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Biology

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61073

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.

Abstract

La coltura ex vivo dei cardiomiociti di mammiferi adulti (CM) presenta il sistema sperimentale più rilevante per lo studio in vitro della biologia cardiaca. I VM di mammiferi adulti sono cellule terminalmente differenziate con capacità proliferative minima. Lo stato post-mitotico dei VM adulti non solo limita la progressione del ciclo cellulare cardiomiocato, ma limita anche la coltura efficiente delle CM. Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per molti studi, come la proliferazione CM e l'analisi dell'espressione genica.

Il topo e il ratto sono i due animali da laboratorio preferiti da utilizzare per l'isolamento cardiomiocato. Mentre la cultura a lungo termine dei CCI ratti è possibile, i VM per topi adulti sono suscettibili alla morte e non possono essere sevati più di cinque giorni in condizioni normali. Pertanto, vi è una necessità critica di ottimizzare l'isolamento delle cellule e il protocollo di coltura a lungo termine per le CCI murine adulte. Con questo protocollo modificato, è possibile isolare con successo e coltura sia per topi adulti e ratto CMs per più di 20 giorni. Inoltre, l'efficienza della trasfezione del siRNA di CM isolato è significativamente aumentata rispetto ai rapporti precedenti. Per l'isolamento CM del topo adulto, il metodo di perfusione Diatrofio viene utilizzato con una soluzione enzimatica ottimale e con tempo sufficiente per la completa dissociazione della matrice extracellulare. Al fine di ottenere CM ventricolari puri, entrambi gli attri sono stati sezionati e scartati prima di procedere con la dissociazione e la placcatura. Le cellule sono state disperse su una piastra rivestita di laminina, che ha permesso un attaccamento efficiente e rapido. I VM sono stati autorizzati ad accontentarsi di 4-6 h prima della trasfezione del siRNA. I supporti di coltura sono stati aggiornati ogni 24 h per 20 giorni, e successivamente, i CM sono stati fissati e macchiati per marcatori cardiaci specifici come La troponina e marcatori del ciclo cellulare come KI67.

Introduction

Le malattie cardiache sono una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Quasi tutti i tipi di lesioni cardiache si tras danno una significativa perdita di cardiomiociti adulti (CM). I cuori dei mammiferi adulti non sono in grado di riparare le loro lesioni cardiache a causa della natura senescente del CM1 adulto. Così, qualsiasi insulto al cuore dei mammiferi adulti si traduce in una perdita permanente di CMs, che porta a una ridotta funzione cardiaca e insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi adulti, piccoli animali come il pesce zebra e i cuori di nuovatta possono rigenerare le loro lesioni cardiache attraverso la proliferazione CMesistente 2,3,4. È in corso uno sforzo mondiale per trovare un nuovo intervento terapeutico per le lesioni cardiache tramite approcci prolifertivi e non proliferative. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari tipi di modelli genetici di topo per studiare le lesioni cardiache e la riparazione. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali in vivo continua ad essere un approccio costoso con l'ulteriore complessità per decifrare un meccanismo autonomo dalle cellule dagli effetti secondari. Inoltre, i sistemi in vivo sono difficili da analizzare CM effetti specifici di un intervento farmacologico che induce la segnalazione cardioprotettiva dal CM.

Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per eseguire analisi di proliferazione cm. I saggi di proliferazione CM richiedono un minimo di 4-5 giorni affinché le cellule siano indotte nel ciclo cellulare e per ottenere dati accurati dopo di che. Inoltre, gli studi che utilizzano cM isolati per studi elettrofisiologici, screening farmacologici, studidi tossicità e studi sull'omeostasi di Ca sono tutti bisognosi di un sistema dicoltura migliorato 5,6,7. Inoltre, studi recenti mostrano il significato cardioprotettivo delle citochine secrete dai CMs (cardiocine)8,9. Al fine di studiare il ruolo terapeutico e il meccanismo molecolare di queste cardiochine durante la riparazione e la rigenerazione del cuore, è necessaria una coltura prolungata.

Le CCI ratto adulte sono sufficientemente robuste per l'isolamento a una cellula e la coltura a lungo termine in un sistema in vitro10,11,12. Tuttavia, i CIM per topi adulti sono di grande interesse per gli analisi in vitro, a causa della disponibilità di una varietà di modelli murini geneticamente modificati, che consente la progettazione e l'esecuzione di varie analisi innovative che non sono possibili con il ratto CM13. A differenza dell'isolamento CM del ratto adulto, è piuttosto difficile ottenere una sospensione a un solo cellula dai cuori dei topi adulti, e la cultura a lungo termine delle VM per topi adulti nella cultura è ancora più impegnativa.

