Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.
Abstract
La culture ex vivo des cardiomyocytes mammifères adultes (CM) présente le système expérimental le plus pertinent pour l’étude in vitro de la biologie cardiaque. Les CMs des mammifères adultes sont des cellules différenciées en phase terminale avec une capacité proliférative minimale. L’état post-mitotique des MCM adultes non seulement limite la progression du cycle cellulaire cardiomyocyte, mais limite également la culture efficace des CM. En outre, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour de nombreuses études, telles que la prolifération cm et l’analyse de l’expression des gènes.
La souris et le rat sont les deux animaux de laboratoire les plus préférés à être utilisés pour l’isolement cardiomyocyte. Bien que la culture à long terme des CMs de rat soit possible, les CMs adultes de souris sont sensibles à la mort et ne peuvent pas être cultivés plus de cinq jours dans des conditions normales. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser l’isolement cellulaire et le protocole de culture à long terme pour les CM murines adultes. Avec ce protocole modifié, il est possible d’isoler et de culture avec succès les CM adultes de souris et de rats pendant plus de 20 jours. De plus, l’efficacité de la transfection du SIRNA du CM isolé est considérablement augmentée par rapport aux rapports précédents. Pour l’isolement cm de souris adulte, la méthode de perfusion de Langendorff est employée avec une solution enzymatique optimale et le temps suffisant pour la dissociation complète de matrice extracellulaire. Afin d’obtenir des MC ventriculaires purs, les deux atrias ont été disséqués et jetés avant de procéder à la dissociation et au placage. Les cellules ont été dispersées sur une plaque enduite de laminine, ce qui a permis un attachement efficace et rapide. Les CM ont été autorisés à se contenter de 4-6 h avant la transfection de siRNA. Les médias culturels ont été rafraîchis tous les 24 h pendant 20 jours, et par la suite, les CM ont été fixés et tachés pour des marqueurs cardiaques spécifiques tels que la troponine et des marqueurs du cycle cellulaire tels que KI67.
Introduction
Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes de décès dans le monde. Presque tous les types de lésions cardiaques entraînent une perte importante de cardiomyocytes adultes (CM). Les cœurs de mammifères adultes sont incapables de réparer leurs lésions cardiaques en raison de la nature sénescente du CM1adulte. Ainsi, toute insulte au cœur des mammifères adultes entraîne une perte permanente de CMs, conduisant à une diminution de la fonction cardiaque et l’insuffisance cardiaque. Contrairement aux mammifères adultes, les petits animaux comme le poisson zèbre et les cœurs de newt peuvent régénérer leurs lésions cardiaques par la prolifération existante cm2,3,4. Un effort mondial est en cours pour trouver une nouvelle intervention thérapeutique pour les lésions cardiaques par le biais d’approches prolifératives et non prolifératives. Au cours des dernières décennies, divers types de modèles génétiques de souris ont été développés pour étudier les lésions cardiaques et la réparation. Cependant, l’utilisation de modèles animaux in vivo continue d’être une approche coûteuse avec la complexité supplémentaire pour déchiffrer un mécanisme cellulaire autonome à partir d’effets secondaires. En outre, les systèmes in vivo sont difficiles à analyser les effets spécifiques cm d’une intervention pharmacologique qui induit la signalisation cardioprotectrice de la CM.
De plus, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour effectuer des analyses de prolifération des CM. Les tests de prolifération cm nécessitent un minimum de 4-5 jours pour que les cellules soient induites dans le cycle cellulaire et pour obtenir des données précises par la suite. En outre, les études qui utilisent des CM isolés pour des études électrophysiologiques, le dépistage des médicaments, les études de toxicité, et les études d’homéostasie Ca++ ont tous besoin d’un système de culture amélioré5,6,7. En outre, des études récentes montrent l’importance cardioprotectrice des cytokines sécrétées par les CMs (cardiokines)8,9. Afin d’étudier le rôle thérapeutique et le mécanisme moléculaire de ces cardiokines pendant la réparation et la régénération de coeur, une culture prolongée est exigée.
