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Biology

अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61073
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

Summary

यहां, हम वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव, ट्रांसफैक्शन और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

वयस्क स्तनधारी कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की पूर्व वीवो संस्कृति कार्डियक जीव विज्ञान के इन विट्रो अध्ययन के लिए सबसे प्रासंगिक प्रायोगिक प्रणाली प्रस्तुत करता है। वयस्क स्तनधारी सीएम न्यूनतम प्रसार क्षमता के साथ मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं। वयस्क सीएम के बाद मिटोटिक राज्य न केवल कार्डियोमायोसाइट सेल चक्र प्रगति को प्रतिबंधित करता है बल्कि सीएम की कुशल संस्कृति को भी सीमित करता है। इसके अलावा, वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति कई अध्ययनों के लिए आवश्यक है, जैसे सीएम प्रसार और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण।

माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले दो सबसे पसंदीदा प्रयोगशाला जानवर हैं। जबकि चूहे के केंद्रीयमों की दीर्घकालिक संस्कृति संभव है, वयस्क माउस सीएम मौत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और सामान्य परिस्थितियों में पांच दिनों से अधिक सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। इसलिए, वयस्क मुरीन सीएम के लिए सेल अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ, 20 से अधिक दिनों के लिए वयस्क माउस और चूहा सीएम दोनों को सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति करना संभव है। इसके अलावा, पिछली रिपोर्टों की तुलना में अलग-थलग पड़े सीएम की सिरना ट्रांसफैक्शन दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। वयस्क माउस सीएम अलगाव के लिए, लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन विधि का उपयोग इष्टतम एंजाइम समाधान और पूर्ण बाह्य मैट्रिक्स वियोजन के लिए पर्याप्त समय के साथ किया जाता है। शुद्ध वेंट्रिकुलर सीएम प्राप्त करने के लिए, दोनों अटरिया को असंबद्धता और चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने से पहले विच्छेदित और त्याग दिया गया था। कोशिकाओं को एक लेमिनिन लेपित प्लेट पर फैलाया गया था, जो कुशल और तेजी से लगाव के लिए अनुमति दी गई थी। सीरना ट्रांसफैक्शन से पहले सीएम को 4-6 घंटे के लिए बसने की अनुमति दी गई थी । संस्कृति मीडिया को 20 दिनों के लिए हर 24 घंटे में ताज़ा किया गया था, और बाद में, सीएम को कार्डियक-विशिष्ट मार्कर जैसे ट्रोपोनिन और सेल चक्र के मार्कर जैसे KI67 के लिए तय और दाग दिया गया था।

Introduction

हृदय रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक हैं। लगभग सभी प्रकार के हृदय की चोट के परिणामस्वरूप वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है। वयस्क स्तनधारी हृदय वयस्क मुख्यमंत्री1की कामुक प्रकृति के कारण अपनी हृदय की चोट की मरम्मत करने में असमर्थ हैं । इस प्रकार, वयस्क स्तनधारी दिल के किसी भी अपमान के परिणामस्वरूप सीएम की स्थायी हानि होती है, जिससे हृदय कार्य और हृदय की विफलता कम हो जाता है। वयस्क स्तनधारियों के विपरीत, जेब्राफिश और न्यूट हार्ट्स जैसे छोटे जानवर मौजूदा सीएम प्रसार2,,3,4 के माध्यम से अपनी हृदय की चोट को पुनर्जीवित करसकते4हैं। एक विश्वव्यापी प्रयास दोनों प्रसारीय और गैर-प्रसारीय दृष्टिकोणों के माध्यम से हृदय की चोट के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय हस्तक्षेप खोजने के लिए चल रहा है। पिछले दशकों में, हृदय की चोट और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, वीवो पशु मॉडल में उपयोग करने के लिए अतिरिक्त जटिलता के साथ एक महंगा दृष्टिकोण के लिए माध्यमिक प्रभाव से एक सेल स्वायत्त तंत्र समझने के लिए जारी है । इसके अलावा, वीवो सिस्टम में सीएम से कार्डियोप्रोटेक्टिव सिग्नलिंग को प्रेरित करने वाले औषधीय हस्तक्षेप के सीएम विशिष्ट प्रभावों का विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है।

इसके अलावा, सीएम प्रसार विश्लेषण करने के लिए वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति आवश्यक है। सीएम प्रसार परख कोशिकाओं को कोशिका चक्र में प्रेरित करने और उसके बाद सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन, दवा स्क्रीनिंग, विषाक्तता अध्ययन और सीए++ होमोस्टेसिस अध्ययन के लिए अलग-थलग पड़े सीएम का उपयोग करने वाले अध्ययनों को,बेहतर संस्कृति प्रणाली5,,6,7की आवश्यकता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीएमएस (कार्डियोकिन्स)8,,9से स्रावित साइटोकिन्स का कार्डियोप्रोटेक्टिव महत्व है। दिल की मरम्मत और उत्थान के दौरान इन कार्डियोकिन्स की चिकित्सीय भूमिका और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, एक लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है।

वयस्क चूहा सीएम एक इन विट्रो सिस्टम10, 11, 12में एकल कोशिका अलगाव औरदीर्घकालिक,12संस्कृति के लिए काफी मजबूत हैं।, हालांकि, वयस्क माउस सीएम इन विट्रो परख के लिए बहुत रुचि रखते हैं, विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता के कारण, जो चूहे सीएम13के साथ विभिन्न अभिनव विश्लेषणों के डिजाइन और निष्पादन की अनुमति देता है। वयस्क चूहा मुख्यमंत्री अलगाव के विपरीत, वयस्क माउस दिलों से एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करना काफी चुनौतीपूर्ण है, और संस्कृति में वयस्क माउस सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति और भी चुनौतीपूर्ण है।

लंगेंडोर्फ प्रणाली का उपयोग करके माउस और चूहे के दिलों से वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव पहले 5,14 ,15सीएम समारोह का अध्ययन करने के लिए,स्थापितकिया गया है ।14 यहां, हमने चूहों और चूहों दोनों से वयस्क सीएम अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के साथ-साथ एक संशोधित दीर्घकालिक संस्कृति, ट्रांसफैक्शन और अलग-थलग कोशिकाओं के सीएम प्रसार के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया है।

