Summary
Здесь мы представляем протокол изоляции, трансфекции и долгосрочной культуры взрослых мышей и крыс кардиомиоцитов.
Abstract
Ex vivo культуры взрослых млекопитающих кардиомиоцитов (CMs) представляет собой наиболее релевантную экспериментальную систему для in vitro исследования сердечной биологии. Взрослые млекопитающие СМ являются неизлечимо дифференцированными клетками с минимальной пролиферативной емкостью. Постмитотическое состояние взрослых CMs не только ограничивает прогрессирование цикла сердечно-миоцитов клеток, но и ограничивает эффективную культуру CMs. Кроме того, долгосрочная культура взрослых CMs необходима для многих исследований, таких как распространение СМ и анализ экспрессии генов.
Мышь и крыса являются двумя наиболее предпочтительными лабораторных животных, которые будут использоваться для кардиомиоцитов изоляции. В то время как долгосрочная культура крысЫ CMs возможно, взрослые мыши CMs восприимчивы к смерти и не могут быть культурно более пяти дней в нормальных условиях. Таким образом, существует критическая необходимость оптимизации изоляции клеток и долгосрочного протокола культуры для взрослых murine CMs. С помощью этого измененного протокола, можно успешно изолировать и культуры как взрослых мыши и крысы CMs в течение более 20 дней. Кроме того, эффективность трансфекции siRNA изолированных СМ значительно возросла по сравнению с предыдущими докладами. Для изоляции мышей-мышей метод перфузии Langendorff используется с оптимальным ферментным раствором и достаточным временем для полной внеклеточной диссоциации матрицы. Для того, чтобы получить чистые желудочковые CMs, как atria были вскрыты и отброшены, прежде чем приступить к разъединению и покрытие. Клетки рассеивались на пластине с ламинином покрытием, что позволяло эффективно и быстро вложения. CMs было разрешено согласиться на 4-6 ч до siRNA трансфекции. Культурные средства массовой информации обновлялись каждые 24 ч в течение 20 дней, а затем, CMs были зафиксированы и окрашены для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin и маркеры клеточного цикла, такие как KI67.
Introduction
Сердечные заболевания являются одной из ведущих причин смерти во всем мире. Почти все виды сердечных травм приводят к значительной потере взрослых кардиомиоцитов (СМ). Взрослые сердца млекопитающих не в состоянии восстановить свои сердечные травмы из-за старческого характера взрослого CM1. Таким образом, любое оскорбление сердца взрослого млекопитающего приводит к постоянной потере СМ, что приводит к снижению сердечной функции и сердечной недостаточности. В отличие от взрослых млекопитающих, мелкие животные, как зебрафиш и тритон сердца могут регенерировать свои сердечные травмы через существующиеСМ распространения 2,3,4. Во всем мире продолжаются усилия по поиску нового терапевтического вмешательства в связи с сердечной травмой с помощью как пролиферативных, так и нераспространенных подходов. В последние десятилетия, различные типы генетических моделей мыши были разработаны для изучения сердечной травмы и ремонта. Однако использование моделей животных in vivo по-прежнему является дорогостоящим подходом с дополнительной сложностью для расшифровки клеточно-автономного механизма от вторичных эффектов. Кроме того, in vivo системы являются сложными для анализа CM специфические эффекты фармакологического вмешательства, которое вызывает кардиопротекторной сигнализации от СМ.
Кроме того, для проведения анализа распространения СМ необходима долгосрочная культура взрослых СМ. Анализы распространения СМ требуют как минимум 4-5 дней для индуцированных клеток в клеточный цикл и получения точных данных после этого. Кроме того, исследования, которые используют изолированные CMs для электрофизиологических исследований, скрининга наркотиков, исследования токсичности,и Ca й гомеостаза исследования все нуждаются в улучшенной системекультуры 5,6,7. Кроме того, последние исследования показывают кардиопротекторное значение цитокинов, выделяется из СМ (кардиокинов)8,,9. Для того, чтобы исследовать терапевтическую роль и молекулярный механизм этих кардиокинов во время ремонта и регенерации сердца, необходима длительная культура.
