Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61073

Summary

Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.

Abstract

Erişkin memeli kardiyomiyositlerin (CMs) ex vivo kültürü, kardiyak biyolojinin in vitro çalışması için en uygun deneysel sistemi sunmaktadır. Erişkin memeli CM'ler en az proliferatif kapasiteye sahip ölümcül farklılaşmış hücrelerdir. Erişkin CM'lerin mitotik sonrası durumu sadece kardiyomiyosit hücre döngüsünün ilerlemesini kısıtlamakla kalmamış, aynı zamanda CM'lerin verimli kültürünü de sınırlandırır. Ayrıca, yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü CM proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi gibi birçok çalışma için gereklidir.

Fare ve sıçan kardiyomiyosit izolasyonu için kullanılan iki en çok tercih edilen laboratuvar hayvanlarıdır. Sıçan CM'lerinin uzun süreli kültürü mümkün olsa da, yetişkin fare CM'leri ölüme duyarlıdır ve normal koşullarda beş günden fazla kültürlenemez. Bu nedenle, yetişkin murine CMs için hücre izolasyonu ve uzun vadeli kültür protokolü optimize etmek için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu değiştirilmiş protokol ile, 20 günden fazla hem yetişkin fare yi hem de fare CM'lerini başarılı bir şekilde izole etmek ve kültüretmek mümkündür. Ayrıca, izole CM siRNA transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde önceki raporlara göre artmıştır. Yetişkin fare CM izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemi optimal enzim çözeltisi ve tam ekstrasellüler matriks ayrışması için yeterli zaman ile kullanılmaktadır. Saf ventriküler CM'ler elde etmek için, her iki atria diseksiyon ve kaplama ile devam etmeden önce diseksiyon ve atılır. Hücreler verimli ve hızlı bağlanmaya olanak sağlayan laminin kaplı bir plaka üzerinde dağıtıldı. CMs siRNA transfeksiyon önce 4-6 saat yerleşmek için izin verildi. Kültür medyası 20 gün boyunca her 24 saatte bir yenilendi ve daha sonra, CM'ler Troponin ve KI67 gibi hücre döngüsünün belirteçleri gibi kardiyak spesifik belirteçler için sabit lendi ve lekelendi.

Introduction

Kalp hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kardiyak yaralanmanın hemen hemen her türü erişkin kardiyomiyosit (CM) kaybıile sonuçlanır. Erişkin memeli kalpler yetişkin CM1senescent doğası nedeniyle kardiyak yaralanma onarmak mümkün değildir. Böylece, yetişkin memeli kalp herhangi bir hakaret CMs kalıcı bir kaybına yol, azaltılmış kalp fonksiyonu ve kalp yetmezliğine yol açan. Yetişkin memelilerin aksine, zebra balığı ve yeni kalpler gibi küçük hayvanlar mevcut CM çoğalması2,3,4ile kardiyak yaralanmalarını yenileyebilirler. Hem proliferatif hem de proliferatif olmayan yaklaşımlar la kardiyak yaralanmalar için yeni bir terapötik müdahale bulmak için dünya çapında bir çaba devam etmektedir. Son yıllarda, genetik fare modelleri çeşitli kardiyak yaralanma ve onarım çalışma geliştirilmiştir. Ancak, in vivo hayvan modelleri kullanarak ikincil etkileri bir hücre özerk mekanizma deşifre etmek için ek karmaşıklığı ile pahalı bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ayrıca in vivo sistemleri, CM'den kardiyoprotektif sinyalizasyona neden olan farmakolojik bir müdahalenin CM'ye özgü etkilerini analiz etmek zordur.

Ayrıca, cm proliferasyon analizleri yapmak için yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü gereklidir. CM proliferasyon tahlilleri hücrelerin hücre döngüsüne indüklenen ve bundan sonra doğru veri elde etmek için en az 4-5 gün gerektirir. Ayrıca, elektrofizyolojik çalışmalar, ilaç taraması, toksisite çalışmaları ve Ca++ homeostaz çalışmaları için izole CM'ler kullanan çalışmalar tüm gelişmiş bir kültür sistemi 5 ihtiyacı vardır5,6,7. Ayrıca, son çalışmalar CMs salgılanan sitokinlerin kardiyoprotektif önemini göstermektedir (kardiyokines)8,9. Kalp onarımı ve rejenerasyonu sırasında bu kardiyokinelerin terapötik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için uzun süreli bir kültür gereklidir.

Yetişkin sıçan CMs bir in vitro sistem10,,11,,12tek hücreli izolasyon ve uzun vadeli kültür için yeterince sağlam . Ancak, yetişkin fare CMs in vitro tahliller için büyük ilgi vardır, genetik olarak değiştirilmiş fare modelleri çeşitli durumu nedeniyle, hangi tasarım ve sıçan CM ile mümkün değildir çeşitli yenilikçi analizlerin yürütülmesi için izin verir13. Yetişkin fare CM izolasyon aksine, yetişkin fare kalplerden tek hücreli süspansiyon elde etmek oldukça zordur, ve kültür yetişkin fare CMs uzun vadeli kültür daha da zordur.

