Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.
Abstract
Die Ex-vivo-Kultur der adulten Säugetierkardiomyozyten (CMs) stellt das relevanteste experimentelle System für die In-vitro-Studie der Herzbiologie dar. Adult mammalian CMs sind endlos differenzierte Zellen mit minimaler proliferativer Kapazität. Der post-mitotische Zustand von CMs für Erwachsene schränkt nicht nur die Progression des Kardiomyozytenzellzyklus ein, sondern auch die effiziente Kultur von CMs. Darüber hinaus ist die langfristige Kultur von CMs für Erwachsene für viele Studien notwendig, wie z. B. cm-Proliferation und Analyse der Genexpression.
Die Maus und die Ratte sind die beiden am häufigsten bevorzugten Labortiere, die für die Kardiomyozytenisolation verwendet werden. Während die langfristige Kultur der Ratten-CMs möglich ist, sind erwachsene Maus-CMs todesanfällig und dürfen unter normalen Bedingungen nicht länger als fünf Tage kultiviert werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Zellisolation und das Langzeitkulturprotokoll für erwachsene murine CMs zu optimieren. Mit diesem modifizierten Protokoll ist es möglich, sowohl adulte Maus- als auch Ratten-CMs für mehr als 20 Tage erfolgreich zu isolieren und zu kultiieren. Darüber hinaus ist die siRNA-Transfektionseffizienz isolierter CM im Vergleich zu früheren Berichten deutlich erhöht. Für die CM-Isolierung der Erwachsenenmaus wird die Langendorff-Perfusionsmethode mit einer optimalen Enzymlösung und ausreichend Zeit für eine vollständige extrazelluläre Matrixdissoziation genutzt. Um reine ventrikuläre CMs zu erhalten, wurden beide Vorhöfe seziert und verworfen, bevor die Disassoziation und Beschichtung fortgesetzt wurden. Die Zellen wurden auf einer lamininbeschichteten Platte verteilt, was eine effiziente und schnelle Befestigung ermöglichte. CMs durften sich mit 4-6 h vor der siRNA-Transfektion begnügen. Kulturmedien wurden alle 24 Stunden für 20 Tage aufgefrischt, und anschließend wurden CMs für herzspezifische Marker wie Troponin und Marker des Zellzyklus wie KI67 fixiert und befleckt.
Introduction
Herzkrankheiten sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Fast alle Arten von Herzverletzungen führen zu einem signifikanten Verlust von erwachsenen Kardiomyozyten (CMs). Erwachsene Säugetierherzen sind nicht in der Lage, ihre Herzverletzung aufgrund der seneszenten Natur des erwachsenen CM1zu reparieren. So führt jede Beleidigung des erwachsenen Säugetierherzens zu einem dauerhaften Verlust von CMs, was zu einer verminderten Herzfunktion und Herzinsuffizienz führt. Im Gegensatz zu erwachsenen Säugetieren können kleine Tiere wie Zebrafische und Newtika ihre Herzverletzungen durch bestehende CM-Proliferation2,3,4regenerieren. Weltweit wird derzeit versucht, eine neuartige therapeutische Intervention bei Herzverletzungen sowohl durch proliferative als auch durch nicht-proliferative Ansätze zu finden. In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Arten von genetischen Mausmodellen entwickelt, um Herzverletzungen und Reparaturen zu untersuchen. Die Verwendung von In-vivo-Tiermodellen ist jedoch nach wie vor ein teurer Ansatz mit der zusätzlichen Komplexität, um einen zellautonomen Mechanismus von Sekundäreffekten zu entschlüsseln. Außerdem sind In-vivo-Systeme eine Herausforderung, CM-spezifische Effekte einer pharmakologischen Intervention zu analysieren, die kardioprotektive Signalisierung aus dem CM induziert.
Darüber hinaus ist die langfristige Kultur der CMs für Erwachsene notwendig, um CM-Proliferationsanalysen durchzuführen. CM-Proliferationstests erfordern mindestens 4-5 Tage, damit Zellen in den Zellzyklus induziert werden und danach genaue Daten erhalten. Darüber hinaus sind Studien, die isolierte CMs für elektrophysiologische Studien, Arzneimittelscreening, Toxizitätsstudien und Ca++ Homöostasestudien nutzen, alle eines verbesserten Kultursystems5,6,7erforderlich. Darüber hinaus zeigen neuere Studien die kardioprotektive Bedeutung von Zytokinen, die von CMs (Kardiokinen)8,9abgesondert werden. Um die therapeutische Rolle und den molekularen Mechanismus dieser Kardiokine während der Herzreparatur und Regeneration zu untersuchen, ist eine längere Kultur erforderlich.