Взрослые крысы CMs являются достаточно надежными для одноклеточной изоляции и долгосрочной культуры в системе in vitro10,11,12. Тем не менее, взрослые мыши CMs имеют большой интерес для in vitro анализы, из-за наличия различных генетически модифицированных моделей мыши, что позволяет для разработки и выполнения различных инновационных анализов, которые невозможны с крысой CM13. В отличие от взрослых крыс CM изоляции, это довольно сложно получить одноклеточную подвеску от взрослых сердца мыши, и долгосрочная культура взрослых мыши CMs в культуре является еще более сложной задачей.
Взрослый CM изоляции от мыши и крысы сердца с помощью системы Langendorff ранее была созданадля изучения функцииCM 5,14,15. Здесь мы подробно описали протоколы изоляции взрослых СМ как от крыс, так и от мышей, а также модифицированную долгосрочную культуру, трансфекцию и распространение СМ изолированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты должны проводиться в соответствии с руководящими принципами Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованными Национальным институтом здравоохранения США (NIH). Все протоколы, отображаемые в видео, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) Университета Цинциннати, Медицинский колледж.
1. Подготовка перед извлечением сердца у взрослых мышей (и крыс)
- Подготовка соответствующих перфузии, ферментов и стоп-решений, в соответствии с рецептами, данными в таблице 1 и таблице 2, для крыс и мыши изоляции, соответственно. Фильтр решения через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить любое загрязнение или неохолиденые частицы.
- Очистите и стерилизовать хирургические инструменты, замачивая их в 70% алкоголя в течение 15 минут, а затем мыть двойной дистиллированной водой. Оставьте инструменты, чтобы высохнуть на чистом бумажном полотенце.
- Предварительно разогреть водяную баню до 37 oC. Проверьте уровень воды в водяной бане, чтобы обеспечить бесперебойную циркуляцию теплой воды через перфузионный аппарат во время процедуры.
- Очистите перфузионный аппарат, работает с 70% алкоголя в течение 5 мин. Повторите.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте скорость потока, что помогает очистить трубы. - После потока алкоголя, очистить остатки алкоголя, запуская двойную дистиллированную воду в течение 10 минут.
- Настройка 3 средних одноразовых полистирола взвешивания блюд для очистки сердца после иссечения. Заполните посуду 20 мл буфера миоцитов.
- Добавьте 2-3 капли гепарина в каждое блюдо с помощью пипетки Pasteur и хорошо перемешайте, промокая несколько раз.
- Возьмите шприц 10 мл с тупой иглой канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тупая игла канюла может быть подготовлена путем резки кончик чистой, стерильной иглы. 21 G иглы и 14 G иглы были использованы, чтобы сделать канюлю для мыши и крысы, соответственно. - Заполните шприц буфером перфузии(таблица 1). Снимите пузырьки воздуха со шприца и поместите его в третье блюдо под углом. Закретись скотчем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс вместо буфера перфузии миоцитов использовалось решение А (таблица2). - Подготовь свободный узел хирургическим швом и поместите его вокруг иглы.
- Ввимите мышь гепарином (100 единиц USP/мышь) путем внутриперитонеальной инъекции за 20 минут до инъекции анестезии.
- Циркулировать буфер перфузии миоцитов(таблица 1) через перфузионный аппарат. Снижение скорости потока до 3 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс вместо буфера перфузии миоцитов использовалось решение А (таблица2). - Через 5 минут замените буфер перфузии раствором фермента(таблица 1). Насыщать ферментный раствор кислородом во время процесса. Используйте скорость потока 3 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции крыс CM, используйте решение E (Таблица 2) вместо. - Анестезия мыши путем внутриперитонеальной инъекции анестезии. Используйте соответствующую дозу анестезии, рекомендованную МАКУК, для терминальной хирургии.
- Подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на щепотку нося. Затем положите мышь на хирургическую платформу.
2. Извлечение сердца из взрослых мышей (и крыс)
- Стерилизовать кожу, вытирая 70% алкоголя.
- Аккуратно откройте грудь.
- Акциз на сердце. Избегайте несердечных тканей во время иссечения.
- Положите сердце на первое блюдо, наполненное перфузией буфера(таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте раствор А для крысы(таблица 2). - Очистите кровь от сердца, мягко сжимая.
- Перенесите сердце на второе блюдо.
- Очистите кровь от сердца и удалите несердечные ткани. Впоследствии перенесите сердце на третье блюдо.
- Обрезать легкие и другие окружающие ткани и cannulate через восходящую аорту. Эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее (lt;5 мин) для улучшения качества и количества CM.