Bir Langendorff sistemi kullanarak fare ve sıçan kalplerinden Yetişkin CM izolasyon u daha önce CM fonksiyonu5,14,,15çalışma kurulmuştur. Burada, hem sıçanlardan hem de farelerden yetişkin CM izolasyonprotokollerinin yanı sıra izole edilmiş hücrelerin değiştirilmiş uzun vadeli kültürü, transfeksiyonu ve CM çoğalmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerine uygun olarak yapılmalıdır. Videoda görüntülenen tüm protokoller Cincinnati Üniversitesi, Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Yetişkin farelerden (ve sıçanlardan) kalp çıkarma öncesi hazırlık

  1. Sırasıyla fare ve fare izolasyonu için Tablo 1 ve Tablo 2'deverilen tariflere göre karşılık gelen perfüzyon, enzim ve durdurma çözeltilerini hazırlayın. Herhangi bir kontaminasyon veya çözülmemiş partikülleri temizlemek için çözeltileri 0,22 m filtreden filtreleyin.
  2. 15 dakika boyunca %70 alkolle ıslatarak cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin ve daha sonra çift distile su ile yıkayın. Temiz bir kağıt havlu üzerinde kuru hava araçları bırakın.
  3. Su banyosunu 37 ºC'ye önceden ısıtın. İşlem sırasında perfüzyon aparatı ile ılık suyun kesintisiz dolaşımını sağlamak için su banyosundaki su seviyesini kontrol edin.
  4. Perfüzyon cihazını %70 alkolle 5 dk. Tekrarederek temizleyin.
    NOT: Borunun temizlenmesine yardımcı olan akış hızını artırın.
  5. Alkol aktıktan sonra, 10 dakika boyunca çift distile su çalıştırarak alkol kalıntıları temizleyin.
  6. Eksizyondan sonra kalbi temizlemek için 3 adet orta boy tek kullanımlık polistiren tartım tabakları ayarlayın. Bulaşıkları 20 mL miyosit tamponu ile doldurun.
  7. Pasteur pipet yardımı ile her çan ara2-3 damla heparin ekleyin ve birden fazla kez pipetleme tarafından iyice karıştırın.
  8. Künt iğne kanüllü 10 mL'lik bir şırınga alın.
    NOT: Temiz ve steril bir iğnenin ucunu keserek künt bir iğne kanüli hazırlanabilir. Fare ve sıçan için kanül yapmak için sırasıyla 21 G iğne ve 14 G iğne kullanıldı.
  9. Şırıngayı perfüzyon tamponuile doldurun (Tablo 1). Şırıngadan hava kabarcıklarını çıkarın ve açılı bir pozisyonda üçüncü tabağa yerleştirin. Bantla sabitleyin.
    NOT: Sıçanlar için miyosit perfüzyon tamponu yerine A Çözeltisi (Tablo 2) kullanılmıştır.
  10. Cerrahi bir dikiş ile gevşek bir düğüm hazırlayın ve iğne etrafında yerleştirin.
  11. Anestezi enjeksiyonundan 20 dakika önce intraperitoneal enjeksiyon ile fareye heparin (100 USP ünitesi/fare) enjekte edin.
  12. Perfüzyon aparatı aracılığıyla miyosit perfüzyon tamponu(Tablo 1)dolaşın. Akış hızını 3 mL/dk'ya düşürün.
    NOT: Sıçanlar için miyosit perfüzyon tamponu yerine A Çözeltisi (Tablo 2) kullanılmıştır.
  13. 5 dakika sonra perfüzyon tamponu enzim solüsyonu ile değiştirin (Tablo 1). İşlem sırasında enzim çözeltisini oksijenle doygunlayın. 3 mL/dk akış hızı kullanın.
    NOT: Fare CM izolasyonu için bunun yerine E (Tablo 2) çözeltisi kullanın.
  14. Anestezi intraperitoneal enjeksiyon ile fare anestezi. Terminal cerrahisi için IACUC tarafından önerilen uygun dozda anestezi kullanın.
  15. Bir parmak sıkışması bir yanıt eksikliği ile anestezi yeterli derinliği onaylayın. Sonra fareyi cerrahi platforma koy.

2. Erişkin farelerden (ve sıçanlardan) kalp çıkarma

  1. % 70 alkol ile silerek cildi sterilize.
  2. Göğsü dikkatlice aç.
  3. Kalbi çıkar. Eksizyon sırasında kalp dışı dokulardan kaçının.
  4. Perfüzyon tampon(Tablo 1)ile dolu ilk çanak, kalp koyun.
    NOT: Fare için A çözeltisi kullanın (Tablo 2).
  5. Yavaşça sıkarak kalpten kan temizleyin.
  6. Kalbi ikinci yemeğe aktar.
  7. Kalpten kan temizleyin ve kardiyak olmayan dokuları çıkarın. Daha sonra, üçüncü çanak kalp aktarın.
  8. Akciğerleri ve diğer çevre dokuları kesin ve yükselen aort yoluyla kanüle. Bu işlem CM kalitesini ve miktarını artırmak için mümkün olduğunca hızlı (<5 dk) yapılmalıdır.