Les CMs adultes de rat sont assez robustes pour l’isolement unicellulaire et la culture à long terme dans un système in vitro10,11,12. Cependant, les CM de souris adultes sont d’un grand intérêt pour les tests in vitro, en raison de la disponibilité d’une variété de modèles de souris génétiquement modifiés, ce qui permet la conception et l’exécution de diverses analyses innovantes qui ne sont pas possibles avec le rat CM13. Contrairement à l’isolement adulte de CM de rat, il est assez difficile d’obtenir une suspension d’une seule cellule des coeurs de souris adultes, et la culture à long terme des CM de souris adultes dans la culture est encore plus difficile.
L’isolement adulte de CM des coeurs de souris et de rat utilisant un système de Langendorff a précédemment été établi pour étudier la fonction de CM5,14,15. Ici, nous avons décrit en détail les protocoles pour l’isolement adulte de CM des rats et des souris, aussi bien qu’une culture modifiée à long terme, la transfection, et la prolifération de CM des cellules isolées.
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Protocol
Toutes les expériences doivent être réalisées conformément aux lignes directrices du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le National Institute of Health (NIH) des États-Unis. Tous les protocoles affichés dans la vidéo ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Cincinnati, College of Medicine.
1. Préparation avant l’extraction cardiaque de souris adultes (et rats)
- Préparer les solutions de perfusion, d’enzyme et d’arrêt correspondantes, selon les recettes données respectivement aux tableaux 1 et 2, pour l’isolement des rats et des souris. Filtrer les solutions à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toute contamination ou particules non déguisées.
- Nettoyez et stérilisez les instruments chirurgicaux en les trempant dans 70% d’alcool pendant 15 min, puis lavez-les avec de l’eau distillée double. Laissez les outils sécher à l’air sur une serviette en papier propre.
- Préchauffer le bain d’eau à 37 ºC. Vérifiez le niveau d’eau dans le bain d’eau pour assurer une circulation ininterrompue de l’eau chaude à travers l’appareil de perfusion pendant la procédure.
- Nettoyez l’appareil de perfusion en courant avec 70% d’alcool pendant 5 min. Répétez.
REMARQUE : Augmentez le débit, ce qui aide à nettoyer le tube. - Après le débit d’alcool, nettoyer les restes d’alcool en exécutant de l’eau distillée double pendant 10 min.
- Mettre en place 3 plats jetables de taille moyenne pesant des plats pour nettoyer le cœur après l’excision. Remplissez les plats de 20 mL de tampon de myocyte.
- Ajouter 2 à 3 gouttes d’héparine dans chaque plat à l’aide de la pipette Pasteur et bien mélanger en pipeting plusieurs fois.
- Prenez une seringue de 10 mL avec une canule à aiguille émoussée.
REMARQUE : Une canule à aiguille émoussée peut être préparée en coupant la pointe d’une aiguille propre et stérile. Une aiguille de 21 G et une aiguille de 14 G ont été utilisées pour fabriquer la canule de la souris et du rat, respectivement. - Remplissez la seringue avec un tampon de perfusion (tableau 1). Retirez les bulles d’air de la seringue et placez-la dans le troisième plat à une position inclinée. Fixez-le avec du ruban adhésif.
REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte. - Préparer un nœud lâche avec une suture chirurgicale et le placer autour de l’aiguille.
- Injectez la souris avec de l’héparine (100 unités USP/souris) par injection intrapéritonéale, 20 min avant l’injection d’anesthésie.
- Faire circuler la tampon de perfusion de myocyte (tableau 1) à travers l’appareil de perfusion. Diminuer le débit à 3 mL/min.
REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte. - Après 5 min, remplacer le tampon de perfusion par la solution enzymatique (tableau 1). Saturer la solution enzymatique avec de l’oxygène pendant le processus. Utilisez un débit de 3 mL/min.
