Summary
Her præsenterer vi en protokol for isolation, transfektion, og langsigtet kultur af voksne mus og rotte kardiomyocytter.
Abstract
Ex vivo kultur af voksne pattedyr kardiomyocytes (CMs) præsenterer den mest relevante eksperimentelle system for in vitro undersøgelse af hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differentierede celler med minimal spredningskapacitet. Den post-mitotiske tilstand af voksne CMs ikke kun begrænser cardiomyocyte celle cyklus progression, men også begrænser den effektive kultur AF CMs. Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMs er nødvendig for mange undersøgelser, såsom CM spredning og analyse af genekspression.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyr, der skal anvendes til kardiomyocyt isolation. Mens den langsigtede kultur af rotte CMs er muligt, voksne mus CMs er modtagelige for døden og kan ikke dyrkes mere end fem dage under normale forhold. Derfor er der et kritisk behov for at optimere celleisolering og langsigtet kultur protokol for voksne murine CMs. Med denne ændrede protokol er det muligt at isolere og kultur både voksne mus og rotte-CM'er i mere end 20 dage. Desuden er siRNA transfektionseffektiviteten af isoleret CM steget betydeligt sammenlignet med tidligere rapporter. Til isolering af voksenmus CM anvendes Langendorff perfusionsmetoden med en optimal enzymopløsning og tilstrækkelig tid til fuldstændig ekstracellulær matrixdissociation. For at opnå rene ventrikulære CMs, både atria blev dissekeret og kasseret, før du fortsætter med disassociation og plating. Celler blev spredt på en laminin belagt plade, som gav mulighed for effektiv og hurtig fastgørelse. CMs fik lov til at nøjes med 4-6 timer før siRNA transfektion. Kulturmedier blev opdateret hver 24 timer i 20 dage, og efterfølgende blev CMs repareret og plettet for hjertespecifikke markører som Troponin og markører for cellecyklus som KI67.
Introduction
Hjertesygdomme er en af de førende dødsårsager på verdensplan. Næsten alle typer af hjerteskader resultere i et betydeligt tab af voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyr hjerter er ude af stand til at reparere deres hjerteskade på grund af senescent karakter af den voksne CM1. Således, enhver fornærmelse mod den voksne pattedyr hjerte resulterer i et permanent tab af CO'er, fører til nedsat hjertefunktion og hjertesvigt. I modsætning til voksne pattedyr, små dyr som zebrafisk og newt hjerter kan regenerere deres hjerteskade gennem eksisterende CM spredning2,3,4. En verdensomspændende indsats er i gang for at finde en ny terapeutisk intervention for hjerteskader via både proliferative og ikke-proliferative tilgange. I de seneste årtier, forskellige typer af genetiske musemodeller er blevet udviklet til at studere hjerteskader og reparation. Men ved hjælp af in vivo dyremodeller fortsætter med at være en dyr tilgang med den ekstra kompleksitet til at dechifrere en celle-autonome mekanisme fra sekundære virkninger. Udover, in vivo systemer er udfordrende at analysere CM specifikke virkninger af en farmakologisk intervention, der inducerer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMMs er nødvendig for at udføre CM spredning analyser. CM spredning assays kræver mindst 4-5 dage for celler, der skal induceres i celle cyklus og for at opnå nøjagtige data efter dette. Derudover, undersøgelser, der udnytter isolerede CMs for elektrofysiologiske undersøgelser, lægemiddelscreening, toksicitet undersøgelser, og Ca++ homøostase undersøgelser er alle behov for en forbedret kultur system5,,6,,7. Desuden viser nylige undersøgelser den kardiobeskyttende betydning af cytokiner udskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For at undersøge den terapeutiske rolle og molekylære mekanisme af disse kardiokiner under hjerte reparation og regenerering, en langvarig kultur er påkrævet.
Voksne rotter er robuste nok til isolation af encellede celler og langsigtet kultur i et in vitro-system10,11,12. Men voksne mus CMs er af stor interesse for in vitro assays, på grund af tilgængeligheden af en række genetisk modificerede musemodeller, som giver mulighed for design og udførelse af forskellige innovative analyser, der ikke er muligt med rotte CM13. I modsætning til voksne rotte CM isolation, er det ganske udfordrende at opnå en enkelt-celle suspension fra voksne mus hjerter, og den langsigtede kultur af voksne mus CMs i kulturen er endnu mere udfordrende.
