Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.
Abstract
A cultura ex vivo dos cardiomiócitos mamíferos adultos (CMs) apresenta o sistema experimental mais relevante para o estudo in vitro da biologia cardíaca. Os CMs de mamíferos adultos são células terminais diferenciadas com capacidade proliferativa mínima. O estado pós-mitótico dos CMs adultos não só restringe a progressão do ciclo celular cardiomiócito, mas também limita a cultura eficiente dos CMs. Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para muitos estudos, como a proliferação de CM e a análise da expressão genética.
O rato e o rato são os dois animais de laboratório mais preferidos para serem usados para o isolamento cardiomiócito. Embora a cultura de longo prazo dos CMs de ratos seja possível, os CMs de camundongos adultos são suscetíveis à morte e não podem ser cultivados por mais de cinco dias em condições normais. Portanto, há uma necessidade crítica de otimizar o isolamento celular e o protocolo de cultura de longo prazo para CMs murine adultos. Com este protocolo modificado, é possível isolar e cultivar com sucesso tanto os CMs de ratos adultos quanto os de ratos por mais de 20 dias. Além disso, a eficiência de transfecção do SIRNA de CM isolado é significativamente aumentada em relação aos relatórios anteriores. Para o isolamento cm do rato adulto, o método de perfusão langendorff é utilizado com uma solução enzimática ideal e tempo suficiente para dissociação completa da matriz extracelular. Para obter CMs ventriculares puros, ambos os átrios foram dissecados e descartados antes de prosseguir com a dissociação e o revestimento. As células foram dispersadas em uma placa revestida de laminina, o que permitiu uma fixação eficiente e rápida. Os CMs foram autorizados a se contentar com 4-6 h antes da transfecção do siRNA. A mídia cultural foi atualizada a cada 24 horas por 20 dias e, posteriormente, os CMs foram fixados e manchados para marcadores específicos cardíacos, como troponina e marcadores do ciclo celular, como KI67.
Introduction
As doenças cardíacas são uma das principais causas de morte em todo o mundo. Quase todos os tipos de lesão cardíaca resultam em uma perda significativa de cardiomiócitos adultos (CMs). Corações de mamíferos adultos são incapazes de reparar sua lesão cardíaca devido à natureza senescente do cmadulto 1. Assim, qualquer insulto ao coração mamífero adulto resulta em uma perda permanente de CMs, levando à redução da função cardíaca e insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos adultos, pequenos animais como zebrafish e newt hearts podem regenerar sua lesão cardíaca através da proliferação cm existente2,3,4. Um esforço mundial está em andamento para encontrar uma nova intervenção terapêutica para lesões cardíacas através de abordagens proliferativas e não proliferativas. Nas últimas décadas, vários tipos de modelos genéticos de camundongos foram desenvolvidos para estudar lesões cardíacas e reparos. No entanto, o uso de modelos in vivo animal continua a ser uma abordagem cara com a complexidade adicional para decifrar um mecanismo de célula-autônoma a partir de efeitos secundários. Além disso, os sistemas in vivo são desafiadores para analisar os efeitos específicos do CM de uma intervenção farmacológica que induz a sinalização cardioprotetora do CM.
Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para realizar análises de proliferação de CM. Os ensaios de proliferação de CM requerem um mínimo de 4-5 dias para que as células sejam induzidas no ciclo celular e obtenham dados precisos depois disso. Além disso, estudos que utilizam CMs isolados para estudos eletrofisiológicos, triagem de medicamentos, estudos de toxicidade e estudos de homeostase Ca++ estão todos precisando de um sistema de cultura melhorado5,,6,7. Além disso, estudos recentes mostram a significância cardioprotetora das citocinas secretadas dos CMs (cardiocinas)8,9. Para investigar o papel terapêutico e o mecanismo molecular desses cardiocinas durante a reparação e regeneração cardíaca, é necessária uma cultura prolongada.
CMs de ratos adultos são robustos o suficiente para isolamento de células únicas e cultura de longo prazo em um sistema in vitro10,,11,,12. No entanto, os CMs de mouse adultos são de grande interesse para ensaios in vitro, devido à disponibilidade de uma variedade de modelos de mouse geneticamente modificados, o que permite o design e a execução de várias análises inovadoras que não são possíveis com o rato CM13. Em contraste com o isolamento cm de ratos adultos, é bastante desafiador obter uma suspensão unicelular de corações de ratos adultos, e a cultura de longo prazo de CMs de camundongos adultos na cultura é ainda mais desafiadora.