REMARQUE : Pour l’isolement de cm de rat, utilisez la solution E (Tableau 2) à la place. - Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale d’anesthésie. Utilisez la dose appropriée d’anesthésie, recommandée par l’IACUC, pour la chirurgie terminale.
- Confirmer une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence d’une réponse à une pincée d’orteil. Ensuite, mettez la souris sur la plate-forme chirurgicale.
2. Extraction du cœur de souris adultes (et de rats)
- Stériliser la peau en essuyant avec 70% d’alcool.
- Ouvrez soigneusement la poitrine.
- Exciser le cœur. Évitez les tissus non cardiaques pendant l’excision.
- Mettez le cœur sur le premier plat, rempli de tampon de perfusion (Tableau 1).
REMARQUE : Utiliser la solution A pour le rat (tableau 2). - Dégagez le sang du cœur en serrant doucement.
- Transférer le cœur dans le deuxième plat.
- Nettoyez le sang du cœur et retirez les tissus non cardiaques. Par la suite, transférer le cœur dans le troisième plat.
- Coupez les poumons et les autres tissus environnants et cannulez par l’intermédiaire de l’aorte ascendante. Cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible (<5 min) afin d’améliorer la qualité et la quantité de CM.
3. Digestion du cœur
- Digestion du cœur de souris
REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur de la souris doivent être oxygénées tout au long de la procédure.- Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.
- Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.
- Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur. Permettre à la solution enzymatique de circuler dans le cœur à une vitesse de 2-3 mL/min.
REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la quantité et de la qualité cm. - Laissez la solution enzymatique circuler dans le cœur pendant 2 min.
- À 2 min, ajouter 40 μL de 100 μM CaCl2 solution à la solution enzymatique et mélanger. Laissez passer la solution enzymatique dans le cœur pendant encore 10-15 min.
REMARQUE : Une fois que le flux devient lisse, le cœur devient brunâtre et doux, indiquant la distribution uniforme de l’enzyme de collagènease et la bonne digestion du cœur.
- Digestion du cœur de rat
REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur du rat doivent être oxygénées tout au long de la procédure.- Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.
- Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.
- Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur.
- Démarrer le flux de la solution A à une vitesse de 2-3 mL/min pendant 3-5 min pour enlever tout sang du cœur.
REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la qualité CM. - Une fois le sang dégagé du cœur, passez de la solution A à la solution E (Tableau 2). Solution de titrage E avec CaCl2 comme indiqué ci-dessous pour une concentration finale de 0,1 mM en solution :
- Après 10 min de perfusion, ajouter 12,5 μL de 0,1 M CaCl2.
- Après 15 min de perfusion, ajouter 25 μL de 0,1 M CaCl2.
- Laissez la solution enzymatique passer à travers le cœur pendant encore 30-40 min, jusqu’à ce que le flux devient rapide et le cœur est souple.
4. Préparation de la suspension à cellule unique CM
- Préparation de la suspension à cellule unique CM (souris)
- Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez-le dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de 5 mL de solution enzymatique et transférez le plat sur une hotte de biosécurité.
REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur. - Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.
- Retirez soigneusement les atrias(1/4 e de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.
- Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.
- Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.
- Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque dans une suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires.
REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique. - Ensuite, ajouter 5 mL de solution d’arrêt pour arrêter l’activité enzymatique, ce qui évite la possibilité de surdigestion.
- Prenez un produit conique frais de 50 mL et placez-le sur une passoire à cellules stérile de 100 μm.
- Passer la suspension cardiomyocyte à travers la passoire cellulaire pour enlever le morceau de tissu. Laver la boîte et la passoire Petri avec une autre solution d’arrêt de 5 mL (tableau 1)pour recueillir les cardiomyocytes qui restent attachés à la passoire.
- Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez-le dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de 5 mL de solution enzymatique et transférez le plat sur une hotte de biosécurité.