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Protocol

सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) द्वारा प्रकाशित । वीडियो में प्रदर्शित सभी प्रोटोकॉल सिनसिनाटी विश्वविद्यालय, चिकित्सा के विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. वयस्क चूहों (और चूहों) से दिल निकालने से पहले तैयारी

  1. क्रमशः चूहे और माउस अलगाव के लिए टेबल 1 और टेबल 2में दिए गए व्यंजनों के अनुसार, संबंधित परफ्यूजन, एंजाइम और स्टॉप सॉल्यूशंस तैयार करें। किसी भी संदूषण या अविवेकी कणों को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
  2. 15 मिनट के लिए 70% शराब में भिगोकर सर्जिकल उपकरणों को साफ और स्टरलाइज करें, और बाद में डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं। एक साफ कागज तौलिया पर सूखी हवा के लिए उपकरण छोड़ दें।
  3. पानी के स्नान को 37 डिग्री तक प्री-हीट करें। प्रक्रिया के दौरान परफ्यूजन उपकरण के माध्यम से गर्म पानी का निर्बाध परिसंचरण सुनिश्चित करने के लिए जल स्नान में जल स्तर की जांच करें।
  4. 5 मिनट के लिए 70% शराब के साथ चलाकर परफ्यूजन उपकरण को साफ करें।
    नोट: प्रवाह दर बढ़ाएं, जो ट्यूबिंग को साफ करने में मदद करता है।
  5. शराब प्रवाह के बाद, 10 मिनट के लिए डबल आसुत पानी चलाकर शराब के अवशेषों को साफ करें।
  6. एक्सिशन के बाद दिल को साफ करने के लिए 3 मीडियम साइज डिस्पोजेबल पॉलीस्टीरिन तौला व्यंजन सेट करें। मायोसाइट बफर के 20 एमएल के साथ व्यंजन भरें।
  7. पाश्चर पिपेट की मदद से प्रत्येक डिश में हेपरिन की 2-3 बूंदें डालें और कई बार पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  8. कुंद सुई कैनुला के साथ 10 एमएल की सिरिंज लें।
    नोट: एक कुंद सुई cannula एक साफ, बाँझ सुई की नोक काटने से तैयार किया जा सकता है । माउस और चूहे के लिए कैनुला बनाने के लिए क्रमशः एक 21 जी सुई और 14 जी सुई का उपयोग किया गया था।
  9. सिरिंज को परफ्यूजन बफर(टेबल 1)से भरें। सिरिंज से किसी भी हवा के बुलबुले निकालें और इसे कोणीय स्थिति में तीसरे पकवान में रखें। इसे टेप से सुरक्षित करें।
    नोट: चूहों के लिए, समाधान ए(टेबल 2)का उपयोग मायोसिटे परफ्यूजन बफर के बजाय किया गया था।
  10. एक शल्य सीवन के साथ एक ढीला गाँठ तैयार करें और इसे सुई के चारों ओर रखें।
  11. एनेस्थीसिया इंजेक्शन से 20 मिनट पहले इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा हेपरिन (100 यूएसपी यूनिट/माउस) के साथ माउस इंजेक्ट करें।
  12. परफ्यूजन उपकरण के माध्यम से मायोसिटे परफ्यूजन बफर(टेबल 1)को प्रसारित करें। प्रवाह दर को घटाकर 3 एमएल/मिनट करें।
    नोट: चूहों के लिए, समाधान ए(टेबल 2)का उपयोग मायोसिटे परफ्यूजन बफर के बजाय किया गया था।
  13. 5 मिनट के बाद, एंजाइम समाधान(तालिका 1)के साथ पर्फ्यूजन बफर को बदलें। प्रक्रिया के दौरान ऑक्सीजन के साथ एंजाइम समाधान संतृप्त करें। 3 एमएल/मिनट के फ्लो रेट का इस्तेमाल करें ।
    नोट: चूहा मुख्यमंत्री अलगाव के लिए, समाधान ई(तालिका 2)के बजाय उपयोग करें ।
  14. एनेस्थीसिया के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें। टर्मिनल सर्जरी के लिए आईएसीयूसी द्वारा अनुशंसित संज्ञाहरण की उचित खुराक का उपयोग करें।
  15. एक टोब चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें। इसके बाद माउस को सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर डाल दें।

2. वयस्क चूहों (और चूहों) से दिल की निकासी

  1. 70% अल्कोहल के साथ पोंछते हुए त्वचा को स्टरलाइज करें।
  2. सावधानी से छाती खोलें।
  3. दिल को आबकारी करें। एक्सिशन के दौरान गैर-दिल के ऊतकों से बचें।
  4. पहली डिश पर दिल रखो, पर्फ्यूजन बफर(तालिका 1)से भरा ।
    नोट: चूहे के लिए समाधान ए का उपयोग करें(टेबल 2)।
  5. धीरे-धीरे निचोड़कर दिल से खून साफ करें।
  6. दिल को दूसरी डिश में ट्रांसफर करें।
  7. दिल से खून को साफ करें और गैर हृदय ऊतकों को हटा दें। इसके बाद दिल को तीसरी डिश में ट्रांसफर कर दें।
  8. फेफड़ों और आसपास के ऊतकों को ट्रिम करें और आरोही महाधमनी के माध्यम से कैनुलेट करें। इस प्रक्रिया को सीएम की गुणवत्ता और मात्रा में सुधार करने के लिए यथासंभव तेजी से (<5 मिनट) किया जाना चाहिए।

