Summary
هنا، نقدم بروتوكولاً للعزلة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان cardiomyocytes.
Abstract
السابقين فيفو ثقافة من الثدييات الكبار cardiomyocytes (CMs) يقدم النظام التجريبي الأكثر صلة للدراسة في المختبر من بيولوجيا القلب. إنّ تقانات الثدييات البالغة هي خلايا متمايزة بشكل نهائي ذات قدرة تكاثرية دنيا. لا تحد حالة ما بعد الميتكت من CMs الكبار من تقدم دورة خلايا القلب العضلي القلب فحسب، بل تحد أيضًا من ثقافة CMs الفعالة. وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للبالغين من أجل إجراء دراسات كثيرة، مثل انتشار الـ CM وتحليل التعبير الجيني.
الفأر والفئران هما الأكثر تفضيلا الحيوانات المختبرية لاستخدامها في عزل cardiomyocyte. وفي حين أن الثقافة الطويلة الأجل لـ CMs الفئران ممكنة، فإن الماوس البالغ عرضة للموت ولا يمكن استزراعه أكثر من خمسة أيام في ظل الظروف العادية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحسين عزل الخلية وبروتوكول الثقافة طويلة الأجل للبالغين مورين CMs. مع هذا البروتوكول المعدلة، فمن الممكن لعزل وثقافة كل من الماوس الكبار و CMs الفئران لأكثر من 20 يوما. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة نقل الـ(سيرنا) لـ CM المعزولة تزداد بشكل كبير مقارنة بالتقارير السابقة. لعزلة CM الماوس الكبار، يتم استخدام طريقة التحلل Langendorff مع حل انزيم الأمثل والوقت الكافي للتفكك المصفوفة خارج الخلية كاملة. من أجل الحصول على CMs البطين النقي ، تم تشريح كل من الأذينين والتخلص منه قبل الشروع في فصل وطلاء. وتفرقت الخلايا على لوحة مغلفة باللفين، مما سمح بتعلقها بكفاءة وسرعة. سُمح لـ CMs بتسوية 4-6 ساعات قبل نقل سيرنا. تم تحديث وسائل الإعلام الثقافة كل 24 ساعة لمدة 20 يوما، وبعد ذلك، تم إصلاح CMs وملطخة لعلامات القلب محددة مثل Troponin وعلامات دورة الخلية مثل KI67.
Introduction
أمراض القلب هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تقريبا جميع أنواع الإصابة القلبية يؤدي إلى فقدان كبير من أمراض القلب الكبار (CMs). قلوب الثدييات الكبار غير قادرين على إصلاح إصابات القلب بسبب الطبيعة الشيخوخة لـ CM البالغ1. وبالتالي، فإن أي إهانة للقلب الثديي البالغين يؤدي إلى فقدان دائم لـ CMs، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة القلب وفشل القلب. على عكس الثدييات الكبار، يمكن للحيوانات الصغيرة مثل حمار وحشي وقلوب نيوت تجديد إصابات القلب من خلال انتشار CM القائمة2،3،4. ويجري بذل جهد عالمي لإيجاد تدخل علاجي جديد للإصابة بالقلب من خلال النهج التكاثرية وغير التكاثرية على حد سواء. في العقود الماضية، تم تطوير أنواع مختلفة من نماذج الماوس الجينية لدراسة إصابة القلب وإصلاح. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج الحيوانات الحية في أن يكون نهجا مكلفا مع تعقيد إضافي لفك آلية الخلية المستقلة من الآثار الثانوية. إلى جانب ذلك، في نظم الجسم الحي هي صعبة لتحليل CM آثار محددة للتدخل الدوائية التي تحفز إشارات القلب من CM.
وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للأجهزة الجماعية للبالغين ضرورية لإجراء تحليلات انتشار الأسلحة العنقودية. تتطلب فحوصات انتشار CM ما لا يقل عن 4-5 أيام حتى يتم تحريض الخلايا في دورة الخلية والحصول على بيانات دقيقة بعد ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات التي تستخدم CMs المعزولة للدراسات الفسيولوجية الكهربائية ، وفحص الأدوية ، ودراسات السمية ، ودراسات Ca++ التوازن كلها في حاجة إلى نظام ثقافة محسن5،6،7. وعلاوة على ذلك، تظهر الدراسات الحديثة أهمية القلبية من السيتوكينات يفرز من CMs (cardiokines)8،9. من أجل التحقيق في الدور العلاجي والآلية الجزيئية لهذه القلب أثناء إصلاح القلب وتجديده ، هناك حاجة إلى ثقافة طويلة.