3. Kalbin sindirimi

  1. Fare kalbinin sindirimi
    NOT: Fare nin kalbinde dolaşan tüm çözeltiler/tamponlar işlem boyunca oksijenlendirilmelidir.
    1. Kantin iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve Langendorff perfüzyon cihazına bağlayın.
    2. Enzim çözeltisi ve sindirim akışı etkileyebilir kalbe giden herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
    3. Kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın. Enzim çözeltisinin kalpten 2-3 mL/dk hızla akmasına izin verin.
      NOT: Geçen çözeltinin hızı kritiktir ve CM miktarı ve kalitesinin sonucu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.
    4. Enzim çözeltisi 2 dakika boyunca kalp ten akmasına izin verin.
    5. 2 dk, enzim çözeltisine 40 μL 100 μM CaCl2 çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Enzim çözeltisi başka bir 10-15 dakika için kalp geçmesine izin verin.
      NOT: Bir kez akış pürüzsüz olur, kalp kahverengimsi ve yumuşak olur, kollajenaz enzimi ve kalbin düzgün sindirim eşit dağılımı gösteren.
  2. Fare kalbinin sindirimi
    NOT: Fare nin kalbinde dolaşan tüm çözeltiler/tamponlar işlem boyunca oksijenlendirilmelidir.
    1. Kantin iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve Langendorff perfüzyon cihazına bağlayın.
    2. Enzim çözeltisi ve sindirim akışı etkileyebilir kalbe giden herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
    3. Kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın.
    4. Çözelti a akışını 3-5 dk kalpten herhangi bir kan çıkarmak için 2-3 mL/dk hızda başlatın.
      NOT: Geçen çözeltinin hızı kritiktir ve CM kalitesinin sonucu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.
    5. Kan kalpten temizlendikten sonra A çözeltisinden çözeltiE(Tablo 2)geçin. Çözeltide 0,1 mM'lik son konsantrasyon için aşağıda belirtildiği gibi CaCl2 ile Titrat çözeltisi E:
      1. Perfüzyon 10 dakika sonra, 0,1 M CaCl212,5 μL ekleyin.
      2. Perfüzyon 15 dk sonra, 0,1 MCaCl2 25 μL ekleyin.
    6. Akış hızlı hale gelene ve kalp esnek olana kadar enzim çözeltisi 30-40 dakika daha kalpten geçsin.

4. CM tek hücreli süspansiyon hazırlanması

  1. CM tek hücreli süspansiyonun hazırlanması (fare)
    1. Kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden çıkarın. 5 mL enzim çözeltisi ile dolu 60 mm Petri kabına taşıyın ve kabı biyogüvenlik başlığına aktarın.
      NOT: Langendorff perfüzyon sisteminden kalbi çıkarmadan önce yeterli kalp sindirimini sağlayın. Sindirim süresi enzim aktivitesine, çözelti akışına ve kalbin büyüklüğüne bağlıdır.
    2. Steriliteyi sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kaputunda daha fazla mekanik ayrışma gerçekleştirin.
    3. Dikkatle atria kaldırmak (1/4bazal kalp kısmı) ve ekstra yağ dokuları.
    4. İnce parçalar halinde forceps ile kalp kıyma.
    5. Steril bir Pasteur pipetalın ve ucunu 45º açıyla kesin.
    6. Bu Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu tek hücreli süspansiyonda hafif pipetleme ile dağıtın. Optimal sindirim tek hücreli kardiyomiyositlerin süspansiyon sağlar.
      NOT: Mekanik yakıcılık nedeniyle CM hasarını azaltmak için transfer borusunun dar, alt kısmını çıkarın.
    7. Daha sonra, aşırı hazımsızlık olasılığını önler enzim aktivitesini durdurmak için durdurmak çözeltisi 5 mL ekleyin.
    8. Taze bir 50 mL konik alın ve steril 100 μm hücresüz üzerine yerleştirin.
    9. Doku yığınıkaldırmak için hücre süzgeci aracılığıyla kardiyomiyosit süspansiyon geçirin. Petri kabını ve süzgeci, süzgeçe bağlı kalan kardiyomiyositleri toplamak için 5 mL'lik başka bir stop çözeltisi(Tablo 1)ile yıkayın.
  2. CM tek hücreli süspansiyon (sıçan) hazırlanması
    1. Kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden çıkarın. Kalbi 5 mL çözelti A ile dolu 100 mm Petri kabına taşıyın ve kabı biyogüvenlik başlığına taşıyın.
      NOT: Langendorff perfüzyon sisteminden kalbi çıkarmadan önce yeterli kalp sindirimini sağlayın. Sindirim süresi enzim aktivitesine, çözelti akışına ve kalbin büyüklüğüne bağlıdır.
    2. Steriliteyi sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kaputunda daha fazla mekanik ayrışma gerçekleştirin.
    3. Dikkatle atria kaldırmak (bazal kalp kısmının 1/4th) ve ekstra yağ dokuları.
    4. İnce parçalar halinde forceps ile kalp kıyma.
    5. Steril bir Pasteur pipetalın ve ucunu 45º açıyla kesin.
    6. Bu Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu tek hücreli süspansiyonda hafif pipetleme ile dağıtın. Optimal sindirim tek hücreli kardiyomiyositlerin süspansiyon sağlar.
      NOT: Mekanik yakıcılık nedeniyle CM hasarını azaltmak için transfer borusunun dar, alt kısmını çıkarın.
    7. CM süspansiyonuna 5 mL çözelti B(Tablo 2)ekleyin ve kalan yağ veya sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için çözeltiyi 100 μm hücresüzden geçirin.
    8. Taze bir 50 mL konik şişede filtrat toplayın.
    9. Petri kabını ve kalan CM'yi hücre süzgecinden geçirmek için 5 mL daha b çözeltisi kullanın.

