Summary
여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
성인 포유류 심근세포(CM)의 전 생체 배양은 심장 생물학의 체외 연구를 위한 가장 관련성이 있는 실험 시스템을 제시합니다. 성인 포유류 CM은 최소한의 증식 능력을 가진 말기 분화 세포입니다. 성인 CM의 미토틱 후 상태는 심근세포 세포 주기 진행을 제한할 뿐만 아니라 CM의 효율적인 배양을 제한합니다. 더욱이, 성인 CM의 장기 배양은 CM 증식 및 유전자 발현의 분석과 같은 많은 연구 결과에 필요합니다.
마우스와 쥐는 심근세포 분리에 사용되는 두 가지 가장 바람직한 실험실 동물이다. 쥐 CM의 장기 문화가 가능하지만 성인 마우스 CM은 사망에 취약하며 정상적인 조건에서 5 일 이상 배양 할 수 없습니다. 따라서 성인 뮤린 CM에 대한 세포 격리 및 장기 배양 프로토콜을 최적화해야 하는 중요한 필요성이 있습니다. 이 수정된 프로토콜을 사용하면 성인 마우스와 쥐 CM을 20일 이상 성공적으로 분리하고 배양할 수 있습니다. 더욱이, 고립된 CM의 siRNA 경질 효율은 이전 보고에 비해 현저히 증가된다. 성인 마우스 CM 절연의 경우, 랑엔도르프 관류 방법은 최적의 효소 용액과 완전한 세포 외 매트릭스 해리를위한 충분한 시간으로 활용됩니다. 순수한 심실 CM을 얻기 위해, 모두 분리 및 도금을 진행하기 전에 해부 및 폐기되었다. 세포는 효율적이고 신속한 부착을 허용 라미닌 코팅 플레이트에 분산되었다. CM은 siRNA 경질 전에 4-6 h에 정착할 수 있었습니다. 배양 매체는 20일마다 24시간마다 리프레시되었고, 그 후, CM은 KI67과 같은 세포 주기의 트로포닌 및 마커와 같은 심장 특정 마커에 대해 고정및 염색되었다.
Introduction
심장 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 심장 상해의 거의 모든 모형은 성인 심근세포 (CMs)의 중요한 손실 귀착됩니다. 성인 포유류 심장은 성인 CM1의노화 특성으로 인해 심장 손상을 복구 할 수 없습니다. 따라서, 성인 포유류 심장에 어떤 모욕은 감소 심장 기능 및 심부전으로 이끌어 내는, CMs의 영원한 손실 결과로 초래됩니다. 성인 포유동물과 달리, 제브라피쉬와 새로운 심장과 같은 작은 동물은 기존의 CM 증식2,,3,,4를통해 심장 손상을 재생할 수 있다. 전 세계적으로 확산 및 비 증식 접근 방식을 통해 심장 부상에 대한 새로운 치료 개입을 찾기 위한 노력이 진행중입니다. 지난 수십 년 동안, 유전 마우스 모델의 다양한 유형은 심장 부상과 수리를 연구하기 위해 개발되었습니다. 그러나 생체 내 동물 모델을 사용하는 것은 이차 효과로부터 세포 자율 메커니즘을 해독하기 위한 추가적인 복잡성으로 고가의 접근법이 계속되고 있다. 게다가, 생체 내 시스템은 CM에서 심장 보호 신호를 유도하는 약리학적 개입의 CM 특이적 효과를 분석하기 가 어렵습니다.
또한 CM 증식 분석을 수행하기 위해서는 성인 CM의 장기적인 문화가 필요합니다. CM 증식 분석법은 세포가 세포 주기로 유도되고 그 후에 정확한 데이터를 얻기 위하여 세포에 대한 최소 4-5 일이 필요합니다. 또한, 전기생리학 연구를 위해 고립된 CM을 활용하는 연구, 약물 스크리닝, 독성 연구, Ca++ 항상성 연구는 모두 개선된 배양 시스템5,,6,,7이필요하다. 더욱이, 최근 연구는 CM (심장 카인)8,,9에서분비 된 사이토카인의 심장 보호 의의를 보여줍니다. 심장 수리 및 재생 중에 이러한 심장 키인의 치료 역할 및 분자 메커니즘을 조사하기 위해서는 장기간 문화가 필요합니다.