L'isolamento CM adulto dai cuori di topo e ratto utilizzando un sistema Langendorff è stato precedentemente stabilito per studiare la funzione CM5,14,15. Qui, abbiamo descritto in dettaglio i protocolli per l'isolamento CM adulto da ratti e topi, così come una coltura a lungo termine modificata, la trasfezione e la proliferazione CM di cellule isolate.

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Protocol

Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità con le linee guida della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicata dal National Institute of Health (NIH) degli Stati Uniti. Tutti i protocolli visualizzati nel video sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati, College of Medicine.

1. Preparazione prima dell'estrazione cardiaca da topi adulti (e ratti)

  1. Preparare le corrispondenti soluzioni di perfusione, enzima e arresto, secondo le ricette fornite nella Tabella 1 e nella Tabella 2,rispettivamente per l'isolamento di ratti e topi. Filtrare le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 m per rimuovere eventuali contaminazioni o particelle non dissolte.
  2. Pulire e sterilizzare gli strumenti chirurgici immergendoli nel 70% di alcol per 15 minuti, e successivamente lavare con acqua doppia distillata. Lasciare asciugare gli utensili su un tovagliolo di carta pulito.
  3. Preriscaldare il bagno d'acqua a 37 oC. Controllare il livello dell'acqua nel bagno d'acqua per garantire una circolazione ininterrotta di acqua calda attraverso l'apparato di perfusione durante la procedura.
  4. Pulire l'apparato di perfusione correndo con 70% di alcol per 5 min. Ripetere.
    NOTA: Aumentare la velocità di flusso, che aiuta a pulire il tubo.
  5. Dopo il flusso di alcolattraverso, pulire i resti di alcol eseguendo acqua doppia distillata per 10 min.
  6. Impostare 3 piatti di pesatura in polistirolo usa e getta di medie dimensioni per pulire il cuore dopo l'escissione. Riempire i piatti con 20 mL di tampone miocite.
  7. Aggiungere 2-3 gocce di epatina ad ogni piatto con l'aiuto di Pasteur pipette e mescolare bene pipetta più volte.
  8. Prendere una siringa da 10 mL con una cannula ad ago smussato.
    NOTA: Una cannula ad ago smussato può essere preparata tagliando la punta di un ago pulito e sterile. Un ago da 21 G e un ago da 14 G sono stati utilizzati per fare la cannula per il topo e il ratto, rispettivamente.
  9. Riempire la siringa con il buffer di perfusione( Tabella 1). Rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa e posizionarla nel terzo piatto in una posizione angolata. Fissalo con nastro adesivo.
    NOTA: per i ratti, è stata utilizzata la soluzione A (Tabella 2) al posto del buffer di perfusione di miociti.
  10. Preparare un nodo sciolto con una sutura chirurgica e posizionarlo intorno all'ago.
  11. Iniettare il topo con epatina (100 unità USP/mouse) per iniezione intraperitoneale, 20 minuti prima dell'iniezione di anestesia.
  12. Far circolare il buffer di perfusione del miocito (Tabella 1) attraverso l'apparato di perfusione. Diminuire la velocità di flusso a 3 mL/min.
    NOTA: per i ratti, è stata utilizzata la soluzione A (Tabella 2) al posto del buffer di perfusione di miociti.
  13. Dopo 5 minuti, sostituire il buffer di perfusione con la soluzione enzimatica (Tabella 1). Saturare la soluzione enzimatica con ossigeno durante il processo. Utilizzare una velocità di flusso di 3 mL/min.
    NOTA: per l'isolamento del RAT CM, utilizzare invece la soluzione E (Tabella 2).
  14. Anestesizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di anestesia. Utilizzare la dose appropriata di anestesia, raccomandata da IACUC, per la chirurgia terminale.
  15. Confermare la profondità sufficiente di anestesia dalla mancanza di una risposta a un pizzico di dito del piedi. Quindi, mettere il mouse sulla piattaforma chirurgica.

2. Estrazione del cuore da topi adulti (e ratti)

  1. Sterilizzare la pelle asciugandosi con il 70% di alcol.
  2. Aprire con attenzione il petto.
  3. Accise il cuore. Evitare tessuti non cardiaci durante l'escissione.
  4. Mettere il cuore sul primo piatto, riempito con tampone perfusione (Tabella 1).
    NOTA: utilizzare la soluzione A per il ratto (Tabella 2).
  5. Cancellare il sangue dal cuore spremendo delicatamente.
  6. Trasferire il cuore al secondo piatto.
  7. Pulire il sangue dal cuore e rimuovere i tessuti non cardiaci. Successivamente, trasferire il cuore al terzo piatto.
  8. Tagliare i polmoni e altri tessuti circostanti e puònulate tramite l'aorta ascendente. Questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile (<5 min) per migliorare la qualità e la quantità di CM.