5. CM'siz lerin kaldırılması

  1. Yetişkin tek hücreli süspansiyondan (fare) CM'lerden çıkarılma
    1. 3 dk için 20 x g hücre süspansiyon santrifüj.
    2. Supernatant atın ve stop çözeltisi 10 mL hücreleri resuspend(Tablo 1).
      NOT: Stop çözeltisindeki BSA konsantrasyonunun artırılması viskozitesini artıracak ve CM olmayanların sedimantasyon hızını azaltacaktır.
    3. Tüpün 3-5 kez hafif çetren inversiyon ile CM'leri yeniden askıya alın.
    4. 3 dk aralıklarla 100 μM CaCl2 çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Üç kez tekrarlayın.
    5. Dördüncü eklemeden sonra, 3 dk için 20 x g kardiyomiyosit süspansiyon santrifüj.
    6. Supernatant atın.
    7. Önceden ısıtılmış (37 ºC), yetişkin fare CM kaplama medyasında(Tablo 3)CM'leri yeniden askıya alın.
  2. Yetişkin tek hücreli süspansiyonlardan (sıçan) CM'siz lerin çıkarılması
    1. Pelet hücreleri 20 x g'de 3 dk 25 ºC'de.
    2. Supernatant atın ve çözelti B 25 mL içine hücreleri resuspend(Tablo 2).
    3. Hücreleri nazik bir şekilde karıştırın ve CM'nin yer çekimi altında yerleşmesini sağlamak için bir tüp standına yerleştirin.
    4. Supernatant'ı dikkatlice atın.
    5. B çözeltisinin 25 mL'lik taze siseviyesindeki hücreleri yeniden askıya alın ve 50 μL, 75 μL ve 100 μL 0,1 M CaCl2'yi 3-5 dk aralıklarla adım adım ekleyerek 1,0 mM CaCl2'ye titre edin.
      NOT: Bu adımda B çözeltisinde daha yüksek bir BSA konsantrasyonu kullanılabilir. B çözeltisindeki BSA konsantrasyonunun artırılması viskoziteyi artırır ve böylece CM'siz lerin sedimantasyon hızını azaltır.
    6. Pelet hücreleri 20 x g için 3 dk 25 ºC'de, supernatant aspire ve yetişkin sıçan hücre kültür ortamı nın istenilen hacmi ekleyin(Tablo 4).
    7. Lamina kaplı bir tabakta Tohum CM'leri.
      NOT: CM olmayan hücrelerin kontaminasyonunu en aza indirmek için kaplamasız bir kültür plakası üzerindeki CM'lerin ön kaplaması kullanılabilir.

6. Yetişkin CM kaplama

  1. Ön kaplama
    1. Kardiyomiyositleri kültür medyasına yeniden uzaklaştırmak.
    2. Hücreleri fare veya fare CM için 60 mm veya 100 mm'lik bir çanak içine önceden plakalayın.
    3. 37 ºC'de %5 CO2 ile desteklenen bir kuluçka makinesinde 2 saat kuluçka ya da tüp lüzmler.
    4. Ön plaka kuluçka sırasında, hücre kültür plakalarını uzun süreli CM kültürü için laminin (PBS'de 10 μg/mL) ile kaplayın.
  2. Ön kaplama 2 saat sonra, 50 mL konik şişe cms toplamak.
  3. Çanak hücreleri toplamak ve transfection deneyleri için bir laminin kaplı 24 iyi kültür plakası içine yeniden plaka.
  4. 37 ºC'de bir kuvözdeki kültür hücreleri %5 co2ile desteklenir. 4-6 saat yüzeyile kardiyomiyositler uymak için yeterli, ve böylece, transfeksiyon 6 saat sonrası kaplama yapılabilir.
    NOT: FBS içeren kaplama ortamı yaygın olarak kullanılır ve proliferasyon çalışmaları ile daha iyi uyumluluk gösterir. Ancak, salgı faktörlerinin analiz edildiği deneylerde serumsuz bir ortam kullanılabilir.