성인,쥐 CM은 체외시스템(10,11,12)에서단세포 절연 및 장기 배양을 충분히 견고하다., 그러나, 성인용 마우스 CM은 쥐 CM13로는불가능한 다양한 혁신적인 분석의 설계 및 실행을 허용하는 다양한 유전자 변형 마우스 모델의 가용성으로 인해 체외 분석에 큰 관심을 갖는다. 성인 쥐 CM 격리와는 달리, 성인 마우스 심혼에게서 단세포 정지를 얻는 것은 아주 도전적이고, 문화에서 성인 마우스 CMs의 장기 문화는 더욱 도전적입니다.
랑엔도르프 시스템을 이용한 마우스및 쥐 심혼으로부터의 성인 CM 절연은 이전에 CM 기능5,,14,,15를연구하기 위해 설립되었다. 여기서, 우리는 쥐와 마우스 둘 다에서 성인 CM 절연을 위한 프로토콜뿐만 아니라, 격리된 세포의 수정된 장기 배양, 형질, CM 증식을 상세히 기술했습니다.
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Protocol
모든 실험은 미국 국립 보건원(NIH)에 의해 간행된 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 지침에 따라 수행되어야 합니다. 비디오에 표시된 모든 프로토콜은 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 마우스 (및 쥐)에서 심장 추출 전에 준비
- 표 1 및 표 2에주어진 조리법에 따라 해당 관류, 효소 및 정지 용액을 각각 쥐와 마우스 절연을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링하여 오염 또는 용해되지 않은 입자를 제거합니다.
- 수술기구를 70% 알코올로 15분 동안 담그고 두 번 증류수로 세척하여 세척합니다. 깨끗한 종이 타월에 공구를 말리십시오.
- 수조를 37ºC로 예열하십시오. 수조의 수위를 확인하여 시술 중에 관류 장치를 통해 따뜻한 물의 중단없이 순환되도록 하십시오.
- 5 분 동안 70 % 알코올로 실행하여 관혈 장치를 청소하십시오.
참고: 튜브를 청소하는 데 도움이 되는 유량을 증가시면 됩니다. - 알코올 이 흘러 후, 10 분 동안 이중 증류수를 실행하여 알코올의 잔해를 청소합니다.
- 절제 후 심장을 청소하기 위해 중간 크기의 일회용 폴리스티렌 계량 접시 3개를 설정합니다. 20mL의 심근세포 버퍼로 접시를 채웁니다.
- 파스퇴르 파이펫의 도움으로 각 접시에 헤파린 2-3 방울을 넣고 여러 번 파이펫을 섞어 잘 섞습니다.
- 무딘 바늘 캐뉼라와 함께 10mL 주사기를 가져 가라.
참고 : 무딘 바늘 캐뉼라는 깨끗하고 멸균 된 바늘의 끝을 절단하여 제조 할 수 있습니다. 21G 바늘과 14G 바늘은 각각 마우스와 쥐에 대한 캐뉼라를 만드는 데 사용되었다. - 주사기를 관류 완충액(표1)으로채웁니다. 주사기에서 기포를 제거하고 각진 위치에 세 번째 접시에 놓습니다. 테이프로 고정하십시오.
참고: 쥐의 경우, 솔루션A(표 2)는심근세포 관류 버퍼 대신 사용하였다. - 수술 봉합사로 느슨한 매듭을 준비하고 바늘 주위에 놓습니다.
- 헤파린 (100 USP 단위/마우스)으로 마우스를 주입하여 관면 주사로, 마취 주사 20 분 전에.
- 심구세포 관류버퍼(표 1)를관류 장치를 통해 순환한다. 유량을 3mL/분으로 줄입니다.
참고: 쥐의 경우, 솔루션A(표 2)는심근세포 관류 버퍼 대신 사용하였다. - 5 분 후, 관혈 완충을 효소 용액(표 1)으로교체하십시오. 공정 중에 효소 용액을 산소로 포화시합니다. 3 mL/분의 유량을 사용합니다.
참고: 쥐 CM 격리의 경우 솔루션E(표 2)를대신 사용합니다. - 마취의 관면 주사에 의해 마우스를 마취. 말기 수술에 대한 IACUC에 의해 권장 마취의 적절한 복용량을 사용합니다.
- 발가락 핀치에 대한 응답의 부족으로 마취의 충분한 깊이를 확인합니다. 그런 다음, 수술 플랫폼에 마우스를 넣어.
2. 성인 마우스 (및 쥐)에서 심장 추출
- 70%의 알코올로 닦아 피부를 살균합니다.
- 조심스럽게 가슴을 엽니 다.
- 마음을 흥분시다. 절제 하는 동안 비 심장 조직을 피하십시오.
- 관류 완충(표 1)으로채워진 첫 번째 접시에 하트를 넣습니다.
참고: 쥐용 솔루션A(표 2)를사용합니다. - 부드럽게 압박하여 심장에서 피를 치웁울 수 있습니다.