3. Digestione del cuore

  1. Digestione del cuore del topo
    NOTA: Tutte le soluzioni/buffer che circolano attraverso il cuore del topo devono essere ossigenate durante tutta la procedura.
    1. Rimuovere con cura l'ago cannulante dalla siringa e collegarlo all'apparato di perfusione Langendorff.
    2. Evitare eventuali bolle d'aria che vanno nel cuore, che possono influenzare il flusso-through della soluzione enzimatica e la digestione.
    3. Spostare la giacca d'acqua verso l'alto per fornire un ambiente omogeneo al cuore. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisca attraverso il cuore ad una velocità di 2-3 mL/min.
      NOTA: la velocità della soluzione di passaggio è fondamentale e ha un impatto significativo sul risultato della quantità e della qualità CM.
    4. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisci attraverso il cuore per 2 minuti.
    5. A 2 minuti, aggiungete 40 soluzione CaCl2 di 100 M alla soluzione ematica e mescolate. Lasciare che la soluzione enzimatica passi attraverso il cuore per altri 10-15 min.
      NOTA: Una volta che il flusso diventa liscio, il cuore diventa brunastro e morbido, indicando la distribuzione uniforme dell'enzima collagenasi e la corretta digestione del cuore.
  2. Digestione del cuore di ratto
    NOTA: Tutte le soluzioni/buffer che circolano attraverso il cuore del ratto devono essere ossigenate durante tutta la procedura.
    1. Rimuovere con cura l'ago cannulante dalla siringa e collegarlo all'apparato di perfusione Langendorff.
    2. Evitare eventuali bolle d'aria che vanno nel cuore, che possono influenzare il flusso-through della soluzione enzimatica e la digestione.
    3. Spostare la giacca d'acqua verso l'alto per fornire un ambiente omogeneo al cuore.
    4. Avviare il flusso della soluzione A ad una velocità di 2-3 mL/min per 3-5 min per rimuovere il sangue dal cuore.
      NOTA: la velocità della soluzione di passaggio è fondamentale e ha un impatto significativo sul risultato della qualità CM.
    5. Una volta che il sangue viene eliminato dal cuore, passare dalla soluzione A alla soluzione E (Tabella 2). Soluzione di titrate E con CaCl2 come indicato di seguito per una concentrazione finale di 0,1 mM nella soluzione:
      1. Dopo 10 minuti di perfusione, aggiungere 12,5 L di 0,1 M CaCl2.
      2. Dopo 15 minuti di perfusione, aggiungere 25 L di 0,1 M CaCl2.
    6. Lasciare che la soluzione enzimatica passi attraverso il cuore per altri 30-40 min, fino a quando il flusso diventa rapido e il cuore è flessibile.