3. दिल का पाचन

  1. माउस दिल का पाचन
    नोट: सभी समाधान/बफ़र्स जो माउस दिल के माध्यम से प्रसारित प्रक्रिया के दौरान ऑक्सीजनयुक्त किया जाना चाहिए ।
    1. सावधानी से सिरिंज से कैन्यूलेटिंग सुई को हटा दें और इसे लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन उपकरण से कनेक्ट करें।
    2. दिल में जाने वाले किसी भी हवा के बुलबुले से बचें, जो एंजाइम समाधान और पाचन के प्रवाह के माध्यम से प्रभावित हो सकता है।
    3. दिल को समरूप वातावरण प्रदान करने के लिए पानी की जैकेट को ऊपर ले जाएं। एंजाइम समाधान को 2-3 एमएल/मिनट की गति से हृदय के माध्यम से प्रवाहित होने दें ।
      नोट: पासिंग समाधान की गति महत्वपूर्ण है और मुख्यमंत्री की मात्रा और गुणवत्ता के परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।
    4. एंजाइम समाधान को 2 मिनट के लिए दिल के माध्यम से प्रवाहित होने दें।
    5. 2 मिनट पर, एंजाइम समाधान और मिश्रण करने के लिए 100 माइक्रोन सीएसीएल2 समाधान के 40 माइक्रोन जोड़ें। एंजाइम समाधान को एक और 10-15 मिनट के लिए दिल से गुजरने दें।
      नोट: एक बार प्रवाह चिकनी हो जाता है, दिल भूरा और नरम हो जाता है, कोलेजनेज़ एंजाइम के भी वितरण और दिल के उचित पाचन का संकेत है ।
  2. चूहे के दिल का पाचन
    नोट: सभी समाधान/बफ़र्स जो चूहे के दिल के माध्यम से प्रसारित प्रक्रिया के दौरान ऑक्सीजनित किया जाना चाहिए ।
    1. सावधानी से सिरिंज से कैन्यूलेटिंग सुई को हटा दें और इसे लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन उपकरण से कनेक्ट करें।
    2. दिल में जाने वाले किसी भी हवा के बुलबुले से बचें, जो एंजाइम समाधान और पाचन के प्रवाह के माध्यम से प्रभावित हो सकता है।
    3. दिल को समरूप वातावरण प्रदान करने के लिए पानी की जैकेट को ऊपर ले जाएं।
    4. दिल से किसी भी रक्त को हटाने के लिए 3-5 मिनट के लिए 2-3 मिलील/मिनट की गति से समाधान ए का प्रवाह शुरू करें।
      नोट: गुजर समाधान की गति महत्वपूर्ण है और मुख्यमंत्री की गुणवत्ता के परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है ।
    5. एक बार जब दिल से रक्त साफ हो जाता है, तो समाधान ए से समाधान ई(टेबल 2) मेंस्विच करें। सीएसीएल2 के साथ टिट्रेट समाधान ई जैसा कि समाधान में 0.1 m m की अंतिम एकाग्रता के लिए नीचे दर्शाया गया है:
      1. 10 मिनट के परफ्यूजन के बाद, 0.1 एम सीएसीएल 2 के12.5माइक्रोन जोड़ें।
      2. 15 मिनट के परफ्यूजन के बाद, 0.1 एम सीएसीएल 2 के25माइक्रोन जोड़ें।
    6. एंजाइम समाधान को एक और 30-40 मिनट के लिए दिल से गुजरने दें, जब तक कि प्रवाह तेजी से न हो जाए और हृदय लचीला न हो जाए।

4. सीएम सिंगल सेल निलंबन की तैयारी

  1. सीएम सिंगल सेल सस्पेंशन (माउस) की तैयारी
    1. लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन सिस्टम से दिल निकालें। इसे एंजाइम समाधान के 5 एमएल से भरे 60 मिमी पेट्री डिश में ले जाएं और डिश को बायोसेफ्टी हुड में स्थानांतरित करें।
      नोट: लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन सिस्टम से दिल को हटाने से पहले पर्याप्त हृदय पाचन सुनिश्चित करें। पाचन समय एंजाइम गतिविधि, समाधान के प्रवाह और दिल के आकार पर निर्भर करता है।
    2. बंध्यता सुनिश्चित करने और संदूषण से बचने के लिए जैव सहायक हुड में किसी भी और यांत्रिक विच्छेदन का प्रदर्शन करें।
    3. अटरिया (बेसल हार्ट वाले हिस्से का1/4वां) और अतिरिक्त वसा वाले ऊतकों को सावधानी से हटा दें।
    4. ठीक टुकड़ों में संदंश के साथ दिल कीमा।
    5. एक बाँझ पाश्चर पिपेट लें और 45º कोण पर इसकी नोक काट लें।
    6. कोमल पिपटिंग द्वारा एकल कोशिका निलंबन में दिल के ऊतकों को वितरित करने के लिए इस पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इष्टतम पाचन एकल कोशिका कार्डियोमायोसाइट्स का निलंबन प्रदान करता है।
      नोट: यांत्रिक भेदने के कारण सीएम क्षति को कम करने के लिए स्थानांतरण पिपेट के संकीर्ण, नीचे के हिस्से को हटा दें।
    7. फिर, एंजाइम गतिविधि को रोकने के लिए स्टॉप सॉल्यूशन के 5 एमएल जोड़ें, जो अधिक अपच की संभावना से बचा जाता है।
    8. एक ताजा 50 एमएल शंकु लें और उस पर एक बाँझ 100 माइक्रोन सेल छन्नी रखें।
    9. ऊतक का हिस्सा हटाने के लिए सेल छलनी के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट निलंबन पास करें। छलनी से जुड़े रहने वाले किसी भी कार्डियोमायोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए पेट्री डिश और छन्नी को स्टॉप सॉल्यूशन(टेबल 1)के एक और 5 एमएल के साथ धोएं।
  2. सीएम सिंगल सेल सस्पेंशन (चूहा) की तैयारी
    1. लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन सिस्टम से दिल निकालें। दिल को 5 एमएल के घोल ए से भरे 100 एमएम पेट्री डिश में ले जाएं और डिश को बायोसेफ्टी हुड में ले जाएं।
      नोट: लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन सिस्टम से दिल को हटाने से पहले पर्याप्त हृदय पाचन सुनिश्चित करें। पाचन समय एंजाइम गतिविधि, समाधान के प्रवाह और दिल के आकार पर निर्भर करता है।
    2. बंध्यता सुनिश्चित करने और संदूषण से बचने के लिए जैव सहायक हुड में किसी भी और यांत्रिक विच्छेदन का प्रदर्शन करें।
    3. अटरिया (बेसल हार्ट वाले हिस्से का 1/4वां) और एक्स्ट्रा फैट टिश्यू को सावधानी से हटा दें।
    4. ठीक टुकड़ों में संदंश के साथ दिल कीमा।
    5. एक बाँझ पाश्चर पिपेट लें और 45º कोण पर इसकी नोक काट लें।
    6. कोमल पिपटिंग द्वारा एकल कोशिका निलंबन में दिल के ऊतकों को वितरित करने के लिए इस पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इष्टतम पाचन एकल कोशिका कार्डियोमायोसाइट्स का निलंबन प्रदान करता है।
      नोट: यांत्रिक भेदने के कारण सीएम क्षति को कम करने के लिए स्थानांतरण पिपेट के संकीर्ण, नीचे के हिस्से को हटा दें।
    7. सीएम सस्पेंशन में सॉल्यूशन बी(टेबल 2)के 5 एमएल जोड़ें और फैट या अन्य नॉन-डाइजेस्ट टिश्यू के किसी भी बचे हुए टुकड़े को हटाने के लिए 100 माइक्रोन सेल छन्नी के जरिए समाधान पास करें।
    8. एक ताजा 50 एमएल शंकु शीशी में फिल्ट्रेट ले लीजिए।
    9. पेट्री डिश और सेल छन्नी के माध्यम से किसी भी शेष सीएम को धोने के लिए समाधान बी के एक और 5 एमएल का उपयोग करें।

5. गैर-सीएम को हटाना

  1. वयस्क एकल सेल निलंबन (माउस) से गैर-सीएम को हटाना
    1. 3 मिनट के लिए 20 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    2. सुपरनैंट को त्यागें और कोशिकाओं को स्टॉप सॉल्यूशन(टेबल1) के 10 एमएल में फिर से खर्च करें।
      नोट: स्टॉप सॉल्यूशन में बीएसए की एकाग्रता बढ़ाने से इसकी चिपचिपाहट बढ़ेगी और गैर-सीएम की तलछट दर में कमी आएगी ।
    3. ट्यूब के कोमल उलटा द्वारा 3-5 बार सीएम को फिर से खर्च करें।
    4. 3 मिनट के अंतराल पर, 100 माइक्रोन सीएसीएल2 समाधान के 10 माइक्रोल जोड़ें और मिश्रण करें। तीन बार दोहराएं।
    5. चौथे अतिरिक्त के बाद, 3 मिनट के लिए 20 x ग्राम पर कार्डियोमायोसाइट निलंबन अपकेंद्रित्र।
    6. सुपरनेट को त्याग दें।
    7. पूर्व गरम (३७ ºC), वयस्क माउस सीएम चढ़ाना मीडिया(तालिका 3)में रिम्स रीसुस्पेंड सीएम ।
  2. वयस्क एकल कोशिका निलंबन (चूहा) से गैर-सीएम को हटाना
    1. 25 ºC पर 3 मिनट के लिए 20 x ग्राम पर गोली कोशिकाएं।
    2. सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को समाधान बी(तालिका2) के 25 एमएल में फिर से खर्च करें।
    3. कोमल उलटा द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं और इसे एक ट्यूब स्टैंड में रखें ताकि सीएम को गुरुत्वाकर्षण के तहत बसने की अनुमति दी जा सके।
    4. सुपरनेट को सावधानी से त्यागें।
    5. कोशिकाओं को समाधान बी के ताजा 25 एमएल में फिर से उठाया जाता है और इसे 1.0 mM CaCl2 तक 50 माइक्रोल, 75 माइक्रोल और 0.1 एम सीएसीएल2 के 3-5 मिनट के अंतराल पर 100 माइक्रोन के अतिरिक्त करें।
      नोट: समाधान बी में बीएसए की एक उच्च एकाग्रता इस कदम पर इस्तेमाल किया जा सकता है । समाधान बी में बीएसए की एकाग्रता बढ़ाने से चिपचिपाहट बढ़ती है और इस प्रकार, गैर-सीएम की तलछट दर कम हो जाती है।
    6. 25 ºC पर 3 मिनट के लिए 20 x ग्राम पर गोली कोशिकाएं, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और वयस्क चूहा सेल कल्चर मीडिया(तालिका 4)की वांछित मात्रा जोड़ें।
    7. एक लेमिनिन लेपित प्लेट पर बीज सीएम।
      नोट: गैर-लेपित संस्कृति प्लेट पर सीएम की प्री-प्लेटिंग का उपयोग गैर-सीएम कोशिकाओं के प्रदूषण को कम करने के लिए किया जा सकता है।

6. वयस्क मुख्यमंत्री चढ़ाना

  1. प्री-प्लेटिंग
    1. कार्डियोमायोसाइट्स को कल्चर मीडिया में रीसपेंड करें।
    2. कोशिकाओं को माउस या चूहे के सीएम के लिए क्रमशः 60 मिमी या 100 मिमी डिश में प्री-प्लेट करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ पूरक एक इनक्यूबेटर में2 घंटे के लिए सीटेट सीएमएस।
    4. प्री-प्लेट इनक्यूबेशन के दौरान, लॉन्ग टर्म सीएम कल्चर के लिए लेमिनिन (पीबीएस में 10 μg/ml) के साथ सेल कल्चर प्लेट्स को कोट करें ।
  2. प्री-प्लेटिंग के 2 घंटे के बाद, 50 एमएल शंकु शीशी में सीएम एकत्र करें।
  3. पकवान से कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें ट्रांसफेक्शन प्रयोगों के लिए लेपित 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में फिर से प्लेट करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं को सीओ 2 के साथ 5% के साथ पूरक कियागया। सतह के साथ कार्डियोमायोसाइट्स का पालन करने के लिए 4-6 घंटे पर्याप्त है, और इस प्रकार, ट्रांसफैक्शन 6 घंटे पोस्ट-प्लेटिंग किया जा सकता है।
    नोट: एफबीएस युक्त चढ़ाना माध्यम आमतौर पर प्रयोग किया जाता है और प्रसार अध्ययन के साथ बेहतर अनुकूलता दिखाता है । हालांकि, एक सीरम मुक्त माध्यम प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जहां गुप्त कारकों का विश्लेषण किया जा रहा है ।

7. ट्रांसफैक्शन

  1. 4-6 घंटे के लिए लेमिनिन के साथ लेपित सेल संस्कृति प्लेटों के लिए सीएम इनक्यूबेट।
  2. लैमिनिन कोटेड प्लेट पर सीएम सीडिंग के चार घंटे बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफेक्शन रीएजेंट (जैसे, लिपोफेक्टामाइन आरएनएआईमैक्स) का उपयोग करके एसआईआरएन (50 एनएम) ब्याज के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें।
  3. ट्रांसफैक्शन के बाद मीडिया 24 घंटे बदलें और उसके बाद हर 24 घंटे 20 दिनों तक।
  4. 20 दिनों के बाद, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पीबीएस में 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, जिसमें कार्डियक-विशिष्ट मार्कर जैसे ट्रोपोनिन के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री शामिल है ताकि लाइव कार्डियोमायोसाइट्स को सुनिश्चित किया जा सके।

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Representative Results

वर्तमान संशोधित प्रोटोकॉल कुशल अलगाव और चूहे और चूहों के केंद्रीय राज्यों में विट्रो की संस्कृति की अनुमति देता है। चूहे सीएम आइसोलेशन के लिए इस प्रक्रिया में कुल 3 वयस्क (12 सप्ताह पुराने) पुरुष फिशर 344 चूहों का इस्तेमाल किया गया। चित्रा 1 प्रक्रिया में आवश्यक शल्य तंत्र और अलगाव सेटअप दिखाता है; प्रत्येक भाग को चिह्नित किया गया है और चित्र किंवदंती में वर्णित है। कोलेजन प्रकार 2 का उपयोग पाचन के लिए किया जाता था, जो सफल अलगाव(चित्रा 2 ए)से उच्च गुणवत्ता वाले सीएम की उच्च मात्रा में पैदावार करता है। अलगाव के बाद चौबीस घंटे, इन कोशिकाओं को Rb1 और Meis2के खिलाफ विशिष्ट siRNAs उत्प्रेरण सेल चक्र से संक्रमित थे, जबकि, सेल-एमआईआर-67 का उपयोग प्रयोग11में ट्रांसफैक्शन नियंत्रण के रूप में किया गया था। रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए सीएमएस को या तो सात दिनों(चित्रा 2B)या बीस दिनों तक(चित्रा 2 सी)के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया था। सेल चक्र गतिविधि के लिए स्कोर करने के लिए, सीएम को 7 दिन तय किया गया था और कार्डियक-विशिष्ट मार्कर ट्रोपोनिन-1, माइटोटिक मार्कर KI67 के लिए दाग दिया गया था, और डीएपीआई(चित्रा 2डी-एफ)के माध्यम से नाभिक की कल्पना की गई थी। नियंत्रण11की तुलना में siRb1 + siMeis2 उपचार के साथ KI67 सकारात्मक कार्डियोमायोसाइट्स में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई। इसके अलावा, चूहा कार्डियोमायोसाइट्स संस्कृति में सात पोस्ट-प्लेटिंग पर संस्कृति में (संकुचन समारोह) को पीट रहे थे, जो स्वस्थ कार्डियोमायोसाइट्स11की एक बानगी विशेषता है।

चूहों में सीएम अलगाव के लिए इस प्रक्रिया में कुल 3 पुरुष और 3 महिला वयस्क (12 सप्ताह की उम्र) C57BL/6 चूहों का इस्तेमाल किया गया । चूहे के अध्ययन के समान, कोलेजन प्रकार 2 का उपयोग वयस्क चूहों के दिल के कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स को पचाने के लिए किया जाता था। वयस्क चूहों सीएम विट्रो में अलगाव और संस्कृति के लिए तुलनात्मक रूप से नाजुक है; इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस सीएम की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए ब्लेबिस्टिन का उपयोग करता है। सफल अलगाव पैदावार और 70-80% स्वस्थ रॉड आकार के सीएम, जिन्हें 20 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है(चित्रा 3ए-सी)और उनके कार्डियक ट्रोपोनिन-आई स्टेनिंग और संकुचन(चित्रा 3 सी)को बनाए रखा जा सकता है। अलग-अलग प्रयोगों में, चार घंटे अलगाव के बाद, माउस सीएम को चूहे के मुख्यमंत्री के लिए वर्णित सिरर्ना कॉकटेल को उत्प्रेरित करने वाले सेल चक्र से संक्रमित किया गया था। संक्षेप में, चूहों सीएम को एक साथ Rb1 और Meis2,और नियंत्रण (cel-miR-67) के खिलाफ विशिष्ट siRNAs से संक्रमित किया गया था। पोस्ट-ट्रांसफेक्शन सीएम 10 दिनों के लिए समय पाठ्यक्रम इमेजिंग के अधीन थे, जिसमें रूपात्मक परिवर्तन(चित्रा 4) दिखायागया था जिसके बाद प्रसार परख(चित्रा 5)होती है। 10 दिन, ट्रोपोनिन-I, KI67, और DAPI के लिए प्रतिरक्षा-फ्लोरोसेंट धुंधला पहले वर्णित के रूप में किया गया था । नियंत्रण(चित्रा 5ए-सी)की तुलना में siRb1 + siMeis2 उपचार के साथ KI67 सकारात्मक कार्डियोमायोसाइट्स में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई।

वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि वयस्क चूहों और चूहों सीएम को 20 दिनों तक और संभावित रूप से लंबे समय तक विट्रो में दीर्घकालिक रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है। 20 दिनों के बाद, सीएम अपने ट्रोपोनिन-I धुंधला के साथ-साथ संकुचन को बनाए रखते हैं यदि अवरोधकों को मीडिया से हटा दिया जाता है ।

मायोसाइट बफर संरचना, पीएच 7.4 (तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता, एमएमए आणविक wt। 1 लीटर के लिए
नैक 113 58.44 6.6037 ग्राम
केसीएल 4.7 74.5513 350.3911 मिलीग्राम
एमजीएसओ4 1.2 120.366 144.4392 मिलीग्राम
केएच2पीओ4 0.6 136.086 81.6516 मिलीग्राम
एनएएच2पीओ4 0.6 119.98 71.988 मिलीग्राम
परफ्यूजन बफर, पीएच 7.4 (प्रत्येक अलगाव के लिए ताजा तैयार करें)
एकाग्रता, एमएमए आणविक wt। आवश्यक राशि
मायोसाइट बफर 250 एमएल
हेपेस 10 238.3012 595.75 मिलीग्राम
2,3-ब्यूतानडिआन मोनोक्सीमाइन 10 101.105 252.775 मिलीग्राम
NaHCO3 ताजा 1.6 84.007 33.6028 मिलीग्राम
टॉरिन फ्रेश 30 125.15 938.625 मिलीग्राम
ग्लूकोज ताजा 20 180.156 900.775 मिलीग्राम
एंजाइम समाधान
स्टॉक कॉन। वर्किंग कॉन। आवश्यक
मायोसाइट बफर 50 एमएल 50 एमएल
कोलेजनेज प्रकार 2 330 यू/मिलीग्राम 620 यू/एमएल 93 मिलीग्राम
प्रोटीज XIV 3.5 यू/मिलीग्राम 0.104 यू/एमएल 1.48 मिलीग्राम
DNase मैं ग्रेड 2 0.015 मिलीग्राम/एमएल
बफर ए को रोकें
स्टॉक कॉन। वर्किंग कॉन। आवश्यक
मायोसाइट बफर 30 एमएल
बीएसए 2.50% 0.75 ग्राम
सीएसीएल2 100 एमएमएम 0.1 mm 30 माइक्रोन
बफर बी बंद करो
स्टॉक कॉन। वर्किंग कॉन। आवश्यक
मायोसाइट बफर 30 एमएल
बीएसए 5.00% 1.5 ग्राम
सीएसीएल2 100 एमएमएम 0.1 mm 30 माइक्रोन

तालिका 1: वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए आवश्यक समाधान।

10x KHB स्टॉक समाधान
(कुल मात्रा = 1L)		 अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) मोलेरिटी (एमएम) राशि (जी)
नैक 1180 68.9 ग्राम
केसीएल 48 3.5 ग्राम
हेपेस 250 59.7 ग्राम
एमजीएसओ4 12.5 1.4 ग्राम
कश्मीर2एचपीओ4 12.5 2.1 ग्राम
पीएच को 4 एम नाओएच (~ 20 एमएल) के साथ 7.4 में समायोजित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
केएचबी सॉल्यूशन, 500 एमएल अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
10x KHB 50 एमएल
ग्लूकोज 0.99 ग्राम
टॉरिन 0.31 ग्राम
500 एमएल में वॉल्यूम लाने के लिए एच2ओ जोड़ें, और पीएच ~ 7.35 होना चाहिए
समाधान एक अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
केएचबी समाधान 500 एमएल (10 mm)
बीडीएम 0.5 ग्राम
100% O2 के साथ ऑक्सीजन और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म
समाधान बी, 50 एमएल अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
समाधान एक 50 एमएल
बीएसए 0.5 ग्राम
0.1 एम CaCl2 (Ca++= 0.1 mM) 50 माइक्रोन
समाधान ई, 50mL अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
समाधान एक 50 एमएल
बीएसए 0.05 ग्राम
कोलेजन प्रकार द्वितीय (263 इकाइयों / 35 मिलीग्राम
हायलुरोनिडेस (टाइप आई-एस) 10 मिलीग्राम
0.1 एम सीएसीएल2 स्टॉक 12.5 माइक्रोल
अच्छी तरह से मिलाएं
CaCl2 स्टॉक, 0.1 M अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
सीएसीएल2 7.35 ग्राम
एच2ओ 500 एमएल
4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

तालिका 2: वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए आवश्यक समाधान।

चढ़ाना मीडिया संरचना, पीएच 7.4
काम एकाग्रता आणविक WT। आवश्यक राशि
Blebbistatin के बिना संस्कृति मीडिया 50 एमएल
बीडीएम 10 mm 101.105 ग्राम/मोल 50.55 मिलीग्राम
एफबीएस 5% 2.5 ग्राम
संस्कृति मीडिया संरचना, पीएच 7.4
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) काम एकाग्रता आणविक WT। आवश्यक राशि
डीएमईएम 1X 250 एमएल
इंसुलिन 1 μg/mL 0.25 मिलीग्राम
ट्रांसफरिन 0.55 μg/mL 0.138 मिलीग्राम
सेलेनियम 0.5 एनजी/एमएल 0.125 माइक्रोग्राम
पेनिसिलिन (यू/एमएल) -स्ट्रेप्टोमाइसिन (जी/एमएल) 100-100 2.5 एमएल
हेपेस 10 mm 238.3012 जी/मोल 595.753 मिलीग्राम
* एफबीएस 10% 25 एमएल
* बीएसए 0.20% 0.5 ग्राम
#Blebbistatin 25 माइक्रोन 292.338 ग्राम/मोल 1.8271 मिलीग्राम
* प्रायोगिक आवश्यकता के अनुसार उनमें से किसी का भी उपयोग करें।
# अलीकोट संस्कृति मीडिया Blebbistatin जोड़ने से पहले चढ़ाना मीडिया तैयार करने के लिए ।
नोट: संस्कृति मीडिया के 200 एमएल तैयार करें।
नोट: चढ़ाना मीडिया के 50 एमएल तैयार करें।

तालिका 3: वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट चढ़ाना और संस्कृति के लिए मीडिया संरचना।

संस्कृति मीडिया संरचना, पीएच 7.4
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) काम एकाग्रता आवश्यक राशि
डीएमईएम 1x 250 एमएल
पेनिसिलिन (यू/एमएल) -स्ट्रेप्टोमाइसिन (जी/एमएल) 100-100 2.5 एमएल
* एफबीएस 10% 25 एमएल

तालिका 4: वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट चढ़ाना और संस्कृति के लिए मीडिया संरचना।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया सेटअप और उपकरण। (I) परफ्यूजन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । 2 सर्जिकल इंस्ट्रूमेंट्स और कैनुलेशन सुई। (III) हार्ट परफ्यूजन असेंबली: ए)हीटिंग जैकेट । ख)डबल वॉल वॉटर जैकेट वेसल। ग)गर्म पानी का इनलेट घूम रहा है। घ)गर्म पानी आउटलेट परिसंचारी । ई)हार्ट परफ्यूजन सॉल्यूशन। एफ)परिसंचरण पंप जी) परफ्यूजन समाधान ट्यूब। एच)ऑक्सीजन सप्लाई ट्यूब। I)पानी स्नान परिसंचारी। जम्मू)दिल के साथ कैनुलेशन सुई, परफ्यूजन आउटलेट पोर्ट से जुड़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क चूहा मुख्यमंत्री अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और दीर्घकालिक संस्कृति। A)वयस्क चूहा सीएम, अलगाव के तुरंत बाद। ख)अलगाव के बाद 7 दिन पर वयस्क चूहा मुख्यमंत्री । C)20 दिन वयस्क चूहा सीएम । डी-एफ) SIRb1 + siMeis2 ट्रांसफैक्शन के बाद 7 दिन पर KI67 सकारात्मक चूहा मुख्यमंत्री। ट्रोपोनिन-I = हरा; DAPI = नीला; KI67 = लाल। सभी प्रयोग डुप्लीकेट में किए गए और कम से कम तीन बार दोहराए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: वयस्क माउस मुख्यमंत्री अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति। A)वयस्क चूहों सीएम, अलगाव के तुरंत बाद । ख)वयस्क चूहों सीएम अलगाव के बाद 7 दिन पर । C)वयस्क चूहों सीएम कार्डियक ट्रोपोनिन-मैं = 20 दिन पर हरे रंग के साथ दाग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क माउस मुख्यमंत्री डी-विभेदन। वयस्क चूहों सीएम डीएमईएम-एचजी मीडिया में दीर्घकालिक संस्कृति (दिन 0 से दिन 10) के दौरान रूपात्मक परिवर्तन दिखाते हैं, जो 10% एफबीएस के साथ पूरक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क माउस मुख्यमंत्री ट्रांसफैक्शन और प्रसार। ए-सी) SIRb1 + siMeis2 ट्रांसफैक्शन के बाद 10 दिन पर KI67 सकारात्मक माउस सीएम। ट्रोपोनिन-I = हरा; DAPI = नीला; KI67 = लाल। घ)बार ग्राफ सिरना-कॉकटेल संक्रमित समूह बनाम नियंत्रण में KI67 सकारात्मक वयस्क माउस सीएम में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है । परिणाम मतलब±SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; = पी मूल्य ≤0.05. पी-वैल्यू ≤0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। सभी प्रयोग ट्रिपलिकेट (एन = 3 पुरुष, 3 महिला) में किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सेल-विशिष्ट मशीनी अध्ययन करने के लिए वयस्क कार्डियोमायोसाइट अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव प्रोटोकॉल पर चर्चा करने वाली कुछ ही रिपोर्टें हैं, और उनमें से भी कम वयस्क,चूहों सीएम15, 16,,17की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए उपयोग की जाती हैं।17 यह दर्शाया गया है कि वयस्क चूहे सीएम में वयस्क चूहों की तुलना में इन विट्रो संस्कृति के प्रति सहनशीलता अधिक होती है सीएम10,11,12.12 इस रिपोर्ट में, हम नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल में न्यूनतम संशोधनों के साथ वयस्क चूहे और चूहों सीएम अलगाव, सिरना ट्रांसफैक्शन, दीर्घकालिक संस्कृति और प्रेरित प्रसार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं।

वयस्क सीएम अलगाव के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) पाचन18, 19,19के लिए दो प्रसिद्ध एंजाइमों, कोलेजनेस और लिबरस के उपयोग पर आधारित हैं। कोलेजनेस वयस्क सीएम आइसोलेशन प्रोटोकॉल में आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एंजाइम है। कोलेजनेस ईसीएम में कोलेजन फाइबर को पचाता है, जिसके परिणामस्वरूप एकल कोशिका सीएम में दिल के ऊतकों का वियोजन होता है। इसी तरह लिबरस ईसीएम को पचाता है। लिबरेस कोलेजनेस के लिए शुद्ध विकल्प है, जो उच्च गतिविधि दिखाता है और इस प्रकार कोलेजनेस की तुलना में सफल अलगाव को प्राप्त करने के लिए सीएम अलगाव के दौरान उच्च परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रक्रिया में, हमने देखा कि लिबरसे के साथ अलग-थलग पड़े सीएम दीर्घकालिक संस्कृति में जीवित नहीं रहते हैं। हालांकि, कोलेजनेस से अलग सीएम संस्कृति की स्थितियों में सीएम की दीर्घायु में सुधार करते हैं ।

इसके अतिरिक्त, हमने वयस्क माउस सीएम20, 21,21की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए संस्कृति मीडिया में ब्लेबिस्टिन नामक एक विशिष्ट मायोसिन II अवरोधक का उपयोग किया। इससे पहले एडल्ट सीएम कल्चर के लिए 2,3-ब्यूशन मोनोक्सीमाइन (बीडीएम) का इस्तेमाल किया जा चुका है। बीडीएम एक ATPase अवरोधक है जो एक खराब परिभाषित तंत्र के माध्यम से अनुबंध समारोह को रोकता है जिसमें ATPase और बिगड़ा सीए+ + संक्रमण22का अवरोध शामिल है। बीडीएम की तुलना में, ब्लेबिस्टिन मायोसिन II का एक विशिष्ट अवरोधक है और बीडीएम की तुलना में कम सांद्रता पर संकुचन समारोह का अधिक महत्वपूर्ण अवरोध दिखाता है। एक संस्कृति मीडिया में वयस्क माउस सीएम की एक पूर्व चढ़ाना, बीडीएम के 10 mM और 25μM blebbistatin में मुख्यमंत्री के बाद संस्कृतियों के साथ पूरक-पूरक और कम सीरम मीडिया लंबी अवधि की संस्कृति में मुख्यमंत्री की उत्तरजीवी और रॉड आकार संरचना में सुधार । हालांकि, मीडिया में वयस्क माउस सीएम की एक सीधी चढ़ाना, 25 माइक्रोनएम ब्लेबिस्टिन और 10% एफबीएस के साथ पूरक प्रसार अध्ययन के लिए बेहतर है। वयस्क चूहा सीएम के समान, जो इन विट्रो संस्कृति में काफी हद तक डी-विभेदन दिखाता है, हमने वयस्क माउस सीएम में कुछ हद तक डी-विभेदन(चित्रा 5)भी देखा। रूपात्मक परिवर्तन प्रसार के लिए आवश्यक कदम हैं। इस प्रकार, वयस्क मुख्यमंत्री को एक वातावरण प्रदान करना जो उनके डी-विभेदन की सुविधा प्रदान करता है, ऐसे अध्ययनों में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। हालांकि इस समय, यह स्पष्ट नहीं है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सटीक चरणों या घटकों में से कौन वयस्क सीएम की बेहतर दीर्घायु के लिए जिम्मेदार है, हममानते हैं कि यह उपयोग किए गए अभिकर्मकों का संयोजन प्रभाव है, अलगाव प्रक्रिया में किए गए संशोधन, और शायद सबसे महत्वपूर्ण रूप से प्रशिक्षित हाथ।

पिछली रिपोर्टों के समान, जो ब्लेबिस्टिन-पूरक मीडिया में वयस्क मुख्यमंत्री के वायरल ट्रांसडक्शन को दिखाते हैं, हमने एसआईआरएन के साथ इन कोशिकाओं के एक कुशल ट्रांसफैक्शन को भी देखा। हमने सीएम के प्रसार को प्रेरित करने के लिए दो सेन्सेंस से जुड़े जीन, Rb1 और Meis2के खिलाफ विशिष्ट siRNAs का इस्तेमाल किया । चूहा मुख्यमंत्री के लिए, हमने ट्रांसफैक्शन के बाद सात दिन प्रसार का आकलन करने के लिए KI67 विश्लेषण किया; हालांकि, माउस वयस्क मुख्यमंत्री में प्रसार ट्रांसफैक्शन के बाद दस दिन पर विश्लेषण किया गया था । एक प्रजाति-विशिष्ट जैविक परिवर्तनशीलता वयस्क चूहे और माउस सीएम के प्रेरित सेल चक्र पुनः प्रवेश में मनाए गए समय अंतर के लिए एक संभावित कारण हो सकता है।

कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क चूहे और माउस सीएम को अलग करने के लिए एक बेहतर, विश्वसनीय और तुलनात्मक प्रक्रिया प्रदान करता है, और तदनुसार उन्हें प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार संस्कृति प्रदान करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल वयस्क मुख्यमंत्री की दीर्घकालिक संस्कृति की अनुमति देता है, जो प्रसार, पैराक्राइन फैक्टर, तनाव प्रतिक्रिया आदि जैसे विभिन्न दीर्घकालिक विश्लेषण करने के लिए एक इन-विट्रो सिस्टम प्रदान करता है।

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस काम को पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय, कॉलेज ऑफ मेडिसिन, डॉ ओनुर कानिसिकक से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01HL148598) से डॉ ओनूर कानिसिकक को अनुदान । डॉ ओनुर कानिसिकक को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (18CDA34110117) का समर्थन है । डॉ परवेज आलम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल ग्रांट (AHA_20POST35200267) का समर्थन है । डॉ मलीना जे Ivey एक NIH T32 अनुदान (एचएल 125204-06A1) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butane Dione monoxime Sigma-Aldrich B-0753
Blebbistatin APExBIO B1387
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059
CaCl2 Sigma-Aldrich 449709
Cell culture plate Corning Costar 3526
Cell strainer BD Biosciences 352360
Cel-miR-67 Dharmacon CN-001000-01-50
Collagenase type2 Worthington LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes Sigma-Aldrich Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium Thermo Scientific SH30022.01
EdU Life Technologies C10337
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps Fisherbrand 22-327379
Glucose Sigma-Aldrich G-5400
Hemocytometer Hausser Scientific 1483
Heparin Sagent Pharmaceuticals PSLAB-018285-02
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-128
Hyaluronidase Sigma H3506
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P-8281
KCl Sigma-Aldrich 746436
Light Microscope Nikon
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778-150
MgSO4 Sigma-Aldrich M-2643
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Fisher Scientific S318-500
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-CI
Pentobarbital Henry Schein 24352
Phosphate buffered saline Life Technologies 20012-027
Protease XIV Sigma-Aldrich P5147-1G
Selenium Sigma-Aldrich 229865+5G
siMeis2 Dharmacon s161030
siRb1 Dharmacon s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors Fisher Scientific 28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps Fisherbrand 16-100-120
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Transferrin Sigma-Aldrich T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor Fisherbrand 22-079-747
Water Bath Fisher Scientific 3006S

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References

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जीव विज्ञान अंक 164 कार्डियोमायोसाइट चूहा माउस पूर्व वीवो दीर्घकालिक संस्कृति ट्रांसफैक्शन प्रसार
अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति
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Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M.… More

Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (164), e61073, doi:10.3791/61073 (2020).

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