Erwachsene Ratten-CMs sind robust genug für einzellige Isolation und Langzeitkultur in einem In-vitro-System10,11,12. Erwachsene Maus-CMs sind jedoch von großem Interesse für In-vitro-Assays, da eine Vielzahl von genetisch veränderten Mausmodellen verfügbar ist, die die Entwicklung und Durchführung verschiedener innovativer Analysen ermöglichen, die mit Ratte CM13nicht möglich sind. Im Gegensatz zur CM-Isolation von erwachsenen Ratten ist es eine ziemliche Herausforderung, eine einzellige Suspension von erwachsenen Mausherzen zu erhalten, und die langfristige Kultur der erwachsenen Maus-CMs in der Kultur ist noch schwieriger.
Adult CM Isolation von Maus- und Rattenherzen mit einem Langendorff-System wurde bereits eingerichtet, um CM-Funktion5,14,15zu studieren. Hier haben wir ausführlich die Protokolle für die CM-Isolierung von Erwachsenen von Ratten und Mäusen sowie eine modifizierte Langzeitkultur, Transfektion und CM-Proliferation isolierter Zellen beschrieben.
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Protocol
Alle Experimente sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt werden, der vom U.S. National Institute of Health (NIH) veröffentlicht wurde. Alle Protokolle, die im Video angezeigt werden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Cincinnati, College of Medicine, genehmigt.
1. Vorbereitung vor Derherzentnahme von erwachsenen Mäusen (und Ratten)
- Bereiten Sie die entsprechenden Perfusions-, Enzym- und Stop-Lösungen gemäß den Rezepturen in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2für die Ratten- bzw. Mausisolierung vor. Filtern Sie die Lösungen durch einen 0,22 m-Filter, um Verunreinigungen oder ungelöste Partikel zu entfernen.
- Reinigen und sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente, indem Sie sie 15 min in 70% Alkohol einweichen und anschließend mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Lassen Sie die Werkzeuge auf einem sauberen Papiertuch trocknen.
- Das Wasserbad auf 37 oC vorheizen. Überprüfen Sie den Wasserstand im Wasserbad, um eine unterbrechungsfreie Zirkulation von warmem Wasser durch das Perfusionsgerät während des Eingriffs zu gewährleisten.
- Reinigen Sie das Perfusionsgerät, indem Sie mit 70% Alkohol für 5 min laufen. Wiederholen.
HINWEIS: Erhöhen Sie den Durchfluss, der hilft, die Schläuche zu reinigen. - Nach dem Alkoholdurchfluss reinigen Sie die Alkoholreste, indem Sie 10 min doppelt destilliertes Wasser laufen lassen.
- Richten Sie 3 mittelgroße Einweg-Polystyrol-Wägeschalen ein, um das Herz nach der Exzision zu reinigen. Füllen Sie die Gerichte mit 20 ml Myozytenpuffer.
- Fügen Sie 2-3 Tropfen Heparin zu jedem Gericht mit Hilfe von Pasteur Pipette und mischen Sie gut durch Pipettieren mehrere Male.
- Nehmen Sie eine 10 ml Spritze mit einer stumpfen Nadelkanüle ein.
HINWEIS: Eine stumpfe Nadelkanüle kann durch Schneiden der Spitze einer sauberen, sterilen Nadel hergestellt werden. Zur Herstellung der Kanüle für die Maus bzw. die Ratte wurden eine 21 G Nadel und eine 14 G Nadel verwendet. - Füllen Sie die Spritze mit Perfusionspuffer (Tabelle 1). Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze und legen Sie sie in der dritten Schale an einer abgewinkelten Position. Sichern Sie es mit Klebeband.
HINWEIS: Für Ratten wurde Anstelle des Myozytenperfusionspuffers Lösung A (Tabelle 2) verwendet. - Bereiten Sie einen lockeren Knoten mit einer chirurgischen Naht vor und legen Sie ihn um die Nadel.
- Injizieren Sie die Maus mit Heparin (100 USP-Einheiten/Maus) durch intraperitoneale Injektion, 20 min vor der Anästhesie-Injektion.
- Zirkulieren Sie den Myozytenperfusionspuffer (Tabelle 1) durch das Perfusionsgerät. Verringern Sie den Durchfluss auf 3 ml/min.
HINWEIS: Für Ratten wurde Anstelle des Myozytenperfusionspuffers Lösung A (Tabelle 2) verwendet. - Ersetzen Sie nach 5 min den Perfusionspuffer durch die Enzymlösung (Tabelle 1). Sättigen Sie die Enzymlösung während des Prozesses mit Sauerstoff. Verwenden Sie eine Durchflussmenge von 3 ml/min.
HINWEIS: Verwenden Sie für die Isolierung von Ratten-CM stattdessen Lösung E (Tabelle 2). - Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Anästhesie. Verwenden Sie die von der IACUC empfohlene dosis Anästhesie für die Terminalchirurgie.
- Bestätigen Sie ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Antwort auf eine Zehenklemme. Legen Sie dann die Maus auf die chirurgische Plattform.