- 하트를 두 번째 요리로 옮기습니다.
- 심장에서 혈액을 청소하 고 비 심장 조직을 제거 합니다. 그 후, 세 번째 접시에 마음을 전송합니다.
- 폐 및 기타 주변 조직을 손질하고 오름차순 대오르타를 통해 캐너레이. 이 절차는 CM 품질과 수량을 향상시키기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야합니다 (&5 분).
3. 심장의 소화
- 마우스 심장의 소화
참고: 마우스 심장을 통해 순환하는 모든 솔루션/버퍼는 시술 내내 산소처리되어야 합니다.- 주사기에서 캐뉼링 바늘을 조심스럽게 제거하고 랑엔도르프 관류 장치에 연결하십시오.
- 효소 용액과 소화의 흐름에 영향을 미칠 수있는 심장으로 가는 기포를 피하십시오.
- 워터 재킷을 위로 이동하여 심장에 균일한 환경을 제공합니다. 효소 용액이 2-3 mL/분의 속도로 심장을 통해 흐르도록 허용하십시오.
참고: 통과 솔루션의 속도는 매우 중요하며 CM 수량 및 품질 의 결과에 큰 영향을 미칩니다. - 효소 용액이 심장을 통해 2 분 동안 흐르게하십시오.
- 2분 후 효소 용액에 100 μM CaCl2 용액의 40 μL을 넣고 섞는다. 효소 용액이 심장을 통과하여 10-15분 간 더 지나도록 하십시오.
참고: 흐름이 부드러워지면 심장이 갈색이 되고 부드러워져 콜라게나제 효소의 균일한 분포와 심장의 적절한 소화를 나타냅니다.
- 쥐 심장의 소화
참고: 쥐 심장을 통해 순환하는 모든 솔루션/버퍼는 시술 내내 산소처리되어야 합니다.- 주사기에서 캐뉼링 바늘을 조심스럽게 제거하고 랑엔도르프 관류 장치에 연결하십시오.
- 효소 용액과 소화의 흐름에 영향을 미칠 수있는 심장으로 가는 기포를 피하십시오.
- 워터 재킷을 위로 이동하여 심장에 균일한 환경을 제공합니다.
- 3-5 분 동안 2-3 mL /min의 속도로 솔루션 A의 흐름을 시작하여 심장에서 혈액을 제거하십시오.
참고: 전달 솔루션의 속도는 매우 중요하며 CM 품질 결과에 큰 영향을 미칩니다. - 혈액이 심장에서 제거되면 용액 A에서 용액 E(표 2)로전환하십시오. 솔루션에서 0.1 mMM의 최종 농도에 대해 아래와 같이 CaCl2를 가진 Titrate 솔루션 E:
- 관류 10분 후 0.1 M CaCl2의12.5 μL을 추가하십시오.
- 관류 15분 후 0.1 M CaCl2의25 μL을 추가하십시오.
- 효소 용액이 흐름이 급속해지고 심장이 유연해질 때까지 30-40분 동안 심장을 통과하게 하십시오.
4. CM 단세포 서스펜션 준비
- CM 단세포 서스펜션(마우스) 제제
- 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거합니다. 5mL의 효소 용액으로 채워진 60mm 페트리 접시로 옮기고 접시를 생물 안전 후드로 옮기습니다.
참고: 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거하기 전에 충분한 심장 소화를 보장하십시오. 소화 시간은 효소 활성, 용액의 흐름 및 심장 크기에 따라 달라집니다. - 멸균을 보장하고 오염을 방지하기 위해 생물 안전 후드에서 더 이상의 기계적 분리를 수행하십시오.
- 조심스럽게 아리아 (기저 심장 부분의 1/4일) 및 여분의 지방 조직을 제거합니다.
- 집게로 하트를 미세한 조각으로 다진다.
- 멸균 파스퇴르 파이펫을 넣고 45º 각도로 팁을 잘라냅니다.
- 이 파스퇴르 파이펫을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 심장 조직을 단일 세포 서스펜션에 분배하십시오. 최적의 소화는 단세포 심근세포의 현탁액을 제공합니다.
참고: 기계식 타선으로 인한 CM 손상을 줄이기 위해 이송 파이프의 좁은 하단 부분을 제거합니다. - 그런 다음, 과다 소화의 가능성을 방지 효소 활성을 중지하는 정지 용액의 5 mL을 추가합니다.
- 신선한 50mL 원식을 가지고 멸균 100 μm 세포 여과기를 놓습니다.