الكبار الجرذان CMs قوية بما فيه الكفاية لعزلة خلية واحدة والثقافة على المدى الطويل في نظام في المختبر10،11،12. ومع ذلك ، فإن الماوس الكبار CMs هي ذات أهمية كبيرة في المختبرات ، وذلك بسبب توافر مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا ، والذي يسمح لتصميم وتنفيذ مختلف التحليلات المبتكرة التي لا يمكن مع الفئران CM13. على النقيض من الكبار الجرذان CM العزلة ، فإنه من الصعب جدا الحصول على تعليق خلية واحدة من قلوب الماوس الكبار ، وثقافة طويلة الأجل من الكبار الماوس CMs في الثقافة هو أكثر تحديا.
الكبار CM العزلة من قلوب الفئران والماوس باستخدام نظام Langendorff سبق أن أنشئت لدراسة وظيفة CM5،14،15. هنا، وصفنا بالتفصيل بروتوكولات لعزلة CM الكبار عن كل من الفئران والجرذان، فضلا عن الثقافة المعدلة على المدى الطويل، وتكاثر تكاثر CM للخلايا المعزولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرها المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة (NIH). وقد وافقت على جميع البروتوكولات المعروضة في الفيديو من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة سينسيناتي، كلية الطب.
1. التحضير قبل استخراج القلب من الفئران البالغة (والجرذان)
- إعداد الضخ المقابلة، والانزيم، وحلول وقف، وفقا لوصفات الواردة في الجدول 1 والجدول 2،لعزل الفئران والفأر، على التوالي. تصفية الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي تلوث أو الجسيمات غير المُحلَّة.
- تنظيف وتعقيم الأدوات الجراحية عن طريق نقعها في 70٪ الكحول لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل بعد ذلك مع الماء المقطر مزدوجة. اترك الأدوات للهواء الجاف على منشفة ورقية نظيفة.
- قبل تسخين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية. تحقق من مستوى المياه في حمام الماء لضمان دوران المياه الدافئة دون انقطاع من خلال جهاز التسريب أثناء الإجراء.
- تنظيف جهاز الضخ عن طريق تشغيل مع 70٪ الكحول لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: زيادة معدل التدفق، مما يساعد على تنظيف الأنابيب. - بعد تدفق الكحول من خلال، وتنظيف بقايا الكحول عن طريق تشغيل الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقيقة.
- إعداد 3 البوليسترين متوسطة الحجم يمكن التخلص منها وزنها أطباق لتنظيف القلب بعد الختان. ملء الأطباق مع 20 مل من المخزن المؤقت myocyte.
- إضافة 2-3 قطرات من الهيبارين إلى كل طبق مع مساعدة من ماصة باستور ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب عدة مرات.
- خذ حقنة 10 مل مع قنية إبرة حادة.
ملاحظة: يمكن تحضير قنية إبرة حادة بقطع طرف إبرة نظيفة ومعقمة. واستخدمت إبرة 21 G وإبرة 14 G لصنع القنية للفأر والجرذ، على التوالي. - ملء حقنة مع المخزن المؤقت perfusion(الجدول 1). إزالة أي فقاعات الهواء من الحقنة ووضعه في الطبق الثالث في موقف الزاوية. تأمينه مع الشريط.
ملاحظة: بالنسبة للفئران، تم استخدام الحل A(الجدول 2)بدلاً من المخزن المؤقت للضخ. - إعداد عقدة فضفاضة مع خياطة الجراحية ووضعها حول الإبرة.
- حقن الماوس مع الهيبارين (100 وحدة USP / الماوس) عن طريق الحقن داخل الصفاق، 20 دقيقة قبل حقن التخدير.
- تعميم المخزن المؤقت الضخ(الجدول 1)من خلال جهاز الضخ. خفض معدل التدفق إلى 3 مل / دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة للفئران، تم استخدام الحل A(الجدول 2)بدلاً من المخزن المؤقت للضخ. - بعد 5 دقائق، استبدال المخزن المؤقت perfusion مع محلول انزيم(الجدول 1). تشبع محلول الإنزيم بالأكسجين أثناء العملية. استخدم معدل تدفق 3 مل/دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة لعزلة CM الجرذان، استخدم الحل E(الجدول 2)بدلاً من ذلك. - تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من التخدير. استخدم الجرعة المناسبة من التخدير، التي أوصت بها IACUC، لإجراء الجراحة النهائية.
- تأكيد عمق كافية من التخدير من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع. ثم، وضع الماوس على منصة الجراحية.
2. استخراج القلب من الفئران البالغة (والجرذان)
- تعقيم الجلد عن طريق مسح مع 70٪ من الكحول.
- فتح بعناية الصدر.
- اُكَسَر القلب تجنب الأنسجة غير القلبية أثناء الختان.
- وضع القلب على الطبق الأول، مليئة عازلة perfusion(الجدول 1).
ملاحظة: استخدم الحل A للفئران(الجدول 2). - مسح الدم من القلب عن طريق الضغط بلطف.
- نقل القلب إلى الطبق الثاني.
- تنظيف الدم من القلب وإزالة الأنسجة غير القلبية. في وقت لاحق، نقل القلب إلى الطبق الثالث.