2. Entnahme des Herzens von erwachsenen Mäusen (und Ratten)
- Sterilisieren Sie die Haut durch Wischen mit 70% Alkohol.
- Öffnen Sie vorsichtig die Brust.
- Verbrauchen Sie das Herz. Vermeiden Sie nicht-herzige Gewebe während der Exzision.
- Legen Sie das Herz auf die erste Schale, gefüllt mit Perfusionspuffer (Tabelle 1).
HINWEIS: Verwenden Sie Lösung A für die Ratte (Tabelle 2). - Reinigen Sie das Blut aus dem Herzen, indem Sie sanft quetschen.
- Übertragen Sie das Herz auf das zweite Gericht.
- Reinigen Sie das Blut aus dem Herzen und entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe. Anschließend das Herz auf das dritte Gericht übertragen.
- Schneiden Sie Die Lunge und das andere umgebende Gewebe ab und können Sie über die aufsteigende Aorta keimen. Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden (<5 min), um die QUALITÄT und Quantität von CM zu verbessern.
3. Verdauung des Herzens
- Verdauung des Mausherzes
HINWEIS: Alle Lösungen/Puffer, die durch das Mausherz zirkulieren, sollten während des gesamten Verfahrens mit Sauerstoff versorgt werden.- Entfernen Sie die Kanulationsnadel vorsichtig aus der Spritze und schließen Sie sie an das Langendorff-Perfusionsgerät an.
- Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz gelangen, was den Durchfluss der Enzymlösung und der Verdauung beeinflussen kann.
- Bewegen Sie die Wasserjacke nach oben, um dem Herzen eine homogene Umgebung zu bieten. Lassen Sie die Enzymlösung mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml/min durch das Herz fließen.
HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Übergabelösung ist entscheidend und hat erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der CM-Menge und -Qualität. - Lassen Sie die Enzymlösung 2 min durch das Herz fließen.
- In 2 min fügen Sie der Enzymlösung 40 L von 100 M CaCl2-Lösung hinzu und mischen. Lassen Sie die Enzymlösung für weitere 10-15 min durch das Herz passieren.
HINWEIS: Sobald der Fluss glatt wird, wird das Herz bräunlich und weich, was auf die gleichmäßige Verteilung des Kollagenase-Enzyms und die richtige Verdauung des Herzens hinweist.
- Verdauung des Rattenherzens
HINWEIS: Alle Lösungen/Puffer, die durch das Rattenherz zirkulieren, sollten während des gesamten Verfahrens mit Sauerstoff versorgt werden.- Entfernen Sie die Kanulationsnadel vorsichtig aus der Spritze und schließen Sie sie an das Langendorff-Perfusionsgerät an.
- Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz gelangen, was den Durchfluss der Enzymlösung und der Verdauung beeinflussen kann.
- Bewegen Sie die Wasserjacke nach oben, um dem Herzen eine homogene Umgebung zu bieten.
- Starten Sie den Fluss der Lösung A mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml/min für 3-5 min, um Blut aus dem Herzen zu entfernen.
HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Übergabelösung ist entscheidend und hat erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der CM-Qualität. - Sobald das Blut aus dem Herzen entfernt ist, wechseln Sie von Lösung A zu Lösung E (Tabelle 2). Titratlösung E mit CaCl2, wie unten angegeben, für eine Endkonzentration von 0,1 mM in Lösung:
- Nach 10 min Perfusion 12,5 l von 0,1 M CaCl2hinzufügen.
- Nach 15 min Perfusion 25 l von 0,1 M CaCl2hinzufügen.
- Lassen Sie die Enzymlösung für weitere 30-40 min durch das Herz gehen, bis der Fluss schnell wird und das Herz biegsam ist.
4. Herstellung der cm einzelligen Suspension
- Vorbereitung der CM-Einzelzellsuspension (Maus)
- Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie es auf eine 60 mm Petrischale, gefüllt mit 5 ml Enzymlösung und übertragen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube.
HINWEIS: Stellen Sie eine ausreichende Herzverdauung sicher, bevor Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem entfernen. Die Verdauungszeit hängt von der Enzymaktivität, dem Lösungsfluss und der Größe des Herzens ab. - Führen Sie eine weitere mechanische Disaggregation in einer Biosicherheitshaube durch, um Sterilität zu gewährleisten und Kontaminationen zu vermeiden.
- Entfernen Sie vorsichtig die Vorhöfe (1/4des Basalherzteils) und zusätzliches Fettgewebe.
- Das Herz mit Dereinzange in feine Stücke zerkleinern.
- Nehmen Sie eine sterile Pasteur Pipette und schneiden Sie ihre Spitze in einem 45o Winkel.
- Verwenden Sie diese Pasteur Pipette, um das Herzgewebe in einer einzelzelligen Suspension durch sanftePipettierung zu verteilen. Die optimale Verdauung sorgt für eine Suspension von einzelligen Kardiomyozyten.
