen van de concentratie van BSA in de stopoplossing zal de viscositeit verhogen en de sedimentatiesnelheid van niet-CMs verminderen. - Resuspend de CMs door zachte inversie van de buis 3-5 keer.
- Voeg met intervallen van 3 minuten 10 μL van 100 μM CaCl2-oplossing toe en meng. Herhaal het driemaal.
- Na de vierde toevoeging, centrifugeren de cardiomyocyte suspensie op 20 x g gedurende 3 min.
- Gooi de supernatant weg.
- Resuspend CMs in voorverwarmde (37 ºC), volwassen muis CM plating media (Tabel 3).
- Verwijdering van niet-CMs uit de volwassen eencellige suspensies (rat)
- Pelletcellen op 20 x g gedurende 3 minuten bij 25 ºC.
- Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 25 mL oplossing B (tabel 2).
- Meng de cellen door zachte inversie en plaats het in een buisstandaard om de CM toe te staan om zich onder ernst te regelen.
- Gooi de supernatant voorzichtig weg.
- Resuspend de cellen in verse 25 mL van oplossing B en titreren tot 1,0 mM CaCl2 door stapsgewijze toevoeging van 50 μL, 75 μL, en 100 μL van 0,1 M CaCl2 op 3-5 min intervallen.
OPMERKING: Een hogere concentratie BSA in oplossing B kan bij deze stap worden gebruikt. Het verhogen van de concentratie van BSA in oplossing B verhoogt de viscositeit en vermindert zo de sedimentatiesnelheid van niet-CMs. - Pelletcellen op 20 x g gedurende 3 minuten bij 25 ºC, het supernatant aanzuigen en het gewenste volume van volwassen rattencelkweekmedia toevoegen (tabel 4).
- Zaad CMs op een laminine gecoate plaat.
OPMERKING: Pre-plating van CMs op een niet-gecoate kweekplaat kan worden gebruikt om de verontreiniging van niet-CM-cellen te minimaliseren.
6. Volwassen CM-beplating
- Voorbeplating
- Resuspend de cardiomyocyten in cultuurmedia.
- Pre-plate de cellen in een 60 mm of 100 mm schotel voor muis of rat CM, respectievelijk.
- Incubeer CMs voor 2 uur in een couveuse aangevuld met 5% CO2 bij 37 ºC.
- Tijdens de pre-plate incubatie, coat de celkweekplaten met laminine (10 μg/mL in PBS) voor de lange termijn CM cultuur.
- Na 2 uur pre-plating, verzamelen CMs in een 50 mL conische flacon.
- Verzamel de cellen uit de schotel en re-plate ze in een laminine gecoate 24 goed cultuur plaat voor transfectie experimenten.
- Kweekcellen in een couveuse op 37 ºC aangevuld met 5% met CO2. 4-6 uur is voldoende om zich aan de cardiomyocyten te hechten aan het oppervlak, en dus kan transfectie 6 uur na het beplating worden uitgevoerd.
OPMERKING: Het beplatingsmedium met FBS wordt vaak gebruikt en vertoont een betere compatibiliteit met proliferatiestudies. Een serumvrij medium kan echter worden gebruikt voor experimenten waarbij secretoire factoren worden geanalyseerd.
7. Transfection
- Broed de CMs aan de celcultuurplaten die 4-6 uur met laminine zijn bekleed.
- Vier uur na cm zaaien op de laminine gecoate plaat, transfecte cellen met siRNAs (50 nM) van belang met behulp van een transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine RNAiMAX) volgens het protocol van de fabrikant.
- Verander media 24 uur na transfectie en elke 24 uur daarna gedurende maximaal 20 dagen.
- Na 20 dagen fix cellen met 4% PFA in PBS voor downstream toepassingen, met inbegrip van immunocytochemie voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin om ervoor te zorgen live cardiomyocyten werden met succes gekweekt op lange termijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het huidige gewijzigde protocol maakt efficiënte isolatie en cultuur van rat en muizen CMs in vitro mogelijk. Voor rat CM isolatie, een totaal van 3 volwassen (12 weken oude) mannelijke Fischer 344 ratten werden gebruikt in de procedure. Figuur 1 toont de chirurgische apparatuur en isolatieopstellingen die nodig zijn in de procedure; elk deel is gemarkeerd en beschreven in de figuurlegende. Collagenase type 2 werd gebruikt voor de spijsvertering, die een hoge hoeveelheid hoge kwaliteit CMs levert van succesvolle isolatie (Figuur 2A). Vierentwintig uur na isolatie werden deze cellen door elkaar gehaald met celcyclus die specifieke siRNAs tegen Rb1 en Meis2opleidde , terwijl cel-miR-67 in het experiment11als transfectiecontrole werd gebruikt . CMs werden gehandhaafd in de cultuur voor zeven dagen (figuur 2B) of tot twintig dagen (Figuur 2C) om de morfologische veranderingen te observeren. Om te scoren voor celcyclusactiviteit, werden CMs vastgesteld op dag 7 en bevlekt voor cardiale specifieke marker Troponin-I, mitotische marker KI67, en kern werd gevisualiseerd via DAPI (Figuur 2D-F). Een aanzienlijke toename van KI67 positieve cardiomyocyten werd waargenomen met siRb1 + siMeis2 behandeling in vergelijking met controle11. Bovendien, de rat cardiomyocyten waren slaan (contractiele functie) in de cultuur op dag zeven na-plating, dat is een kenmerk kenmerk van gezonde cardiomyocyten11.