- تقليم قبالة الرئتين والأنسجة المحيطة الأخرى وقنينة عن طريق الشريان الأورطي التصاعدي. يجب تنفيذ هذا الإجراء بأسرع وقت ممكن (<5 دقيقة) لتحسين جودة CM وكميته.
3. هضم القلب
- هضم قلب الفأر
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول/ المخازن المؤقتة التي تدور من خلال قلب الماوس أكسجين طوال الإجراء.- قم بإزالة الإبرة التكمع بعناية من الحقنة وتوصيلها بجهاز قذف Langendorff.
- تجنب أي فقاعات الهواء الخوض في القلب، والتي قد تؤثر على تدفق من خلال محلول الانزيم والهضم.
- حرك سترة الماء لأعلى لتوفير بيئة متجانسة للقلب. السماح لمحلول انزيم للتدفق من خلال القلب بسرعة 2-3 مل / دقيقة.
ملاحظة: سرعة تمرير الحل أمر بالغ الأهمية ولها تأثير كبير على نتائج CM الكمية والنوعية. - دع محلول الإنزيم يتدفق عبر القلب لمدة 2 دقيقة.
- في 2 دقيقة، إضافة 40 ميكرولتر من 100 μM CaCl2 حل لمحلول انزيم ومزيج. السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لآخر 10-15 دقيقة.
ملاحظة: بمجرد أن يصبح التدفق سلسًا ، يصبح القلب بنيًا وناعمًا ، مما يشير إلى التوزيع المتعادل لأنزيم الكولاجين والهضم السليم للقلب.
- هضم قلب الفئران
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول / المخازن المؤقتة التي تدور من خلال قلب الفئران أكسجين طوال العملية.- قم بإزالة الإبرة التكمع بعناية من الحقنة وتوصيلها بجهاز قذف Langendorff.
- تجنب أي فقاعات الهواء الخوض في القلب، والتي قد تؤثر على تدفق من خلال محلول الانزيم والهضم.
- حرك سترة الماء لأعلى لتوفير بيئة متجانسة للقلب.
- بدء تدفق الحل A بسرعة 2-3 مل / دقيقة لمدة 3-5 دقائق لإزالة أي دم من القلب.
ملاحظة: سرعة تمرير الحل أمر بالغ الأهمية ولها تأثير كبير على نتيجة جودة CM. - بمجرد تطهير الدم من القلب، والتحول من الحل A إلى الحل E(الجدول 2). Titrate الحل E مع CaCl2 كما هو مبين أدناه لتركيز النهائي من 0.1 mM في الحل:
- بعد 10 دقيقة من الضخ، إضافة 12.5 ميكرولتر من 0.1 م CaCl2.
- بعد 15 دقيقة من الضخ، إضافة 25 ميكرولتر من 0.1 م CaCl2.
- السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لمدة 30-40 دقيقة أخرى، حتى يصبح تدفق سريع والقلب هو مرنة.
4. إعداد CM تعليق وحيد الخلية
- إعداد التعليق أحادي الخلية CM (الماوس)
- إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقله إلى طبق بيتري 60 مم مليئة 5 مل من محلول انزيم ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
ملاحظة: ضمان هضم القلب كافية قبل إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. يعتمد وقت الهضم على نشاط الإنزيم وتدفق المحلّل وحجم القلب. - إجراء أي مزيد من التفصيل الميكانيكية في غطاء غطاء السلامة البيولوجية لضمان العقم وتجنب التلوث.
- إزالة بعناية الأذين (1/4th من الجزء القاعدي القلب) والأنسجة الدهنية الزائدة.
- اِنقط القلب بالملقط إلى قطع دقيقة
- خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها بزاوية 45º.
- استخدام هذه الماصات باستور للاستغناء عن أنسجة القلب في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف. الهضم الأمثل يوفر تعليق من خلايا القلب وحيدة الخلية.
ملاحظة: إزالة ضيق، الجزء السفلي من الأنابيب نقل للحد من الضرر CM بسبب البح الميكانيكية. - ثم، إضافة 5 مل من وقف الحل لوقف نشاط الانزيم، الذي يتجنب إمكانية عسر الهضم المفرط.
- اتخاذ جديدة 50 مل مخروطية ووضع مصفاة 100 ميكرومتر خلية معقمة على ذلك.
- تمرير تعليق cardiomyocyte من خلال مصفاة الخلية لإزالة قطعة الأنسجة. غسل طبق بيتري ومصفاة مع آخر 5 مل من حل وقف(الجدول 1) لجمع أي cardiomyocytes التي لا تزال تعلق على مصفاة.
- إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقله إلى طبق بيتري 60 مم مليئة 5 مل من محلول انزيم ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
- إعداد التعليق أحادي الخلية CM (الجرذان)
- إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقل القلب إلى طبق بيتري 100 مم مليئة 5 مل من الحل A ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
ملاحظة: ضمان هضم القلب كافية قبل إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. يعتمد وقت الهضم على نشاط الإنزيم وتدفق المحلّل وحجم القلب. - إجراء أي مزيد من التفصيل الميكانيكية في غطاء غطاء السلامة البيولوجية لضمان العقم وتجنب التلوث.