7. Transfeksiyon

  1. CM'leri lamina ile kaplanmış hücre kültürü plakalarına 4-6 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Laminin kaplı plaka üzerinde CM tohumlama dört saat sonra, üreticinin protokolüne göre bir transfeksiyon reagent (örneğin, Lipofektamine RNAiMAX) kullanarak ilgi siRNA (50 nM) ile transfect hücreleri.
  3. Transfeksiyondan sonra 24 saat ve ondan sonraki 24 saatte bir 20 güne kadar ortam değiştirin.
  4. 20 gün sonra, canlı kardiyomiyositlerin uzun vadede başarılı bir şekilde kültüre kazandırıldığından emin olmak için Troponin gibi kardiyak spesifik belirteçler için immünositokimya da dahil olmak üzere, downstream uygulamaları için PBS'de %4 PFA içeren hücreleri düzeltin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mevcut değiştirilmiş protokol verimli izolasyon ve tüp bebek fare ve fare CMs kültürü sağlar. Sıçan CM izolasyonu için, toplam 3 yetişkin (12 haftalık) erkek Fischer 344 sıçan kullanıldı. Şekil 1, işlemde gerekli olan cerrahi cihazları ve izolasyon kurulumlarını gösterir; her parça işaretlenmiştir ve şekil efsanesinde açıklanmıştır. Kollajenaz tip 2 sindirim için kullanılmıştır, bu da başarılı izolasyondan yüksek miktarda yüksek kaliteli CM'ler verir(Şekil 2A). İzolasyon dan 24 saat sonra, bu hücreler rb1 ve Meis2karşı spesifik siRNA'lar indükleyen hücre döngüsü ile transfected edildi , cel-miR-67 deneyde transfeksiyon kontrolü olarak kullanılmıştır11. Ms'ler morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için kültürde yedi gün(Şekil 2B)veya yirmi güne kadar(Şekil 2C)muhafaza edildi. Hücre döngüsü aktivitesi için skor için, CMs gün 7 sabit ve kardiyak spesifik marker Troponin-I, mitotik marker KI67 için lekeli ve çekirdek DAPI ile görselleştirilmiş(Şekil 2D-F). KI67 pozitif kardiyomiyositlerde önemli bir artış siRb1+siMeis2 tedavisi ile kontrol11ile karşılaştırıldığında gözlendi . Ayrıca, sıçan kardiyomiyositler dayak edildi (kontraktil fonksiyon) gün yedi post-kaplama kültürde, hangi sağlıklı kardiyomiyositbir özelliğidir11.

Farelerde CM izolasyonu için, işlemde toplam 3 erkek ve 3 kadın yetişkin (12 haftalık) C57BL/6 fare kullanıldı. Sıçan çalışmasına benzer şekilde kollajen ve erişkin farelerin kalbinin hücre dışı matriksini sindirmek için kollajen tip 2 kullanılmıştır. Yetişkin fareler CM nispeten izolasyon ve kültür in vitro için kırılgandır; böylece, bu protokol yetişkin fare CM canlılığını artırmak için blebbistatin kullanır. Başarılı izolasyon verimleri >70-80% sağlıklı çubuk şekli CMs, hangi kadar 20 gün için kültürlenebilir(Şekil 3A-C) ve kardiyak Troponin-I boyama ve kontraks korumak(Şekil 3C). Ayrı deneylerde, dört saat sonrası izolasyon, fare CMs sıçan CM. Kısaca açıklandığı gibi siRNA kokteyl indükleyen bir hücre döngüsü ile transfected edildi, fareler CM aynı anda Rb1 ve Meis2karşı spesifik siRNA ile transfected oldu , ve kontrol (cel-miR-67). Transfeksiyon sonrası CM'ler 10 gün boyunca zaman dersi görüntülemesine tabi tutuldular ve bunu proliferasyon tözünü takip eden morfolojik değişiklikleri(Şekil 4)gösterdiler (Şekil 5). 10. günde Troponin-I, KI67 ve DAPI için immün floresan boyama daha önce açıklandığı gibi yapıldı. KI67 pozitif kardiyomiyositlerde kontrole göre siRb1+siMeis2 tedavisinde anlamlı bir artış gözlenmiştir(Şekil 5A-C).

Bu protokol, yetişkin sıçan ların ve farelerin 20 güne kadar ve potansiyel olarak daha uzun süre uzun süreli in vitro kültüre edinilebileni göstermektedir. 20 gün sonra, CM'ler inhibitörleri medyadan kaldırılırsa troponin-i boyama yanı sıra kontraktür korumak.