- 세포 스트레이너를 통해 심근세포 현탁액을 전달하여 조직 덩어리를 제거합니다. 페트리 접시와 스트레이너를 또 다른 5mL스톱 용액(표1)으로세척하여 여과기에 부착된 심근구를 수집합니다.
- 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거합니다. 5mL의 효소 용액으로 채워진 60mm 페트리 접시로 옮기고 접시를 생물 안전 후드로 옮기습니다.
- CM 단세포 서스펜션(rat)의 준비
- 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거합니다. 5mL의 솔루션 A로 채워진 100mm 페트리 접시로 하트를 이동하고 접시를 생물 안전 후드로 옮습니다.
참고: 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거하기 전에 충분한 심장 소화를 보장하십시오. 소화 시간은 효소 활성, 용액의 흐름 및 심장 크기에 따라 달라집니다. - 멸균을 보장하고 오염을 방지하기 위해 생물 안전 후드에서 더 이상의 기계적 분리를 수행하십시오.
- 조심스럽게 아리아 (기저 심장 부분의 1/4)와 여분의 지방 조직을 제거합니다.
- 집게로 하트를 미세한 조각으로 다진다.
- 멸균 파스퇴르 파이펫을 넣고 45º 각도로 팁을 잘라냅니다.
- 이 파스퇴르 파이펫을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 심장 조직을 단일 세포 서스펜션에 분배하십시오. 최적의 소화는 단세포 심근세포의 현탁액을 제공합니다.
참고: 기계식 타선으로 인한 CM 손상을 줄이기 위해 이송 파이프의 좁은 하단 부분을 제거합니다. - 5mL의 용액B(표 2)를CM 서스펜션에 넣고 100 μm 세포 여과기를 통과하여 남은 지방 또는 기타 비소화 조직을 제거합니다.
- 신선한 50mL 원물 유리병에 여과물을 수집합니다.
- 또 다른 5mL의 용액 B를 사용하여 페트리 접시와 나머지 CM을 세포 여과기를 통해 세척하십시오.
- 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 제거합니다. 5mL의 솔루션 A로 채워진 100mm 페트리 접시로 하트를 이동하고 접시를 생물 안전 후드로 옮습니다.
5. 비 CM 의 제거
- 성인 단일 셀 서스펜션(마우스)에서 비-CM 제거
- 3 분 동안 20 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
- 상체를 버리고 정지 용액의 10mL에서 셀을 다시 일시 중지합니다(표1).
참고: 정지 솔루션에서 BSA의 농도를 늘리면 점도가 증가하고 비 CM의 퇴적율을 줄입니다. - 튜브의 부드러운 반전으로 3-5 번 PM을 다시 중단하십시오.
- 3분 간격으로 100 μM CaCl2 용액의 10 μL을 추가하고 혼합합니다. 세 번 반복합니다.
- 네 번째 첨가 후 심근세포 현탁액을 20 x g에서 3 분 동안 원심 분리합니다.
- 상부체를 폐기합니다.
- 미리 따뜻하게 된 (37 ºC), 성인 마우스 CM 도금 매체(표 3)에서CM을 다시 중단합니다.
- 성인 단일 세포 서스펜션(rat)에서 비-CM 제거
- 25 ºC에서 3 분 동안 20 x g의 펠릿 셀.
- 상체를 버리고 세포를 용액B(표 2)의25mL로 재연한다.
- 부드러운 반전으로 세포를 혼합하고 CM이 중력 아래에 정착 할 수 있도록 튜브 스탠드에 배치합니다.
- 상체를 조심스럽게 폐기하십시오.
- 용액 B의 신선한 25mL에서 세포를 다시 중단하고 3-5 분 간격으로 50 μL, 75 μL 및 100 μL의 100 μL을 단계적으로 추가하여 1.0 mM CaCl2로 적시한다.2
참고: 솔루션 B의 BSA 농도가 높을수록 이 단계에서 사용할 수 있습니다. 용액 B에서 BSA의 농도를 증가시켜 점도가 증가하여 비-CM의 침전율을 감소시킨다. - 펠릿 세포는 25 ºC에서 3분 동안 20 x g로, 수퍼내탄을 흡인하고, 성인 쥐 세포 배양 배지의 원하는 부피를 추가한다(표4).
- 라미닌 코팅 플레이트에 씨앗 CM.
참고: 비 코팅 된 배양 판에 있는 CM의 사전 도금은 비 CM 세포의 오염을 최소화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
6. 성인 CM 도금
- 사전 도금
- 심근세포를 문화 매체로 다시 중단합니다.
- 각각 마우스 또는 쥐 CM에 대한 60mm 또는 100mm 접시에 세포를 사전 플레이트.