3. Пищеварение сердца
- Переваривание сердца мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения / буферы, которые циркулируют через сердце мыши должны быть насыщены кислородом на протяжении всей процедуры.- Аккуратно снимите иглу из шприца и соедините ее с перфузионный аппарат Langendorff.
- Избегайте пузырьков воздуха, иных в сердце, которые могут повлиять на поток через ферментный раствор и пищеварение.
- Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца. Разрешить ферментный раствор течь через сердце со скоростью 2-3 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость прохождения решения имеет решающее значение и оказывает значительное влияние на результат CM количество и качество. - Пусть ферментный раствор течет через сердце в течение 2 минут.
- В 2 мин. добавьте 40 МКЛ из 100 МКМ CaCl2 раствора фермента и перемешайте. Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 10-15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только поток становится гладким, сердце становится коричневатым и мягким, что указывает на равномерное распределение фермента коллагеназы и правильное пищеварение сердца.
- Переваривание крысиного сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения / буферы, которые циркулируют через сердце крысы должны быть насыщены кислородом на протяжении всей процедуры.- Аккуратно снимите иглу из шприца и соедините ее с перфузионный аппарат Langendorff.
- Избегайте пузырьков воздуха, иных в сердце, которые могут повлиять на поток через ферментный раствор и пищеварение.
- Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца.
- Начните поток раствора А со скоростью 2-3 мл/мин в течение 3-5 минут, чтобы удалить кровь из сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость прохождения решения имеет решающее значение и оказывает значительное влияние на результат качества CM. - Как только кровь очищается от сердца, переключитесь с раствора А на раствор E(таблица 2). Titrate решение E с CaCl2, как указано ниже для окончательной концентрации 0,1 мМ в растворе:
- После 10 мин перфузии добавьте 12,5 МКЛ из 0,1 М CaCl2.
- После 15 мин перфузии добавьте 25 МКЛ из 0,1 М CaCl2.
- Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 30-40 минут, пока поток не станет быстрым и сердце податливым.
4. Подготовка одноклеточной подвески CM
- Подготовка одноклеточной подвески CM (мышь)
- Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Переместите его в 60 мм чашку Петри, наполненную 5 мл ферментного раствора и перенесите блюдо в капюшон биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточное пищеварение сердца, прежде чем удалить сердце из системы перфузии Langendorff. Время пищеварения зависит от активности фермента, потока раствора и размера сердца. - Выполните любую дальнейшую механическую дезагрегацию в капюшоне биобезопасности, чтобы обеспечить стерильность и избежать загрязнения.
- Тщательно удалите атрию (1/4й части базального сердца) и жировые ткани.
- Фарш сердце с миппами на мелкие кусочки.
- Возьмите стерильный пипетку Pasteur и вырежьте ее кончик под углом 45o.
- Используйте эту пипету Pasteur, чтобы обойтись до ткани сердца в одноклеточной подвеске, нежной трубой. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите узкую, нижнюю часть трубы передачи, чтобы уменьшить повреждение CM из-за механического жгучего. - Затем добавьте 5 мл стоп-раствора, чтобы остановить активность фермента, что позволяет избежать переварения желудка.
- Возьмите свежий 50 мл конической и поместите стерильные 100 мкм клетки ситечко на нем.
- Пройдите подвеску кардиомиоцитов через клеточный ситечко, чтобы удалить кусок ткани. Вымойте чашку Петри и ситечко с еще 5 млстоп-раствора (таблица 1), чтобы собрать любые кардиомиоциты, которые остаются прикрепленными к ситечко.
- Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Переместите его в 60 мм чашку Петри, наполненную 5 мл ферментного раствора и перенесите блюдо в капюшон биобезопасности.
- Подготовка одноклеточной подвески CM (крыса)
- Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Перемести сердце в 100-мм чашку Петри, наполненную 5 мл раствора А, и перемести блюдо в биобезопасность капюшона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточное пищеварение сердца, прежде чем удалить сердце из системы перфузии Langendorff. Время пищеварения зависит от активности фермента, потока раствора и размера сердца. - Выполните любую дальнейшую механическую дезагрегацию в капюшоне биобезопасности, чтобы обеспечить стерильность и избежать загрязнения.
- Тщательно удалите атрию (1/4 части базального сердца) и жировые ткани.