Voor CM isolatie bij muizen werden in de procedure in totaal 3 mannelijke en 3 vrouwelijke volwassenen (12 weken oude) C57BL/6 muizen gebruikt. Vergelijkbaar met de rat studie, collagenase type 2 werd gebruikt om het collageen en de extracellulaire matrix van de volwassen muizen hart te verteren. Volwassen muizen CM is relatief kwetsbaar voor isolatie en cultuur in vitro; dus, dit protocol maakt gebruik van blebbistatin om de levensvatbaarheid van de volwassen muis CM. Succesvolle isolatie opbrengsten >70-80% gezonde staaf vorm CMs, die kunnen worden gekweekt voor maximaal 20 dagen (Figuur 3A-C) en onderhouden van hun cardiale Troponin-I kleuring en contractiliteit (Figuur 3C). In afzonderlijke experimenten, vier uur na isolatie, muis CMs werden doorgetransfecteerd met een celcyclus inducerende siRNA cocktail zoals beschreven voor de rat CM. Kort, muizen CM werd gelijktijdig doorgetast met de specifieke siRNAs tegen Rb1 en Meis2, en controle (cel-miR-67). CMs na de transfectie waren gedurende 10 dagen onderworpen aan tijdsloopbeeldvorming met de morfologische veranderingen (figuur 4), gevolgd door een proliferatietest (figuur 5). Op dag 10 werd immuun-fluorescerende vlekken voor Troponin-I, KI67 en DAPI uitgevoerd zoals eerder beschreven. Een aanzienlijke toename van KI67 positieve cardiomyocyten werd waargenomen met siRb1 + siMeis2 behandeling in vergelijking met controle(Figuur 5A-C).
Het huidige protocol toont aan dat volwassen ratten en muizen CMs op lange termijn in vitro kunnen worden gekweekt voor maximaal 20 dagen en mogelijk langer. Na 20 dagen behouden CMs hun Troponin-I kleuring en contractiliteit als de remmers uit de media worden verwijderd.
| Myocyte buffer samenstelling, pH 7.4 (Bereid voor en kan worden opgeslagen bij 4 °C ) | |||
| Reagens | Concentratie, mM | Moleculaire wt. | Voor 1 liter |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6,6037 g |
| Kcl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| Perfusiebuffer, pH 7.4 (Bereid vers voor op elke isolatie) | |||
| Concentratie, mM | Moleculaire wt. | Benodigde hoeveelheid | |
| Myocyte buffer | 250 mL | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| 2,3-butanedione monoximine | 10 | 101.105 | 252,775 mg |
| NaHCO3 Vers | 1.6 | 84.007 | 33,6028 mg |
| Taurine Vers | 30 | 125.15 | 938,625 mg |
| Glucose vers | 20 | 180.156 | 900,775 mg |
| Enzymoplossing | |||
| Voorraad Conc. | Werkende Conc. | Vereist | |
| Myocyte buffer | 50 mL | 50 mL | |
| Collagenase type 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mg |
| Protease XIV | >3,5 U/mg | 0.104 U/mL | 1,48 mg |
| DNase I graad 2 | 0,015 mg/mL | ||
| Buffer A stoppen | |||
| Voorraad Conc. | Werkende Conc. | Vereist | |
| Myocyte buffer | 30 mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Buffer B stoppen | |||
| Voorraad Conc. | Werkende Conc. | Vereist | |
| Myocyte buffer | 30 mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tabel 1: Oplossingen die nodig zijn voor cardiomyocyteisolatie voor volwassen muizen.