- 인큐베이터에서 2h에 대한 인큐베이션 CM을 37 ºC에서 5% CO2로 보충합니다.
- 프리 플레이트 인큐베이션 동안, 장기 CM 배양에 대한 라미닌 (PBS에서 10 μg /mL)으로 세포 배양 판을 코팅합니다.
- 2 시간 전 도금 후 50 mL 원내 유리병에서 CM을 수집합니다.
- 접시에서 세포를 수집하고 전환 실험을 위해 코팅 된 24 개의 잘 배양 판으로 다시 접시를 놓습니다.
- 37 ºC에서 인큐베이터의 배양 세포는 CO2로5%로 보충하였다. 4-6시간은 표면을 가진 심근구를 부착하기에 충분하므로, 따라서, 트랜스퍼트는 6시간 후 도금을 수행할 수 있다.
참고: FBS를 함유하는 도금 매체는 일반적으로 사용되며 증식 연구와 더 나은 호환성을 보여줍니다. 그러나, 혈청 없는 매체는 분비 요인이 분석되고 있는 실험에 사용될 수 있다.
7. 트랜스페션
- 4-6 시간 동안 라미닌으로 코팅 된 세포 배양 판에 CM을 배양한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 혈중 플레이트에 CM 파종 후 4시간, siRNAs(50nM)를 이용한 트랜스펙트 세포(예를 들어, 리포펙타민 RNAiMAX)를 이용하여 관심 있는 세포.
- 트랜지션 후 24시간, 그 후 24시간마다 미디어를 최대 20일 동안 변경합니다.
- 20일 후, 살아있는 심근세포가 성공적으로 배양되었는지 확인하기 위해 트로노닌과 같은 심장 특정 마커에 대한 면역 세포화학을 포함하여 다운스트림 애플리케이션을 위해 PBS에서 4% PFA를 가진 세포를 수정하였다.
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Representative Results
현재 수정된 프로토콜은 시험관내에서 쥐와 마우스 CM의 효율적인 격리 와 배양을 허용한다. 쥐 CM 격리의 경우, 총 3 명의 성인 (12 주 된) 남성 피셔 344 랫트가 이 시술에 사용되었습니다. 도 1은 수술에 필요한 수술 장치 및 격리 설정을 나타낸다; 각 부품이 그림 범례에 표시되고 설명되었습니다. 콜라게나아제 타입 2는 소화에 사용되었으며, 이는 성공적인 절연으로부터 고품질 의 CM의 높은 양을 산출한다(그림2A). 24시간 후 격리, 이들 세포는 Rb1 및 Meis2에대한 특정 siRNA를 유도하는 세포 주기로 전염된 반면, cel-miR-67은실험(11)에서경질 제어로 사용되었다. CM은 형태학적 변화를 관찰하기 위해 7일(도2B)또는 최대 20일(도2C)에대한 문화권에서 유지되었다. 세포 주기 활성에 대한 점수를 매기기 위해, CM은 7일째에 고정되었고 심장 특이적 마커 트로포닌-I, 미토틱 마커 KI67, 핵을 DAPI(도2D-F)를통해 시각화하였다. KI67 양성 심근세포의 현저한 증가는 대조군11에비해 siRb1+siMeis2 치료로 관찰되었다. 더욱이, 쥐 심근세포는 건강한심근세포(11)의특징인 7일째 후 도금에서 배양(수축기능)을 치고 있었다.
마우스에서 CM 절연을 위해, 총 3명의 남성 및 3명의 여성 성인(12주령) C57BL/6 마우스가 시술에서 사용되었다. 쥐 연구와 유사하게, 콜라게나아제 타입 2는 성인 마우스 심혼의 콜라겐 및 세포외 매트릭스를 소화하기 위하여 이용되었다. 성인 마우스 CM은 체외에서 격리 및 문화에 비교적 취약합니다. 따라서, 이 프로토콜은 블리비스타틴을 사용하여 성인 마우스 CM의 생존가능성을 향상시킵니다.Figure 3A-CFigure 3C 별도의 실험에서, 4시간 후 격리, 마우스 CM은 쥐 CM에 대해 설명한 바와 같이 siRNA 칵테일을 유도하는 세포 주기로 전염되었다. Meis2 Rb1 형질 전환 후 CM은 확산분석(도5)에이어 형태학적 변화를 보여주는 10일 동안 의시간 과정 영상의 적용을 받았다. 10일째에는 트로포닌-I, KI67 및 DAPI용 면역형 염색이 이전에 설명된 대로 수행되었다. KI67 양성 심근세포의 현저한 증가는 대조군(그림5A-C)에비해 siRb1+siMeis2 치료로 관찰되었다.