O isolamento cm adulto de corações de camundongos e ratos usando um sistema Langendorff foi previamente estabelecido para estudar a função CM5,,14,15. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos para o isolamento de CM adultos de ratos e camundongos, bem como uma cultura modificada a longo prazo, transfecção e proliferação de CM de células isoladas.
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Protocol
Todos os experimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). Todos os protocolos exibidos no vídeo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina.
1. Preparação antes da extração cardíaca de camundongos adultos (e ratos)
- Prepare as soluções correspondentes de perfusão, enzima e parada, de acordo com as receitas dadas na Tabela 1 e Tabela 2, para isolamento de ratos e ratos, respectivamente. Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação ou partículas não resolvidas.
- Limpe e esterilize os instrumentos cirúrgicos, absorvendo-os em 70% de álcool por 15 minutos e, posteriormente, lave com água destilada dupla. Deixe as ferramentas secas em uma toalha de papel limpa.
- Pré-aqueça o banho de água a 37 ºC. Verifique o nível de água no banho de água para garantir uma circulação ininterrupta de água morna através do aparelho de perfusão durante o procedimento.
- Limpe o aparelho de perfusão correndo com 70% de álcool por 5 minutos. Repita.
NOTA: Aumente a vazão, o que ajuda a limpar a tubulação. - Após o fluxo de álcool, limpe os restos de álcool correndo água duplamente destilada por 10 minutos.
- Configure 3 pratos descartáveis de poliestireno de tamanho médio para limpar o coração após a excisão. Encha os pratos com 20 mL de tampão de miócito.
- Adicione 2-3 gotas de heparina em cada prato com a ajuda da pipeta Pasteur e misture bem por pipetar várias vezes.
- Pegue uma seringa de 10 mL com uma cânula de agulha cega.
NOTA: Uma cânula de agulha sem corte pode ser preparada cortando a ponta de uma agulha limpa e estéril. Uma agulha de 21 G e uma agulha de 14 G foram usadas para fazer a cânula para o rato e o rato, respectivamente. - Encha a seringa com tampão de perfusão(Tabela 1). Remova quaisquer bolhas de ar da seringa e coloque-a no terceiro prato em uma posição angular. Segure-o com fita adesiva.
NOTA: Para ratos, a Solução A (Tabela 2) foi utilizada em vez de tampão de perfusão de miócito. - Prepare um nó solto com uma sutura cirúrgica e coloque-o ao redor da agulha.
- Injete no camundongo heparina (100 unidades/rato) por injeção intraperitoneal, 20 minutos antes da injeção de anestesia.
- Circule o tampão de perfusão do miócito(Tabela 1)através do aparelho de perfusão. Diminua a vazão para 3 mL/min.
NOTA: Para ratos, a Solução A (Tabela 2) foi utilizada em vez de tampão de perfusão de miócito. - Após 5 min, substitua o tampão de perfusão pela solução enzimápica(Tabela 1). Saturar a solução enzimápica com oxigênio durante o processo. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min.
NOTA: Para o isolamento cm do rato, use a solução E (Tabela 2) em vez disso. - Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de anestesia. Use a dose apropriada de anestesia, recomendada pelo IACUC, para a cirurgia terminal.
- Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela falta de uma resposta a uma pitada de dedo do dedo do sol. Então, coloque o rato na plataforma cirúrgica.
2. Extração de coração de ratos adultos (e ratos)
- Esterilize a pele limpando com 70% de álcool.
- Abra cuidadosamente o peito.
- Extir suascções o coração. Evite tecidos não cardíacos durante a excisão.
- Coloque o coração no primeiro prato, recheado com tampão de perfusão(Tabela 1).
NOTA: Use a solução A para o rato(Tabela 2). - Limpe o sangue do coração apertando suavemente.
- Transfira o coração para o segundo prato.
- Limpe o sangue do coração e remova tecidos não cardíacos. Posteriormente, transfira o coração para o terceiro prato.