- Фарш сердце с миппами на мелкие кусочки.
- Возьмите стерильный пипетку Pasteur и вырежьте ее кончик под углом 45o.
- Используйте эту пипету Pasteur, чтобы обойтись до ткани сердца в одноклеточной подвеске нежным пипеткой. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите узкую, нижнюю часть трубы передачи, чтобы уменьшить повреждение CM из-за механического жгучего. - Добавьте 5 мл раствора B(таблица 2)к подвеске CM и перейдите раствор через 100 мкм клеточного ситечко, чтобы удалить оставшиеся кусочки жира или других непереваренных тканей.
- Соберите фильтрат в свежем коническом флаконе 50 мл.
- Используйте еще 5 мл раствора B для мытья чашки Петри и любого оставшегося CM через клеточный ситечко.
- Удалите сердце из перфузионой системы Лангендорфа. Перемести сердце в 100-мм чашку Петри, наполненную 5 мл раствора А, и перемести блюдо в биобезопасность капюшона.
5. Удаление не-CMs
- Удаление не-CMs из взрослых одноклеточной подвески (мышь)
- Центрифуга клеточной суспензии при 20 x g в течение 3 мин.
- Отбросьте супернатант и повторно посовекуйте ячейки в 10 мл стоп-раствора(таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение концентрации BSA в стоп-растворе увеличит его вязкость и снизит скорость осаждения не-CMs. - Resuspend CMs нежной инверсии трубки 3-5 раз.
- С интервалом в 3 минуты добавьте 10 МКЛ из 100 мкм раствора CaCl2 и смешайте. Повторите трижды.
- После четвертого добавления центрифуга подвески кардиомиоцита на 20 х г в течение 3 мин.
- Откажитесь от супернатанта.
- Resuspend CMs в предварительно разогретых (37 oC), взрослых мыши CM покрытие средств массовой информации (Таблица 3).
- Удаление не-CMs из взрослых одноклеточных суспензий (крыса)
- Пеллетные клетки при 20 x g в течение 3 мин при 25 oC.
- Отбросьте супернатант и повторно посовейте клетки в 25 мл раствора B(таблица 2).
- Смешайте клетки нежной инверсии и поместите его в трубку стоять, чтобы позволить CM поселиться под действием силы тяжести.
- Осторожно отбросьте супернатант.
- Повторное включение клеток в свежие 25 мл раствора B и титровать его до 1,0 мМ CaCl2 пошаговому добавлению 50 МЛ, 75 МЛ и 100 МКЛ 0,1 М CaCl2 с интервалом 3-5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая концентрация BSA в растворе B может быть использована на этом этапе. Увеличение концентрации BSA в растворе B увеличивает вязкость и, таким образом, снижает скорость осаждения не-CMs. - Пеллет клетки на 20 х г в течение 3 мин при 25 oC, аспирировать супернатант, и добавить желаемый объем взрослых крысиных клеток культуры средств массовой информации (Таблица 4).
- Семена CMs на пластине с ламинином покрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное покрытие CMs на пластине культуры без покрытия может быть использовано, чтобы свести к минимуму загрязнение не-CM клеток.
6. Взрослый CM покрытие
- Предварительное покрытие
- Перепродюсовать кардиомиоциты в культурные средства массовой информации.
- Предварительно пластины клеток в 60 мм или 100 мм блюдо для мыши или крысы CM, соответственно.
- Инкубировать CMs в течение 2 ч в инкубаторе дополняется 5% CO2 при 37 oC.
- Во время инкубации предварительной пластины, пальто пластины клеточной культуры с ламинином (10 мкг / мл в PBS) для долгосрочной культуры CM.
- После 2 ч предварительного покрытия, собирать CMs в 50 мл конического флакона.
- Соберите клетки из блюда и повторно пластины их в ламинин покрытием 24 хорошо культуры пластины для трансфекции экспериментов.
- Культурные клетки в инкубаторе при 37 oC дополняются 5% CO2. 4-6 часов достаточно, чтобы прилипать к кардиомиоцитам с поверхностью, а значит, трансфекцию можно выполнять 6 часов после покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда покрытия, содержащая FBS, широко используется и показывает лучшую совместимость с исследованиями распространения. Тем не менее, среда без сыворотки может быть использована для экспериментов, где анализируются секреторные факторы.