본 프로토콜은 성인 쥐와 마우스 CM이 최대 20 일 및 잠재적으로 더 이상 시험관에서 장기 배양 될 수 있음을 보여줍니다. 20 일 후, CM은 억제제가 미디어에서 제거되는 경우 자신의 트로포닌 -I 염색뿐만 아니라 수축을 유지합니다.
| 심근 세포 완충 조성, pH 7.4 (4 °C에서 저장 될 수 있습니다) | |||
| 시약 | 농도, mM | 분자 wt. | 1 리터용 |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| KCl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 mg |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81.6516 mg |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mg |
| 관류 버퍼, pH 7.4 (각 격리에 대해 새로 준비) | |||
| 농도, mM | 분자 wt. | 필요한 금액 | |
| 심근 세포 버퍼 | 250 mL | ||
| 헤페스 | 10 | 238.3012 | 595.75 mg |
| 2,3-부탄네디온 단화민 | 10 | 101.105 | 252.775 mg |
| 나에코3 신선함 | 1.6 | 84.007 | 33.6028 mg |
| 타우린 프레쉬 | 30 | 125.15 | 938.625 mg |
| 포도당 신선한 | 20 | 180.156 | 900.775 mg |
| 효소 용액 | |||
| 스톡 콘. | 작업 Conc. | 필수 | |
| 심근 세포 버퍼 | 50mL | 50mL | |
| 콜라게나아제 타입 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mg |
| 프로테제XIV | >3.5 U/mg | 0.104 U/mL | 1.48 mg |
| DNase I 학년 2 학년 | 0.015 mg/mL | ||
| 버퍼 A 중지 | |||
| 스톡 콘. | 작업 Conc. | 필수 | |
| 심근 세포 버퍼 | 30mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0.75 g | |
| CaCl2 | 100mM | 0.1 mM | 30 μL |
| 버퍼 B 중지 | |||
| 스톡 콘. | 작업 Conc. | 필수 | |
| 심근 세포 버퍼 | 30mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1.5 g | |
| CaCl2 | 100mM | 0.1 mM | 30 μL |
표 1: 성인 마우스 심근세포 격리에 필요한 솔루션입니다.
| 10x KHB 스톡 솔루션 (총 볼륨 = 1L) |
시약 | 어모함 (mM) | 양(g) |
| Nacl | 1180 | 68.9 g | |
| KCl | 48 | 3.5 g | |
| 헤페스 | 250 | 59.7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1.4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2.1 g | |
| pH를 4M NaOH(~20mL)로 7.4로 조정하고 4°C에 저장합니다. | |||
| KHB 솔루션, 500mL | 시약 | 금액 | |
| 10x KHB | 50mL | ||
| 포도 당 | 0.99 g | ||
| 황소자리 | 0.31 g | ||
| 500mL에 볼륨을 가져오기 위해 H2O를 추가하고 pH는 ~ 7.35여야 합니다. | |||
| 솔루션 A | 시약 | 금액 | |
| KHB 솔루션 | 500mL (10mM) | ||
| Bdm | 0.5 g | ||
| 100% O2로 산소를 공급하고 37°C까지 따뜻합니다. | |||
| 솔루션 B, 50mL | 시약 | 금액 | |
| 솔루션 A | 50mL | ||
| Bsa | 0.5 g | ||
| 0.1 M CaCl2 (Ca++=0.1 mM) | 50 μL | ||
| 솔루션 E, 50mL | 시약 | 금액 | |
| 솔루션 A | 50mL | ||
| Bsa | 0.05 g | ||
| 콜라게나제 타입 II (263 단위/mg) | 35 mg | ||
| 히알루로니다제 (I-S 타입) | 10 mg | ||
| 0.1 M CaCl2 주식 | 12.5 μL | ||
| 잘 섞으세요 | |||
| CaCl2 주식, 0.1M | 시약 | 금액 | |
| CaCl2 | 7.35 g | ||
| H2O | 500 mL | ||
| 4°C에 보관 | |||
표 2: 성인 쥐 심근세포 격리에 필요한 솔루션입니다.