- Corte os pulmões e outros tecidos circundantes e cannulate através da aorta ascendente. Este procedimento deve ser realizado o mais rápido possível (<5 min) para melhorar a qualidade e quantidade de CM.
3. Digestão do coração
- Digestão do coração do rato
NOTA: Todas as soluções/buffers que circulam pelo coração do rato devem ser oxigenadas durante todo o procedimento.- Remova cuidadosamente a agulha cannulante da seringa e conecte-a ao aparelho de perfusão langendorff.
- Evite que quaisquer bolhas de ar entrem no coração, o que pode afetar o fluxo da solução e digestão da enzima.
- Mova a jaqueta de água para fornecer um ambiente homogêneo ao coração. Permita que a solução enzimápica flua através do coração a uma velocidade de 2-3 mL/min.
NOTA: A velocidade da solução de passagem é crítica e tem um impacto significativo no resultado da quantidade e qualidade do CM. - Deixe a solução enzimápica fluir pelo coração por 2 minutos.
- Em 2 min, adicione 40 μL de solução cacl2 de 100 μM à solução esticada e misture. Deixe a solução enzimánica passar pelo coração por mais 10-15 minutos.
NOTA: Uma vez que o fluxo fica liso, o coração fica acastulico e macio, indicando a distribuição uniforme da enzima colagenase e a digestão adequada do coração.
- Digestão do coração de rato
NOTA: Todas as soluções/tampões que circulam pelo coração do rato devem ser oxigenadas durante todo o procedimento.- Remova cuidadosamente a agulha cannulante da seringa e conecte-a ao aparelho de perfusão langendorff.
- Evite que quaisquer bolhas de ar entrem no coração, o que pode afetar o fluxo da solução e digestão da enzima.
- Mova a jaqueta de água para fornecer um ambiente homogêneo ao coração.
- Inicie o fluxo da solução A a uma velocidade de 2-3 mL/min por 3-5 min para remover qualquer sangue do coração.
NOTA: A velocidade da solução de passagem é crítica e tem um impacto significativo no resultado da qualidade cm. - Uma vez que o sangue seja retirado do coração, mude da solução A para a solução E(Tabela 2). Solução de titulação E com CaCl2 como indicado abaixo para uma concentração final de 0,1 mM em solução:
- Após 10 min de perfusão, adicione 12,5 μL de 0,1 M CaCl2.
- Após 15 min de perfusão, adicione 25 μL de 0,1 M CaCl2.
- Deixe a solução enzimátil passar pelo coração por mais 30-40 minutos, até que o fluxo se torne rápido e o coração seja flexível.
4. Preparação da suspensão de célula única CM
- Preparação da suspensão de célula única CM (mouse)
- Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova-o para uma placa de Petri de 60 mm cheia de 5 mL de solução enzimada e transfira o prato para um capô de biossegurança.
NOTA: Certifique-se de digestão cardíaca suficiente antes de remover o coração do sistema de perfusão langendorff. O tempo de digestão depende da atividade enzimápica, do fluxo de solução e do tamanho do coração. - Realize qualquer outra desagregação mecânica em um capô de biossegurança para garantir a esterilidade e evitar contaminação.
- Remova cuidadosamente a atria (1/4th da porção do coração basal) e os tecidos de gordura extra.
- Pique o coração com fórceps em pedaços finos.
- Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte sua ponta em um ângulo de 45º.
- Use esta pipeta Pasteur para dispensar o tecido cardíaco em uma suspensão de célula única por pipetação suave. A digestão ideal proporciona uma suspensão de cardiomiócitos unicelulares.
NOTA: Remova a porção estreita e inferior da tubulação de transferência para reduzir os danos de CM devido ao searing mecânico. - Em seguida, adicione 5 mL de solução stop para parar a atividade enzimático, o que evita a possibilidade de superdigestão.
- Pegue um cônico de 50 mL fresco e coloque um coador de células de 100 μm estéril sobre ele.
- Passe a suspensão do cardiomiócito através do coador celular para remover o pedaço de tecido. Lave a placa de Petri e o coador com mais 5 mL de solução de parada(Tabela 1) para coletar quaisquer cardiomiócitos que permaneçam presos ao coador.
- Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova-o para uma placa de Petri de 60 mm cheia de 5 mL de solução enzimada e transfira o prato para um capô de biossegurança.
- Preparação da suspensão de célula única CM (rato)
- Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova o coração para uma placa de Petri de 100 mm cheia de 5 mL de solução A e mova a placa para um capô de biossegurança.
NOTA: Certifique-se de digestão cardíaca suficiente antes de remover o coração do sistema de perfusão langendorff. O tempo de digestão depende da atividade enzimápica, do fluxo de solução e do tamanho do coração. - Realize qualquer outra desagregação mecânica em um capô de biossegurança para garantir a esterilidade e evitar contaminação.
- Remova cuidadosamente a atria (1/4 da porção do coração basal) e os tecidos de gordura extra.
- Pique o coração com fórceps em pedaços finos.
- Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte sua ponta em um ângulo de 45º.
- Use esta pipeta Pasteur para dispensar o tecido cardíaco em suspensão unicelular por tubulação suave. A digestão ideal proporciona uma suspensão de cardiomiócitos unicelulares.
NOTA: Remova a porção estreita e inferior da tubulação de transferência para reduzir os danos de CM devido ao searing mecânico. - Adicione 5 mL de solução B(Tabela 2) à suspensão CM e passe a solução através de um coador de células de 100 μm para remover quaisquer pedaços restantes de gordura ou outro tecido não digerido.
- Colete filtrado em um frasco cônico fresco de 50 mL.
- Use outros 5 mL de solução B para lavar a placa de Petri e qualquer CM restante através do coador celular.
- Remova o coração do sistema de perfusão langendorff. Mova o coração para uma placa de Petri de 100 mm cheia de 5 mL de solução A e mova a placa para um capô de biossegurança.
5. Remoção de não-CMs
- Remoção de não-CMs da suspensão de célula única adulta (mouse)
- Centrifugar a suspensão da célula a 20 x g por 3 min.
- Descarte o supernasce e resuspenque as células em 10 mL de solução stop(Tabela 1).
NOTA: Aumentar a concentração de BSA na solução stop aumentará sua viscosidade e reduzirá a taxa de sedimentação de não-CMs. - Resuspenda os CMs por inversão suave do tubo 3-5 vezes.
- Em intervalos de 3 minutos, adicione 10 μL de solução cacl2 de 100 μM e misture. Repita três vezes.
- Após a quarta adição, centrifugar a suspensão cardiomiocócica em 20 x g por 3 min.
- Descarte o supernaspeso.
- CMs de resuspend em pré-aquecido (37 ºC), mouse adulto CM plating media(Tabela 3).
- Remoção de não-CMs das suspensões unicelulares adultas (rato)
- Células de pelota a 20 x g por 3 min a 25 ºC.
- Descarte o supernasce e resuspenque as células em 25 mL de solução B(Tabela 2).
- Misture as células por inversão suave e coloque-a em um suporte de tubo para permitir que o CM se instale sob gravidade.
- Descarte cuidadosamente o supernaspe.
- Resuspenncie as células em 25 mL frescos de solução B e titule-as a 1,0 mM CaCl2 por adição stepwise de 50 μL, 75 μL e 100 μL de 0,1 M CaCl2 em intervalos de 3-5 min.
NOTA: Uma maior concentração de BSA na solução B poderia ser usada nesta etapa. O aumento da concentração de BSA na solução B aumenta a viscosidade e, portanto, reduz a taxa de sedimentação de não-CMs. - Células de pelota a 20 x g por 3 min a 25 ºC, aspiram o supernasciente e adicionam o volume desejado de mídia de cultura de células de ratos adultos(Tabela 4).
- CMs de sementes em uma placa revestida de laminina.
NOTA: O pré-revestimento de CMs em uma placa de cultura não revestida pode ser usado para minimizar a contaminação de células não-CM.
6. Chapeamento cm adulto
- Pré-revestimento
- Resuspend os cardiomiócitos na mídia cultural.
- Pré-emplacar as células em uma placa de 60 mm ou 100 mm para o rato ou rato CM, respectivamente.
- Incubar CMs por 2h em uma incubadora suplementada com 5% de CO2 a 37 ºC.
- Durante a incubação pré-placa, cubra as placas de cultura celular com laminina (10 μg/mL em PBS) para a cultura cm de longo prazo.
- Após 2h de pré-revestimento, colete CMs em um frasco cônico de 50 mL.
- Colete as células do prato e reempla-las em uma placa de cultura revestida de laminina 24 poços para experimentos de transfecção.
- Células de cultura em uma incubadora a 37 ºC suplementadas com 5% com CO2. 4-6 horas é suficiente para aderir aos cardiomiócitos com a superfície e, assim, a transfecção pode ser realizada 6 horas após o revestimento.
NOTA: O meio de revestimento contendo FBS é comumente utilizado e mostra melhor compatibilidade com estudos de proliferação. No entanto, um meio livre de soro pode ser usado para experimentos onde fatores secretos estão sendo analisados.
7. Transfecção
- Incubar os CMs nas placas de cultura celular revestidas com laminina por 4-6 horas.
- Quatro horas após a semeadura cm na placa revestida de laminina, as células transfectam com siRNAs (50 nM) de interesse usando um reagente de transfecção (por exemplo, Lipofectamine RNAiMAX) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Mude a mídia 24 horas após a transfecção e a cada 24 horas depois disso por até 20 dias.
- Após 20 dias, fixe células com 4% de PFA em PBS para aplicações a jusante, incluindo imunocittoquímica para marcadores específicos cardíacos, como troponina, para garantir que cardiomiócitos vivos foram cultivados com sucesso a longo prazo.
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Representative Results
O protocolo modificado atual permite o isolamento eficiente e a cultura de CMs de ratos e ratos in vitro. Para o isolamento do CM do rato, foram utilizados no procedimento um total de 3 adultos (12 semanas de idade) macho Fischer 344 ratos. A Figura 1 mostra o aparelho cirúrgico e as configurações de isolamento que são necessárias no procedimento; cada parte foi marcada e descrita na lenda da figura. A colagenase tipo 2 foi utilizada para digestão, o que produz uma alta quantidade de CMs de alta qualidade a partir do isolamento bem sucedido(Figura 2A). Vinte e quatro horas após o isolamento, essas células foram transfeinadas com ciclo celular induzindo siRNAs específicos contra Rb1 e Meis2, enquanto cel-miR-67 foi usado como controle de transfecção no experimento11. Os CMs foram mantidos na cultura por sete dias(Figura 2B) ou até vinte dias(Figura 2C) para observar as alterações morfológicas. Para pontuação para a atividade do ciclo celular, os CMs foram fixados no dia 7 e manchados para o marcador específico para o coração Troponin-I, marcador mitótico KI67, e o núcleo foi visualizado através de DAPI (Figura 2D-F). Observou-se aumento significativo nos cardiomiócitos positivos KI67 com tratamento siRb1+siMeis2 quando comparado ao controle11. Além disso, os cardiomiócitos de rato estavam batendo (função contratil) na cultura no sétimo dia pós-chapeamento, que é uma característica marcante dos cardiomiócitos saudáveis11.
Para o isolamento de CM em camundongos, foram utilizados no procedimento um total de 3 camundongos C57BL/6 adultos do sexo masculino e 3 (12 semanas) C57BL/6. Semelhante ao estudo do rato, a colagenase tipo 2 foi usada para digerir o colágeno e a matriz extracelular do coração de camundongos adultos. Camundongos adultos CM é relativamente frágil para isolamento e cultura in vitro; assim, este protocolo utiliza blebbistatin para melhorar a viabilidade do mouse adulto CM. O isolamento bem sucedido produz >70-80% de CMs de forma de haste saudável, que podem ser cultivados por até 20 dias(Figura 3A-C) e manter sua coloração e contratilidade troponina-i cardíaca(Figura 3C). Em experimentos separados, quatro horas após o isolamento, os CMs do rato foram transfectados com um ciclo celular induzindo o Rb1 coquetel de Meis2siRNA, como descrito para o CM do rato. Os CMs pós-transfecção foram sujeitos a imagens de curso por 10 dias mostrando as alterações morfológicas (Figura 4), seguidas por um ensaio de proliferação(Figura 5). No dia 10, a coloração imuno-fluorescente para Troponin-I, KI67 e DAPI foi realizada como descrito anteriormente. Observou-se aumento significativo nos cardiomiócitos positivos KI67 com tratamento siRb1+siMeis2 quando comparado ao controle (Figura 5A-C).
O presente protocolo demonstra que ratos adultos e CMs de camundongos podem ser cultivados in vitro a longo prazo por até 20 dias e potencialmente mais. Após 20 dias, os CMs mantêm sua coloração Troponin-I, bem como a contrariedade se os inibidores forem removidos da mídia.
| Composição tampão de miócito, pH 7.4 (Prepare e pode ser armazenado a 4 °C ) | |||
| Reagente | Concentração, mM | Molecular wt. | Para 1 Litro |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6.6037 g |
| Kcl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 mg |
| MgSO4 | 1.2 | 120.366 | 144,4392 mgs |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81,6516 mgs |
| NaH2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71.988 mgs |
| Tampão de perfusão, pH 7.4 (Prepare-se fresco para cada isolamento) | |||
| Concentração, mM | Molecular wt. | Quantidade necessária | |
| Tampão de miócito | 250 mL | ||
| HEPES | 10 | 238.3012 | 595,75 mgs |
| Monoximina de butanedione de 2,3 anos | 10 | 101.105 | 252.775 mgs |
| NaHCO3 Fresco | 1.6 | 84.007 | 33.6028 mg |
| Taurina Fresca | 30 | 125.15 | 938.625 mgs |
| Glicose Fresca | 20 | 180.156 | 900.775 mgs |
| Solução enzimápica | |||
| Stock Conc. | Trabalhando Conc. | Necessário | |
| Tampão de miócito | 50 mL | 50 mL | |
| Colagenase tipo 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 mgs |
| Protease XIV | >3.5 U/mg | 0.104 U/mL | 1,48 mg |
| DNase I grau 2 | 0,015 mg/mL | ||
| Pare buffer A | |||
| Stock Conc. | Trabalhando Conc. | Necessário | |
| Tampão de miócito | 30 mL | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
| Stop Buffer B | |||
| Stock Conc. | Trabalhando Conc. | Necessário | |
| Tampão de miócito | 30 mL | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 g | |
| CaCl2 | 100 mM | 0,1 mM | 30 μL |
Tabela 1: Soluções necessárias para o isolamento do cardiomiócito do rato adulto.
| 10x KHB Stock Solution (Volume total= 1L) |
Reagente | Molaridade (mM) | Quantidade (g) |
| Nacl | 1180 | 68,9 g | |
| Kcl | 48 | 3,5 g | |
| HEPES | 250 | 59,7 g | |
| MgSO4 | 12.5 | 1,4 g | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 g | |
| Ajuste o pH para 7,4 com 4 M NaOH (~20 mL), armazene a 4 °C | |||
| Solução KHB, 500 mL | Reagente | Quantidade | |
| 10x KHB | 50 mL | ||
| Glicose | 0,99 g | ||
| Taurina | 0,31 g | ||
| Adicione H2O para trazer volume a 500 mL, e o pH deve ser ~7.35 | |||
| Solução A | Reagente | Quantidade | |
| Solução KHB | 500 mL (10 mM) | ||
| Bdm | 0,5 g | ||
| Oxigenar com 100% O2 e aquecer a 37 °C | |||
| Solução B, 50 mL | Reagente | Quantidade | |
| Solução A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,5 g | ||
| 0,1 M CaCl2 (Ca++=0,1 mM) | 50 μL | ||
| Solução E, 50mL | Reagente | Quantidade | |
| Solução A | 50 mL | ||
| Bsa | 0,05 g | ||
| Colagenase tipo II (263 unidades/mg) | 35 mgs | ||
| Hyaluronidase (Tipo I-S) | 10 mgs | ||
| 0,1 M CaCl2 estoque | 12,5 μL | ||
| Misture bem | |||
| CaCl2 Stock, 0.1M | Reagente | Quantidade | |
| CaCl2 | 7,35 g | ||
| H2O | 500 mL | ||
| Armazenar a 4 °C | |||
Tabela 2: Soluções necessárias para o isolamento do cardiomiócito de rato adulto.
| Composição de mídia de chapeamento, pH 7.4 | |||
| Concentração de Trabalho | Molecular Wt. | Quantidade necessária | |
| Mídia cultural sem Blebbistatin | 50 mL | ||
| Bdm | 10 mM | 101.105 g/mol | 50,55 mgs |
| Fbs | 5% | 2,5 g | |
| Composição da mídia cultural, pH 7.4 | |||
| Reagente | Concentração de Trabalho | Molecular Wt. | Quantidade necessária |
| DMEM | 1X | 250 mL | |
| Insulina | 1 μg/mL | 0,25 mg | |
| Transferrina | 0,55 μg/mL | 0,138 mg | |
| Selênio | 0,5 ng/mL | 0,125 μg | |
| Penicilina (U/mL)-estreptomicina (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL | |
| HEPES | 10 mM | 238.3012 g/mol | 595.753 mgs |
| *FBS | 10% | 25 mL | |
| *BSA | 0.20% | 0,5 g | |
| #Blebbistatin | 25 μM | 292.338 g/mol | 1,8271 mg |
| *Use qualquer um deles, conforme exigência experimental. # Aliquot a mídia cultural para preparar a mídia de chapeamento antes de adicionar Blebbistatin. NOTA: Prepare 200 mL de mídia cultural. NOTA: Prepare 50 mL de mídia de revestimento. |
|||
Tabela 3: Composição de mídia para revestimento e cultura de cardiomiócitos de camundongos adultos.
| Composição da mídia cultural, pH 7.4 | ||
| Reagente | Concentração de Trabalho | Quantidade necessária |
| DMEM | 1x | 250 mL |
| Penicilina (U/mL)-estreptomicina (g/mL) | 100-100 | 2,5 mL |
| *FBS | 10% | 25 mL |
Tabela 4: Composição de mídia para revestimento e cultura de cardiomiócitos de ratos adultos.
Figura 1: Configuração do procedimento e equipamento. (I) Representação esquemática da perfusão. (II) Instrumentos cirúrgicos e agulha de canulação. (III) Montagem de perfusão cardíaca: A) Jaqueta de aquecimento. B) Vaso de jaqueta de água de parede dupla. C) Entrada de água aquecida circulante. D) Saída de água aquecida circulante. E) Solução de perfusão cardíaca. F) Bomba circulante G) Tubo de solução de perfusão. H) Tubo de alimentação de oxigênio. I) Banho de água circulante. J) Agulha de canulação com coração, presa à porta de saída de perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento cm de rato adulto, transfecção e cultura de longo prazo. A) Rato adulto CM, imediatamente após o isolamento. B) Rato adulto CM no dia 7 após o isolamento. C) Rato adulto CM no dia 20. D-F) KI67 rato positivo CM no dia 7 após a transfecção siRb1+siMeis2. Troponina-I = verde; DAPI = azul; KI67 = vermelho. Todos os experimentos foram realizados em duplicata e repetidos pelo menos três vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Isolamento cm do rato adulto e cultura de longo prazo. A) Camundongos adultos CM, imediatamente após o isolamento. B) Camundongos adultos CM no dia 7 após o isolamento. C) Camundongos adultos CM manchados com Troponina Cardíaca-I = verde no dia 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Deseferição cm do mouse adulto. Camundongos adultos CM mostrando alterações morfológicas durante a cultura de longo prazo (dia 0 ao dia 10) em mídia DMEM-HG, complementados com 10% de FBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transfecção e proliferação do cm do rato adulto. A-C) KI67 mouse positivo CM no dia 10 após a transfecção siRb1+siMeis2. Troponina-I = verde; DAPI = azul; KI67 = vermelho. D) O gráfico da barra mostra um aumento significativo nos CMs positivos do rato adulto KI67 no grupo transfectado siRNA-coquetel versus controle. Os resultados são apresentados como média±SEM; * = valor p ≤0,05. p-valor ≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram realizados em triplicado (n=3 Masculino,3 Feminino). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma necessidade crítica de estabelecer um protocolo para o isolamento do cardiomiócito adulto e cultura de longo prazo para realizar estudos mecanicistas específicos para células. Existem apenas alguns relatórios discutindo protocolos de isolamento cm adulto, e ainda menos deles são usados para a cultura de longo prazo de camundongos adultos CM15,,16,17. É demonstrado que o cm de rato adulto tem maior tolerância à cultura in vitro do que os camundongos adultos CM10,,11,12. Neste relatório, estabelecemos um protocolo para isolamento cm de ratos e camundongos adultos, transfecção de sirna, cultura de longo prazo e análise a jusante da proliferação induzida, com modificações mínimas nos protocolos regularmente utilizados.
Os protocolos disponíveis para isolamento cm adulto baseiam-se no uso de duas enzimas bem conhecidas, colagenase e liberase, para a digestão da matriz extracelular (ECM)18,19. Colagenase é uma enzima comumente usada nos protocolos de isolamento cm adulto. A colagenase digere as fibras de colágeno no ECM, o que resulta na dissociação do tecido cardíaco no CM unicelular. Da mesma forma, liberase digere o ECM. Liberase é a alternativa purificada para colagemnase, que mostra maior atividade e, portanto, requer maior precisão durante o isolamento do CM para alcançar o isolamento bem sucedido em comparação com a colagemnase. Além disso, no procedimento, notamos que o CM isolado com liberação não sobrevive na cultura de longo prazo. No entanto, cm isolado com colagenase melhora a longevidade do CM nas condições culturais.
Além disso, usamos um inibidor específico de minodã II chamado blebbistatin na mídia cultural para a cultura de longo prazo do mouse adulto CM20,21. Anteriormente, 2,3-butanedione monoximina (BDM) tem sido usado para a cultura cm adulto. BDM é um inibidor de ATPase que inibe a função contratil através de um mecanismo mal definido que inclui a inibição do ATPase e a transição Ca++ prejudicada22. Em comparação com o BDM, blebbistatina é um inibidor específico da minosina II e mostra inibição mais significativa da função contratil em concentrações mais baixas do que o BDM. Um pré-revestimento do cm de camundongo adulto em uma mídia de cultura, complementado com 10 mM de BDM e culturas subsequentes do CM na mídia de 25 μM de blebbistatina e baixo soro melhora a sobrevivência e a estrutura de forma de haste de CM na cultura de longo prazo. No entanto, um revestimento direto do cm de camundongo adulto na mídia, complementado com blebbistatina de 25 μM e 10% FBS é melhor para estudos proliferativos. Semelhante ao cm de rato adulto, que mostra grande extensão de deseferibridade na cultura in vitro, também observamos a deseferitração no cm do camundongo adulto até certo ponto(Figura 5). Mudanças morfológicas são o passo necessário para a proliferação. Assim, proporcionar um ambiente ao CM adulto que facilite sua deseflexão é um fator crítico a ser considerado em tais estudos. Embora neste momento, não esteja claro quais dos passos exatos ou componentes utilizados neste protocolo são responsáveis pela melhor longevidade dos CMs adultos, acreditamos que é um efeito combinado dos reagentes utilizados, as modificações feitas no procedimento de isolamento e talvez o mais importante das mãos treinadas.
Semelhante aos relatórios anteriores que mostram a transdução viral do CM adulto em mídia suplementada por blebbistatina, também observamos uma transfecção eficiente dessas células com siRNAs. Utilizamos siRNAs específicos contra dois genes associados à senescência, Rb1 e Meis2,para induzir a proliferação de CM. Para o CM do rato, realizamos a análise KI67 para avaliar a proliferação no sétimo dia após a transfecção; no entanto, a proliferação no CM adulto do camundongo foi analisada no décimo dia após a transfecção. Uma variabilidade biológica específica da espécie pode ser uma possível razão para a diferença de tempo observada na reentrada do ciclo celular induzido do CM de ratos e camundongos adultos.
No geral, o protocolo descrito aqui fornece um procedimento melhorado, confiável e comparativo para isolar o CM de ratos e ratos adultos, e, consequentemente, cultuá-los conforme necessidade experimental. Além disso, este protocolo permite uma cultura de longo prazo do CM adulto, que fornece um sistema in vitro para realizar várias análises de longo prazo, como proliferação, fator paracrino, resposta ao estresse, etc.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina, ao Dr. Onur Kanisicak; uma subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL148598) ao Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak é apoiado pelo American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). O Dr. Perwez Alam é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey é apoiada por uma bolsa NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
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