7. Трансфекция
- Инкубировать CMs к пластинам культуры клетки покрыть с laminin на 4-6 часов.
- Через четыре часа после СМ посева на пластине с покрытием ламинина, трансфект клетки с siRNAs (50 нМ) интереса с использованием трансфекции реагент (например, липофектамин RNAiMAX) в соответствии с протоколом производителя.
- Изменение средств массовой информации 24 часов после трансфекции и каждые 24 часа после этого на срок до 20 дней.
- После 20 дней, исправить клетки с 4% PFA в PBS для вниз по течению приложений, в том числе иммуноцитохимии для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin для обеспечения живых кардиомиоцитов были успешно культурные долгосрочной перспективе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Текущий измененный протокол позволяет эффективно изоляции и культуры крыс и мышей CMs в пробирке. Для крысы CM изоляции, в общей сложности 3 взрослых (12-недельный) мужчина Фишер 344 крысы были использованы в процедуре. Рисунок 1 показывает хирургический аппарат и изоляционные установки, которые необходимы в процедуре; каждая часть была отмечена и описана в легенде фигуры. Коллагеназа типа 2 была использована для пищеварения, что дает большое количество высококачественных CMs от успешной изоляции(рисунок 2A). Двадцать четыре часа после изоляции, эти клетки были трансфицированы с клеточным циклом индуцирования конкретных siRNAs против Rb1 и Meis2, в то время как, cel-miR-67 был использован в качестве контроля трансфекции вэксперименте 11. CMs были сохранены в культуре в течение семидней (рисунок 2B) или до двадцатидней (рисунок 2C) для наблюдения за морфологическими изменениями. Для оценки активности клеточного цикла, CMs были зафиксированы на 7-й день и окрашены для сердечно-специфического маркера Troponin-I, митотический маркер KI67, и ядро было визуализировано через DAPI (Рисунок 2D-F). Значительное увеличение KI67 положительных кардиомиоцитов наблюдалось с siRb1'siMeis2 лечение по сравнению с контролем11. Кроме того, крысы кардиомиоциты били (контрактильной функции) в культуре на седьмой день после покрытия, что является отличительной чертой, характерной чертой здоровыхкардиомиоцитов 11.
Для изоляции CM у мышей, в общей сложности 3 мужчины и 3 взрослых женщин (12-недельный) C57BL/6 мышей были использованы в процедуре. Как и в случае с исследованием крыс, коллагеназа типа 2 использовалась для переваривания коллагена и внеклеточной матрицы сердца взрослых мышей. Взрослые мыши CM сравнительно хрупкие для изоляции и культуры in vitro; Таким образом, этот протокол использует blebbistatin для улучшения жизнеспособности взрослой мыши CM. Успешная изоляция дает 70-80% здоровой формы стержня CMs, которые могут быть откоулены на срок до 20 дней (Рисунок 3A-C) и поддерживать их сердечного Troponin-I окрашивания и контрактности (Рисунок 3C). В отдельных экспериментах, четыре часа после изоляции, мыши CMs были transfected с клеточным циклом индуцирования siRNA коктейль, как описано для крысы CM. Кратко, мышей CM был одновременно трансфицированы с конкретными siRNAs против Rb1 и Meis2, и контроль (cel-miR-67). После трансфекции CMs были предметом визуализации курса времени в течение 10 дней, показывающиеморфологические изменения ( рисунок 4), который сопровождается анализом распространения (Рисунок 5). На 10-й день, иммунно-флуоресцентное окрашивание для Troponin-I, KI67, и DAPI было выполнено, как описано ранее. Значительное увеличение KI67 положительных кардиомиоцитов наблюдалось при лечении siRb1'siMeis2 по сравнению с контролем(рисунок 5A-C).
Настоящий протокол показывает, что взрослые крысы и мыши CMs могут быть культурные долгосрочные in vitro на срок до 20 дней и, возможно, дольше. После 20 дней, CMs поддерживать их Troponin-I окрашивания, а также контрактность, если ингибиторы удаляются из средств массовой информации.
| Миоцит буферный состав, рН 7.4 (Подготовка и может храниться при 4 КК ) | |||
| Реагента | Концентрация, мММ | Молекулярный wt. | За 1 литр |
| Nacl | 113 | 58.44 | 6,6037 г |
| Kcl | 4.7 | 74.5513 | 350.3911 мг |
| МгСО4 | 1.2 | 120.366 | 144.4392 мг |
| KH2PO4 | 0.6 | 136.086 | 81,6516 мг |
| 2PO4 | 0.6 | 119.98 | 71,988 мг |
| Буфер перфузии, рН 7.4 (Подготовка свежая для каждой изоляции) | |||
| Концентрация, мММ | Молекулярный wt. | Требуемая сумма | |
| Буфер миоцитов | 250 мл | ||
| ГЕПЕС | 10 | 238.3012 | 595,75 мг |
| 2,3-бутаненский моноксимин | 10 | 101.105 | 252,775 мг |
| NaHCO3 Свежий | 1.6 | 84.007 | 33.6028 мг |
| Таурин Свежий | 30 | 125.15 | 938,625 мг |
| Глюкоза свежая | 20 | 180.156 | 900.775 мг |
| Ферментный раствор | |||
| Сток Конт. | Рабочий Кон. | Обязательно | |
| Буфер миоцитов | 50 мл | 50 мл | |
| Коллагеназа типа 2 | 330 U/mg | 620 U/mL | 93 мг |
| Протеаз XIV | 3,5 U/mg | 0.104 U/mL | 1,48 мг |
| DNase I класс 2 | 0,015 мг/мл | ||
| Остановить буфер A | |||
| Сток Конт. | Рабочий Кон. | Обязательно | |
| Буфер миоцитов | 30 мл | ||
| Bsa | 2.50% | 0,75 г | |
| CaCl2 | 100 мМ | 0,1 мМм | 30 мкл |
| Остановить буфер B | |||
| Сток Конт. | Рабочий Кон. | Обязательно | |
| Буфер миоцитов | 30 мл | ||
| Bsa | 5.00% | 1,5 г | |
| CaCl2 | 100 мМ | 0,1 мМм | 30 мкл |
Таблица 1: Решения, необходимые для изоляции кардиомиоцитов для взрослых мышей.
| 10x КХБ Фондовое решение (Общий объем 1L) |
Реагента | Моларность (mM) | Сумма (г) |
| Nacl | 1180 | 68,9 г | |
| Kcl | 48 | 3,5 г | |
| ГЕПЕС | 250 | 59,7 г | |
| МгСО4 | 12.5 | 1,4 г | |
| K2HPO4 | 12.5 | 2,1 г | |
| Отрегулируйте рН до 7,4 с 4 M NaOH (20 мл), храните при 4 градусах Цельсия | |||
| Решение KHB, 500 мл | Реагента | Сумма | |
| 10x KHB | 50 мл | ||
| Глюкозы | 0,99 г | ||
| Таурин | 0,31 г | ||
| Добавьте H2O, чтобы довести объем до 500 мл, а рН должен быть 7,35 евро | |||
| Решение A | Реагента | Сумма | |
| Решение KHB | 500 мл (10 мМ) | ||
| Bdm | 0,5 г | ||
| Кислород со 100% O2 и тепло до 37 градусов по Цельсию | |||
| Решение B, 50 мл | Реагента | Сумма | |
| Решение A | 50 мл | ||
| Bsa | 0,5 г | ||
| 0.1 M CaCl2 (Caq 0.1 mM) | 50 мкл | ||
| Решение E, 50mL | Реагента | Сумма | |
| Решение A | 50 мл | ||
| Bsa | 0,05 г | ||
| Коллагеназа II типа (263 единицы/мг) | 35 мг | ||
| Гиалуронидаза (Тип I-S) | 10 мг | ||
| 0.1 Акции M CaCl2 | 12,5 мл | ||
| Хорошо перемешать | |||
| Акции CaCl2, 0.1M | Реагента | Сумма | |
| CaCl2 | 7,35 г | ||
| H2O | 500 мл | ||
| Хранить по 4 градусов по Цельсию | |||
Таблица 2: Решения, необходимые для изоляции взрослых крыс кардиомиоцитов.