- إزالة بعناية الأذين (1/4th من الجزء القاعدي القلب) والأنسجة الدهنية الزائدة.
- اِنقط القلب بالملقط إلى قطع دقيقة
- خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها بزاوية 45º.
- استخدام هذه الماصات باستور للاستغناء عن أنسجة القلب في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف. الهضم الأمثل يوفر تعليق من خلايا القلب وحيدة الخلية.
ملاحظة: إزالة ضيق، الجزء السفلي من الأنابيب نقل للحد من الضرر CM بسبب البح الميكانيكية. - إضافة 5 مل من الحل ب(الجدول 2)إلى التعليق CM وتمرير الحل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة أي قطع المتبقية من الدهون أو الأنسجة الأخرى غير هضم.
- جمع الترشيح في قارورة مخروطية 50 مل جديدة.
- استخدام آخر 5 مل من الحل باء لغسل طبق بيتري وأي CM المتبقية من خلال مصفاة الخلية.
- إزالة القلب من نظام الضخ Langendorff. نقل القلب إلى طبق بيتري 100 مم مليئة 5 مل من الحل A ونقل الطبق إلى غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية.
5- إزالة غير الـ CMs
- إزالة غير CMs من تعليق خلية واحدة للبالغين (الماوس)
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 20 × ز لمدة 3 دقائق.
- تجاهل عظمى و resuspend الخلايا في 10 مل من وقف الحل (الجدول 1).
ملاحظة: زيادة تركيز BSA في محلول التوقف سيزيد من لزوجته ويقلل من معدل الترسيب من غير CMs. - resuspend CMs عن طريق عكس لطيف من الأنبوب 3-5 مرات.
- في 3 دقائق، إضافة 10 ميكرولتر من 100 μM CaCl2 الحل ومزيج. كرر ثلاث مرات.
- بعد الإضافة الرابعة، الطرد المركزي تعليق cardiomyocyte في 20 × ز لمدة 3 دقائق.
- تجاهل المُندفع.
- Resuspend CMs في درجة حرارة مسبقة (37 درجة مئوية)، ماوس بالغ 2000 سم تصفيح الوسائط (الجدول 3).
- إزالة غير CMs من تعليق خلية واحدة للبالغين (فئران)
- خلايا بيليه في 20 × ز لمدة 3 دقائق في 25 درجة مئوية.
- تجاهل افرا و resuspend الخلايا في 25 مل من الحل باء(الجدول 2).
- اخلط الخلايا عن طريق انعكاس لطيف ووضعها في موقف أنبوب للسماح لـ CM بالاستقرار تحت الجاذبية.
- تجاهل بعناية فائقة.
- Resuspend الخلايا في 25 مل جديدة من الحل B و titrate ذلك إلى 1.0 mM CaCl2 بإضافة خطوة من 50 ميكرولتر، 75 ميكرولتر، و 100 ميكرولتر من 0.1 MCl2 في 3-5 دقائق.
ملاحظة: يمكن استخدام تركيز أعلى من BSA في الحل B في هذه الخطوة. وزيادة تركيز الـ BSA في الحل باء يزيد من اللزوجة وبالتالي، يقلل من معدل الترسيب في غير CMs. - بيليه الخلايا في 20 × ز لمدة 3 دقائق في 25 درجة مئوية، وpirate supernatant، وإضافة الحجم المطلوب من الكبار خلية الفئران وسائل الإعلام ثقافة(الجدول 4).
- بذور CMs على لوحة مغلفة لامينين.
ملاحظة: يمكن استخدام الطلاء المسبق لـ CMs على لوحة استزراع غير مغلفة لتقليل تلوث الخلايا غير CM.
6. الكبار CM الطلاء
- قبل الطلاء
- إعادة تعليق عضلة القلب في وسائل الإعلام الثقافة.
- قبل لوحة الخلايا في طبق 60 مم أو 100 ملم للفأر أو الفئران CM، على التوالي.
- احتضان CMs لمدة 2 ساعة في ح ح مع 5٪ CO2 في 37 ºC.
- أثناء الحضانة قبل لوحة، معطف لوحات ثقافة الخلية مع laminin (10 ميكروغرام / مل في PBS) لثقافة CM على المدى الطويل.
- بعد 2 ساعة من الطلاء المسبق، وجمع CMs في 50 مل قارورة مخروطية.
- جمع الخلايا من الطبق وإعادة لوحة لهم في laminin المغلفة 24 لوحة ثقافة جيدا لتجارب transfection.
- الخلايا الثقافية في حاضنة في 37 درجة مئوية تكملها بنسبة 5٪ مع CO2. 4-6 ساعات كافية للتمسك cardiomyocytes مع السطح، وبالتالي، يمكن تنفيذ transfection 6 ساعات بعد الطلاء.