Miyosit tampon bileşimi, pH 7.4 (Hazırlayın ve 4 °C'de saklanabilir)
Reaktif Konsantrasyon, mM Moleküler wt. 1 Litre İçin
Nacl 113 58.44 6.6037 g
Kartal 4.7 74.5513 350.3911 mg
MgSO4 1.2 120.366 144.4392 mg
KH2PO4 0.6 136.086 81.6516 mg
NaH2PO4 0.6 119.98 71.988 mg
Perfüzyon tamponu, pH 7.4 (Her izolasyon için taze hazırlanın)
Konsantrasyon, mM Moleküler wt. Gereken tutar
Miyosit tamponu 250 mL
HEPES 10 238.3012 595.75 mg
2,3-butanedione monoksin 10 101.105 252.775 mg
NaHCO3 Taze 1.6 84.007 33.6028 mg
Taurin Taze 30 125.15 938.625 mg
Glikoz Taze 20 180.156 900.775 mg
Enzim çözeltisi
Stok Conc. Çalışma Conc. Gerekli
Miyosit tamponu 50 mL 50 mL
Kollajenaz tip 2 330 U/mg 620 U/mL 93 mg
Proteaz XIV >3.5 U/mg 0.104 U/mL 1.48 mg
DNase I sınıf 2 0.015 mg/mL
Arabellek A'yı Durdur
Stok Conc. Çalışma Conc. Gerekli
Miyosit tamponu 30 mL
Bsa 2.50% 0,75 g
CaCl2 100mm 0,1 mM 30 μL
Arabellek B'yi Durdur
Stok Conc. Çalışma Conc. Gerekli
Miyosit tamponu 30 mL
Bsa 5.00% 1,5 g
CaCl2 100mm 0,1 mM 30 μL

Tablo 1: Yetişkin fare kardiyomiyosit izolasyonu için gerekli çözümler.

10x KHB Stok Çözümü
(Toplam hacim= 1L)
Reaktif Azı lılık (mM) Tutar (g)
Nacl 1180 68.9 g
Kartal 48 3,5 g
HEPES 250 59.7 g
MgSO4 12.5 1.4 g
K2HPO4 12.5 2.1 g
4 M NaOH (~20 mL) ile pH'ı 7,4'e ayarlayın, 4 °C'de saklayın
KHB Çözeltisi, 500 mL Reaktif Tutar
10x KHB 50 mL
Glikoz 0,99 g
Taurin 0,31 g
500 mL'ye hacim getirmek için H2O ekleyin ve pH ~7,35 olmalıdır
Çözüm A Reaktif Tutar
KHB çözümü 500 mL (10 mM)
Bdm 0,5 g
%100 O2 ve 37 °C'ye kadar sıcak oksijen
Çözelti B, 50 mL Reaktif Tutar
Çözüm A 50 mL
Bsa 0,5 g
0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) 50 μL
Çözelti E, 50mL Reaktif Tutar
Çözüm A 50 mL
Bsa 0,05 g
Kollajenaz tip II (263 adet/mg) 35 mg
Hyaluronidase (Tip I-S) 10 mg
0,1 M CaCl2 hisse senedi 12,5 μL
İyi bir şekilde karıştırın
CaCl2 Stok, 0.1M Reaktif Tutar
CaCl2 7.35 g
H2O 500 mL
4 °C'de saklayın

Tablo 2: Erişkin sıçan kardiyomiyosit izolasyonu için gerekli çözümler.

Kaplama medya kompozisyonu, pH 7.4
Çalışma Konsantrasyonu Moleküler Wt. Gerekli miktar
Blebbistatin olmadan kültür medya 50 mL
Bdm 10 mM 101.105 g/mol 50.55 mg
Fbs 5% 2,5 g
Kültür medya kompozisyonu, pH 7.4
Reaktif Çalışma Konsantrasyonu Moleküler Wt. Gerekli miktar
DMEM 1X 250 mL
Insülin 1 μg/mL 0.25 mg
Transferrin 0,55 μg/mL 0.138 mg
Selenyum 0,5 ng/mL 0,125 g
Penisilin (U/mL)-streptomisin (g/mL) 100-100 2,5 mL
HEPES 10 mM 238.3012 g/mol 595.753 mg
*FBS 10% 25 mL
*BSA 0.20% 0,5 g
#Blebbistatin 25 μM 292.338 g/mol 1.8271 mg
*Deneysel gereksinime göre bunlardan birini kullanın.
# Aliquot kültür medya Blebbistatin eklemeden önce kaplama medya hazırlamak için.
NOT: 200 mL kültür ortamı hazırlayın.
NOT: 50 mL kaplama ortamı hazırlayın.

Tablo 3: Yetişkin fare kardiyomiyosit kaplama ve kültür için medya kompozisyonu.

Kültür medya kompozisyonu, pH 7.4
Reaktif Çalışma Konsantrasyonu Gerekli miktar
DMEM 1 x 250 mL
Penisilin (U/mL)-streptomisin (g/mL) 100-100 2,5 mL
*FBS 10% 25 mL

Tablo 4: Yetişkin sıçan kardiyomiyosit kaplama ve kültür için medya kompozisyon.