| 도금 미디어 구성, pH 7.4 | |||
| 작업 집중 | 분자 Wt. | 필요한 금액 | |
| 블레비스타틴이 없는 문화 미디어 | 50mL | ||
| Bdm | 10mM | 101.105 g/mol | 50.55 mg |
| FBS | 5% | 2.5 g | |
| 문화 미디어 구성, pH 7.4 | |||
| 시약 | 작업 집중 | 분자 Wt. | 필요한 금액 |
| DMEM | 1X | 250 mL | |
| 인슐린 | 1 μg/mL | 0.25 mg | |
| 트랜스퍼린 | 0.55 μg/mL | 0.138 mg | |
| 셀레늄 | 0.5 ng/mL | 0.125 μg | |
| 페니실린 (U/mL)-연쇄상 구균 (g/mL) | 100-100 | 2.5 mL | |
| 헤페스 | 10mM | 238.3012 g/mol | 595.753 mg |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0.5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1.8271 mg |
| *실험 요건에 따라 둘 중 하나를 사용하십시오. # 알리쿼트 문화 매체는 블레비스타틴을 추가하기 전에 도금 매체를 준비합니다. 참고: 문화 매체 200mL를 준비하십시오. 참고: 도금 용지 50mL를 준비합니다. |
|||
표 3: 성인 마우스 심근세포 도금 및 배양용 미디어 조성.
| 문화 미디어 구성, pH 7.4 | ||
| 시약 | 작업 집중 | 필요한 금액 |
| DMEM | 1x | 250 mL |
| 페니실린 (U/mL)-연쇄상 구균 (g/mL) | 100-100 | 2.5 mL |
| *FBS | 10% | 25 mL |
표 4: 성인 쥐 심근세포 도금 및 문화를 위한 미디어 조성.
그림 1: 절차 설정 및 장비. (I) 관류의 회로도 표현. (II) 외과 기기 및 캐니언 바늘. (III) 심장 관류 조립 : A) 가열 재킷. B) 이중 벽 물 재킷 용기. C)가열된 수분 입구순환. D)가열 된 물 콘센트를 순환. E) 심장 관류 용액. F) 순환 펌프 G) 관류 용액 튜브. H) 산소 공급 튜브. I)순환 수조. J)관류 출구 포트에 부착 된 심장이있는 캔송 바늘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성인 쥐 CM 격리, 형질 전환 및 장기 문화. A)성인 쥐 CM, 격리 직후. B)고립 후 7일째성인 쥐 CM. C)20일째성인 쥐 CM. D-F) KI67 양성 쥐 CM 7 일 siRb1 +siMeis2 transfection 후. 트로포닌-I = 녹색; DAPI = 파란색; KI67 = 빨간색. 모든 실험은 복제하여 3회 이상 반복하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 마우스 CM 격리 및 장기 문화. A)성인 마우스 CM, 격리 직후. B)고립 후 7일째성인 마우스 CM. C)심장 트로포닌-I = 20일째에 녹색으로 염색된 성인 마우스 CM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성인 마우스 CM 탈분화. DMEM-HG 배지에서 장기 배양(0일~10일) 동안 형태학적 변화를 보여주는 성인 마우스 CM은 10%의 FBS로 보충되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 성인 마우스 CM 형질 전환 및 증식. A-C) KI67 양성 마우스 CM 10 일 siRb1 +siMeis2 transfection 후. 트로포닌-I = 녹색; DAPI = 파란색; KI67 = 빨간색. D)바 그래프는 siRNA 칵테일 트랜스감염된 그룹에서 KI67 양성 성인용 마우스 CM이 대조군대비 현저한 증가를 나타낸다. 결과는 의미로 제시된다±SEM; * = p-값 ≤0.05. p-값 ≤0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 실험은 트리플리케이트(n=3 남성,3 여성)에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포 특정 기계학 연구를 수행하기 위해 성인 심근 세포 격리 및 장기 배양을위한 프로토콜을 수립해야 하는 중요한 필요가 있습니다. 성인 CM 격리 프로토콜에 대해 논의하는 보고서는 몇 가지뿐이며, 그 중 더 적은 수의 성인 마우스 CM15,,16,,17의장기 배양에 사용된다. 성인 쥐 CM은 성인 마우스 CM10,,11,,12보다체외 배양에 더 높은 내성을 갖는다는 것을 보여 주었다. 이 보고서에서, 우리는 정기적으로 사용되는 프로토콜에 최소한의 수정과 함께 성인 쥐와 마우스 CM 격리, siRNA 트랜스포션, 장기 배양 및 유도 된 확산의 다운스트림 분석을위한 프로토콜을 수립합니다.