ملاحظة: تستخدم عادةً الوسيلة التي تحتوي على FBS، وهي تظهر توافقًا أفضل مع دراسات الانتشار. ومع ذلك، يمكن استخدام وسيط خال من المصل للتجارب حيث يتم تحليل العوامل السرية.
7. نقل
- احتضان CMs إلى لوحات ثقافة الخلية المغلفة مع اللامينيين لمدة 4-6 ساعات.
- أربع ساعات بعد البذر CM على لوحة المغلفة laminin، الخلايا transfect مع siRNAs (50 nM) من الفائدة باستخدام مُكْشف transfection (على سبيل المثال، RNAiMAX RNAiMAX الدهنية) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تغيير الوسائط 24 ساعة بعد عملية نقل و 24 ساعة بعد ذلك لمدة تصل إلى 20 يومًا.
- بعد 20 يوما، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لتطبيقات المصب، بما في ذلك الكيمياء المناعية لعلامات القلب محددة مثل تروبونين لضمان أمراض القلب الحية كانت مستزرعة بنجاح على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول المعدل الحالي يسمح العزلة الفعالة وثقافة الفئران والفئران CMs في المختبر. لعزل الفئران CM، ما مجموعه 3 الكبار (12 أسبوعا) ذكر فيشر 344 الفئران استخدمت في هذا الإجراء. ويبين الشكل 1 الجهاز الجراحي والاجهزة العزلة المطلوبة في العملية؛ وقد تم وضع علامة على كل جزء ووصفها في أسطورة الرقم. وقد استخدم نوع Collagenase 2 للهضم، الذي ينتج كمية عالية من CMs عالية الجودة من العزلة الناجحة(الشكل 2A). أربع وعشرين ساعة بعد العزلة، وكانت هذه الخلايا التي تنتقل مع دورة الخلية التي تحفز siRNAs محددة ضد Rb1 و Meis2، في حين تم استخدام cel-miR-67 كما التحكم في transfection في التجربة11. تم الحفاظ على CMs في الثقافة لمدة ثلاثة أيام(الشكل 2B)أو ما يصل إلى عشرين يوما(الشكل 2C)لمراقبة التغيرات المورفولوجية. للتسجيل لنشاط دورة الخلية، تم تثبيت CMs في اليوم 7 وملطخة لعلامة القلب الخاصة Troponin-I، مؤشر ميتوتك KI67، وكان تصور نواة من خلال DAPI (الشكل 2D-F). لوحظت زيادة كبيرة في KI67 cardiomyocytes إيجابية مع siRb1 + siMeis2 العلاج بالمقارنة مع السيطرة11. وعلاوة على ذلك، كانت الفئران cardiomyocytes الضرب (وظيفة انكماشية) في الثقافة في اليوم السابع بعد الطلاء، والتي هي سمة مميزة للقلب صحية11.
لعزل CM في الفئران، تم استخدام ما مجموعه 3 ذكور و 3 الإناث الكبار (12 أسبوعا) C57BL/6 الفئران في هذا الإجراء. على غرار دراسة الفئران ، تم استخدام الكولاجين من النوع 2 لهضم الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية لقلب الفئران البالغة. الكبار الفئران CM هشة نسبيا للعزلة والثقافة في المختبر; وهكذا، يستخدم هذا البروتوكول blebbistatin لتحسين صلاحية الماوس الكبار CM. ناجحة العزلة الغلة > 70-80٪ شكل قضيب صحي CMs، والتي يمكن أن تكون مثقف لمدة تصل إلى 20 يوما(الشكل 3A-C)والحفاظ على القلب Troponin-I تلطيخ وانكماش(الشكل 3C). في تجارب منفصلة، أربع ساعات بعد العزل، تم نقل CMs الماوس مع دورة الخلية التي تحفز كوكتيل سيرنا كما هو موضح لCM Rb1 الفئران. Meis2 خضعت CMs ما بعد التكاثر إلى تصوير الدورة الزمنية لمدة 10 أيام تظهر التغيرات المورفولوجية(الشكل 4)والتي تليها مقايسة الانتشار(الشكل 5). في اليوم 10، تم تنفيذ تلطيخ الفلورسنت المناعي لتروبونين-الأول، KI67، وDAPI كما هو موضح سابقا. لوحظت زيادة كبيرة في KI67 cardiomyocytes إيجابية مع siRb1 + siMeis2 العلاج عند مقارنتها بالتحكم (الشكل 5A-C).