Voksen CM isolation fra mus og rotte hjerter ved hjælp af en Langendorff system er tidligere blevet etableret for at studere CMfunktion 5,14,15. Her har vi beskrevet protokollerne for voksen CM isolering fra både rotter og mus, samt en modificeret langsigtet kultur, transfektion og CM spredning af isolerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg bør udføres i overensstemmelse med retningslinjerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr offentliggjort af U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokoller, der vises i videoen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Forberedelse før hjerteekstraktion fra voksne mus (og rotter)
- Forbered de tilsvarende perfusions-, enzym- og stopopløsninger i henhold til opskrifterne i tabel 1 og tabel 2for henholdsvis rotte- og museisolation. Opløsningerne filtreres gennem et 0,22 μm filter for at fjerne eventuel forurening eller uopløste partikler.
- Rengør og sterilisere de kirurgiske instrumenter ved iblødsætning dem i 70% alkohol i 15 min, og derefter vaskes med dobbelt destilleret vand. Lad værktøjet lufttørre på en ren køkkenrulle.
- Forvarm vandbadet til 37 ºC. Kontroller vandstanden i vandbadet for at sikre en uafbrudt cirkulation af varmt vand gennem perfusionsapparatet under proceduren.
- Rengør perfusionsapparatet ved at køre med 70% alkohol i 5 min. Gentag.
BEMÆRK: Øg strømningshastigheden, hvilket hjælper med at rengøre slangen. - Efter alkohol flowthrough, rense rester af alkohol ved at køre dobbelt destilleret vand i 10 min.
- Opsæt 3 mellemstore engangspolystyrenvejsskåle for at rense hjertet efter excision. Fyld retterne med 20 ml myocyt buffer.
- Tilføj 2-3 dråber heparin til hver skål ved hjælp af Pasteur pipette og bland godt ved pipettering flere gange.
- Tag en 10 ml sprøjte med en stump kanylekanyle.
BEMÆRK: En stump kanyle kanyle kan fremstilles ved at skære spidsen af en ren, steril nål. En 21 G nål og 14 G nål blev brugt til at gøre kanylen til mus og rotte, henholdsvis. - Fyld sprøjten med perfusionsbuffer (tabel 1). Fjern eventuelle luftbobler fra sprøjten, og placer den i den tredje skål i vinklet position. Fastgør den med tape.
BEMÆRK: For rotter blev løsning A (tabel 2) anvendt i stedet for myocytperfusionsbuffer. - Forbered en løs knude med en kirurgisk sutur og læg den omkring nålen.
- Injicer musen med heparin (100 USP-enheder/mus) ved intraperitoneal injektion, 20 min før anæstesi injektion.
- Myocytperfusionsbufferen (tabel 1) cirkuleres gennem perfusionsapparatet. Reducer strømningshastigheden til 3 ml/min.
BEMÆRK: For rotter blev løsning A (tabel 2) anvendt i stedet for myocytperfusionsbuffer. - Efter 5 minutter udskiftes perfusionsbufferen med enzymopløsningen (tabel 1). Mætte enzymopløsningen med ilt under processen. Brug en strømningshastighed på 3 ml/min.
BEMÆRK: Ved rotte-CM-isolering anvendes opløsning E (tabel 2) i stedet. - Bedøve musen ved intraperitoneal injektion af anæstesi. Brug den passende dosis anæstesi, anbefalet af IACUC, til terminalkirurgi.
- Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved manglen på en reaktion på en tå knivspids. Derefter sætte musen på den kirurgiske platform.
2. Udvinding af hjerte fra voksne mus (og rotter)
- Steriliser huden ved at tørre med 70% alkohol.
- Åbn forsigtigt brystet.
- Punktafgifter hjertet. Undgå ikke-hjertevæv under excision.
- Sæt hjertet på den første skål, fyldt med perfusion buffer (Tabel 1).
BEMÆRK: Brug opløsning A til rotter (tabel 2). - Ryd blodet fra hjertet ved forsigtigt at klemme.