- Préparation de la suspension à cellule unique CM (rat)
- Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez le cœur vers une boîte de Pétri de 100 mm remplie de 5 mL de solution A et déplacez le plat vers une hotte de biosécurité.
REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur. - Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.
- Retirez soigneusement les atrias (1/4e de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.
- Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.
- Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.
- Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque en suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires.
REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique. - Ajouter 5 mL de solution B (tableau 2) à la suspension CM et passer la solution à travers une passoire à cellules de 100 μm pour enlever les morceaux restants de graisse ou d’autres tissus non digérés.
- Recueillir le filtrate dans un flacon conique frais de 50 mL.
- Utilisez un autre 5 mL de solution B pour laver la boîte de Pétri et tout cm restant à travers la passoire cellulaire.
- Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez le cœur vers une boîte de Pétri de 100 mm remplie de 5 mL de solution A et déplacez le plat vers une hotte de biosécurité.
5. Suppression des non-CM
- Retrait des non-CM de la suspension adulte à cellule unique (souris)
- Centrifuge la suspension cellulaire à 20 x g pendant 3 min.
- Jeter le supernatant et resuspender les cellules dans 10 mL de solution d’arrêt (Tableau 1).
REMARQUE : L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution d’arrêt augmentera sa viscosité et réduira le taux de sédimentation des non-MC. - Resuspendez les CM par l’inversion douce du tube 3-5 fois.
- À intervalles de 3 min, ajouter 10 μL de 100 μM CaCl2 solution et mélanger. Répétez trois fois.
- Après le quatrième ajout, centrifuge la suspension cardiomyocyte à 20 x g pendant 3 min.
- Jetez le supernatant.
- Resuspend les MC en préchauffés (37 ºC), les supports de placage CM de souris adultes (tableau 3).
- Retrait des non-CM des suspensions adultes à cellule unique (rat)
- Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC.
- Jeter le supernatant et resuspender les cellules en 25 mL de solution B (Tableau 2).
- Mélanger les cellules par une légère inversion et les placer dans un support de tube pour permettre au CM de s’installer sous la gravité.
- Jeter soigneusement le supernatant.
- Resuspendez les cellules dans 25 mL frais de la solution B et titrez-les à 1,0 mM CaCl2 par addition progressive de 50 μL, 75 μL et 100 μL de 0,1 M CaCl2 à intervalles de 3 à 5 min.
REMARQUE : Une concentration plus élevée de BSA dans la solution B pourrait être utilisée à cette étape. L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution B augmente la viscosité et, par conséquent, réduit le taux de sédimentation des non-MC. - Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC, aspirant le supernatant, et ajouter le volume désiré de la culture de cellules de rat adultes (tableau 4).
- Semer les CM sur une plaque enduite de laminine.
REMARQUE : Le pré-placage des MC sur une plaque de culture non enduite peut être utilisé pour minimiser la contamination des cellules non CM.
6. Placage CM adulte
- Pré-placage
- Resuspend les cardiomyocytes dans les médias culturels.
- Pré-plaquer les cellules dans un plat de 60 mm ou 100 mm pour la souris ou le rat CM, respectivement.
- Incuber les CM pendant 2 h dans un incubateur complété par 5% de CO2 à 37 ºC.
- Pendant l’incubation pré-plaque, enduisez les plaques de culture cellulaire de laminine (10 μg/mL en PBS) pour la culture CM à long terme.
- Après 2 h de pré-placage, recueillir les CM dans un flacon conique de 50 mL.
- Recueillir les cellules du plat et les re-plaquer dans une plaque de culture de 24 puits enduit de laminine pour des expériences de transfection.
- Cellules de culture dans un incubateur à 37 ºC complétés par 5% avec CO2. 4-6 heures est suffisante pour adhérer aux cardiomyocytes avec la surface, et donc, la transfection peut être effectuée 6 heures après le placage.
REMARQUE : Le milieu de placage contenant FBS est couramment utilisé et montre une meilleure compatibilité avec les études de prolifération. Cependant, un milieu sans sérum peut être utilisé pour des expériences où des facteurs sécrétoires sont analysés.
7. Transfection
- Incuber les MC aux plaques de culture cellulaire recouvertes de laminine pendant 4-6 heures.
- Quatre heures après l’ensemencement cm sur la plaque enduite de laminine, les cellules transfectées avec des siARN (50 nM) d’intérêt à l’aide d’un réactif transfection (par exemple, lipofectamine RNAiMAX) selon le protocole du fabricant.
- Changez de support 24 heures après la transfection et toutes les 24 heures après cela pendant jusqu’à 20 jours.
- Après 20 jours, fixer les cellules avec 4% PFA dans PBS pour les applications en aval, y compris l’immunocytochimie pour les marqueurs cardiaques spécifiques tels que troponine pour assurer cardiomyocytes vivants ont été cultivés avec succès à long terme.
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Representative Results
Le protocole modifié actuel permet l’isolement efficace et la culture des rats et des souris CMs in vitro. Pour l’isolement de CM de rat, un total de 3 adultes (12 semaines)mâle Fischer 344 rats ont été utilisés dans la procédure. La figure 1 montre l’appareil chirurgical et les configurations d’isolement requises dans la procédure; chaque partie a été marquée et décrite dans la légende de la figure. Collagène de type 2 a été utilisé pour la digestion, ce qui donne une grande quantité de CMs de haute qualité de l’isolement réussi (Figure 2A). Vingt-quatre heures après l’isolement, ces cellules ont été transfectées avec le cycle cellulaire induisant des siARN spécifiques contre Rb1 et Meis2, tandis que, cel-miR-67 a été utilisé comme contrôle de transfection dans l’expérience11. Les MC ont été maintenus en culture pendant sept jours (figure 2B)ou jusqu’à vingt jours (figure 2C)pour observer les changements morphologiques. Pour marquer pour l’activité du cycle cellulaire, les CM ont été fixés le jour 7 et tachés pour le marqueur cardiaque Spécifique Troponin-I, marqueur mitotique KI67, et le noyau a été visualisé par DAPI (Figure 2D-F). Une augmentation significative des cardiomyocytes positifs ki67 a été observée avec le traitement siRb1+siMeis2 par rapport au contrôle11. En outre, les cardiomyocytes de rat battaient (fonction contractile) dans la culture le jour sept post-placage, qui est une caractéristique caractéristique de cardiomyocytes sains11.
Pour l’isolement de CM chez les souris, un total de 3 mâles et 3 femelles adultes (12 semaines) C57BL/6 souris ont été utilisés dans la procédure. Semblable à l’étude de rat, le type 2 de collagènease a été employé pour digérer le collagène et la matrice extracellulaire du coeur adulte de souris. Souris adultes CM est relativement fragile pour l’isolement et la culture in vitro; ainsi, ce protocole utilise la blebbistatine pour améliorer la viabilité de la souris adulte CM. Rendements d’isolement réussis >70-80% de forme de tige saine CM, qui peuvent être cultivés pour un jour allant jusqu’à 20 jours (Figure 3A-C) et de maintenir leur tuponine cardiaque-I tache et contractilité (Figure 3C). Dans des expériences distinctes, quatre heures après l’isolement, les CM de souris ont été transfectés avec un cycle cellulaire induisant le cocktail siRNA comme décrit pour le rat CM. Brièvement, les souris CM ont été simultanément transfectées avec les siARN spécifiques contre Rb1 et Meis2, et le contrôle (cel-miR-67). Les CM post-transfection ont fait l’objet d’une imagerie temporelle pendant 10 jours montrant les changements morphologiques (figure 4) qui sont suivis d’un test de prolifération (figure 5). Le jour 10, la coloration immuno-fluorescente pour Troponin-I, KI67, et DAPI a été exécutée comme précédemment décrit. Une augmentation significative des cardiomyocytes positifs KI67 a été observée avec le traitement siRb1+siMeis2 par rapport au contrôle (Figure 5A-C).
Le présent protocole démontre que les rats adultes et les souris CMs peuvent être cultivés à long terme in vitro pendant jusqu’à 20 jours et potentiellement plus. Après 20 jours, les CM maintiennent leur coloration troponine-I ainsi que leur contractilité si les inhibiteurs sont retirés des médias.
| Composition tampon de Myocyte, pH 7.4 (Préparer et peut être stocké à 4 °C ) | |||
| Réactif | Concentration, mM | Wt moléculaire. | Pour 1 litre |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| Kcl | 4.7 | 74.5513 | 350,3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81,6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| Tampon de perfusion, pH 7.4 (Préparer frais pour chaque isolement) | |||
| Concentration, mM | Wt moléculaire. | Montant requis | |
| Tampon myocyte | 250 mL | ||
| Hepes | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| Monoximine 2,3-butanedione | 10 | 101.105 | 252.775 mg |
| NahCO3 Frais | 1.6 | 84.007 | 33,6028 mg |
| Taurine Fresh | 30 | 125.15 | 938,625 mg |
| Glucose frais | 20 | 180.156 | 900,775 mg |
| Solution enzymatique | |||
| Stock Conc. | Conc de travail. | Obligatoire | |
| Tampon myocyte | 50 mL | 50 mL | |
| Collagène de type 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mg |
| Protéase XIV | >3,5 U/mg | 0.104 U/mL | 1,48 mg |
| DNase I grade 2 | 0,015 mg/mL | ||
| Arrêter la mémoire tampon A | |||
| Stock Conc. | Conc de travail. | Obligatoire | |
| Tampon myocyte | 30 mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Arrêter la mémoire tampon B | |||
| Stock Conc. | Conc de travail. | Obligatoire | |
| Tampon myocyte | 30 mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tableau 1 : Solutions requises pour l’isolement cardiomyocyte de souris adulte.
| 10x KHB Stock Solution (Volume total = 1L) |
Réactif | Molarity (mM) | Montant (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| Kcl | 48 | 3,5 g | |
| Hepes | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| Ajuster le pH à 7,4 avec 4 M NaOH (~20 mL), conserver à 4 °C | |||
| Solution KHB, 500 mL | Réactif | Montant | |
| 10x KHB | 50 mL | ||
| Glucose | 0,99 g | ||
| Taurine | 0,31 g | ||
| Ajouter H2O pour porter le volume à 500 mL, et le pH doit être ~7.35 | |||
| Solution A | Réactif | Montant | |
| Solution KHB | 500 mL (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Oxygéner avec 100% O2 et chaud à 37 °C | |||
| Solution B, 50 mL | Réactif | Montant | |
| Solution A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Solution E, 50mL | Réactif | Montant | |
| Solution A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Collagène de type II (263 unités/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Type I-S) | 10 mg | ||
| 0,1 M CaCl2 stock | 12,5 μL | ||
| Bien mélanger | |||
| Action CaCl2, 0,1 M | Réactif | Montant | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 mL | ||
| Conserver à 4 °C | |||
Tableau 2 : Solutions requises pour l’isolement des cardiomyocytes chez les rats adultes.
| Composition des médias de placage, pH 7.4 | |||
| Concentration de travail | Wt moléculaire. | Montant requis | |
| Médias culturels sans Blebbistatin | 50 mL | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| Fbs | 5% | 2,5 g | |
| Composition des médias culturels, pH 7,4 | |||
| Réactif | Concentration de travail | Wt moléculaire. | Montant requis |
| Dmem | 1X | 250 mL | |
| Insuline | 1 μg/mL | 0,25 mg | |
| Transferrine | 0,55 μg/mL | 0,138 mg | |
| Sélénium | 0,5 ng/mL | 0,125 μg | |
| Pénicilline (U/mL)-streptomycine (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL | |
| Hepes | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595,753 mg |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1,8271 mg |
| *Utilisez l’un ou l’autre d’entre eux, selon l’exigence expérimentale. # Aliquot les médias de la culture pour préparer le placage des médias avant d’ajouter Blebbistatin. NOTE: Préparer 200 mL de médias culturels. REMARQUE : Préparez 50 mL de support de placage. |
|||
Tableau 3 : Composition des médias pour le platage et la culture de cardiomyocytes de souris adultes.