Figure 1
Şekil 1: Prosedür kurulumu ve donanımı. (I) Perfüzyonşematif temsili. (II) Cerrahi aletler ve kanülasyon iğnesi. (III) Kalp perfüzyon montaj: A) Isıtma ceket. B)Çift duvarlı su ceketi kabı. C) Sirkülasyonhalinde ısıtılmış su girişi. D) Sirkülasyonlü ısıtılmış su çıkışı. E) Kalp perfüzyon çözeltisi. F) Sirkülasyon pompası G) Perfüzyon çözeltisi tüpü. H) Oksijen besleme tüpü. I) Dolaşan su banyosu. J)Perfüzyon çıkış noktasına bağlı kalpli kanülasyon iğnesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yetişkin sıçan CM izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültür. A) Yetişkin sıçan CM, izolasyon hemen sonra. B) İzolasyondan sonra 7. C) Yetişkin sıçan CM gün 20. D-F) SiRb1+siMeis2 transfeksiyonundan sonra 7. Troponin-I = yeşil; DAPI = mavi; KI67 = kırmızı. Tüm deneyler çoğaltılmış ve en az üç kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yetişkin fare CM izolasyon ve uzun vadeli kültür. A) Yetişkin fareler CM, izolasyonhemen sonra. B)İzolasyondan sonra 7. C) Yetişkin fareler CM Kardiyak Troponin-I = yeşil gün 20 ile lekeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Yetişkin fare CM de-differentiation. DMEM-HG ortamlarında uzun süreli kültür de (gün 0-Gün 10) sırasında morfolojik değişiklikleri gösteren yetişkin fareler CM, %10 FBS ile desteklenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Yetişkin fare CM transfeksiyon ve çoğalma. A-C) SiRb1+siMeis2 transfeksiyonundan sonra 10. Troponin-I = yeşil; DAPI = mavi; KI67 = kırmızı. D)Çubuk grafiği, siRNA-kokteyl transfected grubunda ki67 pozitif yetişkin fare CM'lerinde kontrole karşı önemli bir artış gösterir. Sonuçlar ortalama±SEM olarak sunulur; * = p değeri ≤0.05. p-değeri ≤0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Tüm deneyler triplicate (n=3 Erkek,3 Kadın) yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücreye özgü mekanistik çalışmalar yapabilmek için yetişkin kardiyomiyosit izolasyonu ve uzun vadeli kültür için bir protokol kurulması çok önemlidir. Yetişkin CM izolasyon protokolleri tartışırken sadece birkaç rapor vardır, ve hatta bunların daha az yetişkin farelerCM15,,16,,17uzun vadeli kültür için kullanılır. Bu yetişkin sıçan CM yetişkin fareler CM10,11,12daha in vitro kültüre daha yüksek bir tolerans olduğu gösterilmiştir. Bu raporda, yetişkin sıçan ve farelerIN CM izolasyonu, siRNA transfeksiyonu, uzun süreli kültür ve indüklenen proliferasyonun downstream analizi için düzenli olarak kullanılan protokollerde en az değişiklikle bir protokol oluşturduk.

Yetişkin CM izolasyonu için mevcut protokoller iki iyi bilinen enzimlerin kullanımına dayanmaktadır, kollajenaz ve liberaz, ekstrasellüler matris için (ECM) sindirim18,19. Kollajenaz, erişkin CM izolasyon protokollerinde yaygın olarak kullanılan bir enzimdir. Kollajenaz ECM kollajen lifleri sindirir, hangi tek hücreli CM kalp dokusunun dissociation sonuçlanır. Benzer şekilde, liberaz ECM sindirir. Liberaz kollajenaz için saflaştırılmış bir alternatiftir, hangi yüksek aktivite gösterir ve böylece kollajenaz ile karşılaştırıldığında başarılı izolasyon elde etmek için CM izolasyon sırasında daha yüksek hassasiyet gerektirir. Ayrıca, prosedürde, biz CM liberaz ile izole uzun vadeli kültürde hayatta olmadığını fark ettim. Ancak, CM kollajenaz ile izole kültür koşullarında CM uzun ömürlü artırır.