성인 CM 절연을 위한 유효한 프로토콜은 세포외 매트릭스(ECM)소화(ECM) 소화(18,,19)에대해 잘 알려진 두 가지 효소, 콜라게나제 및 해방제의 사용에 기초한다. 콜라게나제는 성인 CM 격리 프로토콜에서 일반적으로 사용되는 효소입니다. 콜라게나제는 ECM의 콜라겐 섬유를 소화하여 단일 세포 CM에서 심장 조직의 해리를 초래합니다. 마찬가지로, 해방은 ECM을 소화합니다. Liberase는 콜라게나아제에 대한 정제 된 대안으로, 이는 더 높은 활성을 나타내므로 콜라게나아제에 비해 성공적인 격리를 달성하기 위해 CM 격리 중에 더 높은 정밀도가 필요합니다. 더욱이, 절차에서, 우리는 해방으로 고립된 CM이 장기 문화에서 살아남지 못한다는 것을 것을을 발견했습니다. 그러나, 콜라게나아제로 분리된 CM은 문화 조건에서 CM의 수명을 향상시킵니다.
또한, 성인 마우스 CM20,21의장기 배양을 위해 배양 매체에 블리스타틴이라는 특정 미오신 II억제제를사용했다. 이전에는 2,3-부탄네디온 단산소민(BDM)이 성인 CM 배양에 사용되어 왔다. BDM은 ATPase및 손상된 Ca++ 전환(22)의억제를 포함하는 제대로 정의된 메커니즘을 통해 수축 기능을 억제하는 ATPase 억제제이다. BDM에 비해, blebbistatin는 myosin II의 특정 억제제이고 BDM 보다는 더 낮은 농도에서 수축 기능의 더 중요한 억제를 보여줍니다. 25μm 블비스타틴 보충제 및 저혈재 배지에서 BDM 10mM및 CM의 후속 배양으로 보완된 배양 매체에서 성인 마우스 CM의 사전 도금은 CM의 생존가능성 및 로드 형상을 장기적인 배양에서 향상시킨다. 그러나, 25 μM 블비스타틴과 10% FBS로 보충된 미디어에서 성인 마우스 CM의 직접적인 도금은 증식 연구에 더 낫다. 체외 배양에서 탈분화의 큰 정도를 보여주는 성인 쥐 CM과 유사하게, 우리는 또한 어느 정도 성인 마우스 CM에서 탈분화를 관찰(도 5). 형태학적 변화는 확산에 필요한 단계입니다. 따라서, 그들의 탈분화를 용이하게 하는 성인 CM에 환경을 제공하는 것은 그 같은 연구 결과에서 고려하는 중요한 요인입니다. 이 때에도 이 프로토콜에 사용되는 정확한 단계 나 구성 요소가 성인 CM의 향상된 수명에 대한 책임이 있는지는 분명하지 않지만, 우리는 그것이 사용되는 시약의 조합 효과, 격리 절차에서 수정한 것, 그리고 아마도 가장 중요한 것은 훈련 된 손이라고 믿습니다.
blebbistatin 보충 매체에 있는 성인 CM의 바이러스성 번역을 보여주는 이전 보고와 유사합니다, 우리는 또한 siRNAs를 가진 이 세포의 능률적인 transfection를 관찰했습니다. 우리는 CM 증식을 유도하기 위하여 2개의 노화 관련 유전자, Rb1 및 Meis2에대하여 특정 siRNAs를 이용했습니다. 쥐 CM의 경우, 우리는 위장 후 7 일째에 증식을 평가하기 위해 KI67 분석을 수행했습니다. 그러나, 마우스 성인 CM의 증식은 형질 전환 후 10일째에 분석되었다. 종별 생물학적 가변성은 성인 쥐 와 마우스 CM의 유도된 세포 주기 재진입에서 관찰된 시차에 대한 가능한 이유가 될 수 있다.
전반적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 성인 쥐와 마우스 CM을 분리하고, 따라서 실험적 필요에 따라 배양하기 위해 개선되고 신뢰할 수 있으며 비교 절차를 제공한다. 더욱이, 이 프로토콜은 증식, 파라크리인인, 스트레스 반응 등과 같은 다양한 장기 분석을 수행하는 체외 시스템을 제공하는 성인 CM의 장기 배양을 허용한다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 작품은 병리학 및 실험실 의학의 학과에서 자금 지원, 신시내티 대학, 의과 대학, 박사 오누르 카니시카크; 국립 보건원(R01HL148598)에서 오누르 카니시카크 박사에게 교부금. 오누르 카니시카크 박사는 미국 심장 협회 경력 개발 상(18CDA34111117)의 지원을 받고 있습니다. 퍼웨즈 알람 박사는 미국 심장 협회 박사 후 보조금(AHA_20POST35200267)의 지원을 받고 있습니다. 말리나 J. 아이비 박사는 NIH T32 교부금(HL 125204-06A1)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