| Composition des médias culturels, pH 7,4 | ||
| Réactif | Concentration de travail | Montant requis |
| Dmem | 1x | 250 mL |
| Pénicilline (U/mL)-streptomycine (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL |
| *FBS | 10% | 25 mL |
Tableau 4 : Composition des médias pour le revêtement et la culture du cardiomyocyte de rat adulte.
Figure 1 : Configuration de la procédure et équipement. (I) Représentation schématique de la perfusion. (II) Instruments chirurgicaux et aiguille de cannulation. (III) Assemblage de perfusion cardiaque: A) Veste chauffante. B) Récipient double de veste d’eau de mur. C) Entrée d’eau chauffée en circulation. D) Sortie d’eau chauffée en circulation. E) Solution de perfusion cardiaque. F) Pompe circulante G) Tube de solution de perfusion. H) Tube d’alimentation en oxygène. I) Bain d’eau circulant. J) Aiguille de cannulation avec coeur, attachée au port de sortie de perfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Isolement cm de rat adulte, transfection, et culture à long terme. A) Rat adulte CM, immédiatement après l’isolement. B) Rat adulte CM le jour 7 après l’isolement. C) Rat adulte CM le jour 20. D-F) KI67 rat positif CM le jour 7 après la transfection siRb1+siMeis2. Troponin-I = vert; DAPI = bleu; KI67 = rouge. Toutes les expériences ont été réalisées en double et répétées au moins trois fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Isolement cm de souris adulte et culture à long terme. A) Souris adultes CM, immédiatement après l’isolement. B) Souris adultes CM le jour 7 après l’isolement. C) Souris adultes CM tachées de troponine cardiaque-I = vert le jour 20. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Déch différenciation cm de souris adulte. Souris adultes CM montrant des changements morphologiques au cours de la culture à long terme (jour 0 au jour 10) dans les médias DMEM-HG, complété par 10%FBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Transfection et prolifération cm de souris adultes. A-C) KI67 souris positive CM le jour 10 après la transfection siRb1+siMeis2. Troponin-I = vert; DAPI = bleu; KI67 = rouge. D) Le graphique à barres montre une augmentation significative des CMs positifs de souris adultes de KI67 dans le groupe transfecté de siRNA-cocktail par rapport au contrôle. Les résultats sont présentés comme moyens±SEM; * = p-valeur ≤0,05. p-value ≤0,05 a été considéré statistiquement significatif. Toutes les expériences ont été réalisées en triple (n=3 mâle,3 femelle). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il est essentiel d’établir un protocole pour l’isolement cardiomyocyte adulte et la culture à long terme pour effectuer des études mécanistes spécifiques aux cellules. Il n’y a que quelques rapports discutant des protocoles adultes d’isolement cm, et encore moins d’entre eux sont utilisés pour la culture à long terme des souris adultes CM15,16,17. Il est démontré que le rat adulte CM a une plus grande tolérance à la culture in vitro que les souris adultes CM10,11,12. Dans ce rapport, nous établissons un protocole pour l’isolement des rats adultes et des souris CM, la transfection siRNA, la culture à long terme, et l’analyse en aval de la prolifération induite, avec des modifications minimales dans les protocoles régulièrement utilisés.