4. Preparazione della sospensione CM a cella singola

  1. Preparazione della sospensione CM a cella singola (topo)
    1. Rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Di Langendorff. Spostarlo in un piatto Petri da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione enzimatica e trasferire il piatto in una cappa di biosicuzione.
      NOTA: Assicurarsi una digestione cardiaca sufficiente prima di rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Langendorff. Il tempo di digestione dipende dall'attività enzimatica, dal flusso della soluzione e dalle dimensioni del cuore.
    2. Eseguire qualsiasi ulteriore disaggregazione meccanica in una cappa di biosicuzione per garantire la sterilità ed evitare la contaminazione.
    3. Rimuovere con cura gli atri (1/4th della porzione di cuore basale) e tessuti grassi extra.
    4. Tritare il cuore con le bende in pezzi fini.
    5. Prendere una pipetta Pasteur sterile e tagliare la punta ad un angolo di 45o.
    6. Utilizzare questa pipetta Pasteur per erogare il tessuto cardiaco in una sospensione a un solo cellula mediante pipetta dolce. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti uni cellula.Optimal digestion provides a suspension of single-cell cardiomiocytes.
      NOTA: Rimuovere la parte inferiore stretta del tubo di trasferimento per ridurre i danni da CM dovuti alla bruciatura meccanica.
    7. Quindi, aggiungere 5 mL di soluzione di arresto per fermare l'attività enzimatica, che evita la possibilità di overdigestion.
    8. Prendere un fresco conico da 50 mL e posizionarci un colino sterile da 100 m per cellule.
    9. Passare la sospensione cardiomiocato attraverso il colino cellulare per rimuovere il pezzo di tessuto. Lavare il piatto Petri e il colino con altri 5 mL di soluzione di arresto(tabella 1) per raccogliere eventuali cardiomiociti che rimangono attaccati al colino.
  2. Preparazione della sospensione CM a cella singola (rat)
    1. Rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Di Langendorff. Spostare il cuore in un piatto Petri da 100 mm riempito con 5 mL di soluzione A e spostare il piatto in una cappa biosicurie.
      NOTA: Assicurarsi una digestione cardiaca sufficiente prima di rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Langendorff. Il tempo di digestione dipende dall'attività enzimatica, dal flusso della soluzione e dalle dimensioni del cuore.
    2. Eseguire qualsiasi ulteriore disaggregazione meccanica in una cappa di biosicuzione per garantire la sterilità ed evitare la contaminazione.
    3. Rimuovere con cura gli atri (1/4 della porzione di cuore basale) e i tessuti grassi extra.
    4. Tritare il cuore con le bende in pezzi fini.
    5. Prendere una pipetta Pasteur sterile e tagliare la punta ad un angolo di 45o.
    6. Utilizzare questa pipetta Pasteur per erogare il tessuto cardiaco in sospensione a unimo mediante pipetta dolce. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti uni cellula.Optimal digestion provides a suspension of single-cell cardiomiocytes.
      NOTA: Rimuovere la parte inferiore stretta del tubo di trasferimento per ridurre i danni da CM dovuti alla bruciatura meccanica.
    7. Aggiungere 5 mL della soluzione B (Tabella 2) alla sospensione CM e passare la soluzione attraverso un colino a cellule da 100 m per rimuovere eventuali pezzi di grasso rimanenti o altri tessuti non digeriti.
    8. Raccogliere il filtrato in una fresca fiala conica da 50 mL.
    9. Utilizzare altri 5 mL di soluzione B per lavare il piatto Petri e qualsiasi CM rimanente attraverso il colino cellulare.

5. Rimozione di non CPM

  1. Rimozione di non CCI dalla sospensione per uni cellulare per adulti (topo)
    1. Centrifugare la sospensione della cella a 20 x g per 3 min.
    2. Eliminare il supernata e risundere le celle in 10 mL della soluzione di arresto (Tabella 1).
      NOTA: Aumentare la concentrazione di BSA nella soluzione stop aumenterà la sua viscosità e ridurrà il tasso di sedimentazione dei non-CM.
    3. Riesponire i CM per leggera inversione del tubo 3-5 volte.
    4. A intervalli di 3 minuti, aggiungere 10 gradi di 100 M CaCl2 e mescolare. Ripetere tre volte.
    5. Dopo la quarta aggiunta, centrifugare la sospensione cardiomiocato a 20 x g per 3 min.
    6. Scarta il supernatant.
    7. Rispendere le CCI in pre-riscaldato (37 oC), il supporto di placcatura CM per topi adulti(Tabella 3).
  2. Rimozione di non PM dalle sospensioni monotono per adulti (rat)
    1. Cellule di pellet a 20 x g per 3 min a 25 oC.
    2. Eliminare il supernante e rispendere le cellule in 25 mL della soluzione B(Tabella 2).
    3. Mescolare le cellule per inversione delicata e posizionarlo in un supporto tubo per consentire al CM di stabilirsi sotto gravità.
    4. Scartare con cura il supernatant.
    5. Risundere le cellule in 25 mL fresche della soluzione B e a 1,0 mM CaCl2 con l'aggiunta graduale di 50 l, 75 l, e 100 l di 0,1 M CaCl2 a intervalli di 3-5 minuti.
      NOTA: In questa fase potrebbe essere utilizzata una maggiore concentrazione di BSA nella soluzione B. Aumentando la concentrazione di BSA nella soluzione B aumenta la viscosità e, quindi, riduce il tasso di sedimentazione dei non-CM.
    6. Cellule di pellet a 20 x g per 3 min a 25 oC, aspirare il supernante e aggiungere il volume desiderato di supporti di coltura delle cellule di ratto adulto (Tabella 4).
    7. Seme di MM su una piastra rivestita di laminina.
      NOTA: La pre-placcatura dei PM su una piastra di coltura non rivestita può essere utilizzata per ridurre al minimo la contaminazione delle cellule non CM.