| 10x KHB Stock-oplossing (Totaal volume= 1L) |
Reagens | Molariteit (mM) | Bedrag (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| Kcl | 48 | 3,5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| Pas de pH aan op 7,4 met 4 M NaOH (~20 mL), opslag bij 4 °C | |||
| KHB-oplossing, 500 mL | Reagens | Bedrag | |
| 10x KHB | 50 mL | ||
| Glucose | 0,99 g | ||
| Taurine | 0,31 g | ||
| Voeg H2O toe om het volume op 500 mL te brengen en de pH moet ~ 7,35 zijn | |||
| Oplossing A | Reagens | Bedrag | |
| KHB-oplossing | 500 mL (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Zuurstofgehalte met 100% O2 en warm tot 37 °C | |||
| Oplossing B, 50 mL | Reagens | Bedrag | |
| Oplossing A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Oplossing E, 50mL | Reagens | Bedrag | |
| Oplossing A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Collagenase type II (263 eenheden/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Type I-S) | 10 mg | ||
| 0,1 M CaCl2 voorraad | 12,5 μL | ||
| Meng goed | |||
| CaCl2 Stock, 0,1 M | Reagens | Bedrag | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 mL | ||
| Winkel bij 4 °C | |||
Tabel 2: Oplossingen die nodig zijn voor cardiomyocyte-isolatie van volwassen ratten.
| Plating media samenstelling, pH 7.4 | |||
| Werkconcentratie | Moleculaire Wt. | Vereist bedrag | |
| Cultuurmedia zonder Blebbistatin | 50 mL | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| FBS | 5% | 2,5 g | |
| Samenstelling cultuurmedia, pH 7.4 | |||
| Reagens | Werkconcentratie | Moleculaire Wt. | Vereist bedrag |
| DMEM (DMEM) | 1X | 250 mL | |
| Insuline | 1 μg/mL | 0,25 mg | |
| Transferrine | 0,55 μg/mL | 0,138 mg | |
| Selenium | 0,5 ng/mL | 0,125 μg | |
| Penicilline (U/mL)-streptomycine (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595.753 mg |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1,8271 mg |
| * Gebruik een van hen, volgens de experimentele eis. # Aliquot de cultuur media voor te bereiden plating media voor het toevoegen van Blebbistatin. LET OP: Bereid 200 mL cultuurmedia voor. LET OP: Bereid 50 mL beplatingsmedia voor. |
|||
Tabel 3: Mediasamenstelling voor cardiomyocyte beplating en cultuur van volwassen muizen.
| Samenstelling cultuurmedia, pH 7.4 | ||
| Reagens | Werkconcentratie | Vereist bedrag |
| DMEM (DMEM) | 1x | 250 mL |
| Penicilline (U/mL)-streptomycine (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL |
| *FBS | 10% | 25 mL |
Tabel 4: Mediasamenstelling voor cardiomyocyte beplating en cultuur van volwassen ratten.
Figuur 1: Procedure-installatie en uitrusting. I) Schematische weergave van de perfusie. (II) Chirurgische instrumenten en cannulation naald. (III) Hartperfusieassemblage: A) Verwarmingsjack. B) Dubbele muur water jas schip. C) Circulerende verwarmde waterinlaat. D) Circulerende verwarmde wateruitlaat. E) Hartperfusieoplossing. F) Circulerende pomp G) Perfusie oplossing buis. H) Zuurstoftoevoerbuis. I) Circulerend waterbad. J) Cannulation naald met hart, bevestigd aan de perfusie uitlaat poort. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Volwassen rat CM isolatie, transfectie, en cultuur op lange termijn. A) Volwassen rat CM, onmiddellijk na isolatie. B) Volwassen rat CM op dag 7 na isolatie. C) Volwassen rat CM op dag 20. D-F) KI67 positieve rat CM op dag 7 na siRb1+siMeis2 transfectie. Troponin-I = groen; DAPI = blauw; KI67 = rood. Alle experimenten werden uitgevoerd in tweevoud en herhaald ten minste drie keer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Volwassen muis CM isolatie en lange termijn cultuur. A) Volwassen muizen CM, onmiddellijk na isolatie. B) Volwassen muizen CM op dag 7 na isolatie. C) Volwassen muizen CM bevlekt met Cardiac Troponin-I = groen op dag 20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Volwassen muis CM de-differentiatie. Volwassen muizen CM die morfologische veranderingen laten zien tijdens de langetermijncultuur (dag 0 tot dag 10) in DMEM-HG-media, aangevuld met 10%FBS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Volwassen muis CM-transfectie en proliferatie. A-C) KI67 positieve muis CM op dag 10 na siRb1+siMeis2 transfectie. Troponin-I = groen; DAPI = blauw; KI67 = rood. D) Bar grafiek toont een aanzienlijke toename van KI67 positieve volwassen muis CMs in de siRNA-cocktail transfected groep versus controle. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde±SEM; * = p-waarde ≤0,05. p-waarde ≤0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n=3 Man,3 Vrouw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een kritische behoefte om een protocol voor volwassen cardiomyocyten isolatie en cultuur op lange termijn vast te stellen om celspecifieke mechanistische studies uit te voeren. Er zijn slechts een paar rapporten over volwassen CM isolatie protocollen, en nog minder van hen worden gebruikt voor de lange termijn cultuur van volwassen muizen CM15,16,17. Aangetoond wordt dat de volwassen rat CM een hogere tolerantie heeft voor in vitro cultuur dan de volwassen muizen CM10,11,12. In dit rapport stellen we een protocol op voor de CM-isolatie van volwassen ratten en muizen CM, siRNA-transfectie, cultuur op lange termijn en downstream-analyse van geïnduceerde proliferatie, met minimale wijzigingen in de regelmatig gebruikte protocollen.
De beschikbare protocollen voor de isolement van volwassenen CM zijn gebaseerd op het gebruik van twee bekende enzymen, collagenase en liberase, voor de extracellulaire matrix (ECM) spijsvertering18,19. Collagenase is een veelgebruikt enzym in de volwassen CM isolatie protocollen. Collagenase verteert de collageenvezels in de ECM, wat resulteert in de dissociatie van het hartweefsel in de eencellige CM. Op dezelfde manier verteert liberase de ECM. Liberase is het gezuiverde alternatief voor collagenase, dat een hogere activiteit vertoont en dus een hogere precisie vereist tijdens cm-isolatie om succesvolle isolatie te bereiken in vergelijking met collagenase. Bovendien merkten we in de procedure dat de CM geïsoleerd met liberase niet overleeft in de langetermijncultuur. CM geïsoleerd met collagenase verbetert echter de levensduur van CM in de kweekomstandigheden.
Daarnaast gebruikten we een specifieke myosine II-remmer genaamd blebbistatin in de cultuurmedia voor de langetermijncultuur van volwassen muis CM20,21. Voorheen werd 2,3-butanedione monoximine (BDM) gebruikt voor de volwassen CM-cultuur. BDM is een ATPase-remmer die de contractiele functie remt via een slecht gedefinieerd mechanisme dat remming van ATPase en verminderde Ca++ overgang22omvat. In vergelijking met de BDM is blebbistatine een specifieke remmer van myosine II en vertoont het een significantere remming van de contractiele functie bij lagere concentraties dan de BDM. Een pre-plating van de volwassen muis CM in een cultuur media, aangevuld met 10 mM van BDM en latere culturen van de CM in de 25 μM blebbistatin-aangevuld en lage serum media verbetert de overlevingskansen en staafvorm structuur van CM in de lange termijn cultuur. Echter, een directe beplating van de volwassen muis CM in de media, aangevuld met 25 μM blebbistatine en 10% FBS is beter voor proliferative studies. Vergelijkbaar met de volwassen rat CM, die een grote mate van dedifferentiatie in de in vitro cultuur toont, hebben we ook waargenomen de-differentiatie in de volwassen muis CM tot op zekere hoogte (Figuur 5). Morfologische veranderingen zijn de noodzakelijke stap voor de proliferatie. Dus, het verstrekken van een omgeving aan volwassen CM die hun de-differentiatie vergemakkelijkt is een kritische factor te overwegen in dergelijke studies. Hoewel op dit moment, is het niet duidelijk welke van de exacte stappen of componenten die worden gebruikt in dit protocol is verantwoordelijk voor de verbeterde levensduur van volwassen CMs, zijn wij van mening dat het een combinatie-effect van de gebruikte reagentia, de wijzigingen in de isolatieprocedure, en misschien wel het belangrijkste de getrainde handen.
Vergelijkbaar met de vorige rapporten waaruit de virale transductie van de volwassen CM in blebbistatine-aangevuld media blijkt, zagen we ook een efficiënte transfectie van deze cellen met siRNAs. We gebruikten specifieke siRNAs tegen twee senescentie-geassocieerde genen, Rb1 en Meis2,om de CM proliferatie te induceren. Voor de rat CM hebben we KI67-analyses uitgevoerd om de proliferatie op dag zeven na transfectie te beoordelen; echter, de proliferatie in de muis volwassen CM werd geanalyseerd op dag tien na transfectie. Een soortspecifieke biologische variabiliteit zou een mogelijke reden kunnen zijn voor het waargenomen tijdsverschil in de geïnduceerde celcyclus re-entry van volwassen rat en muis CM.
Over het algemeen biedt het hier beschreven protocol een verbeterde, betrouwbare en vergelijkende procedure om volwassen rat en muis CM te isoleren, en dienovereenkomstig cultuur ze als per experimentele behoefte. Bovendien maakt dit protocol een langetermijncultuur van de volwassen CM mogelijk, die een in vitro-systeem biedt om verschillende langetermijnanalyses uit te voeren, zoals proliferatie, paracrinefactor, stressrespons, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, College of Medicine, aan Dr. Onur Kanisicak; een subsidie van de National Institutes of Health (R01HL148598) aan Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wordt ondersteund door de American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam wordt ondersteund door de Postdoctorale subsidie van de American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey wordt ondersteund door een NIH T32-subsidie (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