HINWEIS: Entfernen Sie den schmalen unteren Teil der Transferpipette, um CM-Schäden durch mechanische Senklagerung zu reduzieren. - Fügen Sie dann 5 ml Stop-Lösung hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen, was die Möglichkeit einer Überverdauung vermeidet.
- Nehmen Sie eine frische 50 ml konische und legen Sie ein steriles 100 m Zellsieb darauf.
- Passieren Sie die Kardiomyozytensuspension durch das Zellsieb, um den Gewebebrocken zu entfernen. Waschen Sie die Petrischale und das Sieb mit weiteren 5 ml Stop-Lösung (Tabelle 1), um alle Kardiomyozyten zu sammeln, die am Sieb befestigt bleiben.
- Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie es auf eine 60 mm Petrischale, gefüllt mit 5 ml Enzymlösung und übertragen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube.
- Vorbereitung der CM einzelligen Suspension (Ratte)
- Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie das Herz auf eine 100 mm Petrischale gefüllt mit 5 ml Lösung A und bewegen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube.
HINWEIS: Stellen Sie eine ausreichende Herzverdauung sicher, bevor Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem entfernen. Die Verdauungszeit hängt von der Enzymaktivität, dem Lösungsfluss und der Größe des Herzens ab. - Führen Sie eine weitere mechanische Disaggregation in einer Biosicherheitshaube durch, um Sterilität zu gewährleisten und Kontaminationen zu vermeiden.
- Entfernen Sie vorsichtig die Vorhöfe (1/4 des Basalherzteils) und zusätzliches Fettgewebe.
- Das Herz mit Dereinzange in feine Stücke zerkleinern.
- Nehmen Sie eine sterile Pasteur Pipette und schneiden Sie ihre Spitze in einem 45o Winkel.
- Verwenden Sie diese Pasteur Pipette, um das Herzgewebe in einzelliger Suspension durch sanftePipettierung zu verteilen. Die optimale Verdauung sorgt für eine Suspension von einzelligen Kardiomyozyten.
HINWEIS: Entfernen Sie den schmalen unteren Teil der Transferpipette, um CM-Schäden durch mechanische Senklagerung zu reduzieren. - Fügen Sie der CM-Suspension 5 ml lösungB (Tabelle 2) hinzu und übergeben Sie die Lösung durch ein 100-m-Zellsieb, um alle verbleibenden Fett- oder anderen nicht verdauten Gewebe zu entfernen.
- Filtrat in einer frischen 50 ml konischen Durchstechflasche sammeln.
- Verwenden Sie weitere 5 ml Lösung B, um die Petrischale und alle verbleibenden CM durch das Zellsieb zu waschen.
- Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie das Herz auf eine 100 mm Petrischale gefüllt mit 5 ml Lösung A und bewegen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube.
5. Entfernung von Nicht-CMs
- Entfernung von Nicht-CMs aus der erwachsenen einzelzelligen Suspension (Maus)
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 20 x g für 3 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 ml Stop-Lösung wieder aus (Tabelle 1).
ANMERKUNG: Eine Erhöhung der BSA-Konzentration in der Stop-Lösung wird ihre Viskosität erhöhen und die Sedimentationsrate von Nicht-CMs reduzieren. - Setzen Sie die CMs durch sanfte Umkehrung des Rohres 3-5 mal aus.
- In 3 min Intervallen 10 l von 100 'M CaCl2 Lösung hinzufügen und mischen. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Zentrifugieren Sie nach der vierten Zugabe die Kardiomyozytensuspension bei 20 x g für 3 min.
- Entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspend CMs in vorgewärmt (37 oC), Erwachsenenmaus CM-Beschichtungsmedien (Tabelle 3).
- Entfernung von Nicht-CMs aus den erwachsenen einzelzelligen Suspensionen (Ratte)
- Pelletzellen bei 20 x g für 3 min bei 25 oC.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 25 ml der Lösung B (Tabelle 2) aus.
- Mischen Sie die Zellen durch sanfte Umkehrung und legen Sie sie in einen Rohrständer, damit sich der CM unter der Schwerkraft absetzen kann.
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
- Setzen Sie die Zellen in frischen 25 ml der Lösung B wieder ab und titrate sie auf 1,0 mM CaCl2 durch schrittweise Zugabe von 50 l, 75 l und 100 l von 0,1 M CaCl2 in 3-5 min Intervallen.
HINWEIS: In diesem Schritt könnte eine höhere BSA-Konzentration in Lösung B verwendet werden. Die Erhöhung der BSA-Konzentration in Lösung B erhöht die Viskosität und reduziert damit die Sedimentationsrate von Nicht-CMs. - Pelletzellen bei 20 x g für 3 min bei 25 oC, aspirieren den Überstand, und fügen Sie das gewünschte Volumen der erwachsenen Rattenzellkultur Medien (Tabelle 4).