6. Placcatura CM per adulti

  1. Pre-placcating
    1. Rispendere i cardiomiociti nei media di coltura.
    2. Pre-piastra le cellule in un piatto di 60 mm o 100 mm per topo o ratto CM, rispettivamente.
    3. Incubare i VM per 2 h in un'incubatrice integrata con il 5% di CO2 a 37 oC.
    4. Durante l'incubazione pre-piastra, rivestire le piastre di coltura cellulare con laminina (10 g/mL in PBS) per la coltura CM a lungo termine.
  2. Dopo 2 h di pre-placcatura, raccogliere i CM in una fiala conica da 50 mL.
  3. Raccogliere le cellule dal piatto e ri-plate in un laminin rivestito 24 piastra di coltura bene per esperimenti di trasfezione.
  4. Cellule di coltura in un incubatore a 37 oC integrato con 5% con CO2. 4-6 ore è sufficiente per aderire ai cardiomiociti con la superficie, e quindi, la trasfezione può essere eseguita 6 ore dopo la placcatura.
    NOTA: Il mezzo di placcatura contenente FBS è comunemente usato e mostra una migliore compatibilità con gli studi di proliferazione. Tuttavia, un mezzo privo di siero può essere utilizzato per esperimenti in cui vengono analizzati fattori secretori.

7. Trasfezione

  1. Incubare i PM alle piastre di coltura cellulare rivestite con laminina per 4-6 ore.
  2. Quattro ore dopo la semina CM sulla piastra rivestita di laminina, le cellule trasfect con siRNA (50 nM) di interesse utilizzando un reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamine RNAiMAX) secondo il protocollo del produttore.
  3. Cambiare i media 24 ore dopo la trasfezione e ogni 24 ore dopo per un massimo di 20 giorni.
  4. Dopo 20 giorni, fissare le cellule con 4% PFA in PBS per applicazioni a valle, tra cui l'immunocitochimica per marcatori cardiaci specifici come Troponin per garantire cardiomiociti vivi sono stati ri culturezzati con successo a lungo termine.

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Representative Results

L'attuale protocollo modificato consente un isolamento efficiente e la coltura di RAT e topi in vitro. Per l'isolamento del ratto CM, nella procedura sono stati utilizzati 3 ratti Fischer di sesso maschile adulto (12 settimane). Figura 1 mostra l'apparato chirurgico e le configurazioni di isolamento che sono necessari nella procedura; ogni parte è stata contrassegnata e descritta nella legenda della figura. Collagenase tipo 2 è stato utilizzato per la digestione, che produce un'elevata quantità di CM di alta qualità da un isolamento di successo (Figura 2A). Ventiquattro ore dopo l'isolamento, queste cellule sono state trasfettate con ciclo cellulare che induce siRNA specifici contro Rb1 e Meis2, mentre, cel-miR-67 è stato utilizzato come controllo della trasfezione nell'esperimento11. Le CCI sono state mantenute in impostazioni cultura per sette giorni (Figura 2B) o fino a venti giorni (Figura 2C) per osservare i cambiamenti morfologici. Per segnare per l'attività del ciclo cellulare, i CIM sono stati fissati il giorno 7 e macchiati per il marcatore specifico della frequenza cardiaca Troponin-I, marcatore mitotico KI67, e nucleo è stato visto attraverso DAPI (Figura 2D-F). Un aumento significativo dei cardiomiociti positivi KI67 è stato osservato con il trattamento siRb1-siMeis2 rispetto al controllo11. Inoltre, i cardiomiociti del ratto battevano (funzione contrattile) nella coltura il giorno sette post-plating, che è una caratteristica distintiva dei cardiomiocitisani 11.

Per l'isolamento CM nei topi, nella procedura sono stati utilizzati complessivamente 3 topi maschi e 3 femmine adulti (12 settimane) C57BL/6. Simile allo studio del ratto, il collagene di tipo 2 è stato utilizzato per digerire il collagene e la matrice extracellulare del cuore dei topi adulti. I topi adulti CM sono relativamente fragili per l'isolamento e la coltura in vitro; pertanto, questo protocollo utilizza la blebbistatin per migliorare la vitalità del CM del mouse adulto.Figure 3A-CFigure 3C In esperimenti separati, quattro ore dopo l'isolamento, i CPM per topi sono stati trafettati con un ciclo cellulare che induceva cocktail Rb1 di Meis2siRNA come descritto per il ratto CM. I CCI post-trasmettizione sono stati soggetti a tempo di imaging del corso per 10 giorni che mostravano i cambiamenti morfologici (Figura 4) che è seguito da un saggio di proliferazione (Figura 5). Il giorno 10, la colorazione immuno-fluorescente per Troponin-I, KI67 e DAPI è stata eseguita come descritto in precedenza. Un aumento significativo dei cardiomiociti positivi KI67 è stato osservato con il trattamento siRb1-siMeis2 rispetto al controllo (Figura 5A-C).

L'attuale protocollo dimostra che i RATTI adulti e i cime dei topi possono essere sevati in vitro a lungo termine per un massimo di 20 giorni e potenzialmente più a lungo. Dopo 20 giorni, i MM mantengono la loro colorazione Troponina-I e la contrattura se gli inibitori vengono rimossi dai media.