ويبين هذا البروتوكول أن الجرذان والفئران البالغة يمكن أن تُزرع على المدى الطويل في المختبر لمدة تصل إلى 20 يوماً وربما تكون أطول. بعد 20 يوما، CMs الحفاظ على تلطيخ تروبونين الأول وكذلك انكماش إذا تم إزالة مثبطات من وسائل الإعلام.
| Myocyte تكوين العازلة، درجة حرارة 7.4 (إعداد ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية) | |||
| الكاشف | تركيز، mM | ث الجزيئية. | لمدة 1 لتر |
| NaCl | 113 | 58.44 | 6.6037 غ |
| KCl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 ملغ |
| مغسمو4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 ملغ |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 ملغ |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 ملغ |
| التخزين المؤقت للدفق، 7.4 pH (إعداد جديدة لكل عزل) | |||
| تركيز، mM | ث الجزيئية. | المبلغ المطلوب | |
| المخزن المؤقت myocyte | 250 مل | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595.75 ملغ |
| 2،3-بوتانديون أحادية | 10 | 101.105 | 252.775 ملغ |
| NaHCO3 الطازجة | 1.6 | 84.007 | 33.6028 ملغ |
| تورين فريش | 30 | 125.15 | 938.625 ملغ |
| الجلوكوز الطازج | 20 | 180.156 | 900.775 ملغ |
| محلول انزيم | |||
| الأسهم Conc. | العمل Conc. | مطلوب | |
| المخزن المؤقت myocyte | 50 مل | 50 مل | |
| كولاجيناز نوع 2 | 330 يو / ملغ | 620 U/مل | 93 ملغ |
| بروتياز الرابع عشر | > 3.5 U / ملغ | 0.104 U/mL | 1.48 ملغ |
| DNase الأول الصف 2 | 0.015 ملغم/مل | ||
| إيقاف المخزن المؤقت A | |||
| الأسهم Conc. | العمل Conc. | مطلوب | |
| المخزن المؤقت myocyte | 30 مل | ||
| جيش صرب البوسنه | 2.50% | 0.75 غ | |
| CaCl2 | 100 mM | 0.1 مليون م.م | 30 ميكرولتر |
| إيقاف المخزن المؤقت B | |||
| الأسهم Conc. | العمل Conc. | مطلوب | |
| المخزن المؤقت myocyte | 30 مل | ||
| جيش صرب البوسنه | 5.00% | 1.5 غرام | |
| CaCl2 | 100 mM | 0.1 مليون م.م | 30 ميكرولتر |
الجدول 1: الحلول اللازمة لعزل القلب الماوس الكبار.
| 10x KHB الأسهم الحل (الحجم الإجمالي = 1 لتر) |
الكاشف | المولاري (mM) | المبلغ (ز) |
| NaCl | 1180 | 68.9 غرام | |
| KCl | 48 | 3.5 غرام | |
| HEPES | 250 | 59.7 غ | |
| مغسمو4 | 12.5 | 1.4 غرام | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2.1 غرام | |
| ضبط درجة الحرارة إلى 7.4 مع 4 M NaOH (~ 20 مل)، وتخزينها عند 4 درجة مئوية | |||
| KHB الحل، 500 مل | الكاشف | المبلغ | |
| 10x KHB | 50 مل | ||
| الجلوكوز | 0.99 غرام | ||
| تورين | 0.31 غرام | ||
| إضافة H2O لتحقيق حجم إلى 500 مل، وينبغي أن يكون من 7.35 ~ | |||
| الحل A | الكاشف | المبلغ | |
| حل KHB | 500 مل (10 مل م م) | ||
| BDM | 0.5 غرام | ||
| الأوكسجين مع 100٪ O2 ودافئة إلى 37 درجة مئوية | |||
| الحل B، 50 مل | الكاشف | المبلغ | |
| الحل A | 50 مل | ||
| جيش صرب البوسنه | 0.5 غرام | ||
| 0.1 M CaCl2 (Ca++= 0.1 mM) | 50 ميكرولتر | ||
| الحل E، 50 مل | الكاشف | المبلغ | |
| الحل A | 50 مل | ||
| جيش صرب البوسنه | 0.05 غ | ||
| كولاجيناز نوع II (263 وحدة / ملغ) | 35 ملغ | ||
| Hyaluronidase (النوع الأول-S) | 10 ملغ | ||
| 0.1 M CaCl2 الأسهم | 12.5 ميكرولتر | ||
| مزيج جيد | |||
| CaCl2 الأسهم، 0.1M | الكاشف | المبلغ | |
| CaCl2 | 7.35 غ | ||
| H2O | 500 مل | ||
| مخزن عند 4 درجة مئوية | |||
الجدول 2: الحلول اللازمة لعزل الكبار في القلب للفئران.
| تركيب وسائط الطلاء، 7.4 pH | |||
| التركيز العامل | Wt الجزيئية. | المبلغ المطلوب | |
| وسائل الإعلام الثقافة دون بليبيستاتين | 50 مل | ||
| BDM | 10 mM | 101.105 غرام/مول | 50.55 ملغ |
| FBS | 5% | 2.5 غرام | |
| الثقافة تكوين وسائل الإعلام، وhH 7.4 | |||
| الكاشف | التركيز العامل | Wt الجزيئية. | المبلغ المطلوب |
| DMEM | 1X | 250 مل | |
| الانسولين | 1 ميكروغرام/مل | 0.25 ملغ | |
| Transferrin | 0.55 ميكروغرام/مل | 0.138 ملغ | |
| السيلينيوم | 0.5 نانوغرام/مل | 0.125 ميكروغرام | |
| البنسلين (U/mL)-ستريبتوميسين (g/mL) | 100-100 | 2.5 مل | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 غرام/مول | 595.753 ملغ |
| * FBS | 10% | 25 مل | |
| * BSA | 0.20% | 0.5 غرام | |
| #Blebbistatin | 25 ميكرومتر | 292.338 غرام/مول | 1.8271 ملغ |
| *استخدم أيًا منهما، حسب المتطلبات التجريبية. # Aliquot وسائل الإعلام الثقافة لإعداد وسائل الإعلام الطلاء قبل إضافة Blebbistatin. ملاحظة: إعداد 200 مل من وسائل الإعلام الثقافة. ملاحظة: إعداد 50 مل من وسائل الاعلام الطلاء. |
|||
الجدول 3: تركيب الوسائط لطلاء القلب والاستزراع بالماوس البالغ.
| الثقافة تكوين وسائل الإعلام، وhH 7.4 | ||
| الكاشف | التركيز العامل | المبلغ المطلوب |
| DMEM | 1 x | 250 مل |
| البنسلين (U/mL)-ستريبتوميسين (g/mL) | 100-100 | 2.5 مل |
| * FBS | 10% | 25 مل |
الجدول 4: تركيب وسائط لطلاء واستزراع الجرذان الكبار.
الشكل 1: إعداد الإجراءات والمعدات. (ط) التمثيل التخطيطي للضخ. (ثانيا) الأدوات الجراحية وإبرة التكبيب. (III) القلب فيروية الجمعية: أ) سترة التدفئة. ب) مزدوجة الجدار وعاء سترة المياه. ج) تعميم مدخل المياه الساخنة. د) تعميم منفذ المياه الساخنة. E) حل ضخ القلب. F) تعميم مضخة G) أنبوب حل perfusion. ح) أنبوب إمدادات الأوكسجين. ط) حمام المياه المتداولة. J) إبرة تعليب مع القلب، تعلق على منفذ منفذ القذف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل الفئران البالغة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل. A)الكبار الفئران CM، مباشرة بعد العزل. ب) الكبار الفئران CM في اليوم 7 بعد العزل. ج)الكبار الفئران CM في اليوم 20. D-F) KI67 إيجابية الفئران CM في اليوم 7 بعد siRb1 + siMeis2 transfection. تروبونين-I = الأخضر؛ DAPI = أزرق؛ KI67 = أحمر. وقد أجريت جميع التجارب في نسختين ومكررتين ثلاث مرات على الأقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكبار ماوس CM العزلة والثقافة على المدى الطويل. أ)الفئران الكبار CM، مباشرة بعد العزل. ب) الفئران الكبار CM في اليوم 7 بعد العزل. ج) الفئران البالغة CM ملطخة القلب تروبونين-I = الأخضر في اليوم 20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الماوس الكبار CM دي التمايز. الكبار الفئران CM تظهر التغيرات المورفولوجية خلال الثقافة على المدى الطويل (يوم 0 إلى يوم 10) في وسائل الإعلام DMEM HG، تستكمل مع 10٪ FBS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: ماوس الكبار CM transfection والانتشار. أ-ج) KI67 الماوس الإيجابي CM في اليوم 10 بعد siRb1 + siMeis2 transfection. تروبونين-I = الأخضر؛ DAPI = أزرق؛ KI67 = أحمر. D) يظهر الرسم البياني الشريطي زيادة كبيرة في CMs الماوس الكبار إيجابية KI67 في مجموعة التناسلية المضادة للكوكتيل- الكارنا مقابل السيطرة. يتم عرض النتائج على أنها متوسط±SEM; * = قيمة ≤0.05. p-value ≤0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. تم تنفيذ جميع التجارب في ثلاثية (n = 3 ذكر، 3 أنثى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك حاجة ماسة إلى إنشاء بروتوكول لعزلة القلب و الثقافة طويلة الأجل لإجراء دراسات ميكانيكية خاصة بالخلايا. هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تناقش الكبار CM بروتوكولات العزل، وتستخدم أقل منهم حتى لثقافة طويلة الأجل من الفئران الكبار CM15،16،17. وقد تبين أن الكبار الفئران CM لديه التسامح أعلى في في المختبر من الفئران الكبار CM10،11،12. في هذا التقرير، وضعنا بروتوكولاً لعزل الفئران والفئران البالغة، وtransfection، والثقافة على المدى الطويل، والتحليل المصب للانتشار المستحث، مع الحد الأدنى من التعديلات في البروتوكولات المستخدمة بانتظام.