- Samen-CMs auf einer lamininbeschichteten Platte.
HINWEIS: Die Vorbeschichtung von CMs auf einer nicht beschichteten Kulturplatte kann verwendet werden, um die Kontamination von Nicht-CM-Zellen zu minimieren.
6. Adult CM Beschichtung
- Vorbeschichtung
- Setzen Sie die Kardiomyozyten in Kulturmedien aus.
- Die Zellen in eine 60 mm bzw. 100 mm Schale für Maus- bzw. Ratten-CM vorkleben.
- Inkubieren Sie CMs für 2 h in einem Inkubator, ergänzt mit 5%CO2 bei 37 oC.
- Während der Vorplatteninkubation die Zellkulturplatten mit Laminin (10 g/ml in PBS) für eine langfristige CM-Kultur beschichten.
- Nach 2 h Vorbeschichtung cMs in einer 50 ml konischen Durchstechflasche sammeln.
- Sammeln Sie die Zellen aus der Schale und verkleben Sie sie in eine laminbeschichtete 24-Well-Kulturplatte für Transfektionsexperimente.
- Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 oC, ergänzt um 5% mitCO2. 4-6 Stunden sind ausreichend, um die Kardiomyozyten mit der Oberfläche zu haften, und somit kann die Transfektion 6 Stunden nach der Beschichtung durchgeführt werden.
HINWEIS: Das Beschichtungsmedium, das FBS enthält, wird häufig verwendet und zeigt eine bessere Kompatibilität mit Proliferationsstudien. Ein serumfreies Medium kann jedoch für Experimente verwendet werden, bei denen sekretore Faktoren analysiert werden.
7. Transfektion
- Inkubieren Sie die CMs 4-6 Stunden lang auf die mit Laminin beschichteten Zellkulturplatten.
- Vier Stunden nach der CM-Aussaat auf der lamininbeschichteten Platte transfekieren Zellen mit siRNAs (50 nM) mit einem Transfektionsreagenz (z.B. Lipofectamin RNAiMAX) nach dem Herstellerprotokoll.
- Wechseln Sie die Medien 24 Stunden nach der Transfektion und alle 24 Stunden danach für bis zu 20 Tage.
- Nach 20 Tagen, fix zellen mit 4% PFA in PBS für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie für herzspezifische Marker wie Troponin, um sicherzustellen, dass lebende Kardiomyozyten erfolgreich langfristig kultiviert wurden.
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Representative Results
Das aktuelle modifizierte Protokoll ermöglicht eine effiziente Isolierung und Kultur von Ratten- und Mäuse-CMs in vitro. Zur Isolierung der Ratte CM wurden insgesamt 3 erwachsene (12 Wochen alte) männliche Fischer 344 Ratten in das Verfahren eingebracht. Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Apparate und Isolationseinrichtungen, die im Verfahren erforderlich sind; jedes Teil wurde in der Abbildungslegende markiert und beschrieben. Kollagenase Typ 2 wurde für die Verdauung verwendet, was eine hohe Menge an hochwertigen CMs aus erfolgreicher Isolation ergibt (Abbildung 2A). Vierundzwanzig Stunden nach der Isolation wurden diese Zellen mit Zellzyklus transfiziert, der spezifische siRNAs gegen Rb1 und Meis2induzieren, während cel-miR-67 als Transfektionskontrolle im Experiment11verwendet wurde. CMs wurden entweder sieben Tage lang(Abbildung 2B) oder bis zu zwanzig Tage lang(Abbildung 2C) in kulturgemäß gepflegt, um die morphologischen Veränderungen zu beobachten. Um die Zellzyklusaktivität zu bewerten, wurden CMs an Tag 7 fixiert und für den herzspezifischen Marker Troponin-I, den mitotischen Marker KI67 und den Kern durch DAPI visualisiert (Abbildung 2D-F). Bei der Behandlung mit siRb1+siMeis2 wurde ein signifikanter Anstieg der KI67-positiven Kardiomyozyten im Vergleich zu Kontrolle11beobachtet. Darüber hinaus schlugen die Rattenkardiomyozyten in der Kultur am siebten Tag nach der Plattierung, was ein Kennzeichen für gesunde Kardiomyozytenist 11.