Les protocoles disponibles pour l’isolement adulte de CM sont basés sur l’utilisation de deux enzymes bien connues, la collagènease et la liberase, pour la digestion extracellulaire de matrice (ECM)18,19. La collagène est une enzyme couramment utilisée dans les protocoles adultes d’isolement CM. La collagène est en mesure de digérer les fibres de collagène de l’ECM, ce qui entraîne la dissociation du tissu cardiaque dans le CM unicellulaire. De même, liberase digère l’ECM. Liberase est l’alternative purifiée pour la collagène, qui montre une activité plus élevée et nécessite donc une plus grande précision pendant l’isolement CM pour atteindre l’isolement réussi par rapport à la collagènease. En outre, dans la procédure, nous avons remarqué que le CM isolé avec liberase ne survit pas dans la culture à long terme. Cependant, CM isolé avec la collagène améliore la longévité de CM dans les conditions de culture.
En outre, nous avons utilisé un inhibiteur spécifique de la myosine II appelé blebbistatin dans les médias de culture pour la culture à long terme de la souris adulte CM20,21. Auparavant, la monoximine de 2,3 butanedione (BDM) a été utilisée pour la culture CM adulte. BDM est un inhibiteur de l’ATPase qui inhibe la fonction contractile grâce à un mécanisme mal défini qui comprend l’inhibition de l’ATPase et altérée Ca++ transition22. Par rapport au BDM, la blebbistatine est un inhibiteur spécifique de la myosine II et montre une inhibition plus significative de la fonction contractile à des concentrations inférieures à celles du BDM. Un pré-placage de la souris adulte CM dans un support de culture, complété par 10 mM de BDM et les cultures suivantes de la CM dans le 25 μM blebbistatin-complété et faible milieu sérique améliore la survie et la structure de forme de tige de CM dans la culture à long terme. Cependant, un placage direct de la souris adulte CM dans les médias, complété par 25 μM blebbistatine et 10% FBS est mieux pour les études prolifératives. Semblable au rat adulte CM, qui montre une grande ampleur de dé-différenciation dans la culture in vitro, nous avons également observé la dé-différenciation dans la souris adulte CM dans une certaine mesure (Figure 5). Les changements morphologiques sont l’étape nécessaire à la prolifération. Ainsi, fournir un environnement aux cm adultes qui facilite leur dé-différenciation est un facteur critique à considérer dans de telles études. Même si, à l’heure actuelle, il n’est pas clair lesquels des étapes exactes ou des composants utilisés dans ce protocole est responsable de l’amélioration de la longévité des CM adultes, nous croyons qu’il s’agit d’un effet combiné des réactifs utilisés, les modifications apportées dans la procédure d’isolement, et peut-être le plus important des mains formées.
Semblable aux rapports précédents montrant la transduction virale du CM adulte dans les médias blebbistatin-complétés, nous avons également observé une transfection efficace de ces cellules avec des siARN. Nous avons utilisé des siARN spécifiques contre deux gènes associés à la sénescence, Rb1 et Meis2, pour induire la prolifération cm. Pour le rat CM, nous avons effectué l’analyse KI67 pour évaluer la prolifération le septième jour après la transfection; cependant, la prolifération dans la souris adulte CM a été analysée le jour dix après la transfection. Une variabilité biologique spécifique à une espèce pourrait être une raison possible du décalage horaire observé dans la rentrée du cycle cellulaire induit du rat adulte et de la souris CM.
Dans l’ensemble, le protocole décrit ici fournit une procédure améliorée, fiable et comparative pour isoler le rat adulte et la souris CM, et par conséquent les culture selon les besoins expérimentaux. En outre, ce protocole permet une culture à long terme de la CM adulte, qui fournissent un système in vitro pour effectuer diverses analyses à long terme telles que la prolifération, facteur paracrine, réponse au stress, etc.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par le financement du Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de Cincinnati, College of Medicine, au Dr Onur Kanisicak; une subvention des National Institutes of Health (R01HL148598) au Dr Onur Kanisicak. Le Dr Onur Kanisicak est soutenu par l’American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Le Dr Perwez Alam est soutenu par la subvention postdoctorale de l’American Heart Association (AHA_20POST35200267). Le Dr Malina J. Ivey est soutenu par une subvention T32 des NIH (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
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