| Состав средств массовой информации Plating, рН 7.4 | |||
| Рабочая концентрация | Молекулярная wt. | Требуемая сумма | |
| Культурные СМИ без Блеббистатина | 50 мл | ||
| Bdm | 10 мМ | 101.105 г/мол | 50,55 мг |
| Fbs | 5% | 2,5 г | |
| Культура медиа композиция, рН 7,4 | |||
| Реагента | Рабочая концентрация | Молекулярная wt. | Требуемая сумма |
| ДМЭМ | 1X | 250 мл | |
| Инсулина | 1 мкг/мл | 0,25 мг | |
| Трансферрин | 0,55 мкг/мл | 0,138 мг | |
| Селен | 0,5 нг/мл | 0,125 мкг | |
| Пенициллин (U/mL)-стрептомицин (г/мл) | 100-100 | 2,5 мл | |
| ГЕПЕС | 10 мМ | 238.3012 г/мол | 595,753 мг |
| ФБС | 10% | 25 мл | |
| (BSA) | 0.20% | 0,5 г | |
| #Blebbistatin | 25 МКМ | 292.338 г/мол | 1.8271 мг |
| «Используйте любой из них, в соответствии с экспериментальным требованием. Aliquot культуры средств массовой информации для подготовки покрытия средств массовой информации, прежде чем добавить Blebbistatin. ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 200 МЛ культуры средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 50 мл покрытия мультимедиа. |
|||
Таблица 3: Медиа-композиция для взрослых мыши кардиомиоцитов покрытие и культуры.
| Культура медиа композиция, рН 7,4 | ||
| Реагента | Рабочая концентрация | Требуемая сумма |
| ДМЭМ | 1x | 250 мл |
| Пенициллин (U/mL)-стрептомицин (г/мл) | 100-100 | 2,5 мл |
| ФБС | 10% | 25 мл |
Таблица 4: Медиа-композиция для взрослых крыс кардиомиоцитов покрытие и культуры.
Рисунок 1: Процедура установки и оборудования. (I) Схематическое представление перфузии. (II) Хирургические инструменты и игла канюляции. (III) Сборка перфузии сердца: A) Нагревательный пиджак. B)Двойной настенный сосуд водяной куртки. C) Циркулирующая нагретая вода вход. D)Циркулирующая нагретая розетка воды. E)Раствор перфузии сердца. F) Циркулирующий насос G) Перфузия раствор трубки. H)Кислородная трубка. I)Циркулирующая водяная ванна. J) Канкуляционная игла с сердцем, прикрепленная к порту розетки перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Взрослая крыса CM изоляции, трансфекции, и долгосрочной культуры. A) Взрослая крыса CM, сразу после изоляции. B) Взрослая крыса CM на 7-й день после изоляции. C)Взрослая крыса CM на 20-й день. D-F) KI67 положительные крысы CM на 7-й день после siRb1'siMeis2 трансфекции. Тропонин-I и зеленый; DAPI - синий; KI67 - красный. Все эксперименты проводились дубликатами и повторялись не менее трех раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Взрослые мыши CM изоляции и долгосрочной культуры. A) Взрослые мыши CM, сразу после изоляции. B) Взрослые мыши CM на 7-й день после изоляции. C) Взрослые мыши CM окрашенные с сердечной Troponin-I зеленый день 20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Взрослая мышь CM де-дифференциации. Взрослые мыши CM показаны морфологические изменения во время долгосрочной культуры (день 0 до дня 10) в DMEM-HG средств массовой информации, дополняется 10%FBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Взрослые мыши CM трансфекции и распространения. A-C) KI67 положительная мышь CM на 10-й день после трансфекции siRb1'siMeis2. Тропонин-I и зеленый; DAPI - синий; KI67 - красный. D) Бар график показывает значительное увеличение KI67 положительные взрослые мыши CMs в siRNA-коктейль трансфицированной группы по сравнению с контролем. Результаты представлены как ±SEM; - p-значение ≤0,05. p-значение ≤0,05 было сочтено статистически значимым. Все эксперименты проводились в тройном (n'3 Мужчины,3 самки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует критическая необходимость в создании протокола для взрослых кардиомиоцитов изоляции и долгосрочной культуры для выполнения клеточных механистических исследований. Есть только несколько докладов, обсуждающих взрослых ПРОТОКОЛов изоляции CM, и еще меньше из них используются для долгосрочной культуры взрослых мышей CM15,16,17. Показано, что взрослая крыса CM имеет более высокую терпимость к культуре in vitro, чем взрослые мыши CM10,,11,12. В этом докладе мы устанавливаем протокол для взрослых крыс и мышей CM изоляции, siRNA трансфекции, долгосрочной культуры, и вниз по течению анализ индуцированного распространения, с минимальными изменениями в регулярно используемых протоколов.