Für die CM-Isolierung bei Mäusen wurden insgesamt 3 männliche und 3 weibliche Erwachsene (12 Wochen alt) C57BL/6-Mäuse verwendet. Ähnlich wie bei der Rattenstudie wurde Kollagenase Typ 2 verwendet, um das Kollagen und die extrazelluläre Matrix des erwachsenen Mäuseherzens zu verdauen. Adult mice CM ist vergleichsweise zerbrechlich für Isolation und Kultur in vitro; Daher verwendet dieses Protokoll Blebbistatin, um die Lebensfähigkeit der erwachsenen Maus CM zu verbessern. Erfolgreiche Isolation ergibt >70-80% gesunde Stabform CMs, die für bis zu 20 Tage kultiviert werden können (Abbildung 3A-C) und ihre kardiale Troponin-I Färbung und Kontraktilität zu erhalten (Abbildung 3C). In separaten Experimenten, vier Stunden nach der Isolierung, wurden Maus-CMs mit einem Zellzyklus transfiziert, der siRNA-Cocktail induzieren, wie für den Ratten-CM beschrieben. Kurz gesagt, Mäuse CM wurde gleichzeitig mit den spezifischen siRNAs gegen Rb1 und Meis2transfiziert, und Kontrolle (cel-miR-67). CMs nach der Transfektion wurden 10 Tage lang einer Zeitverlaufsbildgebung unterzogen, die die morphologischen Veränderungen (Abbildung 4) zeigt, gefolgt von einem Proliferationstest (Abbildung 5). Am 10. Tag wurde die immunfluoreszierende Färbung von Troponin-I, KI67 und DAPI wie zuvor beschrieben durchgeführt. Bei der Behandlung mit siRb1+siMeis2 wurde ein signifikanter Anstieg der KI67-positiven Kardiomyozyten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet (Abbildung 5A-C).
Das vorliegende Protokoll zeigt, dass erwachsene Ratten und Mäuse CMs langfristig in vitro für bis zu 20 Tage und potenziell länger kultiviert werden können. Nach 20 Tagen, CMs halten ihre Troponin-I Färbung sowie Kontraktilität, wenn die Inhibitoren aus den Medien entfernt werden.
| Myozytenpufferzusammensetzung, pH 7,4 (Vorbereiten und bei 4 °C lagern) | |||
| Reagenz | Konzentration, mM | Molekulare Gew. | Für 1 Liter |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| Kcl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| Perfusionspuffer, pH 7,4 (Für jede Isolierung frisch vorbereiten) | |||
| Konzentration, mM | Molekulare Gew. | Erforderlicher Betrag | |
| Myozytenpuffer | 250 ml | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| 2,3-Butanion-Monomin | 10 | 101.105 | 252.775 mg |
| NaHCO3 Frisch | 1.6 | 84.007 | 33.6028 mg |
| Taurin Fresh | 30 | 125.15 | 938.625 mg |
| Glucose Fresh | 20 | 180.156 | 900.775 mg |
| Enzymlösung | |||
| Lager Conc. | Arbeits-Conc. | Erforderlich | |
| Myozytenpuffer | 50 ml | 50 ml | |
| Kollagenase Typ 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mg |
| Protease XIV | >3,5 U/mg | 0,104 U/ml | 1,48 mg |
| DNase I Klasse 2 | 0,015 mg/ml | ||
| Stop-Puffer A | |||
| Lager Conc. | Arbeits-Conc. | Erforderlich | |
| Myozytenpuffer | 30 ml | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 l |
| Stop-Puffer B | |||
| Lager Conc. | Arbeits-Conc. | Erforderlich | |
| Myozytenpuffer | 30 ml | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 l |
Tabelle 1: Lösungen für die Kardiomyozytenisolation von Erwachsenen.
| 10x KHB Lagerlösung (Gesamtvolumen = 1L) |
Reagenz | Mollichkeit (mM) | Betrag (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| Kcl | 48 | 3,5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| pH auf 7,4 bei 4 M NaOH (ca. 20 ml) einstellen, bei 4 °C lagern | |||
| KHB-Lösung, 500 ml | Reagenz | Menge | |
| 10x KHB | 50 ml | ||
| Glukose | 0,99 g | ||
| Taurin | 0,31 g | ||
| Fügen Sie H2O hinzu, um das Volumen auf 500 ml zu erhöhen, und der pH-Wert sollte 7,35 USD betragen. | |||
| Lösung A | Reagenz | Menge | |
| KHB-Lösung | 500 mL (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Sauerstoffat mit 100%O2 und warm bis 37 °C | |||
| Lösung B, 50 ml | Reagenz | Menge | |
| Lösung A | 50 ml | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 l | ||
| Lösung E, 50mL | Reagenz | Menge | |
| Lösung A | 50 ml | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Kollagenase Typ II (263 Einheiten/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Typ I-S) | 10 mg | ||
| 0.1 M CaCl2 Lagerbestand | 12,5 l | ||
| Gut mischen | |||
| CaCl2 Aktie, 0,1 Mio. | Reagenz | Menge | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 ml | ||
| Bei 4 °C lagern | |||
Tabelle 2: Lösungen für die Kardiomyozytenisolation von Erwachsenenratten.