وتستند البروتوكولات المتاحة لعزل CM الكبار على استخدام اثنين من الإنزيمات المعروفة، collagenase وliberase، لعملية الهضم مصفوفة خارج الخلية (ECM)18،19. Collagenase هو انزيم شائع الاستخدام في بروتوكولات عزل CM الكبار. كولاجيناز يهضم ألياف الكولاجين في ECM، مما يؤدي إلى تفكك أنسجة القلب في CM أحادي الخلية. وبالمثل، liberase يهضم ECM. Liberase هو البديل النقي لكولاجيناز، والذي يظهر أعلى النشاط، وبالتالي يتطلب دقة أعلى خلال عزل CM لتحقيق العزلة الناجحة بالمقارنة مع الكولاجيناز. وعلاوة على ذلك، في الإجراء، لاحظنا أن CM معزولة مع liberase لا البقاء على قيد الحياة في الثقافة على المدى الطويل. ومع ذلك، CM معزولة مع collagenase يحسن طول العمر من CM في ظروف الثقافة.
بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا مثبطات معينة myosin II دعا blebbistatin في وسائل الإعلام الثقافة للثقافة على المدى الطويل من الكبار ماوس CM20،21. سابقا، 2،3-بوتانديون monoximine (BDM) وقد استخدمت لثقافة CM الكبار. BDM هو مثبط ATPase الذي يمنع وظيفة العقد من خلال آلية محددة بشكل سيئ والتي تشمل تثبيط ATPase وإعاقة انتقال Ca++ 22. بالمقارنة مع BDM، blebbistatin هو مثبط معين من الميوسين الثاني ويظهر تثبيط أكثر أهمية من وظيفة انكماشية في تركيزات أقل من BDM. قبل الطلاء من الماوس الكبار CM في وسائل الإعلام الثقافة، تستكمل مع 10 mM من BDM والثقافات اللاحقة من CM في 25 μM blebbistatin- تكمل وسائل الإعلام المصل وانخفاض يحسن من البقاء على قيد الحياة وشكل قضيب هيكل CM في الثقافة على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن الطلاء المباشر للماوس البالغ CM في وسائل الإعلام، مع استكمال 25 μM blebbistatin و 10٪ FBS هو أفضل للدراسات التكاثرية. على غرار الجرذان الكبار CM، الذي يظهر قدرا كبيرا من إزالة التمايز في الثقافة في المختبر، لاحظنا أيضا دي التمايز في الماوس الكبار CM إلى حد ما (الشكل 5). التغيرات المورفولوجية هي الخطوة الضرورية للانتشار. وبالتالي، فإن توفير بيئة للبالغين من كبار السن التي تسهل إلغاء التفريق بين هذه التشوهات عامل حاسم يجب مراعاته في هذه الدراسات. على الرغم من أنه في هذا الوقت، ليس من الواضح أي من الخطوات أو المكونات الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول هي المسؤولة عن تحسين طول العمر من CMs الكبار، ونحن نعتقد أنه هو تأثير مزيج من الكواشف المستخدمة، والتعديلات التي أدخلت في إجراء العزل، وربما الأهم من ذلك اليدين المدربين.
على غرار التقارير السابقة التي تظهر النقل الفيروسي لـ CM البالغ في وسائل الإعلام المكملة للبليبيستاتين ، لاحظنا أيضًا نقلًا فعالًا لهذه الخلايا باستخدام الـ siRNAs. استخدمنا siRNAs محددة ضد اثنين من الجينات المرتبطة senescence، Rb1 وMis2، للحث على انتشار CM. بالنسبة الجرذان CM، قمنا بتحليل KI67 لتقييم الانتشار في اليوم السابع بعد التكاثر؛ ومع ذلك، تم تحليل الانتشار في الماوس CM الكبار في اليوم العاشر بعد transfection. ويمكن أن يكون التغير البيولوجي الخاص بالأنواع سببا محتملا للفرق الزمني الملاحظ في دورة الخلية المستحثة التي تعيد دخول الفئران البالغة والماوس CM.
وعموما، فإن البروتوكول الموصوف هنا يوفر إجراء محسن وموثوقا به ومقارنا لعزل الفئران والماوس الكبار CM، وبالتالي ثقافتهم حسب الحاجة التجريبية. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول بثقافة طويلة الأجل لـ "الـ"س.م.م" البالغ، التي توفر نظاماً في المختبر لإجراء تحليلات متعددة طويلة الأجل مثل الانتشار، وعامل الباركرين، والاستجابة للإجهاد، وما إلى ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من خلال تمويل من قسم علم الأمراض والطب المختبري، جامعة سينسيناتي، كلية الطب، إلى الدكتور أونور كانيسيك؛ منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01HL148598) إلى الدكتور أونور كانيسيك. الدكتور أونور كانيسيكاك مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية جائزة التطوير الوظيفي (18CDA34110117). الدكتور بيرويز علم مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة ما بعد الدكتوراه (AHA_20POST35200267). الدكتورة مالينا ج. آيفي مدعومة بمنحة من المعاهد القومية للصحة T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