Доступные протоколы для взрослых CM изоляции основаны на использовании двух известных ферментов, коллагеназы и либеразы, для внеклеточной матрицы (ECM)пищеварения 18,19. Коллагеназа является широко используемым ферментом во взрослых протоколах изоляции CM. Коллагеназа переваривает коллагеновые волокна в ECM, что приводит к диссоциации сердечной ткани в одноклеточной СМ. Аналогичным образом, liberase переваривает ECM. Liberase является очищенной альтернативой коллагеназы, которая показывает более высокую активность и, таким образом, требует более высокой точности во время изоляции CM для достижения успешной изоляции по сравнению с коллагеназой. Кроме того, в процедуре, мы заметили, что CM изолированы с liberase не выживает в долгосрочной культуре. Тем не менее, CM изолированы с коллагеназы улучшает долговечность CM в культурных условиях.
Кроме того, мы использовали конкретный ингибитор миозин II называется blebbistatin в культурных средствах массовой информации для долгосрочной культуры взрослых мыши CM20,21. Ранее, 2,3-butanedione моноксимин (BDM) был использован для взрослых культуры CM. BDM является ингибитором ATPase, который подавляет контрактильной функции через плохо определенный механизм, который включает в себя ингибирование ATPaseи нарушения Caпереход 22. По сравнению с BDM, blebbistatin является специфическим ингибитором миозин II и показывает более значительное ингибирование контрактильной функции при более низких концентрациях, чем BDM. Предварительное покрытие взрослой мыши CM в культурных средствах массовой информации, дополненный 10 мМ BDM и последующих культур CM в 25 МК blebbistatin дополнены и низким содержанием сыворотки средств улучшает живучесть и структура формы стержня CM в долгосрочной культуре. Тем не менее, прямое покрытие взрослой мыши CM в средствах массовой информации, дополненный 25 МКМ blebbistatin и 10% FBS лучше для пролиферативных исследований. Как и взрослые крысы CM, который показывает большую степень де-дифференциации в культуре in vitro, мы также наблюдали де-дифференциации во взрослой мыши CM в некоторой степени (Рисунок 5). Морфологические изменения являются необходимым шагом для распространения. Таким образом, обеспечение среды для взрослых CM, что облегчает их де-дифференциации является одним из важнейших факторов, чтобы рассмотреть в таких исследованиях. Хотя в настоящее время не ясно, какие именно шаги или компоненты, используемые в этом протоколе, отвечают за улучшение долговечности взрослых CMs, мы считаем, что это комбинированный эффект используемых реагентов, изменения, внесенные в процедуру изоляции, и, возможно, самое главное обученные руки.
Как и в предыдущих докладах, показывающих вирусную трансдукцию взрослого СМ в Блезистатин-дополненных средств массовой информации, мы также наблюдали эффективную трансфекцию этих клеток с siRNAs. Мы использовали конкретные siRNAs против двух сенесценции связанных генов, Rb1 и Meis2, чтобы вызвать распространение CM. Для крысы CM, мы провели анализ KI67 для оценки распространения на седьмой день после трансфекции; однако, распространение в мыши взрослых CM был проанализирован на десятый день после трансфекции. Вид-специфической биологической изменчивости может быть возможной причиной наблюдаемой разницы во времени в индуцированном клеточном цикле повторного входа взрослых крыс и мышей CM.
В целом, описанный здесь протокол обеспечивает улучшенную, надежную и сравнительную процедуру изоляции взрослых крыс и мышей CM и, соответственно, культурирует их в соответствии с экспериментальной потребностью. Кроме того, этот протокол позволяет долгосрочной культуры взрослых CM, которые обеспечивают in vitro системы для выполнения различных долгосрочных анализов, таких как пролиферацию, паракрин фактор, стресс ответ и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием от кафедры патологии и лабораторной медицины Университета Цинциннати, Медицинского колледжа, д-ра Онура Канишичака; грант От Национальных институтов здравоохранения (R01HL148598) доктору Онуру Канисаку. Д-р Онур Kanisicak поддерживается Американской ассоциации сердца Карьера развития премии (18CDA34110117). Д-р Perwez Алам поддерживается Американской ассоциации сердца постдокторской грант (AHA_20POST35200267). Д-р Малина Айви поддерживается грантом NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