Composizione buffer miocite, pH 7.4 (Preparare e può essere conservato a 4 gradi centigradi)
Reagente Concentrazione, mM Molecolare wt. Per 1 litro
Nacl 113 58.44 6.6037 g
Kcl 4.7 74.5513 350.3911 mg
MgSO4 1.2 120.366 144.4392 mg
KH2PO4 0.6 136.086 81.6516 mg
NaH2PO4 0.6 119.98 71.988 mg
Buffer di perfusione, pH 7.4 (Preparare fresco per ogni isolamento)
Concentrazione, mM Molecolare wt. Importo richiesto
Buffer miocite 250 mL
HEPES 10 238.3012 595,75 mg
2,3-butanedione monossimina 10 101.105 252.775 mg
NaHCO3 Fresco 1.6 84.007 33.6028 mg
Taurine Fresco 30 125.15 938.625 mg
Glucosio Fresco 20 180.156 900.775 mg
Soluzione enzimatica
Magazzino Conc. Lavoro Conc. Obbligatorio
Buffer miocite 50 mL 50 mL
Collagenasi tipo 2 330 U/mg 620 U/mL 93 mg
Protease XIV >3,5 U/mg 0,104 U/mL 1,48 mg
DNase I grado 2 0,015 mg/mL
Interrompi buffer A
Magazzino Conc. Lavoro Conc. Obbligatorio
Buffer miocite 30 mL
Bsa 2.50% 0,75 g
CaCl2 100 mM 0,1 mM 30 L
Interrompi buffer B
Magazzino Conc. Lavoro Conc. Obbligatorio
Buffer miocite 30 mL
Bsa 5.00% 1,5 g
CaCl2 100 mM 0,1 mM 30 L

Tabella 1: Soluzioni necessarie per l'isolamento cardiomiocato per topi adulti.

10x Soluzione di stock KHB
(Volume totale 1L)
Reagente Molarità (mM) Importo (g)
Nacl 1180 68,9 g
Kcl 48 3,5 g
HEPES 250 59,7 g
MgSO4 12.5 1,4 g
K2HPO4 12.5 2,1 g
Regolare il pH a 7,4 con 4 M NaOH (20 mL), conservare a 4 gradi centigradi
Soluzione KHB, 500 mL Reagente Quantità
10x KHB 50 mL
Glucosio 0,99 g
Taurina 0,31 g
Aggiungere H2O per portare il volume a 500 mL, e il pH dovrebbe essere di 7,35 USD
Soluzione A Reagente Quantità
Soluzione KHB 500 mL (10 mM)
Bdm 0,5 g
Ossigenare con 100% O2 e caldo a 37 gradi centigradi
Soluzione B, 50 mL Reagente Quantità
Soluzione A 50 mL
Bsa 0,5 g
0,1 M CaCl2 (Ca 0,1 mM)++ 50 L
Soluzione E, 50mL Reagente Quantità
Soluzione A 50 mL
Bsa 0,05 g
Collagenasi di tipo II (263 unità/mg) 35 mg
Hyaluronidase (Tipo I-S) 10mg
0,1 M CaCl2 stock 12,5 L
Mescolare bene
CaCl2 Stock, 0,1 milioni Reagente Quantità
CaCl2 7,35 g
H2O 500 mL
Conservare a 4 gradi centigradi

Tabella 2: Soluzioni necessarie per l'isolamento cardiomiocato di ratto adulto.

Composizione multimediale di placcatura, pH 7.4
Concentrazione di lavoro Molecolare Wt. Importo richiesto
Media culturali senza Blebbistatin 50 mL
Bdm 10 mM 101.105 g/mol 50,55 mg
Fbs 5% 2,5 g
Composizione dei supporti di coltura, pH 7.4
Reagente Concentrazione di lavoro Molecolare Wt. Importo richiesto
DMEM 1X 250 mL
Insulina 1 g/mL 0,25 mg
Transferrina 0,55 g/mL 0,138 mg
Selenio 0,5 ng/mL 0,125 g
Penicillina (U/mL)-streptomicina (g/mL) 100-100 2,5 mL
HEPES 10 mM 238.3012 g/mol 595.753 mg
FBS 10% 25 mL
(BSA) 0.20% 0,5 g
#Blebbistatin 25 M 292.338 g/mol 1,8271 mg
- Utilizzare uno di essi, in base al requisito sperimentale.
Aliquot i media di cultura per preparare i media di placcatura prima di aggiungere Blebbistatin.
NOTA: Preparare 200 mL di supporti culturali.
NOTA: Preparare 50 mL di supporti di placcatura.

Tabella 3: Composizione multimediale per la placcatura e la cultura del cardiomiocte per topi adulti.

Composizione dei supporti di coltura, pH 7.4
Reagente Concentrazione di lavoro Importo richiesto
DMEM 1x 250 mL
Penicillina (U/mL)-streptomicina (g/mL) 100-100 2,5 mL
FBS 10% 25 mL

Tabella 4: Composizione media per la placcatura e la coltura del cardiomiocte ratto adulto.

Figure 1
Figura 1: Configurazione e attrezzatura della procedura. (I) Rappresentazione schematica della perfusione. (II) Strumenti chirurgici e ago di cannulation. (III) Assemblaggio per la perfusione cardiaca: A) Giacca riscaldante. B) Doppia parete water jacket vaso. C) Ingresso di acqua riscaldata circolante. D) Presa d'acqua riscaldata circolante. E) Soluzione per la perfusione cardiaca. F) Pompa circolante G) Tubo di soluzione perfusione. H) Tubo di alimentazione dell'ossigeno. I) Bagno d'acqua circolante. J) Ago di cannulation con cuore, attaccato alla porta di uscita perfusione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: isolamento CM ratto adulto, trasfezione e cultura a lungo termine. A) Ratto adulto CM, subito dopo l'isolamento. B) Ratto adulto CM il giorno 7 dopo l'isolamento. C) Ratto adulto CM il giorno 20. D-F) KI67 ratto positivo CM il giorno 7 dopo la trasfezione siRb1-siMeis2. Troponina-I - verde; DAPI - blu; KI67 - rosso. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato e ripetuti almeno tre volte. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Isolamento CM per topi adulti e cultura a lungo termine. A) Topi adulti CM, subito dopo l'isolamento. B) Topi adulti CM il giorno 7 dopo l'isolamento. C) Topi adulti CM macchiati con Troponina Cardiaca-I - verde il giorno 20. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: de-differenziazione CM del mouse adulto. I topi adulti CM che mostrano cambiamenti morfologici durante la coltura a lungo termine (giorno 0 al giorno 10) nei supporti DMEM-HG, integrati con 10%FBS. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Trasfezione e proliferazione CM per topi adulti. A-C) KI67 mouse CM positivo il giorno 10 dopo la trasfezione siRb1-siMeis2. Troponina-I - verde; DAPI - blu; KI67 - rosso. D) Il grafico a barre mostra un aumento significativo delle CPM di topo adulto positivo KI67 nel gruppo trasfetto siRNA-cocktail rispetto al controllo. I risultati sono presentati come media±SEM; Valore p ≤0,05. il valore p ≤0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato (n. 3 Maschio,3 Femminile). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

C'è una necessità fondamentale di stabilire un protocollo per l'isolamento dei cardiomiocisti adulti e la coltura a lungo termine per eseguire studi meccanicistici specifici delle cellule. Ci sono solo pochi rapporti che parlano di protocolli di isolamento CM adulti, e ancora meno di loro sono utilizzati per la coltura a lungo termine di topi adulti CM15,16,17. È stato dimostrato che il ratto adulto CM ha una maggiore tolleranza alla coltura in vitro rispetto ai topi adulti CM10,11,12. In questa relazione, stabiliamo un protocollo per l'isolamento CM di ratti e topi adulti, la trasfezione del siRNA, la coltura a lungo termine e l'analisi a valle della proliferazione indotta, con modifiche minime nei protocolli regolarmente utilizzati.

I protocolli disponibili per l'isolamento CM adulto si basano sull'uso di due enzimi noti, collagenasi e libera, per la digestione a matrice extracellulare (ECM)18,19. La collagenasi è un enzima comunemente usato nei protocolli di isolamento CM adulti. Collagenasi digerisce le fibre di collagene nell'ECM, che si traduce nella dissociazione del tessuto cardiaco nel CM unincescolare. Allo stesso modo, liberare digerisce l'ECM. Liberase è l'alternativa purificata per il collagenasi, che mostra una maggiore attività e quindi richiede una maggiore precisione durante l'isolamento CM per ottenere un isolamento di successo rispetto al collagene. Inoltre, nella procedura, abbiamo notato che il CM isolato con libera non sopravvive nella cultura a lungo termine. Tuttavia, CM isolato con collagenasi migliora la longevità di CM nelle condizioni di coltura.