- Overfør hjertet til den anden skål.
- Rengør blodet fra hjertet og fjern ikke-hjertevæv. Derefter overføre hjertet til den tredje skål.
- Trim off lunger og andre omkringliggende væv og kanyler via den stigende aorta. Denne procedure bør udføres så hurtigt som muligt (<5 min) for at forbedre cm-kvaliteten og -kvantiteten.
3. Fordøjelse af hjertet
- Fordøjelse af musen hjerte
BEMÆRK: Alle de opløsninger/buffere, der cirkulerer gennem musehjertet, skal iltes under hele proceduren.- Fjern forsigtigt kanylen fra sprøjten og tilslut den til Langendorff perfusion apparatet.
- Undgå eventuelle luftbobler, der går ind i hjertet, hvilket kan påvirke gennemstrømningen af enzymopløsningen og fordøjelsen.
- Flyt vandjakken op for at give et homogent miljø til hjertet. Lad enzymopløsningen flyde gennem hjertet med en hastighed på 2-3 ml/min.
BEMÆRK: Hastigheden af passerende løsning er kritisk og har en betydelig indvirkning på resultatet af CM kvantitet og kvalitet. - Lad enzymopløsningen flyde gennem hjertet i 2 min.
- Ved 2 min. tilsættes 40 μL 100 μM CaCl2 opløsning til enzymopløsningen og blandes. Lad enzymopløsningen passere gennem hjertet i yderligere 10-15 min.
BEMÆRK: Når strømmen bliver glat, hjertet bliver brunlig og blød, hvilket indikerer en jævn fordeling af kollagenase enzym og korrekt fordøjelse af hjertet.
- Fordøjelsen af rottehjertet
BEMÆRK: Alle de opløsninger/buffere, der cirkulerer gennem rottehjertet, skal iltes under hele proceduren.- Fjern forsigtigt kanylen fra sprøjten og tilslut den til Langendorff perfusion apparatet.
- Undgå eventuelle luftbobler, der går ind i hjertet, hvilket kan påvirke gennemstrømningen af enzymopløsningen og fordøjelsen.
- Flyt vandjakken op for at give et homogent miljø til hjertet.
- Start strømmen af opløsning A med en hastighed på 2-3 ml/min i 3-5 min. for at fjerne blod fra hjertet.
BEMÆRK: Hastigheden af den passerende løsning er kritisk og har en betydelig indvirkning på resultatet af CM kvalitet. - Når blodet er fjernet fra hjertet, skiftes fra opløsning A til opløsning E (Tabel 2). Titratopløsning E med CaCl2 som angivet nedenfor for en endelig koncentration på 0,1 mM i opløsning:
- Efter 10 min perfusion tilsættes 12,5 μL 0,1 M CaCl2.
- Efter 15 min perfusion tilsættes 25 μL 0,1 M CaCl2.
- Lad enzymopløsningen passere gennem hjertet i yderligere 30-40 min, indtil strømmen bliver hurtig, og hjertet er bøjeligt.
4. Fremstilling af CM encellede suspension
- Forberedelse af CM enkeltcellesuspension (mus)
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusion system. Flyt den til en 60 mm petriskål fyldt med 5 ml enzymopløsning og overfør skålen til en biosikkerhedshætte.
BEMÆRK: Sørg for tilstrækkelig hjertefordøjelse, før hjertet fjernes fra Langendorff perfusionssystemet. Fordøjelsestiden afhænger af enzymaktiviteten, opløsningsstrømmen og hjertets størrelse. - Udfør yderligere mekanisk opdeling i en biosikkerhedshætte for at sikre sterilitet og undgå kontaminering.
- Fjern forsigtigt atria (1/4th af basal hjerte del) og ekstra fedtvæv.
- Hakke hjertet med kraftvæddestykker i fine stykker.
- Tag en steril Pasteur pipette og skær spidsen i en vinkel på 45º.
- Brug denne Pasteur pipette til at dispensere hjertevævet i en enkeltcellesuspension ved skånsom pipettering. Optimal fordøjelse giver en suspension af encellede kardiomyocytter.
BEMÆRK: Fjern den smalle, nederste del af overførselsrøret for at reducere CM-skader på grund af mekanisk sviende. - Derefter tilsættes 5 ml stopopløsning for at stoppe enzymaktiviteten, hvilket undgår muligheden for overdigestion.
- Tag en frisk 50 ml konisk og læg en steril 100 μm cellestien på den.
- Pass kardiomyocyt suspension gennem cellen si til at fjerne væv luns. Petriskålen og sien vaskes med yderligere 5 ml stopopløsning (tabel 1) for at indsamle kardiomyocytter, der forbliver fastgjort til sien.
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusion system. Flyt den til en 60 mm petriskål fyldt med 5 ml enzymopløsning og overfør skålen til en biosikkerhedshætte.
- Fremstilling af CM encellede suspension (rotte)
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusion system. Flyt hjertet til en 100 mm petriskål fyldt med 5 ml opløsning A, og flyt skålen til en biosikkerhedshætte.
BEMÆRK: Sørg for tilstrækkelig hjertefordøjelse, før hjertet fjernes fra Langendorff perfusionssystemet. Fordøjelsestiden afhænger af enzymaktiviteten, opløsningsstrømmen og hjertets størrelse. - Udfør yderligere mekanisk opdeling i en biosikkerhedshætte for at sikre sterilitet og undgå kontaminering.
- Fjern forsigtigt atria (1/4th af den basale hjerte del) og ekstra fedtvæv.
- Hakke hjertet med kraftvæddestykker i fine stykker.
- Tag en steril Pasteur pipette og skær spidsen i en vinkel på 45º.
- Brug denne Pasteur pipette til at dispensere hjertevævet i encellede suspension ved blid pipettering. Optimal fordøjelse giver en suspension af encellede kardiomyocytter.
BEMÆRK: Fjern den smalle, nederste del af overførselsrøret for at reducere CM-skader på grund af mekanisk sviende. - Der tilsættes 5 ml opløsning B (tabel 2) til CM-suspensionen, og opløsningen overføres gennem en 100 μm cellestien for at fjerne eventuelle resterende fedtstykker eller andet ikke-fordøjet væv.
- Filtratet opsamls i et friskt 50 ml konisk hætteglas.
- Brug yderligere 5 ml opløsning B til at vaske petriskålen og eventuel resterende CM gennem cellesien.
- Fjern hjertet fra Langendorff perfusion system. Flyt hjertet til en 100 mm petriskål fyldt med 5 ml opløsning A, og flyt skålen til en biosikkerhedshætte.
5. Fjernelse af ikke-KM'er
- Fjernelse af ikke-CM'er fra voksen encellet suspension (mus)
- Centrifuge celle suspension ved 20 x g i 3 min.
- Supernatanten kasseres, og cellerne skal opslævens igen i 10 ml stopopløsning (tabel 1).
BEMÆRK: Hvis koncentrationen af BSA øges i stopopløsningen, vil det øge dens viskositet og reducere sedimenteringshastigheden for ikke-CO'er. - Resuspend the CMs ved blid inversion af røret 3-5 gange.
- Der tilsættes med 3 minutters mellemrum 10 μL 100 μM CaCl2-opløsning og blandes. Gentag tre gange.
- Efter den fjerde tilsætning centrifuger kardiomyocytaffjedringen ved 20 x g i 3 min.
- Kassér supernatanten.
- Opsprænning af CM'er i forvarmte (37 ºC), voksent cm plating-medie til voksne (tabel 3).
- Fjernelse af ikke-CM'er fra voksne encellede suspensioner (rotte)
- Pellet celler ved 20 x g i 3 min ved 25 ºC.
- Supernatanten kasseres, og cellerne opslæmes igen i 25 ml opløsning B (tabel 2).
- Bland cellerne ved blid inversion og læg den i et rør stativ for at tillade CM at bosætte sig under tyngdekraften.
- Kassér forsigtigt supernatanten.
- Cellerne opspnå cellerne igen i frisk 25 ml opløsning B, og det titrerer det til 1,0 mM CaCl2 ved trinvis tilsætning af 50 μL, 75 μL og 100 μL på 0,1 M CaCl2 med 3-5 minutters mellemrum.
BEMÆRK: Der kan anvendes en højere koncentration af BSA i opløsning B på dette trin. Forøgelse af koncentrationen af BSA i løsning B øger viskositeten og reducerer dermed sedimenteringshastigheden for ikke-CMs. - Pellet celler ved 20 x g i 3 min ved 25 ºC, aspirere supernatant, og tilsæt den ønskede mængde af voksne rotte celle kultur medier (Tabel 4).
- Seed CMs på en laminin belagt plade.
BEMÆRK: Forstyrning af CMs på en ikke-belagt kulturplade kan bruges til at minimere forureningen af ikke-CM-celler.
6. Voksen CM plating
- For-plating
- Resuspend the cardiomyocytes into culture media.
- Forplade cellerne i en 60 mm eller 100 mm skål for henholdsvis mus eller rotte CM.
- Inkuber CMs i 2 timer i en inkubator suppleret med 5% CO2 ved 37 ºC.
- Under forpladeinkubationen belægges cellekulturpladerne med laminin (10 μg/ml i PBS) for at få en langsigtet CM-kultur.
- Efter 2 timers forplægning indsamles CMs i et 50 ml konisk hætteglas.
- Saml cellerne fra skålen og re-plade dem i en laminin belagt 24 godt kultur plade til transfektion eksperimenter.
- Kulturceller i en inkubator ved 37 ºC suppleret med 5 % med CO2. 4-6 timer er tilstrækkeligt til at holde sig til kardiomyocytter med overfladen, og dermed kan transfektion udføres 6 timer efter plating.
BEMÆRK: Plating medium, der indeholder FBS er almindeligt anvendt og viser bedre kompatibilitet med spredning undersøgelser. Et serumfrit medium kan dog bruges til eksperimenter, hvor sekretoriske faktorer analyseres.
7. Transfektion
- Inkuber CMs'erne til cellekulturpladerne belagt med laminin i 4-6 timer.
- Fire timer efter CM såning på laminin belagt plade, transfect celler med siRNAs (50 nM) af interesse ved hjælp af en transfection reagens (f.eks Lipofectamin RNAiMAX) i henhold til producentens protokol.
- Skift medie 24 timer efter transfektion og hver 24 timer efter, at i op til 20 dage.
- Efter 20 dage fikser celler med 4% PFA i PBS til downstream-anvendelser, herunder immunoktokemi til hjertespecifikke markører som Troponin for at sikre, at levende kardiomyocyter med succes blev dyrket på lang sigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende modificerede protokol giver mulighed for effektiv isolering og kultur af rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolation, i alt 3 voksne (12 uger gamle) mandlige Fischer 344 rotter blev anvendt i proceduren. Figur 1 viser det kirurgiske apparat og isoleringsopsætninger, der kræves i proceduren. hver del er markeret og beskrevet i figurlegenden. Kollagen type 2 blev brugt til fordøjelsen, hvilket giver en høj mængde af høj kvalitet CMs fra vellykket isolation (Figur 2A). Fireogtyve timer efter isolation, disse celler blev transficeret med celle cyklus inducerende specifikke siRNA'er mod Rb1 og Meis2, mens, cel-miR-67 blev brugt som transfection kontrol ieksperimentet 11. CMs blev holdt i kultur i enten syv dage (figur 2B) eller op til tyve dage (figur 2C) for at observere de morfologiske ændringer. For at score for cellecyklusaktivitet blev CMs fastsat på dag 7 og farves for hjertespecifik markør Troponin-I, mitotisk markør KI67, og kernen blev visualiseret gennem DAPI (Figur 2D-F). Der blev observeret en signifikant stigning i KI67 positive kardiomyocytter med siRb1+siMeis2-behandling sammenlignet medkontrol 11. Desuden var rotten kardiomyocytter slå (kontraktile funktion) i kultur på dag syv post-plating, som er et kendetegn karakteristisk for sunde kardiomyocytter11.
For CM isolation i mus blev der anvendt i alt 3 voksne mænd og 3 huner (12 uger gamle) C57BL/6 mus i proceduren. I lighed med rottestudiet blev kollagentype 2 brugt til at fordøje kollagen og den ekstracellulære matrix af det voksne mushjerte. Voksen mus CM er forholdsvis skrøbelig for isolation og kultur in vitro; Således denne protokol bruger blebbistatin til at forbedre levedygtigheden af den voksne mus CM. Vellykket isolation udbytter > 70-80% sund stang form CM'er, som kan dyrkes i op til 20 dage (Figur 3A-C) og opretholde deres hjerte Troponin-I farvning og kontraktilitet (Figur 3C). I separate eksperimenter, fire timer efter isolation, mus CMs blev transficeret med en celle cyklus inducerende siRNA cocktail som beskrevet for rotten CM. Kort, mus CM blev samtidig transfet med de specifikke siRNA'er mod Rb1 og Meis2, og kontrol (cel-miR-67). CMs efter transfektionen var genstand for tidsforløbsbilleddannelse i 10 dage, der viste de morfologiske ændringer (figur 4), som efterfølges af en spredningsanalyse (figur 5). På dag 10 blev immunlysstofrør for Troponin-I, KI67 og DAPI udført som tidligere beskrevet. Der blev observeret en signifikant stigning i KI67 positive kardiomyocytter med siRb1+siMeis2-behandling sammenlignet med kontrol (Figur 5A-C).
Den nuværende protokol viser, at voksne rotter og mus CMs kan dyrkes langsigtet in vitro i op til 20 dage og potentielt længere. Efter 20 dage, CMs opretholde deres Troponin-I farvning samt kontraktilitet, hvis hæmmere fjernes fra medierne.
| Myocyt buffer sammensætning, pH 7,4 (Forbered og kan opbevares ved 4 °C ) | |||
| Reagens | Koncentration, mM | Molekylær wt. | For 1 Liter |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| KCl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| Perfusionsbuffer, pH 7.4 (Forbered frisk til hver isolering) | |||
| Koncentration, mM | Molekylær wt. | Krævede beløb | |
| Myocyte-buffer | 250 mL | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mg |
| 2,3-butanedione monoximine | 10 | 101.105 | til 252,775 mg |
| NaHCO3 Frisk | 1.6 | 84.007 | 33.6028 mg |
| Taurin Frisk | 30 | 125.15 | 938,625 mg |
| Glukose Frisk | 20 | 180.156 | 900,775 mg |
| Enzymopløsning | |||
| Stock Conc. | Arbejder Conc. | Kræves | |
| Myocyte-buffer | 50 mL | 50 mL | |
| Kollagen type 2 | 330 U/mg | 620 U/ml | 93 mg |
| Protease XIV | >3,5 U/mg | 0.104 U/ml | 1,48 mg |
| DNase I lønklasse 2 | 0.015 mg/ml | ||
| Stop Buffer A | |||
| Stock Conc. | Arbejder Conc. | Kræves | |
| Myocyte-buffer | 30 mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Stop Buffer B | |||
| Stock Conc. | Arbejder Conc. | Kræves | |
| Myocyte-buffer | 30 mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tabel 1: Løsninger, der kræves til isolering af hjertemyocyt for voksne mus.
| 10x KHB Stock Løsning (Samlet volumen= 1L) |
Reagens | Kindtænderhed (mM) | Beløb (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| KCl | 48 | 3,5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| PH-pH til 7,4 med 4 M NaOH (~20 ml), opbevares ved 4 °C | |||
| KHB-løsning, 500 ml | Reagens | Beløb | |
| 10x KHB | 50 mL | ||
| Glukose | 0,99 g | ||
| Taurin | 0,31 g | ||
| Tilføj H2O for at bringe volumen til 500 ml, og pH skal være ~ 7,35 | |||
| Løsning A | Reagens | Beløb | |
| KHB løsning | 500 ml (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Oxygenat med 100% O2 og varm til 37 °C | |||
| Løsning B, 50 ml | Reagens | Beløb | |
| Løsning A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Løsning E, 50 ml | Reagens | Beløb | |
| Løsning A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Kollagentype II (263 enheder/mg) | 35 mg | ||
| Hyaluronidase (Type I-S) | 10 mg | ||
| 0,1 M CaCl2 lager | 12,5 μL | ||
| Bland godt | |||
| CaCl2 Lager, 0,1 M | Reagens | Beløb | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 ml | ||
| Opbevares ved 4 °C | |||
Tabel 2: Løsninger, der kræves til isolering af voksne rotter.
| Plating mediesammensætning, pH 7,4 | |||
| Koncentration | Molekylær Wt. | Obligatorisk beløb | |
| Kulturmedier uden Blebbistatin | 50 mL | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mg |
| Fbs | 5% | 2,5 g | |
| Kulturmediesammensætning, pH 7,4 | |||
| Reagens | Koncentration | Molekylær Wt. | Obligatorisk beløb |
| kr. | 1x | 250 mL | |
| Insulin | 1 μg/ml | 0,25 mg | |
| Transferrin | 0,55 μg/ml | 0,138 mg | |
| Selen | 0,5 ng/ml | 0,125 μg | |
| Penicillin (U/ml)-streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595.753 mg |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1.8271 mg |
| * Brug en af dem, som pr forsøgskrav. # Aliquot kulturmediet til at forberede plating medier, før du tilføjer Blebbistatin. BEMÆRK: Forbered 200 ml kulturmedier. BEMÆRK: Forbered 50 ml plating media. |
|||
Tabel 3: Mediesammensætning for voksne mus kardiomyocyte plating og kultur.
| Kulturmediesammensætning, pH 7,4 | ||
| Reagens | Koncentration | Obligatorisk beløb |
| kr. | kr. | 250 mL |
| Penicillin (U/ml)-streptomycin (g/ml) | 100-100 | 2,5 ml |
| *FBS | 10% | 25 mL |
Tabel 4: Mediesammensætning for voksne rotte kardiomyocyte plettering og kultur.
Figur 1: Opsætning og udstyr til procedure. i) Skematisk repræsentation af perfusionen. (II) Kirurgiske instrumenter og kanyle. (III) Hjerteperfusionssamling: A) Varmejakke. B)Dobbelt væg vand jakke fartøj. C) Cirkulerende opvarmet vandindtag. D)Cirkulerende opvarmet vandudtag. E)Hjerteperfusionsopløsning. F)Cirkulerende pumpe G) Perfusion opløsning rør. H)Ilttilførselsrør. I)Cirkulerende vandbad. J)Kanyle med hjerte, fastgjort til perfusion stikkontakten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Voksen rotte CM isolation, transfektion, og langsigtet kultur. A)Voksen rotte CM, umiddelbart efter isolation. B)Voksen rotte CM på dag 7 efter isolation. C) Voksen rotte CM på dag 20. D-F) KI67 positiv rotte CM på dag 7 efter siRb1+siMeis2 transfektion. Troponin-I = grøn; DAPI = blå; KI67 = rød. Alle forsøg blev udført i to eksemplarer og gentaget mindst tre gange. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Voksen mus CM isolation og langsigtet kultur. A)Voksen mus CM, umiddelbart efter isolation. B)Voksen mus CM på dag 7 efter isolation. C) Voksne mus CM farves med Cardiac Troponin-I = grøn på dag 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Cm-dedifferentiering for voksenmus. Voksen mus CM viser morfologiske ændringer i løbet af langsigtet kultur (dag 0 til dag 10) i DMEM-HG medier, suppleret med 10% FBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Voksen mus CM transfektion og spredning. A-C) KI67 positiv mus CM på dag 10 efter siRb1+siMeis2 transfektion. Troponin-I = grøn; DAPI = blå; KI67 = rød. D)Bar graf viser en betydelig stigning i KI67 positive voksne mus CMs i siRNA-cocktail transfected gruppe versus kontrol. Resultaterne præsenteres som middelværdi±SEM; * = p-værdi ≤0,05. p-værdi ≤0,05 blev anset for statistisk signifikant. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer (n= 3 Mand,3 Kvinde). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er et kritisk behov for at etablere en protokol for voksne kardiomyocyt isolation og langsigtet kultur til at udføre celle-specifikke mekanistiske undersøgelser. Der er kun et par rapporter diskuterer voksne CM isolation protokoller, og endnu færre af dem bruges til langsigtet kultur af voksne mus CM15,16,17. Det er blevet påvist, at den voksne rotte CM har en højere tolerance over for in vitro kultur end de voksne mus CM10,11,12. I denne rapport opretter vi en protokol for voksen rotte- og mus-cm-isolation, siRNA-transinfektion, langsigtet kultur og downstream-analyse af induceret spredning med minimale ændringer i de regelmæssigt anvendte protokoller.
Tilgængelige protokoller for voksen CM isolation er baseret på brugen af to kendte enzymer, kollagenase og liberase, for den ekstracellulære matrix (ECM) fordøjelse18,19. Collagenase er et almindeligt anvendt enzym i de voksne CM isolation protokoller. Kollagen fordøjer kollagen fibre i ECM, hvilket resulterer i dissociation af hjertevæv i encellede CM. Tilsvarende liberase fordøjer ECM. Liberase er det rensede alternativ til kollagenase, som viser højere aktivitet og dermed kræver højere præcision under CM isolation for at opnå en vellykket isolation i forhold til kollagenase. Desuden bemærkede vi i proceduren, at cm isoleret med liberase ikke overlever i den langsigtede kultur. Men CM isoleret med kollagenase forbedrer levetiden af CM i kulturforholdene.
Derudover brugte vi en specifik myosin II-hæmmer kaldet blebbistatin i kulturmedierne til den langsigtede kultur af voksen mus CM20,21. Tidligere, 2,3-butanedione monoximin (BDM) er blevet brugt til voksne CM kultur. BDM er en ATPase-hæmmer, der hæmmer kontraktilefunktionen gennem en dårligt defineret mekanisme, der omfatter hæmning af ATPase og nedsat Ca++ overgang22. I forhold til BDM er blebbistatin en specifik hæmmer af myosin II og viser mere signifikant hæmning af kontraktilefunktion ved lavere koncentrationer end BDM. En for-plating af den voksne mus CM i en kultur medier, suppleret med 10 mM BDM og efterfølgende kulturer af CM i 25 μM blebbistatin-suppleret og lav serum medier forbedrer overlevelsesevne og stang form struktur CM i langsigtet kultur. Men en direkte plating af den voksne mus CM i medierne, suppleret med 25 μM blebbistatin og 10% FBS er bedre for proliferative undersøgelser. I lighed med den voksne rotte CM, som viser en stor grad af de-differentiering i in vitro kultur, vi også observeret de-differentiering i den voksne mus CM til en vis grad (Figur 5). Morfologiske ændringer er det nødvendige skridt for spredningen. Således giver et miljø til voksne CM, der letter deres de-differentiering er en kritisk faktor til at overveje i sådanne undersøgelser. Selv om det på nuværende tidspunkt ikke er klart, hvilke af de nøjagtige trin eller komponenter, der anvendes i denne protokol, der er ansvarlige for den forbedrede levetid for voksne CMs, mener vi, at det er en kombinationseffekt af de anvendte reagenser, de ændringer, der er foretaget i isolationsproceduren, og måske vigtigst af alt de uddannede hænder.
I lighed med de tidligere rapporter, der viser viral transduktion af den voksne CM i blebbistatin-suppleret medier, vi også observeret en effektiv transfection af disse celler med siRNA' er. Vi brugte specifikke siRNA'er mod to senescence-associerede gener, Rb1 og Meis2,for at fremkalde CM spredning. For rotte CM, udførte vi KI67 analyse for at vurdere spredning på dag syv efter transfektion; spredningen i muse adult CM blev dog analyseret på dag ti efter transfektion. En artsspecifik biologisk variabilitet kan være en mulig årsag til den observerede tidsforskel i den inducerede cellecyklus genindtræden af voksen rotte- og muse-CM.
Samlet set den protokol, der er beskrevet her giver en forbedret, pålidelig og sammenlignende procedure for at isolere voksne rotte og mus CM, og derfor kultur dem som pr eksperimentelle behov. Desuden giver denne protokol mulighed for en langsigtet kultur af den voksne CM, som giver en in vitro-system til at udføre forskellige langsigtede analyser såsom spredning, parakrine faktor, stress respons, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Institut for Patologi og Laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et tilskud fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak er støttet af American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes af American Heart Association postdoc tilskud (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey støttes af et NIH T32-tilskud (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