| Beschichtungsmedienzusammensetzung, pH 7,4 | |||
| Arbeitskonzentration | Molekulare Wt. | Erforderlicher Betrag | |
| Kulturmedien ohne Blebbistatin | 50 ml | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| Fbs | 5% | 2,5 g | |
| Kulturmedienkomposition, pH 7,4 | |||
| Reagenz | Arbeitskonzentration | Molekulare Wt. | Erforderlicher Betrag |
| DMEM | 1X | 250 ml | |
| Insulin | 1 g/ml | 0,25 mg | |
| Transferrin | 0,55 g/ml | 0,138 mg | |
| Selen | 0,5 ng/ml | 0,125 g | |
| Penicillin (U/mL)-Streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595.753 mg |
| *FBS | 10% | 25 ml | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 m | 292.338 g/mol | 1.8271 mg |
| *Verwenden Sie eine von ihnen, gemäß der experimentellen Anforderung. Aliquot die Kulturmedien, um Platting-Medien vorzubereiten, bevor Blebbistatin hinzugefügt wird. HINWEIS: Bereiten Sie 200 ml Kulturmedien vor. HINWEIS: Bereiten Sie 50 ml Beschichtungsmedien vor. |
|||
Tabelle 3: Medienzusammensetzung für Erwachsene Maus Cardiomyozyten-Beschichtung und Kultur.
| Kulturmedienkomposition, pH 7,4 | ||
| Reagenz | Arbeitskonzentration | Erforderlicher Betrag |
| DMEM | 1x | 250 ml |
| Penicillin (U/mL)-Streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml |
| *FBS | 10% | 25 ml |
Tabelle 4: Medienzusammensetzung für erwachsene Rattenkardiomyozytenbeschichtung und Kultur.
Abbildung 1: Einrichtung und Ausstattung der Prozedur. (I) Schematische Darstellung der Perfusion. (II) Chirurgische Instrumente und Kanulationsnadel. (III) Herzperfusionsbaugruppe: A) Heizmantel. B) Doppelwand Wasserjacke Gefäß. C) Zirkulierender beheizter Wassereinlass. D) Zirkulierender beheizter Wasseraustritt. E) Herzperfusionslösung. F) Umwälzpumpe G) PerfusionslösungRohr. H) Sauerstoffversorgungsrohr. I) Zirkulierendes Wasserbad. J) Cannulationsnadel mit Herz, am Perfusionsauslassanschluss befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Cm-Isolation, Transfektion und Langzeitkultur für Erwachsene Ratten. A) Erwachsene Ratte CM, sofort nach der Isolierung. B) Erwachsene Ratte CM an Tag 7 nach Isolation. C) Erwachsene Ratte CM am 20. Tag. D-F) KI67 positive Ratte CM am Tag 7 nach siRb1+siMeis2 Transfektion. Troponin-I = grün; DAPI = blau; KI67 = rot. Alle Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt und mindestens dreimal wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erwachsenenmaus CM-Isolation und Langzeitkultur. A) Erwachsene Mäuse CM, unmittelbar nach der Isolierung. B) Erwachsene Mäuse CM an Tag 7 nach Isolation. C) Erwachsene Mäuse CM mit Herz Troponin-I = grün am Tag 20 gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Cm-Dedifferenzierung der Erwachsenenmaus. Adult mice CM zeigt morphologische Veränderungen während der Langzeitkultur (Tag 0 bis Tag 10) in DMEM-HG Medien, ergänzt mit 10%FBS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Cm-Transfektion und Proliferation der Erwachsenenmaus. A-C) KI67 positive Maus CM am Tag 10 nach siRb1+siMeis2 Transfektion. Troponin-I = grün; DAPI = blau; KI67 = rot. D) Bargraph zeigt einen signifikanten Anstieg der KI67-positiven Maus-CMs für Erwachsene in der siRNA-cocktail transfizierten Gruppe im Vergleich zur Kontrolle. Die Ergebnisse werden als mittelwert±SEM; * = p-Wert ≤0,05. p-Wert ≤0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung (n=3 männlich,3 weiblich) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Es ist von entscheidender Bedeutung, ein Protokoll für die Isolierung der Kardiomyozyten und die langfristige Kultur für die Durchführung zellspezifischer mechanistischer Studien zu erstellen. Es gibt nur wenige Berichte über Erwachsene CM Isolation Protokolle, und noch weniger von ihnen werden für die langfristige Kultur von erwachsenen Mäusen CM15,16,17verwendet. Es wird gezeigt, dass die erwachsene Ratte CM eine höhere Toleranz gegenüber In-vitro-Kultur als die erwachsenen Mäuse CM10,11,12hat. In diesem Bericht erstellen wir ein Protokoll für erwachsene Ratten- und Mäuse-CM-Isolierung, siRNA-Transfektion, Langzeitkultur und nachgelagerte Analyse der induzierten Proliferation mit minimalen Änderungen in den regelmäßig verwendeten Protokollen.
Verfügbare Protokolle für die CM-Isolierung für Erwachsene basieren auf der Verwendung von zwei bekannten Enzymen, Kollagenase und Liberase, für die extrazelluläre Matrix (ECM) Verdauung18,19. Kollagenase ist ein häufig verwendetes Enzym in den Erwachsenen-CM-Isolationsprotokollen. Kollagennase verdaut die Kollagenfasern im ECM, was zur Dissoziation des Herzgewebes im einzelzelligen CM führt. In ähnlicher Weise verdaut liberase das ECM. Liberase ist die gereinigte Alternative für Kollagenase, die eine höhere Aktivität zeigt und daher eine höhere Präzision während der CM-Isolation erfordert, um eine erfolgreiche Isolation im Vergleich zur Kollagenase zu erreichen. Darüber hinaus haben wir im Verfahren festgestellt, dass die cm isoliert mit Liberase nicht in der langfristigen Kultur überleben. Jedoch, CM isoliert mit Kollagenase verbessert die Langlebigkeit von CM in den Kulturbedingungen.
Zusätzlich verwendeten wir einen spezifischen Myosin-II-Hemmer namens Blebbistatin in den Kulturmedien für die Langzeitkultur der Erwachsenenmaus CM20,21. Zuvor, 2,3-Butandion-Monoximin (BDM) wurde für die Erwachsenen-CM-Kultur verwendet. BDM ist ein ATPase-Hemmer, der die kontraktile Funktion durch einen schlecht definierten Mechanismus hemmt, der die Hemmung von ATPase und einen beeinträchtigten Ca++ Übergang22umfasst. Im Vergleich zum BDM ist Blebbistatin ein spezifischer Myosin-II-Inhibitor und zeigt eine signifikantere Hemmung der kontraktilen Funktion bei niedrigeren Konzentrationen als das BDM. Eine Vorbeschichtung der Erwachsenenmaus CM in einem Kulturmedium, ergänzt durch 10 mM BDM und nachfolgende Kulturen des CM in den 25 -M Blebbistatin-ergänzten und niedrigen Serummedien verbessert die Überlebensfähigkeit und Stabformstruktur von CM in der Langzeitkultur. Eine direkte Beschichtung der Erwachsenenmaus CM in den Medien, ergänzt durch 25 M Blebbistatin und 10% FBS, ist jedoch besser für proliferative Studien. Ähnlich wie bei der erwachsenen Ratte CM, die ein hohes Maß an Dedifferenzierung in der In-vitro-Kultur zeigt, beobachteten wir auch eine De-Differenzierung in der erwachsenen Maus CM bis zu einem gewissen Grad (Abbildung 5). Morphologische Veränderungen sind der notwendige Schritt für die Proliferation. Daher ist die Bereitstellung eines Umfelds für erwachsene CM, das ihre Entdifferenzierung erleichtert, ein kritischer Faktor, der in solchen Studien berücksichtigt werden muss. Auch wenn zu diesem Zeitpunkt nicht klar ist, welche der genauen Schritte oder Komponenten, die in diesem Protokoll verwendet werden, für die verbesserte Langlebigkeit von Erwachsenen-CMs verantwortlich ist, glauben wir, dass es sich um eine Kombinationswirkung der verwendeten Reagenzien, der Änderungen im Isolationsverfahren und vielleicht vor allem der geschulten Hände handelt.
Ähnlich wie die vorherigen Berichte, die die virale Transduktion des erwachsenen CM in blebbistatin-ergänzten Medien zeigten, beobachteten wir auch eine effiziente Transfektion dieser Zellen mit siRNAs. Wir verwendeten spezifische siRNAs gegen zwei seneszenzassoziierte Gene, Rb1 und Meis2, um die CM-Proliferation zu induzieren. Für die Ratte CM führten wir EINE KI67-Analyse durch, um die Proliferation am siebten Tag nach der Transfektion zu bewerten; jedoch wurde die Proliferation bei Maus Erwachsenen CM am Tag zehn nach der Transfektion analysiert. Eine artspezifische biologische Variabilität könnte ein möglicher Grund für den beobachteten Zeitunterschied im induzierten Zellzyklus beim Wiedereintritt von erwachsenen Ratten- und Maus-CM sein.
Insgesamt bietet das hier beschriebene Protokoll ein verbessertes, zuverlässiges und vergleichendes Verfahren, um adulte Ratten- und Maus-CM zu isolieren und sie entsprechend nach experimentellem Bedarf zu kultiieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine langfristige Kultur des erwachsenen CM, die ein In-vitro-System zur Durchführung verschiedener Langzeitanalysen wie Proliferation, Parakrinfaktor, Stressreaktion usw. zur Verfügung stellt.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Universität Cincinnati, College of Medicine, an Dr. Onur Kanisicak unterstützt; ein Stipendium der National Institutes of Health (R01HL148598) an Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wird vom American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117) unterstützt. Dr. Perwez Alam wird von der American Heart Association Postdoktorandenstipendium (AHA_20POST35200267) unterstützt. Dr. Malina J. Ivey wird durch ein NIH T32-Stipendium (HL 125204-06A1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
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