Inoltre, abbiamo usato uno specifico inibitore di miosina II chiamato blebbistatin nei media di coltura per la coltura a lungo termine del topo adulto CM20,21. In precedenza, 2,3-butanedione monoximina (BDM) è stato utilizzato per la cultura CM adulto. BDM è un inibitore ATPase che inibisce la funzione contrattile attraverso un meccanismo mal definito che include l'inibizione di ATPasee alterata transizione Ca. Rispetto al BDM, la blebbistatina è un inibitore specifico della miosina II e mostra un'inibizione più significativa della funzione contrattile a concentrazioni inferiori rispetto al BDM. Una pre-placcatura del topo adulto CM in un supporto di coltura, integrato con 10 mM di BDM e le successive culture del CM nel supporto blebbistatin-integrato e basso siero 25-M migliora la sopravvivenza e la struttura della forma dell'asta di CM nella cultura a lungo termine. Tuttavia, una placcatura diretta del topo adulto CM nei media, integrata con 25 blebbistatin di M e 10% FBS è meglio per gli studi proliferative. Simile al ratto adulto CM, che mostra una grande de-differenziazione nella coltura in vitro, abbiamo anche osservato la de-differenziazione nel topo adulto CM in una certa misura (Figura 5). I cambiamenti morfologici sono il passo necessario per la proliferazione. Così, fornire un ambiente per adulti CM che facilita la loro de-differenziazione è un fattore critico da considerare in tali studi. Anche se in questo momento, non è chiaro quale dei passaggi o dei componenti esatti utilizzati in questo protocollo sia responsabile della migliore longevità delle CMS adulte, riteniamo che si tratta di un effetto combinato dei reagenti utilizzati, delle modifiche apportate nella procedura di isolamento e, forse, soprattutto delle mani addestrate.

Simile ai rapporti precedenti che mostrano la trasduzione virale del CM adulto nei media integrati dalla blebbistatina, abbiamo anche osservato un'efficiente trasfezione di queste cellule con siRNA. Abbiamo usato siRNA specifici contro due geni associati alla senescenza, Rb1 e Meis2, per indurre la proliferazione cm. Per il ratto CM, abbiamo eseguito l'analisi KI67 per valutare la proliferazione il giorno sette dopo la trasfezione; tuttavia, la proliferazione nel CM adulto dei topi è stata analizzata il giorno dieci dopo la trasfezione. Una variabilità biologica specifica della specie potrebbe essere una possibile ragione per la differenza di orario osservata nel rientro del ciclo cellulare indotto del ratto adulto e del topo CM.

Nel complesso, il protocollo qui descritto fornisce una procedura migliorata, affidabile e comparativa per isolare il CM di ratto e topo adulto, e di conseguenza li ha coltura in base alle esigenze sperimentali. Inoltre, questo protocollo consente una coltura a lungo termine del CM adulto, che fornisce un sistema in vitro per eseguire varie analisi a lungo termine come la proliferazione, il fattore paracrino, la risposta allo stress, ecc.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Cincinnati, College of Medicine, al Dr. Onur Kanisicak; una sovvenzione del National Institutes of Health (R01HL148598) al Dr. Onur Kanisicak. Il Dr. Onur Kanisicak è supportato dall'American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam è supportato dalla sovvenzione post-dottorato American Heart Association (AHA_20POST35200267). La dott.ssa Malina J. Ivey è supportata da una sovvenzione NIH T32 (HL 125204-06A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butane Dione monoxime Sigma-Aldrich B-0753
Blebbistatin APExBIO B1387
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059
CaCl2 Sigma-Aldrich 449709
Cell culture plate Corning Costar 3526
Cell strainer BD Biosciences 352360
Cel-miR-67 Dharmacon CN-001000-01-50
Collagenase type2 Worthington LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes Sigma-Aldrich Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium Thermo Scientific SH30022.01
EdU Life Technologies C10337
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps Fisherbrand 22-327379
Glucose Sigma-Aldrich G-5400
Hemocytometer Hausser Scientific 1483
Heparin Sagent Pharmaceuticals PSLAB-018285-02
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-128
Hyaluronidase Sigma H3506
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P-8281
KCl Sigma-Aldrich 746436
Light Microscope Nikon
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778-150
MgSO4 Sigma-Aldrich M-2643
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Fisher Scientific S318-500
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-CI
Pentobarbital Henry Schein 24352
Phosphate buffered saline Life Technologies 20012-027
Protease XIV Sigma-Aldrich P5147-1G
Selenium Sigma-Aldrich 229865+5G
siMeis2 Dharmacon s161030
siRb1 Dharmacon s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors Fisher Scientific 28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps Fisherbrand 16-100-120
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Transferrin Sigma-Aldrich T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor Fisherbrand 22-079-747
Water Bath Fisher Scientific 3006S

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References

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Biologia Problema 164 Cardiomiocato Ratto Topo Ex-vivo Cultura a lungo termine Trafezione Proliferazione
Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti
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Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M.More

Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (164), e61073, doi:10.3791/61073 (2020).

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