Ayrıca, biz yetişkin fare CM20,,21uzun vadeli kültür için kültür medyada blebbistatin denilen belirli bir miyozin II inhibitörü kullanılır. Daha önce, 2,3-butanedione monoksimine (BDM) yetişkin CM kültürü için kullanılmıştır. BDM, ATPaz ve bozulmuş Ca++ geçiş22inhibisyonu içeren kötü tanımlanmış bir mekanizma ile kontraktil fonksiyonu inhibe eden bir ATPe inhibitörüdür. BDM ile karşılaştırıldığında, blebbistatin miyozin II'nin spesifik bir inhibitörüdür ve BDM'den daha düşük konsantrasyonlarda kontraktil fonksiyonun daha önemli inhibisyonu gösterir. Bir kültür medyasında yetişkin fare CM ön kaplama, BDM 10 mM ve 25 μM blebbistatin takviyeli ve düşük serum ortamda CM sonraki kültürleri ile takviye uzun vadeli kültürde CM hayatta kalma ve çubuk şekli yapısını artırır. Ancak, medyada yetişkin fare CM doğrudan kaplama, 25 μM blebbistatin ve% 10 FBS ile desteklenen proliferatif çalışmalar için daha iyidir. In vitro kültürde büyük ölçüde de-farklılaşma gösteren yetişkin sıçan CM'ye benzer şekilde, yetişkin fare CM'de debir dereceye kadar de-farklılaşma gözlemledik(Şekil 5). Morfolojik değişiklikler çoğalması için gerekli adımdır. Bu nedenle, yetişkin CM'ye farklılaşmalarını kolaylaştıran bir ortam sağlamak bu tür çalışmalarda göz önünde bulundurulması gereken kritik bir faktördür. Şu anda, bu protokolde kullanılan tam adımlardan veya bileşenlerden hangisinin yetişkin CM'lerin gelişmiş uzun ömürlülüksorumlu olduğu açık olmasa da, biz kullanılan reaktifler bir kombinasyon etkisi olduğuna inanıyoruz, izolasyon prosedürü yapılan değişiklikler, ve belki de en önemlisi eğitimli eller.

Blebbistatin destekli medyada erişkin CM'nin viral transdüksiyonuna benzer şekilde, bu hücrelerin siRNA'larla etkili bir transfeksiyonu gözlendirildi. Cm proliferasyonlarını indüklemek için rb1 ve Meis2olmak üzere iki senescence ilişkili gene karşı spesifik siRNA'lar kullandık. Sıçan CM için transfeksiyon dan sonra yedinci gün proliferasyonu değerlendirmek için KI67 analizini yaptık; ancak, fare yetişkin CM proliferasyon transfeksiyon sonra gün on analiz edildi. Türe özgü biyolojik değişkenlik, yetişkin sıçan ve fare CM'nin indüklenen hücre döngüsündeki yeniden girişinde gözlenen zaman farkının olası bir nedeni olabilir.

Genel olarak, burada açıklanan protokol yetişkin sıçan ve fare CM izole etmek için geliştirilmiş, güvenilir ve karşılaştırmalı bir prosedür sağlar ve buna göre kültür deneysel ihtiyaca göre. Ayrıca, bu protokol, in vitro sistemi sağlayan yetişkin CM'nin uzun vadeli bir kültürüne olanak sağlar ve bu kültürde proliferasyon, parakrin faktör, stres tepkisi gibi çeşitli uzun vadeli analizler gerçekleştirilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Bu çalışma, Cincinnati Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nden Dr. Onur Kanisicak'a; Dr. Onur Kanisicak'a Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01HL148598) hibe. Dr. Onur Kanisicak, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110117) tarafından desteklenmiştir. Dr. Perwez Alam, Amerikan Kalp Birliği doktora sonrası hibe (AHA_20POST35200267) tarafından desteklenir. Dr Malina J. Ivey bir NIH T32 hibe (HL 125204-06A1) tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butane Dione monoxime Sigma-Aldrich B-0753
Blebbistatin APExBIO B1387
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059
CaCl2 Sigma-Aldrich 449709
Cell culture plate Corning Costar 3526
Cell strainer BD Biosciences 352360
Cel-miR-67 Dharmacon CN-001000-01-50
Collagenase type2 Worthington LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes Sigma-Aldrich Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium Thermo Scientific SH30022.01
EdU Life Technologies C10337
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps Fisherbrand 22-327379
Glucose Sigma-Aldrich G-5400
Hemocytometer Hausser Scientific 1483
Heparin Sagent Pharmaceuticals PSLAB-018285-02
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-128
Hyaluronidase Sigma H3506
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P-8281
KCl Sigma-Aldrich 746436
Light Microscope Nikon
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778-150
MgSO4 Sigma-Aldrich M-2643
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Fisher Scientific S318-500
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-CI
Pentobarbital Henry Schein 24352
Phosphate buffered saline Life Technologies 20012-027
Protease XIV Sigma-Aldrich P5147-1G
Selenium Sigma-Aldrich 229865+5G
siMeis2 Dharmacon s161030
siRb1 Dharmacon s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors Fisher Scientific 28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps Fisherbrand 16-100-120
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Transferrin Sigma-Aldrich T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor Fisherbrand 22-079-747
Water Bath Fisher Scientific 3006S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
  2. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
  3. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
  4. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  5. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
  6. Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
  7. Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
  8. Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
  9. Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
  10. Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
  11. Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
  12. Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
  13. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
  14. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
  15. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
  16. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
  17. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
  18. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
  19. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
  20. Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
  21. Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
  22. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).

Tags

Biyoloji Sayı 164 Kardiyomiyosit Sıçan Fare Ex-vivo Uzun vadeli kültür Transfeksiyon Proliferasyon
İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M.More

Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (164), e61073, doi:10.3791/61073 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter